INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES RESPIRATORIAS ISMAEL COSÍO VILLEGAS

REGLAMENTO INTERNO DE LA UNIDAD DE CITOMETRÍA

NOVIEMBRE, 2014

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FECHA DE AUTORIZACIÓN DÍA MES AÑO 27 11 2014

HOJA No.

ÍNDICE

Página INTRODUCCIÓN

2

I.

OBJETIVO DEL REGLAMENTO DE LA UNIDAD DE CITOMETRÍA

3

II.

EQUIPOS

4

III. MARCO JURÍDICO

5

IV. REGLAS GENERALES DE LA UNIDAD DE CITOMETRÍA

9

V.

11

DERECHOS DE LOS USUARIOS

VI. RESPONSABILIDADES DE LOS USUARIOS VII. SANCIONES POR INCUMPLIMIENTO AL REGLAMENTO DE LA UNIDAD DE CITOMETRÍA

12 14

VIII. INTEGRANTES DE LA COMISIÓN DE LA UNIDAD DE CITOMETRÍA

15

IX.

RESPONSABILIDADES DE LA COMISIÓN DE LA UNIDAD DE CITOMETRÍA

16

X.

RESPONSABILIDADES DEL RESPONSABLE DE LA UNIDAD DE CITOMETRÍA

17

XI.

ANEXOS

18

XII. GLOSARIO

31

XIII. VALIDACIÓN DE LA COMISIÓN DE LA UNIDAD DE CITOMETRÍA

33

XIV. AUTORIZACIÓN DEL REGLAMENTO DE LA UNIDAD DE CITOMETRÍA

34

1

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HOJA No. 2

INTRODUCCIÓN

La Unidad de Citometría del INER se ha formado por iniciativa de la Comisión de la misma, con la finalidad de que el Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias Ismael Cosío Villegas como Institución de tercer nivel cuente con una Unidad de Servicios de Citometría accesible a todos los investigadores del Instituto, así como a usuarios externos. La Unidad de Citometría del INER se encuentra anexa al Laboratorio de Inmunología Integrativa de la Dirección de Investigación. El objetivo de la Unidad es hacer posible el uso de la citometría y la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) con muestras de personas con distintas enfermedades incluyendo las infecciosas transmisibles en condiciones apropiadas de seguridad biológica. El documento está integrado por un conjunto de reglas emitidas por la Comisión de la Unidad de Citometría, Dirección de Investigación y revisado por el Departamento de Planeación. La elaboración del reglamento es responsabilidad de la Comisión de la Unidad de Citometría con autorización de la Dirección de Investigación. Cabe señalar que el Reglamento de la Unidad de Citometría deberá ser revisado y actualizado conforme a las necesidades del área y a los lineamientos que dictan las jerarquías superiores.

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HOJA No. 3

I. OBJETIVO DEL REGLAMENTO DE LA UNIDAD DE CITOMETRÍA

El presente Reglamento tiene por objeto establecer las directrices para el uso correcto y óptimo de los equipos de la Unidad de Citometría del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias, Ismael Cosío Villegas.

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HOJA No. 4

II. EQUIPOS

II.1 EQUIPO FACS ARIA II Analizador y Sorteador de muestras de donadores sanos, animales de laboratorio o células inactivadas de pacientes o células inactivadas de animales con infecciones transmisibles. El equipo tiene un láser violeta 405nm, un láser azul 488nm y un láser rojo 633nm; tiene capacidad de detectar 9 fluorescencias (colores) y 2 parámetros de dispersión de la luz (FSC y SSC) simultáneamente. Este citómetro cuenta con la posibilidad de sortear hasta cuatro poblaciones diferentes al mismo tiempo en tubos. También tiene la posibilidad de sortear en placas de 6, 12, 24, 48 y 96 pozos. Cuenta con el software DIVA 6.2. (Ver Anexo XI.1 Configuración de Equipo FACS ARIA II).

II.2 EQUIPO FACS JAZZ Analizador y sorteador con un láser rojo 640nm y un láser azul 488nm; 6 colores y 2 parámetros de dispersión de luz (FSC y SSC) simultáneamente (Ver Anexo XI.3, Configuración de Equipo FACS JAZZ). Este citómetro se encuentra contenido en un gabinete de bioseguridad clase II A2, lo que permite sortear muestras infecto-contagiosas en condiciones de contención biológica. Este citómetro cuenta con la posibilidad de sortear hasta dos poblaciones diferentes al mismo tiempo en tubos. También tiene la posibilidad de sortear en placas de 6, 12, 24, 48 y 96 pozos, cuenta con sorfware “Sortware”.

