unidad didáctica 5. recuentos celulares. Los recuentos celulares son una serie de procedimientos que tienen por objeto determinar el número de cada uno de los tipos celulares que están comprendidos en una unidad de volumen de sangre (generalmente, en 1 mm3). Todos los recuentos celulares constan de 3 fases descritas a continuación. • Dilución de la sangre. • Cómputo del número de células. • Cálculo matemático del número de células presentes en 1 mm3 de sangre. Los recuentos celulares pueden realizarse mediante métodos manuales (recuentos en cámara) o automáticos (recuentos en contadores electrónicos), siendo éstos los dos bloques diferenciados en el presente tema. La primera opción, tal y como podremos descubrir a lo largo del tema, se encuentra actualmente en desuso debido al amplio margen de error de la técnica. Otro de los motivos a destacar es la falta de operatividad en los laboratorios actuales debido a la necesidad de tiempo invertido y elevado volumen de trabajo. 1. recuento manual o recuento en cámara. el recuento de los distintos elementos formes presentes en sangre, es una de las prácticas más antiguas en hematología. Siendo además muy útiles los resultados obtenidos en estos puesto que permiten la detección e alteraciones cuantitativas ( en la cantidad o número) de las distintas células sanguíneas. • Recuento de plaquetas. En determinadas situaciones patológicas ( alteraciones en el tamaño de las plaquetas) el recuento automático no resulta efectivo, puesto que el aumento de tamaño de dichas células no permite al aparato diferenciarlas de otras células sanguíneas de un tamaño mayor. • Estudio celular en otras muestras biológicas. Existen otras muestras biológicas ( líquido cefalorraquídeo, peritoneal y otros muchos), en los que a menudo es necesario llevar a cabo el recuento de hematíes o leucocitos que por situación patológica se encuentra en ellos. No se realiza automáticamente, sino que se opta por la práctica de un recuento en cámara. Por ello, además de por la inclusión de este apartado dentro de la Legislación Vigente para el presente Ciclo Formativo, procederemos al estudio de dicha técnica. • material necesario. cámara de neubauer. También se llama cámara cuentaglóbulos o hemocitómetro. Consiste en una placa gruesa de cristal con forma de porta, cuya porción central está dividida en 3 ejes perpendiculares al eje longitudinal de la cámara. De ellas, las dos laterales se hallan sobreelevadas 0.1 mm con respecto a la central, y en esta última hay grabado un retículo cuadrangular ( cámara simple). La banda central puede estar, a su vez, subdividida en 2 semi bandas idénticas y separadas por un surco paralelo al eje longitudinal de la cámara ( cámaras dobles). En cada una de estas dos semibandas hay grabado 1

un retículo idéntico que facilitará el recuento celular.

No todas las cámaras de recuento son iguales, la más utilizada en hematología es la cámara de neubauer. Se trata de una cámara doble, cuyos retículos ( 2 al tratarse de una cámara doble) se denominan retículos de neubauer. La siguiente figura muestra las dimensiones de dicho retículo:

Tal y como puede apreciarse en la figura, cada retículo se divide en nueve cuadrados grandes de 1mm de lado. Siendo los cuadrados de las esquinas los destinados al recuento de leucocitos ( al existir éstos en menor número que hematíes, se precisa menor número de líneas de referencia), a su vez dichos cuadrados se subdividen en 16 cuadrados denominados medianos de 0.25 mm de lado. El cuadrado central es el destinado al recuento de hematíes y plaquetas. Dicho cuadrado se subdivide en 25 cuadrados medianos ( 0.2mm de lado), y a su vez éstos se subdivide en 16 cuadros denominados pequeños. Por tanto el número total de cuadraditos constituyentes del cuadro central es de 400 cuadrados. cubreobjetos. Preferiblemente, debe ser algo más grueso que los normalmente utilizados. Se coloca de forma que apoye sobre las dos bandas laterales de la porción central de la cámara. De esta mane-ra, queda delimitado un espacio entre la banda central y el cubre en el que se deposita la muestra y cuyo espe-sor es de 0,1 mm. Algunas cámaras también constan de dos pinzas especiales que parten, cada una, de una de las porciones late-rales de la cámara y que tienen por misión la de asegurar la fijación del cubre a la misma.

