Recogida de muestras para el laboratorio ¿Qué, cómo, cual, cuanto? Paloma Chaves Sanz Directora técnica del laboratorio APG Rodriguez San Pedro 10 28015 Madrid

OBTENCIÓN: La primera pregunta que nos planteamos cuando tenemos que hacer un análisis de sangre es ¿qué tipo de aguja debo emplear, en que tipo de tubo tengo que recogerlo, qué cantidad de sangre se necesitará? El uso de palomillas o agujas y el distinto calibre de las mismas, lo mismo que el volumen de las jeringuillas y la elección de la vena dependerá en ocasiones del tamaño del animal al que vamos a extraer la sangre. La cantidad de sangre extraída dependerá también de las pruebas que solicitemos al laboratorio. La aguja rosa es de 18G (la más gruesa), la amarilla de 20G, la verde de 21G, la azul de 23G y la naranja de 25G de insulina (la más fina). (Fig. 1)

Figura 1¿Qué calibre de aguja, que jeringuilla, qué cantidad? Dependerá del tipo de animal.

Figura 2 ¿Cuál tubo elijo?

Figura 3 Código Internacional de colores para

Recogida de tubos (Norma ISO 6740) Cuando

En cuanto a los tubos, existe un Código internacional de colores para recogida de tubos (norma ISO 6740), (Figura 3). Dependiendo del color del tapón el anticoagulante será diferente y se utilizará para distintos fines. Tubo de tapón lila lleva EDTA sódico o potásico se usa para la realización de hemogramas y estudio de células y parásitos hemáticos. Tubo de tapón verde lleva heparina sodio, potasio, litio y amonio se utiliza para perfiles bioquímicos. Tubo de tapón azul lleva citrato sódico y se utiliza para pruebas de coagulación. El tubo de tapón gris lleva fluoruro sódico y se utiliza para determinación de glucosa. Tubo de tapón rojo no lleva ningún tipo de anticoagulante. Con él obtenemos suero para pruebas de bioquímica, hormonas e inmunología.

Anticoagulante Modo de acción

Cantidad/ ml Ventajas sangre

EDTA Na o K

1-2 mg/ml

Quelante Calcio

Heparina Na,K, Li, Inhibe paso 20 U/ml Li,NH4 protrombina- a trombina

Utilización

Color tapón

Conserva morfología Interfiere células sanguíneas determinaciones bioquímicas

Hemograma LILA Parásitos hemáticos

Conserva pH sanguíneo

Perfiles VERDE bioquímicos

Citrato sódico

Quelante calcio

Sol. 3,8%: Hemostasia 1vol.citrato/ 9 vol. sangre

Fluoruro Sódico

Inhibe glucólisis

2-4mg/ml

Sin anticoagulante

Inconvenientes

Desaconsejable hematología

Conserva factores Coagulación AZUL lábiles coagulación algunas horas

Conservador de Desaconsejable la en otras Deter. de la glucosa determinaciones glucosa bioquímicas

GRIS

Bioquímica ROJO Inmunología

HEMOGRAMA El tapón lila corresponde al anticoagulante EDTA (etilendiaminotetraacético) en forma de sales de sodio o potasio (Fig.4). El EDTA es el anticoagulante que mejor conserva las células sanguíneas. Actúa como anticoagulante por ser quelante del calcio de la muestra. La concentración de la muestra debe ser de 1-2 mgr/ml de sangre. Esto lo conseguimos añadiendo la cantidad de sangre que nos indica el tubo. Excepcionalmente podemos hacer un hemograma en tubos con otro tipo de anticoagulante como por ejemplo Heparina litio pero conserva peor la

morfología celular y se producen con más frecuencia todavía agregados plaquetarios.

Fig.4

Tubos de EDTA

Métodos: Una vez obtenida la muestra de sangre quitamos la aguja de la jeringuilla y solo con esta introducimos la sangre en el tubo correspondiente. (Figuras 5 y 6). Tapamos con el tapón e invertimos suavemente varias veces (cinco o seis) para que la sangre se mezcle bien con el anticoagulante. Nunca bruscamente como si fuera una coctelera.

Figura 5

SI

Figura 6

NO

Si añadimos un volumen distinto de sangre al indicado en el tubo tendremos problemas. Si el volumen de sangre es mayor al del tubo se nos coagulará la sangre. Si el volumen de sangre es menor se nos producirán: Hemólisis, crenación de los hematíes, falsas disminuciones del hematocrito, VCM y falsos aumentos de CCMH. Se puede hacer un hemograma con 0,5 a 1 ml de sangre.