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III. MARCO JURÍDICO

Constitución Política de los Estados Unidos Mexicanos. D.O.F. 05-II-1917. Ref. 07-VII-2014. Leyes Ley General de Salud. D.O.F. 07-II-1984. Ref. 04-VI-2014. Ley Federal de Procedimiento Administrativo. D.O.F. 04-VIII-1994. Ref. 09-IV-2012. Ley de Adquisiciones, Arrendamientos y Servicios del Sector Público. D.O.F. 04-I-2000. Ref. 16-I-2012. Ley de Obras Públicas y Servicios Relacionados con las Mismas. D.O.F. 04-I-2000. Ref. 09-IV-2012. Ley General de Protección Civil. D.O.F. 12-V-2000. Ref. 03-VI-2014. Ley de los Institutos Nacionales de Salud. D.O.F. 26-V-2000. Ref. 30-V-2012. Ley Federal de Responsabilidades Administrativas de los Servidores Públicos. D.O.F. 13-III-2002. Ref. 14-VII-2014. Ley Federal de Transparencia y Acceso a la Información Pública Gubernamental. D.O.F. 11-VI-2002. Ref. 14-VII-2014.

HOJA No. 5

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Ley Federal para Prevenir y Eliminar la Discriminación. D.O.F. 11-VI-2003. Ref. 20-V-2014. Ley General para la Igualdad entre Mujeres y Hombres. D.O.F. 02-VIII-2006. Ref. 14-XII-2013. Ley General de Acceso de las Mujeres a una Vida Libre de Violencia. D.O.F. 01-II-2007. Ref. 02-IV-2014. Ley General para la inclusión de las personas con discapacidad. D.O.F. 30-V-2011. Ley General de Protección Civil. D.O.F. 3-VI-2014. Ley de Asistencia Social D.O.F. 02-IX-2004. Ref. 23-IV-2013. Ley General de Víctimas. D.O.F. 09-I-2013. Ref. 03-V-2013. Códigos Código Civil Federal. D.O.F. 26-V-1928. Ref. 24-XII-2013. Código Penal Federal. D.O.F. 14-VIII-1931. Ref. 14-VI-2014. Código Federal de Procedimientos Civiles. D.O.F. 24-II-1943. Ref. 09-IV-2012.

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HOJA No. 6

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HOJA No. 7

Código Federal de Procedimientos Penales. D.O.F. 30-VIII-1934. Ref. 14-VI-2014. Reglamentos Reglamento de la Ley Federal de Transparencia y Acceso a la Información Pública Gubernamental. D.O.F. 11-VI-2003. Ref. 11-VI- 2003. Reglamento de la Ley General de Acceso de las Mujeres a una Vida Libre de Violencia. D.O.F. 25-XI-2013. Reglamento de la Ley General para Prevenir, Sancionar y Erradicar los Delitos en Materia de Trata de Personas y para la Protección y Asistencia a las Víctimas de estos Delitos. D.O.F. 23-IX-2013. Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud. D.O.F. 06-I-1987. Ref. 02-IV- 2014.

NORMAS OFICIALES Norma Oficial Mexicana NOM-024-SSA3-2012, Que establece los objetivos funcionales y funcionalidades que deberán observar los productos de Sistemas de Expediente Clínico Electrónico para garantizar la interoperabilidad, procesamiento, interpretación, confidencialidad, seguridad y uso de estándares y catálogos de la información de los registros electrónicos en salud. D.O.F. 30-II-2012. Norma Oficial Mexicana NOM-004-SSA3-2012, Del expediente clínico. D.O.F. 15-X-2012. Ref. 13-XI-2013.

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HOJA No. 8

NOM-012-SSA3-2012, Que establece los criterios para la ejecución de proyectos de investigación para la salud en seres humanos. D.O.F. 04-I-2013. Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-2002, Que establece los requisitos para la separación, envasado. Almacenamiento, recolección, transporte, tratamiento y disposición final de los residuos peligrosos biológico-infecciosos que se generen en establecimientos que presten atención médica. D.O.F. 1-XI-2011. Norma Oficial Mexicana NOM-019-STPS-2011, Constitución, integración,organización y funcionamiento de las comisiones de seguridad e higiene. D.O.F. 13-IV-2011. NORMA Oficial Mexicana NOM-017-STPS-2008, Equipo de protección personal-Selección, uso y manejo en los centros de trabajo. D.O.F. 09-XII-2008. NOTA: El presente marco normativo incorpora disposiciones vigentes al momento de su elaboración, con independencia de la expedición y/o modificación de disposiciones realizadas de manera posterior, particularmente de aquellas cuya vigencia queda sujeta al ejercicio fiscal en curso.