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PIPETAS DILUIDORAS DE THOMA. Son unas pipetas especiales de cristal que constan de un largo tubo capilar graduado y de una dilatación ampular o bulbo. El tubo capilar termina en punta, a nivel de uno de sus extremos, y se continúa con el bulbo, a nivel del otro de sus extremos. Además, está dividido en 10 partes iguales, y en su superficie están especialmente bien mar-cadas la 5a división (con un 0,5) y la 10ª (con un 1). El bulbo contiene una perla de vidrio para facilitar la mezcla de la sangre con el líquido de dilución, y acaba en un tubo capilar corto. La perla de vidrio es roja en las pipetas empleadas para el recuento de hematíes, y blanca en las usadas para el recuento de leucocitos. Además, en las pipetas para hematíes la capacidad del bulbo es 100 veces superior a la del tubo capilar largo, por lo que en el tubo capilar corto hay una marca de 101, Y en las pipetas para leucocitos la capacidad del bulbo es 10 veces mayor que la del tubo capilar largo, por lo que en el tubo capilar corto hay una marca de 11.

GOMA DE ASPIRACIÓN Y BOQUILLA.

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Es un tubo de goma que permite la aspiración de la muestra y del líquido de dilución. En uno de sus extremos tiene encajada una boquilla, y por el otro se ensambla al tubo capilar corto de cual-quiera de las pipetas de Thoma. Al tubo se le aplica una boquilla por la cual el técnico procederá a la aspiración. Todo ello queda reflejado en la siguiente figura.

• reactivos. como reactivo se utiliza líquido de dilución. Existen varios tipos. Su composición varía según el tipo de células que se pretende contar. Los que se utilizan para el recuento de hematíes contienen cloruro sódico para hacerlos isotónicos con respecto al plasma y evitar, de esta forma, la hemólisis. Pero algunos incorporan también anticoagulantes como el citrato de sodio, e incluso antisépticos como la formalina. Los que se emplean para el recuento de leucocitos contienen una sustancia, como el ácido acético glacial que rompe los hematíes y un colorante, como el violeta de genciana, que tiñe el núcleo de los leucocitos. Los que se usan para el recuento de plaquetas pueden incorporar una sustancia hemolítica y un antiagregan-te plaquetario. Los líquidos diluyentes más utilizados son el de Hayem, para el recuento de hematíes, y el de Turck, para el recuento de leucocitos. • muestra problema. Sangre capilar o venosa anticoagulada con EDTA. Esta sangre se utilizará convenientemente diluida. • limpieza del material. Con respecto a la limpieza de la cámara de neubauer, tras su uso, ha de ser aclarada con agua tibia y posteriormente debe secarse con un paño suave y limpio dejándola al aire. Tras el empleo de las pipetas de Thoma, éstas deben lavarse interiormente del siguiente modo:

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• Primero, haciendo pasar a través de ellas agua corriente, una vez. • Luego, haciendo pasar a través de ellas agua destilada, 3 veces. • Finalmente, haciendo pasar a través de ellas acetona o alcohol de 95°, otra vez. Tras ello, ha de secarse su interior, preferentemente mediante un secador de aire. • GENERALIDADES ACERCA DEL RECUENTO MANUAL. Atendiendo al elemento forma del cual queramos llevar a cabo el recuento, además de utilizar un líquido de dilución diferente, la dilución a realizar también será distinta, lo cual se encuentra directamente relacionado con el número de cada tipo celular presente en la muestra sanguínea en condiciones normales. Las diluciones a realizar en cada caso, así como las indicaciones para la correcta práctica de la dilución y llenado de la cámara se expondrán en las prácticas correspondientes en cada caso. Como generalidad importante, debemos citar que en todos los casos, una vez llevemos a cabo el recuento de las células correspondientes en las regiones apropiadas de la cámara ( dependiendo del tipo celular objeto de estudio), los resultados deben ser referidos a un volumen ( lo conseguimos al conocer las dimensiones del retículo y cómo no la altura de la cámara) y al tiempo ser corregidos por el factor de dilución utilizado. Sólo de este modo expresaremos los resultados tal y como es debido: número de células ( leucocitos, hematíes o plaquetas) / mm3. Por otro lado, es necesario remarcar el amplio margen de error presentado por el método que nos ocupa en estos momentos. La técnica de recuento manual se caracteriza presentar un alto margen de error motivado por: • Errores en la práctica de la dilución. • Contaminación del líquido de dilución. • Error en el montaje y / o llenado de la cámara. • Error en los cálculos a realizar. • Error en el recuento propiamente dicha. El margen de error puede disminuirse con una buen práctica y destreza del operador, pero existe una sistemática a seguir para evitar o disminuir el error en el recuento propiamente dicho, puesto que de no ser así, sería sencillo que una célula fuese contada por partida doble o a la inversa. La sistemática a seguir es la siguiente: El recuento presupone un conocimiento exacto de las líneas límite de las cámaras de conteo utilizadas. Éstas se pueden ver en la ilustración. Para que las células, que están en o cerca de las líneas de limitación, no se cuenten dos veces o se sobrepasen en el conteo, hay que atenerse a determinadas reglas. Se cuentan todas las células dentro de una zona de medición definida. También se cuentan las células (marcadas en negro), que se apoyan o tocan en las 2 caras: la línea de medida izquierda y superior. Esto también es válido para el tipo de la operación de conteo propiamente dicha, que debe efectuarse en forma 5

de meandro.

El recuento se efectúa en el ángulo superior izquierdo en dirección de la flecha.

2. RECUENTO AUTOMÁTICO: CONTADORES ELECTRÓNICOS. Los autoanalizadores hematológicos o contadores electrónicos, son actualmente la opción en los laboratorios modernos. El margen de error obtenido mediante los métodos manuales, el cual oscila en torno al 20%, se ve disminuido enormemente con el desarrollo de estos aparatos, siendo el margen de error en torno o incluso inferior al 1%. Tal y como se podrá observar a lo largo de este apartado, como norma general los contadores electrónicos no se limitan a llevar a cabo el recuento celular de los distintos elementos formes. Por lo general proporcionan los resultados de todos y cada uno de los parámetros constituyentes del hemograma. 6

2.1. COMPONENTES QUE CONSTITUYEN EL CONTADOR ELECTRÓNICO. DILUIDOR. Disminuye la concentración de la sangre hasta el nivel adecuado para el funcionamiento del contador. Generalmente diluye poco para el recuento de leucocitos (por ejemplo, a 1/300 en el contador ABX MICRO-SOT) y mucho para el recuento de hematíes (por ejemplo, a 1/20.000 en el contador ABX MICROSOT). La dilución realizada por dicho elemento variará dependiendo del contador electrónico en cuestión, aunque todo ello no es necesario que sea tenido en cuenta en el trabajo del técnico. Como líquido diluyente utiliza una solución isotónica con capacidad conductora. COMPRESOR− ASPIRADOR. Aporta la presión y el vacío necesarios para transportar la sangre, convenientemente diluida, al dispositivo de medida. DISPOSITIVO DE MEDIDA. Es la cámara donde se cuentan realmente las células sanguíneas (cámara de medida o de lectura). Su diseño depende del método de recuento utilizado por cada modelo de contador. Puede basarse en un sistema de detección celular por medida de la impedancia o en sistemas ópticos de detección celular. En los contadores electrónicos más avanzados, una válvula de cerámica reparte la muestra hacia distintas cámaras de medida. Cada cámara de medida está especialmente diseñada para el recuento de un tipo celular (glóbulos rojos, leucocito s o plaquetas) o para ]a determinación de hemoglobina. TRANSDUCTOR. Transforma las señales, procedentes del dispositivo de medida, en impulsos eléctricos. Suele ser un fotomultiplicador. DISCRIMINADOR. Diferencia los impulsos eléctricos generados por cada uno de los tipos de células sanguíneas. PROCESADOR. Recoge los datos obtenidos, los procesa y los proyecta en una pantalla. REGISTRADOR. Imprime en papel los resultados conseguidos. 2.2. MÉTOTODOS ELECTRÓNICOS DE RECUENTO CELULAR. Cada contador electrónico, se basa en su propio fundamento para obtener los resultados. En este apartado trataremos de adentrar al alumno en el interior del autoanalizador, para que trate de entender cómo se hace posible el recuento. 7