Figura 7 El tubo de la izquierda tiene poco volumen de sangre y el de la derecha demasiada por lo que se ha formado un coágulo.

NO Mirar en el tubo siempre la señal hasta donde hay que llenarlo de sangre. En caso de usar tubos Tapval podemos quitar la aguja e introducir en émbolo por el orificio superior (Fig. 8), es muy cómodo pero si lo vamos a remitir al laboratorio, la sangre puede salirse y no os podéis imaginar lo que cunde una gota de sangre (Fig. 9) en un sobre y no podéis imaginaros como llega el tubo o tubos que le acompañan al laboratorio pues sigue goteando. Por favor quitar el tapón, os llevará unos segundos más y hacerlo como si fuera un tubo de tapón hermético (Fig.10).

Fig.8

Fig.9

Fig.10

Identificación: Es importantísimo identificar los tubos con los datos del animal al que realizaremos el análisis antes incluso de depositar la sangre en él. Evitaremos así un posible error preanalítico que puede complicarse en el laboratorio. (Figura 11)

Figura 11

SI

NO

Si además acompañamos a las muestras identificadas de un protocolo facilitaremos mucho el trabajo al laboratorio, indicando: Los datos del animal: Nombre, raza, sexo, edad. Datos de la clínica o veterinario que la remite. Tipo de muestra. Breve historia clínica. Tratamientos empleados. Determinación que se solicita. Conservación:

Lo ideal son dos horas desde la obtención de la muestra a temperatura ambiente o 24 horas en nevera a 4º C para no alterar los valores del hemograma. JAMÁS introducir en el congelador. Las plaquetas deben determinarse lo antes posible para evitar agregados. Los frotis sanguíneos deben realizarse como máximo dos horas después de haber obtenido la muestra y fijarlos en metanol durante dos minutos una vez secos. Hay una serie de factores a considerar Un animal estresado puede presentar Híperglucemia, neutrofilia madura y/o linfocitosis. Produciremos hemólisis si usamos agujas de bajo calibre y jeringas de alto volumen (Figura 12).

Figura 12

NO

La contaminación con un exceso de antiséptico puede producir hemólisis debido al alcohol. La extracción de sangre extravasada puede producir hemólisis y agregación plaquetaria (Fig. 13 y 14)

Fig.13 Agregados plaquetarios

Fig. 14

Hemólisis

Fig. 15 Crenación de hematíes

La contaminación con el líquido de fluidoterapia producirá una dilución de la muestra e incluso contaminación de la misma si el fluido lleva potasio produciendo hiperkalemia (Fig. 16).

Fig. 16

NO

Si el volumen de sangre es mayor al del tubo se nos coagulará la sangre. Si el volumen de sangre es menor se nos producirán: Hemólisis, creación de los hematíes (Fig. 15), falsas disminuciones del hematocrito, VCM y falsos aumentos de CCMH. PRUEBAS DE BIOQUÍMICA Las podemos hacer prácticamente todas en suero, en plasma también siempre que el anticoagulante no interfiera en la prueba. Los tubos de suero no llevan ningún tipo de anticoagulante y el tapón es de color rojo, según las norma ISO 6710 (Fig.17). En el mercado hay tubos sin anticoagulante que no siguen esta norma y hay tapones de todos los colores. Tenemos que asegurarnos que el tubo elegido para suero no lleve anticoagulante de ningún tipo. Para inmunología el tubo de elección es el de suero lo mismo que para la determinación de hormonas.

Fig. 17 Tubos de Heparina Li y sin nada

Las pruebas de bioquímica también pueden hacerse en plasma recogido en un tubo con heparina litio, tubos con tapón verde (Fig. 17) pues no interfieren los resultados sin embrago en EDTA interfieren las pruebas enzimáticas (fosfatasa alcalina) y los iones Ca y K. Manejo de las muestras:

Si recogemos la sangre en tubo de suero, tenemos que dejarlo en posición vertical y a temperatura ambiente Fig. (18 y 19). No debemos refrigerarlo antes de su coagulación y retracción del coagulo (de treinta minutos a una hora después de la recogida) pues produciríamos hemólisis.

Fig. 18 Fig.19 El microtubo de la Fig. 18 se dejó en posición horizontal el de la Fig. 19 en posición vertical, en los dos se ve el coagulo y su retracción.