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HOJA No. 9

IV. REGLAS GENERALES

1.

El horario de servicio de la Unidad de Citometría será de lunes a viernes de 9:00 a 17:00 horas.

2.

Las solicitudes de uso se atenderán únicamente en fecha y hora en la cual fueron solicitadas.

3.

En el caso de que fuera indispensable usar algún equipo fuera del horario establecido, se debe avisar al Responsable, quien decidirá si designa a un suplente de la sesión fuera de horario o permanece en ella. Para la realización de la actividad será indispensable la presencia del Responsable o del suplente asignado.

4.

No se podrán dar llaves de la Unidad para acceder a los equipos en ausencia del Responsable, salvo en las condiciones mencionadas en el punto anterior. El Responsable reportará inmediatamente cualquier irregularidad en el acceso a la Unidad a la Comisión, a la Subdirección de Investigación Biomédica o a la Dirección de Investigación.

5.

Únicamente está permitido el uso de los equipos al usuario autorizado en el horario determinado con la presencia del Responsable o suplente de la Unidad de Citometría.

6.

Tendrán acceso a los equipos de la Unidad usuarios internos y externos. El acceso deberá ser supervisado por el Responsable de la Unidad o suplente asignado; siempre y cuando los equipos hayan sido puestos en funcionamiento, calibrados (verificados para control de calidad) por este Responsable.

7.

En caso de una falla o problema del equipo se debe informar inmediatamente al Responsable. Se solicita que el equipo con fallas no sea utilizado y que no se intente repararlo.

8.

Los equipos de la Unidad se utilizarán para adquisición de muestras y sorting, no para análisis de datos.

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HOJA No. 10

9. Es recomendable que los usuarios tengan conocimiento sobre los parámetros adecuados para la lectura de sus muestras, particularmente los voltajes. Esto lo pueden definir con la asesoría de los usuarios capacitados. Contarán también con la asesoría del Responsable o suplente asignado por el responsable en caso de ausencia. Las asesorías se darán preferentemente fuera de las sesiones de uso de equipo, para optimizar el tiempo disponible para otros usuarios. 10. Ningún usuario podrá ofrecer servicios o promocionar la Unidad de Citometría a terceros si no cuenta con aprobación de la Comisión o el Responsable de la Unidad, toda vez que los datos personales se encuentran previstos en la Ley del IFAI. 11. No se podrán realizar grabaciones o filmaciones promocionales para difusión, si no se cuenta con la autorización de la Comisión o Responsable. 12. No se podrá hacer uso de las instalaciones para juntas, reuniones o actividades de índole personal de los usuarios y/o ajenas a la Unidad de Citometría. 13. La Unidad estará vigilada constantemente por una cámara de video a cargo del Departamento de Informática.

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HOJA No. 11

V. DERECHOS DE LOS USUARIOS 1. Todos los usuarios tendrán acceso a los citómetros. 2. Todos los usuarios tendrán derecho a llevarse los datos generados en su sesión de trabajo y serán responsables del uso de esta conforme a la Ley Federal de Transparencia y Acceso a la Información Pública Gubernamental y su reglamento. 3. El tiempo de uso del equipo lo definirá el usuario justificando el tiempo requerido.

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HOJA No. 12

VI. RESPONSABILIDADES DE LOS USUARIOS

1. Los usuarios externos deberán enviar un oficio de petición dirigida a la Comisión de la Unidad de Citometría para solicitar el acceso a los equipos de la Unidad. 2. Todos los usuarios tendrán la responsabilidad de respetar su horario asignado así como la sesión del siguiente usuario. 3. Los usuarios deberán programar el uso del (los) equipo (s) solicitado (s) con al menos un día de anticipación. Para ello, los usuarios deberán registrarse en la agenda correspondiente al equipo solicitado en la Unidad, el día y el horario en que se trabajará y el cual deberán respetar. Nota: En el caso del FACS JAZZ, se pide una anticipación de un día, debido a que la preparación que requiere el equipo toma más tiempo. Pueden requerirse ajustes adicionales durante la sesión de uso. El Responsable de la Unidad supervisará estos posibles ajustes. 4. En caso de requerir la cancelación del horario previamente reservado, ésta deberá hacerse con el mayor tiempo posible, al menos 3 horas antes de iniciar su sesión programada, para estar en posibilidad de ceder la sesión a otro usuario. 5. Al finalizar la última sesión de trabajo o si el siguiente usuario comience dos horas después o más, el equipo deberá apagarse. 6. La preparación de las muestras será responsabilidad del usuario, quien debe llevar sus muestras listas para la adquisición y/o separación. 7. Al terminar la sesión de adquisición, los usuarios deberán guardar sus archivos FCS 3.0 en discos CD o DVD por lo que serán los únicos responsables de tener su respaldo de datos. El Responsable del citómetro determinará cuándo es necesario liberar espacio en el browser de DIVA pues, en caso de saturarse puede entorpecer el funcionamiento del equipo.