Lógicamente, no se recogen todos y cada uno de los fundamentos existentes, pero si los más habituales e importantes. 2.2.1. MÉTODO DE LA RESISTENCIA ELÉCTRICA O DE LA IMPEDANCIA. Es el utilizado por los primeros contadores, ya que fue descubierto por Coulter en 1956. Se basa en lo siguiente: • Mientras que las células sanguíneas conducen mal la electricidad, el líquido diluyente es un buen conductor de la electricidad (posee una gran conductividad eléctrica). • El dispositivo de medida consiste en un pequeño orificio, a través del cual se hace pasar la sangre diluida. Tiene colocados un electrodo a su entrada y otro a su salida. • También se hace pasar una corriente eléctrica constante a través de ese mismo orificio. • Si el orificio es atravesado solamente por líquido diluyente, la resistencia eléctrica medida por los electrodos es mínima y constante, pero cuando el orificio es atravesado por una célula sanguínea, se produce un aumento de la resistencia eléctrica y un cambio de potencial entre los electrodos. • El número de señales eléctricas generadas indica el número de células presentes en la sangre y la amplitud de estas señales es directamente proporcional al volumen celular. De este modo es posible la identificación de las células y por tanto el recuento. 2.2.2. MÉTODO DE LA DISPERSIÓN DE LA LUZ O DE LA DIFRACCIÓN. MÉTODO DEL CAMPO OSCURO. El dispositivo de medida consiste en un capilar por el que circula la sangre diluida y que es atravesado por un haz de luz halógena. Cuando no pasan células a lo largo del capilar, el haz de luz incide sobre una zona no sensible (disco campo oscuro); pero si una célula pasa a través del capilar, dispersa los rayos del haz luminoso hacia afuera del disco, donde son captados por un fotodetector. El número de señales luminosas detectado indica el número de células presentes en la sangre, y la intensidad de la dispersión luminosa producida por cada una de ellas es directamente proporcional al tamaño y contenido de las células, siendo de este modo posible la identificación y por tanto el recuento. MÉTODO DEL RAYO LÁSER. El dispositivo de medida consta de un detector situado detrás de un capilar por el que circula un flujo continuo de sangre diluida; es pues un citómetro de flujo. Un rayo láser atraviesa el capilar y se dirige hacia el detector. Cuando no pasan células a lo largo del capilar, el rayo láser incide sobre el detector, pero si una célula pasa a través del capilar, el rayo láser es interceptado por ella y deja de incidir sobre el detector. El número de interferencias indica el número de células presentes en la sangre, y el grado de interferencia que produce cada célula a su paso es directamente proporcional a su tamaño. En estos contadores, la luz láser puede ser, por ejemplo, un láser de helio−neón polarizado verticalmente a una longitud de onda de 632,8 nm (el empleado en los contadores CELL−DYN 3000 y 3500 de los 8

Laboratorios Abbott). 2.3. PARÁMETROS QUE DETERMINA UN CONTADOR ELECTRÓNICO. Los modernos contadores electrónicos pueden llegar a determinar hasta más de 50 parámetros. Entre éstos cabe destacar los siguientes: • Número de hematíes por mm3 de sangre. • Porcentaje de reticulocitos. • Número de leucocitos por mm3 de sangre. • Fórmula leucocitaria. • Número de plaquetas por mm3 de sangre. • Índices hematimétricos (eritrocitarios, reticulocitarios, leucocitarios y plaquetarios). • Valor hematocrito. • Concentración de hemoblobina en la sangre. • Velocidad de sedimentación globular. Todos estos parámetros constituyen las determinaciones analíticas incluidas en el hemograma o también denominado perfil hematológico básico, del cual trataremos en temas sucesivos. LDC− Hematologia U.D. 5 −7−

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