Si la sangre no desuera bien, esto suele ser lo habitual, centrifugaremos a 2.500-3000 rpm durante 5-10 minutos. Lo ideal es separarlos antes de las dos horas de recogida de la sangre. Si la sangre la recogemos en tubo de heparina litio podemos centrifugarla inmediatamente después para la obtención del plasma. Diferencias entre el suero y el plasma: Suero Riesgo de hemólisis mayor que en suero Centrifugación tras coagulación Muestra idónea para la mayoría de pruebas: bioquímicas e inmunológicas No contiene fibrinógeno

Plasma Riesgo de hemólisis menor que en suero Centrifugación inmediata En pruebas bioquímicas posible interferencia con anticoagulante (mínimas con heparina Litio) Contiene fibrinógeno Conservación de suero o plasma: Se conserva 3 días a 4º C y congelado a – 20º C durante mucho tiempo

Conservación de las muestras 20 – 25 º Compuesto C Albúmina 6 días ALT (GPT) 1 día AST (GOT) 3 días Bilirrubina total Solo muestra reciente Calcio 10 días Colesterol 6 días Creatinina 1 día Fosfatasa ↓10% actividad alcalina en 7 d. Fósforo 2 días inorgánico GGT 5 días Glucosa (en 1 día FlNa) Potasio 2 semanas Proteínas 7 días totales Urea 1 día

4º C

-20º C

6 días 7 días 7 días -

Varios meses 1 mes 1 mes -

10 días 6 días 1 día 7 días

8 meses 4 meses Varios meses 1 mes

7 días

Varios meses

10 días 2 días

1 mes -

2 semanas 1 mes

Varios meses Varios meses

3 días

6 meses

Determinación de glucosa: La sangre la podemos recoger en un tubo de suero, en cuyo caso la deberemos centrifugar en el momento que se haya coagulado o en un tubo con Heparina Litio en cuyo caso deberemos centrifugar inmediatamente o en un tubo de Fluoruro sódico, tubo de tapón gris (Fig. 20), que inhibirá las enzimas de la glucólisis y conserva el valor de glucosa durante 24 horas a temperatura ambiente o 48 horas a 4 º C.

Fig. 20 Tubos de fluoruro Na

Sino lo hacemos siguiendo este protocolo no podremos valorar la glucosa pues se produce un consumo de esta por parte de los hematíes.

COAGULACIÓN: La sangre se recogerá en un tubo de citrato sódico, tubo de tapón azul (Fig. 21). Las cantidades de sangre serán las correspondientes al volumen de anticoagulante, (9 partes de sangre por 1 de anticoagulante). Centrifugar antes de los 30 minutos de extracción de la sangre a 3.000 rpm durante 15 minutos. Refrigerar un máximo de 2 horas o congelar a -20 ºC.

Fig. 21 Tubos de Citrato sódico

URIANÁLISIS: Recomendamos NO USAR frascos de orina para remitir la muestra al laboratorio, a no ser que sean herméticos es preferible remitirla en tubos. Durante el transporte suelen ser frecuentes los accidentes. Para el urianálisis solo son necesarios 5 ó 10 ml de orina. Conviene indicar la forma de recogida de la muestra: micción espontánea, sonda o cistocentesis y especialmente cuando se trate de urocultivos, en cuyo caso el frasco o tubo deberá ser estéril. Se conservan perfectamente de 12 a 24 horas a 4 ºC. ANÁLISIS DE HECES: Lo ideal son los análisis seriados de 3 a 5 días en caso de diagnóstico de giardias por ejemplo. Se conservaran a 4ºC excepto la última muestra que se enviará a temperatura ambiente y lo más fresca posible.

Usar recipientes adecuados NO USAR BOLSAS DE PLASTICO o PAPEL DE ALUMINIO para remitir las muestras. Para coprocultivos los frascos deberán ser estériles. LÍQUIDOS ORGÁNICOS: Se remitirán en dos tubos, uno con EDTA para el recuento de células y la citología y otro de suero para pruebas bioquímicas en caso de que se soliciten. Para el cultivo bacteriológico se empleará un tubo estéril o la propia jeringuilla de extracción. Los portas con las extensiones para las citologías deben ir fijadas en metanol. CITOLOGIAS Y BIOPSIAS: Citologías: Materiales: Agujas, jeringuillas y portas. Métodos: Pedemos realizarla de dos formas: Punción con aguja fina o punción–aspiración con aguja fina. Las dos técnicas son muy similares. La primera es ideal para ganglios pues al ser estos muy frágiles asegura la integridad de las células y en tejidos muy vascularizados para minimizar la contaminación sanguínea. No tomaremos muestras de zonas ulceradas pues solo reflejara el proceso inflamatorio. En lesiones de gran tamaño la zona central suele estar necrosada/inflamada por tanto debemos ir a los bordes.