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HOJA No. 13

8. Al término de la sesión de adquisición será responsabilidad del usuario consultar la agenda para identificar si debe dejar encendido o apagar el equipo. Si va a continuar otro usuario deberá dejarlo encendido y será responsabilidad del siguiente usuario apagarlo, siguiendo las instrucciones correspondientes. 9. Los usuarios que cuenten con capacitación para el manejo del equipo FACS ARIA II, la cual puede ser impartida por el Responsable de la Unidad, el especialista de aplicaciones del fabricante (Becton Dickinson) o algún especialista certificado, asesorarán a los usuarios de sus Departamentos. Esta asesoría consistirá en: medios aceptables para la resuspensión final de células, fluorocromos que requerirán una limpieza posterior del equipo, fluorocromos compatibles, necesidad de fijación e inactivación de las células, condiciones de fijación e inactivación, parámetros básicos para la adquisición de datos (valores de FSC, SSC), tubos de compensación y otros controles, así como procedimientos especiales como lavados, de acuerdo al tipo de tinción. 10. El usuario cumplirá las indicaciones del Responsable de la Unidad para el encendido, lavado, eliminación de desechos y apagado del equipo. Estas instrucciones estarán a la vista del usuario pegadas cerca del equipo en uso, esto con la finalidad de garantizar el uso óptimo del equipo. Ver Anexo XI.2 FACS ARIA II y Anexo XI.4 FACS JAZZ.

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HOJA No. 14

VII. SANCIONES POR INCUMPLIMIENTO AL REGLAMENTO DE LA UNIDAD DE CITOMETRÍA

1. Cuando un usuario interno o externo no cumpla con las reglas y procedimientos establecidos en este reglamento se dará conocimiento al Departamento de Relaciones Laborales para que de ser el caso se inicie el procedimiento administrativo laboral correspondiente o en su efecto se notificará al Órgano Interno de Control.

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HOJA No. 15

VIII. INTEGRANTES DE LA COMISIÓN DE LA UNIDAD DE CITOMETRÍA La comisión de la Unidad de Citometría se compone de investigadores que forman parte de distintos Departamentos de la Dirección de Investigación del INER, integrada por: Dr. Joaquín A. Zúñiga Ramos, Subdirector de Investigación Biomédica. Dr. Enrique Espinosa Arciniega, Jefe del Departamento de Investigación en Inmunología. Dra. Blanca Ortiz Quintero, Departamento de Bioquímica. Dra. María Isabel Sada Ovalle, Jefa del Laboratorio de Inmunología Integrativa. Dr. José G. Cisneros Lira, Laboratorio de Biología Celular, Departamento Fibrosis Pulmonar. Dra. Criselda Mendoza Milla, Laboratorio de Biología Celular, Departamento Fibrosis Pulmonar. Q.F.B. Dámaris Priscila Romero Rodríguez, Responsable de la Unidad de Citometría, Subdirección de Investigación Biomédica. Suplentes del Responsable de la Unidad de Citometría: Dra. Criselda Mendoza Milla. Laboratorio de Biología Celular, Departamento Fibrosis Pulmonar. Dra. Blanca Ortiz Quintero. Departamento de Bioquímica. Dr. Francisco Urrea Ramírez. Departamento de Bioquímica. Biól. Alfredo Cruz Lagunas. Departamento de Investigación en Inmunología. Mtro. Gustavo Olvera García. Departamento de Investigación en Inmunología.

