Prácticas de Bioquímica I

Práctica: Reacciones Generales de aminoácidos y proteínas

REACCIONES GENERALES DE CARACTERIZACIÓN DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS. Objetivos Al terminar esta práctica el estudiante estará en capacidad de: -

Aplicar pruebas químicas para la determinación cualitativa de aminoácidos.

-

Conocer la importancia de los grupos R en la determinación cualitativa de los aminoácidos.

-

Emplear reacciones específicas para la caracterización de proteínas.

Introducción Los aminoácidos son las unidades estructurales más simples (monómeros) que componen la estructura de las proteínas; están constituidos por un grupo amino (NH2 o NH3+), un grupo carboxilo (COOH o COO-) unido al carbono 2 de la molécula, un átomo de hidrógeno y una cadena radical conocida también como grupo R. Esta última es específica para cada aminoácido y contribuyen a la identificación de los mismos. La presencia de estos grupos químicos en la estructura de los aminoácidos es lo que determina que estas moléculas intervengan en un gran número de reacciones químicas. Las reacciones pueden ir de lo general, como es el caso de la reacción de la ninhidrina o la de Biuret, hasta lo muy específico como veremos en el desarrollo de este trabajo práctico.

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Práctica: Reacciones Generales de aminoácidos y proteínas

MATERIALES Y REACTIVOS -

Tubos de ensayo

-

Pipetas graduadas de 1, 2 y 5 mL

-

Baños de María

-

Goteros

-

Pinzas para tubo de ensayo

-

Cilindro graduado

-

Soluciones al 0,2% de los aminoácidos disponibles en el laboratorio.

-

Solución de albúmina al 0,5 %

-

Reactivo de ninhidrina: preparada al 0,1 % en etanol

-

Acetato de plomo al 10 %

-

NaOCl al 10 %

-

NaOH al 30 %

-

HNO3 Concentrado

-

Reactivo de Millon: disolver 40 g de mercurio metálico en 57 mL de HNO3 y aforar con cuidado a 100 mL con agua destilada

-

Reactivo de Biuret: puede presentarse como una mezcla, combinando previamente sulfato de cobre e hidróxido de sodio. En dicho caso se usarán 0,5 mL de dicha mezcla

Reacción de la Ninhidrina Consiste en la reacción del grupo amino y/o carboxilo libre de los aminoácidos y las proteínas con la ninhidrina. Esta es una de las reacciones de uso frecuente en el estudio químico de los aminoácidos, péptidos y proteínas. Se fundamenta en la reacción de la ninhidrina frente a las moléculas que poseen funciones amínicas y carboxílicas libres, formándose un compuesto final de color violáceo. En esta reacción, cada equivalente de aminoácido reacciona con dos equivalentes de ninhidrina. Aunque la reacción de la ninhidrina con aminoácidos y proteínas es de fácil ejecución, esta lleva implícita varias etapas:

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1. Condensación de la Ninhidrina con el aminoácido: O

O OH

H2O

O H3N+ CHC OR O

O

NCHC OH

aminoácido

OH O

O

R

O

O

2. Formación de la base de Schiff: O

O-

R

N CHR

NCHC OH O

O

+ CO2

O

3. Formación del dicetohidrindeno: O-

ON CHR

H2O

NH2

+ CHO R

O

O

4. Condensación del amino-dicetohidrindeno con otra molécula de ninhidrina: O

ONH2 O

O

ON

+ O O

O

O

El último compuesto en esta cadena de reacciones es de color azul violáceo, e indica la presencia de grupos carboxilo y/o amino libres en la muestra analizada. Experimento 1 Prueba de la Ninhidrina. En tres tubos de ensayo rotulados (1, 2 y 3) coloque 2 mL de aminoácido (tubo 1), de proteína (tubo 2) y de compuesto desconocido (tubo 3). Agregue a cada tubo 10 gotas de reactivo de ninhidrina y agite suavemente. Coloque los tubos en baño de agua hirviente durante al menos 10 minutos. En caso positivo la solución se tornará violeta lo que indica la presencia de aminoácidos y/o proteínas con grupos amino o carboxilo libres 3

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Práctica: Reacciones Generales de aminoácidos y proteínas

Reacción de Biuret: Es una reacción general para la identificación de péptidos y/o proteínas. Se le da ese nombre debido a que el color que se produce en esta reacción, es similar al de la condensación de dos moléculas de urea (H2N=C=NH2), conocido en alemán como: Biuret. Se fundamenta en la formación de un compuesto azul violeta por la reacción del ión cúpicro con el péptido o proteína en medio alcalino. Este ión forma un enlace covalente coordinado con los enlaces peptídicos (ver reacción). La reacción dará resultado positivo si el compuesto analizado posee al menos dos enlaces peptídicos en su estructura. En el caso de los aminoácidos y dipéptidos la reacción es negativa. Si se observa la reacción se verá claramente porqué hacen falta dos enlaces:

C

O

N H

2

O Cu

CH C

C

R OH

CH Cu

-

O

N H

CH

R

C

O

++

C H N

E nlaces Peptídicos

O

NH

H N

++

R O

C

N H

Enlace covalente coordinado

Experimento 2 Prueba de Biuret En tres tubos de ensayo debidamente rotulados (1, 2 y 3) agregue 2 mL de cualquier aminoácido disponible (tubo 1), de albúmina (tubo 2) y de compuesto desconocido (tubo 3). Añada a todos los tubos 5 gotas de CuSOa 1 % y 5 gotas de NaOH 30%. Agite suavemente y observe la aparición de un color violeta que indica la presencia de péptidos o proteínas. El color celeste indica que el resultado es negativo. 4