Fig. 22

Fig. 123

Introducimos la aguja y aspiramos con una jeringuilla de 10 ml. Sacamos la aguja y la volvemos a introducir en otra dirección y aspiramos de nuevo. Una vez realizada la aspiración, separamos la aguja y llenamos la jeringuilla de aire. Ponemos la aguja de nuevo y vaciamos la jeringa en un porta (Fig. 22) Hacemos la extensión inmediatamente por el procedimiento de squash o aplastamiento (Fig. 23). Es decir, ponemos sobre el porta que contiene la

gota otro porta formando una cruz con el anterior y lo deslizamos suave y rápidamente. Dejamos secar y fijamos con metanol. Lo remitimos al laboratorio sin teñir. Se enviarán en portapreparaciones de plástico o envueltas en papel absorbente para acolcharlas. Si lo visualizamos nosotros se teñirá con técnicas Romanowsky. Biopsias: Materiales: Bisturí, tijeras, pinzas, punch, frascos herméticos, fijador (Fig.24). Métodos: Tamaño: El tamaño ideal de la muestra seria de 1cm x 1cm aproximadamente. En caso de muestras de mayor tamaño deberemos hacer cortes cada 1,5 cms perpendiculares al eje mayor o tomar varias muestras incluyendo los márgenes de extirpación (Fig. 25).

Fig. 24

Fig.25

Fijación: La fijación de las muestras para oncología se hace por métodos químicos (fijadores). El más común es el formol al 10%. Formol al 10%: Se prepara con 1 parte de formaldehído al 40% 9 partes de agua También puede substituirse el agua por solución salina fisiológica al 9% Hay otras fórmulas pero esta es la más común. Recipientes: Existen distintos tipos de recipientes, la única condición es que sea hermético y adecuado para la muestra (Fig. 26 y 27). Deberá ir perfectamente identificado.

Fig. 26

Fig. 27

Volumen de fijador: Deberá superar el volumen de la muestra en una proporción 20:1 o 40:1 Se debe sumergir el material en el fijador y no a la inversa para evitar el contacto de esta con las paredes y el fondo del recipiente, evitando que se adhiera. Si la muestra flotara (pulmón) la sumergiremos totalmente en el fijador. Duración de la fijación: Generalmente las muestras están fijadas a las 24-36 horas de haberlas introducido en el fijador. En formol las muestras no se alteran en semanas o meses. Protocolo: Las muestras deberán ir acompañadas de un protocolo con: Los datos del animal: nombre, raza, sexo, edad. Datos de la clínica o veterinario que la remite. Historia clínica. Localización: Día y hora de la extracción y fijación. Tratamientos empleados y respuestas a estos. Analíticas si las hubiera. Por favor recordad que enviáis la muestra a un citólogo o a un patólogo no a un adivino. Errores Figura 28 No es aconsejable el uso de frascos de cristal pues durante el transporte pueden ocurrir accidentes. El volumen del fijador no es el adecuado. La muestra no está fileteada en porciones de 1,5 cms, está entera. No está etiquetado o identificado el frasco

Fig.28

NO

Fig.29

NO Figura 29 El frasco es de plástico y hermético pero demasiado pequeño para la muestra. La muestra no está fileteada en porciones de 1,5 cm. No hay fijador en el frasco, está vacío. Bibliografía: Bush B.M.: Manual del Laboratorio Veterinario de Análisis Clínicos. Ed. Acribia BE Powers “The Pathology of Neoplasia” Small Animal Clinical Oncology 2.001-WD Saunders Co Cowell RL,Tayler RD: Diagnostic Cytology of dog and cat. Ed. American Veterinary publications, Inc 1.989 CowellRL, Tayler RD, Meinkoth JH: Diagnostic cytology and hematology of the dog and cat. Ed. Mosby 1.999 Davidsohn I. Henry J.B.: Diagnóstico clínico por el laboratorio. Ed. Salvat 6ª edición Martínez de Merlo, E.: Atlas de citología clínica del perro y el gato. Ed. Servet 2.008 Steven E. Weisbrode: “The Histopathology laboratory in Diagnosis of Neoplasia”