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HOJA No. 16

IX. RESPONSABILIDADES DE LA COMISIÓN DE LA UNIDAD DE CITOMETRÍA 1. La Comisión de la Unidad de Citometría decidirá la ubicación, ampliación, las políticas de acceso, uso y mantenimiento (incluyendo limitación de acceso) de la Unidad y sus equipos. 2. Nombrará al Responsable de la Unidad de Citometría así como a los suplentes de la misma. 3. Decidirá cualquier cambio a este Reglamento. 4. Promoverá que los equipos se mantengan disponibles, siguiendo este reglamento, para la comunidad científica. 5. Promoverá que haya usuarios capacitados por el personal especializado en el mayor número posible en los Departamentos de la Dirección de Investigación del Instituto, sin que el uso sea exclusivo de estos usuarios. 6. Evaluará las solicitudes de acceso de usuarios externos del INER para su posible autorización. 7. Los Comisión de Citometría suministrará las perlas de calibración Cytometer Setup and Tracking (CST) marca BD; las perlas Accudrop Flourescent Beads (Accudrop) marca BD; las perlas Sphero Ultra Rainbow Fluorescent Particles URFP-30-20 107/mL, 3.0-3.4 um (Sphero) marca Spherotech, para el control de calidad y calibración rutinaria de los equipos. 8. En caso de daño físico intencionado a cualquiera de los equipos por parte de algún usuario, se considerará daño patrimonial al Instituto; por lo tanto, la Comisión de la Unidad de Citometría notificará al Departamento de Relaciones Laborales para que gestione el proceso administrativo laboral correspondiente o en su efecto se notificará al Órgano Interno de Control. 9. La Comisión de la Unidad de Citometría recibirá del Responsable de la Unidad las pruebas documentales, del registro físico (“bitácora”) de que el usuario ocupó el equipo, el tiempo de uso, tipo de muestra analizada, condiciones de inicio y condiciones de apagado.

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HOJA No. 17

X. RESPONSABILIDADES DEL RESPONSABLE DE LA UNIDAD DE CITOMETRÍA 1. El Responsable de la Unidad de Citometría dará un servicio de 9:00 am a 17:00 pm de lunes a viernes. 2. El Responsable informará sobre cualquier irregularidad encontrada en los equipos a la Comisión de la Unidad de Citometría y Dirección de Investigación. También dará aviso al personal encargado de la vigilancia de la cámara. 3. El Responsable de la Unidad reportará cualquier irregularidad en el acceso a la Unidad a la Comisión, Subdirección de Investigación y Dirección de Investigación. 4. El Responsable de la Unidad realizará las calibraciones diarias para garantizar el buen funcionamiento de los equipos, así como la línea base cada vez que se cambie de lotes de perlas CST. 5. En caso indispensable de usar un equipo fuera del horario establecido, el Responsable de la Unidad de Citometría decidirá si se designa a un suplente o este permanece en ella. 6. El Responsable de la Unidad llevará un registro físico en bitácora, del usuario que ocupó el equipo, tiempo de uso, tipo de muestra, condiciones de inicio y condiciones de apagado de los equipos. 7. El Responsable de la Unidad llevará un registro electrónico de las calibraciones para el FACS ARIA II y un registro físico en bitácora para las calibraciones del FACS JAZZ. 8. El Responsable de la Unidad llevará un registro físico de todos los mantenimientos preventivos y correctivos de ambos equipos. 9. El Responsable de la Unidad dará un informe semestral a la Comisión de la Unidad de Citometría sobre la cantidad de servicios prestados, insumos consumidos y necesidades de la Unidad.

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XI. ANEXOS XI.1 CONFIGURACIÓN DE EQUIPO FACS ARIA II Laser azul 488nm A 780/60 B 695/40 C 610/20 D 575/26 E 530/30 F G H Laser Rojo 633nm A 780/60 B 660/20 C -----Laser Violeta 405nm A 530/ 30 B 450/40

Long pass 735LP 655LP 595LP 556LP 502LP 488/10 ------Long pass 735LP --------Long Pass 502LP -----

Fluorocromos PE-Cy7 PerCP, PeCy5, PerCP-Cy5.5 Pe Texas Red, 7AAD PI, PE FITC, AF488, CFSE, GFP SSC ------Fluorocromos APC-Cy7, APC-H7 APC, AF647 ----Fluorocromos Amcyan, Aqua dye, UV500 DAPI, Pacific Blue, Cascade Blue, UV450

C----

-----

-----

HOJA No. 18

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HOJA No. 19

XI.2 EQUIPO FACS ARIA II.

Para la utilización del equipo FACS ARIA II se deberá:

a)

Encendido

1.

Encender el equipo (el Ups siempre estará encendido), asegurarse de que los tres láseres estén encendidos.

2.

Encender la computadora y entrar a DIVA con la clave BDIS.

3.

Entrar a la sesión del usuario autorizado con su propia clave.

4.

Revisar los niveles de los fluidos, llenar en caso de ser necesario.

5.

Hacer fluidics start up siguiendo las indicaciones que el equipo muestra en pantalla.

6.

Asegurarse que el nozzle sea del tamaño adecuado.