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Reacción de Sullivan En esta reacción se detecta la presencia de aminoácidos azufrados (portadores de grupos sulfhidrilos (-SH) y disulfuros (-S-S) como la cisteína y la cistina respectivamente. Se basa en la alcalinización de la muestra que contiene el azufre produciéndose Na2S el cual en presencia de acetato de plomo forma un precipitado negruzco de sulfuro de plomo (PbS). Las proteínas que contengan estos grupos también darán positiva esta reacción. La misma se desarrolla de la siguiente manera:

1. O

O +

H3N

CH C

O-

+

+ 2NaOH

H3N

CH C

CH2

CH2

SH

OH

O-

+ Na2S + H2O

serina

Cisteina

2. Na2S + (CH3COO) 2Pb

2CH3COONa

+ PbS

Experimento 3 Prueba de Sullivan En tres tubos de ensayo rotulados 1, 2 y 3 agregue: 2 mL de cisteína (tubo 1), albúmina (tubo 2) y compuesto desconocido (tubo 3). Adicione con cuidado 1 mL de NaOH al 30% y 5 gotas de acetato de plomo al 10% a todos los tubos. Mezclar y calentar a 100 °C de 2 a 3 minutos. En caso positivo se formará un precipitado negruzco de PbS.

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Reacción de Sakaguchi Está reacción es específica para la identificación del grupo guanidino. Se fundamenta en la condensación del grupo guanidino con el α-naftol en un medio altamente oxidante, con la posterior producción de un compuesto de color rojo intenso. Esta prueba da positiva frente a la arginina así como a las proteínas que contienen este aminoácido. O H3N CH C OCH2 CH2 CH2

+

H3N CH C O

+

CH2 CH2 CH2

OH

+

NH

O

C NH2

alfa naftol

NH C NH NH2

Cromógeno rojo

Arginina

Experimento 4 Prueba de Sakagushi En tres tubos de ensayo rotulados previamente (1, 2 y 3) agregue 2mL de arginina (tubo 1), albúmina (tubo 2) y compuesto desconocido (tubo 3). Añada 3 gotas de NaOH al 30% a cada uno y agite suavemente. Agregar 3 gotas de α-naftol al 0,5 % en etanol a todos los tubos y mezcle bien. Posteriormente agregue a los tubos 1 mL de hipoclorito de sodio (NaOCl) al 14%. La positividad de la reacción se observará de inmediato en los tubos que contengan arginina, bien sea libre o como parte de la estructura de una proteína.

Reacción

Xantoproteica:

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Permite identificar aminoácidos que tienen anillo bencénico en su estructura, tales como la fenilalanina o la tirosina. En esta reacción el aminoácido reacciona con ácido nítrico concentrado, ocurriendo la nitración del anillo aromático Como productos finales de la reacción se forman nitroderivados de color amarillo. O +

H32N

CH C CH2

O -

O

+

+

H32N

CH C

O-

CH2

HNO3

NO2 OH

OH

Tirosina

Tisosina nitrada (amarillo)

Experimento 5 Prueba xantoproteica En tres tubos de ensayo rotulados previamente (1, 2 y 3) coloque 2 mL de tirosina (tubo 1), albúmina (tubo 2) y compuesto desconocido (tubo 3). Agregue 2 mL de HNO3 concentrado a cada tubo y caliente los tubos en un baño de agua hirviendo de 1 a 3 minutos.

La aparición de un color amarillo indica una

reacción positiva para aminoácidos aromáticos. Reacción de Millon: Tiene especificidad para detectar la presencia de tirosina o de proteínas que la contengan. Es una variante de la reacción xantoproteíca, identifica los compuestos que contienen un grupo -OH ligado al anillo bencénico. En dicha reacción además de la nitración del anillo fenólico, se incorpora a su estructura el mercurio (Hg++) produciéndose un derivado mercúrico de nitrotirosina de color rojo.

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O +H N 3

CH C

O O-

+H

CH2

3N

CH C

O-

CH2

+ HgNO2

N O

OH

OHg

Tirosina

Compuesto mercúrico de Tirosina

Experimento 6 Prueba de Millon Coloque en tres tubos de ensayo rotulados previamente (1, 2 y 3) 2 mL de tirosina (tubo 1), de albúmina (tubo 2) y de compuesto desconocido (tubo 3). Añada a cada tubo 0,2 mL de reactivo de millon. Calentar cuidadosamente sin llegar a ebullición. En caso positivo se observará una coloración rojiza.

Auto evaluación 1. Explique porque aminoácidos como la cistina dan una reacción positiva a la reacción de Sullivan. 2. Explique el fundamento de la reacción de Biuret. 3. Diga las aplicaciones de la reacción xantoproteica. 4. ¿Cómo cree usted que resultaría la reacción de Biuret si la

aplicamos a un

dipéptido? 5.- ¿Porque un aminoácido resulta negativo a la reacción de Biuret?

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Bibliografía Alemany, M; Font, S. Práctica de Bioquímica. Edit Alhambra. España 1.983. Pavia, Donald; Lampman, Gary; Kriz George. Introduction to organic laboratory techniques. Saunders editores. 1976. Plummer, David. Bioquímica práctica. Mc Graw Hill. 1981. Robyt, John; White Bernard. Bioquemical Techniques. Waveland Press. 1987.

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