7.

Encender el stream y ajustarlo de ser necesario.

8.

Hacer CST, verificando que el lote de perlas coincida con la línea base.

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b) Desechos

1.

Cada vez que se deseche a la tarja el contenido del tanque de desechos o waste, el usuario deberá poner 1 litro de hipoclorito de sodio y dejar inactivando por lo menos 20 minutos.

2.

Los usuarios serán responsables de llevarse sus tubos de desecho y desecharlos de la manera apropiada.

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c)

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HOJA No. 21

Apagado

1.

Lavar el citómetro en modo de adquisición con FACS Clean por cinco minutos en flow rate 11.

2.

En caso de haber usado yoduro de propidio se lavará primero con etanol al 70% por 10 minutos y posteriormente con FACS Clean por cinco minutos.

3.

Posteriormente se pasará agua desionizada por cinco minutos.

4.

Apagar el stream.

5.

Hacer Fluidics Shut down siguiendo las indicaciones del equipo que se muestran en pantalla.

6.

Apagar el citómetro.

7.

Apagar la computadora.

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HOJA No. 22

XI.3 CONFIGURACIÓN DE EQUIPO FACS JAZZ

Laser azul 488nm

Long pass

Fluorocromos

A ---B 692/40

750LP 645LP

PE-Cy7 PerCP, PeCy5, Cy5.5

C ----

----

----

D 585/29 E 530/40

550LP 505LP

PI, PE FITC, AF488, CFSE, GFP

F

488/10

SSC

G

----

----

H

----

----

Laser Rojo 642nm

Long pass

Fluorocromos

A ------

750LP

APC-Cy7, APC-H7

B 660/20 C ------

---------

APC, AF647 -----

PerCP

-

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HOJA No. 23

XI.4 EQUIPO FACS JAZZ Para la utilización del Equipo FACS JAZZ se deberá: a)

Encendido 1.

Encender el gabinete de bioseguridad y esperar 5 minutos a que recircule el aire dentro del gabinete.

2.

Encender UPS.

3.

Encender caja electrónica.

4.

Encender el switch de aire en el citómetro.

5.

Permitir que los láseres se calientes al menos 15 minutos antes de correr el Daily QC.

6.

Encender Workstation.

7.

Acceder al Programa (icono de BD) dando click en connect.

8.

Verificar que las ventanas workspace, sortviewpane y pressure control estén abiertas.

9.

Ir a File, Restore, Worspace y Seleccionar Daily QC.

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HOJA No. 24

b) Verificación de fluidos

1.

Llenar el tanque del sheath hasta un nivel de 5 litros, verificar que el waste este vacío y adicionar 500ml de hipoclorito al 7%.

2.

Verificar que la línea de aire y línea de sheath estén conectadas al tanque del sheath.

3.

Reconectar el filtro del sheath.

4.

Encender el compresor del aire y el compresor de vacío.

5.

Verificar las presiones de los tanques, 27psi para el sheath y 5-15Hg para el waste.

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c)

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HOJA No. 25

Encendido en húmedo del sistema

1.

Retirar la bubble reservoir y el flush bucket.

2.

Quitar la nozzle y sonicar 1 minuto en agua destilada.

3.

Colocar la nozzle en la nozzle nut con ayuda de una jeringa con filtro.

4.

Enroscar la nozzle debajo de la nozzle assembly y colocar el fllush bucket debajo de la nozzle.

9.

5.

Dar click en el botón rinse y verificar que la línea este llena de sheath.

6.

Parar el Rinse una vez llenas las líneas.

7.

Encender el stream y enceder el backflush por 20 segundos para llenar la línea de fluido.

8.

Apagar el stream. Instalar el bubble reservoir lleno de agua desionizada debajo de la nozzle y dar click en purge.

10. Click en pulse para ayudar a liberar las burbujas. 11. Verificar que no haya burbujas en el sistema y encender el stream. 12. Retirar el bubble reservoir y el flush bucket. 13. Remover el exceso de fluido de la nozzle. Es importante no limpiarla con sanitas o cotonetes de algodón pues corre el riesgo de taparse por una pelusa.

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HOJA No. 26

d) Encendido en húmedo del sistema

1.

Retirar la bubble reservoir y el flush bucket.

2.

Quitar la nozzle y sonicar 1 minuto en agua destilada.

3.

Colocar la nozzle en la nozzle nut con ayuda de una jeringa con filtro.

4.

Enroscar la nozzle debajo de la nozzle assembly y colocar el fllush bucket debajo de la nozzle.

5.

Dar click en el botón rinse y verificar que la línea este llena de sheath.

6.

Parar el Rinse una vez llenas las líneas.

7.

Encender el stream y enceder el backflush por 20 segundos para llenar la línea de fluido.

8.

Apagar el stream.

9.

Instalar el bubble reservoir lleno de agua desionizada debajo de la nozzle y dar click en purge.

10. Click en pulse para ayudar a liberar las burbujas. 11. Verificar que no haya burbujas en el sistema y encender el stream. 12. Retirar el bubble reservoir y el flush bucket. 13. Remover el exceso de fluido de la nozzle. Es importante no limpiarla con sanitas o cotonetes de algodón pues corre el riesgo de taparse por una pelusa.

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e)

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HOJA No. 27

Control de Calidad diario (Daily QC)

1.

Alineación del stream hacia los pinholes y alineación del stream al drain.

2.

Optimizar el canal de flourescencia del láser primario (azul). Nota. En un tubo de 12 x 75mm de polipropileno colocar una gota de las perlas Sphero en 1 ml de facsflow.

3.

Adquirir la muestra y ajustar el sample offset hasta tener 200 evt/seg.

4.

Abrir el laser shutter azul y ajustar hasta encontrar en los plots la mayor IMF de la población Singlets.

5.

Una vez teniendo la mayor intensidad media de fluorescencia, ajustar los valores de la media en 45,000 de todos los parámetros. Nota: El SSC deberá ajustarse a 25,000.

6.

Optimizar la señal de FSC solo en caso de ser necesario.

7.

Verificar que el laser delay este en 10.4.

8.

Abrir el shutter rojo y ajustar hasta encontrar en los plots la mayor IMF de la población singlets.

9.

En la ventana de recording settings seleccionar en Path el folder y en File colocar el nombre Daily QC y fecha.

10. Guardar 2000 eventos. 11. Detener la adquisición, retirar el tubo y dar un backflush de al menos 30 segundos.

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f)

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HOJA No. 28

Apagado del sistema

1. Limpiar la línea de la muestra; colocar 3ml de FACS clean y adquirir mínimo 5 minutos, posteriormente adquirir mínimo 5 minutos agua desionizada.

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HOJA No. 29

g) Apagado en húmedo 1.

Colocar un tubo con 3ml de agua desionizada en el puerto de la muestra.

2.

Colocar el flush bucket debajo de la nozzle assembly.

3.

Llenar el bubble reservoir con agua destilada y colocar debajo de la nozzle verificado que la punta toque el agua.

4.

Parar el stream.

5.

Enceder el Purge durante 1 minuto para llenar la nozzle de agua desionizada.

6.

Cerrar el Sortware.

7.

Apagar computadora.

8.

Verificar que el switch del citómetro se deje en ON.

9.

Apagar UPS.

10. Apagar los compresores. 11. Cerrar el gabinete de bioseguridad y apagar el aire.

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HOJA No. 30

h) Apagado en seco 1.

Colocar el flush bucket debajo de la nozzle assembly.

2.

Parar el stream.

3.

Desconectar la línea de aire y la línea de sheath del tanque del sheath.

4.

Liberar la presión del tanque.

5.

Vaciar el tanque del Sheath y poner un litro de agua desionizada aproximadamente. Es importante no desechar a la tarja el facs flow en este paso.

6.

Reconectar las líneas del tanque del Sheath y verificar la presión del tanque 27psi

7.

Dar click en rinse y backflush por 2 minutos para correr agua por todas las líneas.

8.

Realizar un bypass del filtro conectando los cables azules uno con otro.

9.

Conectar la línea del sheath con la línea de aire de modo que el tanque del sheath quede completamente desconectado. Es importante no conectar las líneas si el filtro sigue conectado.

10. Dar click en rinse y después backflush para pasar aire por las líneas y esperar a que este completamente seco el sistema. 11. Retirar la nozzle y colocarla en un tubo de agua destilada. 12. Sonicar un minuto, descartar el agua y colocar agua limpia nuevamente. Dejar el tubo con la nozzle dentro del gabinete. 13. Colocar la nozzle nut. 14. Limpiar el área de trabajo si es necesario. 15. Cerrar el Sortware. 16. Apagar Computadora. 17. Verificar que el switch del citómetro se deje en Off. 18. Apagar UPS. 19. Apagar los compresores. 20. Cerrar el gabinete de bioseguridad y apagar el aire.

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HOJA No. 31

XII. GLOSARIO

Archivos FCS 3.0.- Archivos generados por los programas DIVA y sortware que podrán ser utilizados en distintos programas de análisis de datos de citometría. Backflush.- Lavado de la línea de inyección. Browser de DIVA.- Navegador del Software del programa DIVA. Bubble reservoir.- Accesorio indispensable en forma de burbuja para la inyección de agua a la boquilla (nozzle) del equipo FACS JAZZ. Bypass.- Acción de retirar el filtro de la línea del Sheat y reconectar sus cabezales azules uno con otro. Esta acción es exclusiva para el citómetro FACS JAZZ. Citometría.- Medición celular. Citometría de Flujo.-Técnica de análisis celular que implica medir las características de dispersión de luz y fluorescencia que poseen las células conforme se les hace pasar a través de un rayo de luz. Citómetro.-Instrumento de medición celular basado en la incidencia de un haz de luz (láser), sobre un fluorocromo emitiendo fluorescencia en una longitud de onda determinada. Contenedor secundario.-Segundo contenedor que protege los tubos (contenedor primario) con muestras para su traslado. Daily QC.- Reporte diario de la calibración y ajuste de láseres del equipo FACS JAZZ. Drain.-Desagüe del FACS JAZZ. Inspector/ Parameters.-Opciones del sorfware DIVA para escoger los parámetros a utilizar en cada sesión. Facs Clean.-Solución de lavado para los citómetros de flujo. Fluidics Start up.- Lavado inicial que desplaza al etanol al 70% que se encuentra en las líneas del citómetro y lo sustituye por Facs Flow.

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HOJA No. 32

Sortware.- Paquetería o programa computacional diseñado para manejar el citómetro FACS JAZZ, particularmente para el sorting. Stream.- Chorro de solución facs flow que permite observar la formación de gotas al pasar por la celda de flujo, al recibir una carga eléctrica. Tinción: Acción de teñir o marcar las células con distintos anticuerpos monoclonales conjugados (unidos covalentemente) a fluorocromos. Tubos de compensación: Tubos con células teñidas con un solo fluorocromo cada uno, que servirán como controles de eliminación de señales de fluorescencia traslapadas en una tinción multiparamétrica. Sheath.- Solución Facs Flow. UPS.- Sistema de energía ininterrumpible. Valores FSC.- Valores de voltaje para medir la desviación frontal de la luz al incidir sobre una célula, proporcional a su tamaño. Valores SSC.- Valores de voltaje para medir la desviación lateral de la luz al incidir sobre una célula,proporcionales a su complejidad o granularidad. Ventanas workspace.- Ventana del sortware que despliega funciones para operar el equipo y adquirir las muestras en el citómetro FACS JAZZ. Ventanas sortviewpane.- Ventana del sortware que permite observar la posición del drain, stream y los pinholes del citómetro FACS JAZZ. Ventanas pressure waste.- Ventana del sortware que permite controlar los cambios de presión del FACS JAZZ. Workstation.- Estación de trabajo donde se tienen instaladas las computadoras con el software cada equipo.

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HOJA No. 33

XIII. VALIDACIÓN DE LA COMISIÓN DE LA UNIDAD DE CITOMETRÍA

____________________________________________ Dr. Joaquín Zúñiga Ramos Subdirector de Investigación Biomédica

____________________________________________ ____________________________________________ Dr. Héctor Espinosa Arciniega Q.F.B Dámaris Romero Rodríguez Jefe del Departamento de Investigación Responsable de la Unidad de Citometría en Inmunología

____________________________________________ ____________________________________________ Dra. Blanca Ortiz Quintero Dra. María Sada Ovalle Departamento de Bioquímica Jefa del laboratorio de Inmunología Integrativa

____________________________________________ ____________________________________________ Dra. Criselda Mendoza Milla Dr. José Cisneros Lira Laboratorio de Biología Celular Laboratorio de Biología Celular

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HOJA No. 34

XIV. AUTORIZACIÓN DEL REGLAMENTO INTERNO DE LA UNIDAD DE CITOMETRÍA REALIZÓ

____________________________________________ Dr. Héctor Espinosa Arciniega Jefe del Departamento de Investigación en Inmunología

____________________________________________ Q.F.B Dámaris Romero Rodríguez Responsable de la Unidad de Citometría

REVISÓ

____________________________________________ Lic. Liliana Morales Suárez Jefa del Departamento de Planeación

____________________________________________ Lic. Rosa Uribe Navarrete Jefa del Departamento de Asuntos Jurídicos

AUTORIZÓ

____________________________________________ Dr. Joaquín Zúñiga Ramos Subdirector de Investigación Biomédica

____________________________________________ Dr. Moisés Selman Lama Director de Investigación