1 REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS DOCTORADO EN QUÍMICA

FITOQUÍMICA Y FARMACOLOGÍA DE Lippia schlimii (VERBENACEAE) Tesis Doctoral presentada como requisito para optar al Título de Doctor en Química

Autor: Lcdo. Néstor Segundo Peña Andrade

Tutor: Dra. Dinorah Ávila Peña

Maracaibo, marzo de 2013

5

Este trabajo fue realizado en los siguientes laboratorios: i.

Laboratorio de Productos Naturales de la Facultad Experimental de Ciencias de La Universidad del Zulia (L.U.Z.). Maracaibo, Venezuela.

ii.

Laboratorio de Neuroquímica y Farmacología del instituto de Investigaciones clínicas “Dr. Américo Negrette” de La Universidad del Zulia (L.U.Z.). Maracaibo, Venezuela.

iii.

Instituto de Investigaciones de la Facultad de Farmacia y Bioanálisis, de la Universidad de los Andes, Mérida, Venezuela.

iv.

Laboratorio de Microbiología General de la Facultad Experimental de Ciencias de La Universidad del Zulia (L.U.Z.). Maracaibo, Venezuela.

9

DEDICATORIA

A Dios por haberme permitido seguir viviendo y poder ver concluido el sueño que alguna vez me tracé en mi camino. A mis padres, pilares fundamentales en mi vida

10 AGRADECIMIENTOS

A mi DIOS por haber soplado nueva vida en mi, permitiéndome así poder terminar mis estudios doctorales, Gracias Dios mío! por tan memorable regalo. A mis padres y mis hermanos, quienes siempre han estado con migo y con los cuales he contado en todo momento, este triunfo también es de ustedes. A la ilustre Universidad del Zulia, en especial a la Facultad Experimental de Ciencias, mi segunda casa, lugar de aprendizaje y ahora de trabajo. El Lugar que me vio crecer como profesional, ahora me acoge entre su seno como un docente más de su departamento. A la Dra. Dinorah Ávila Peña, mi tutora, mi madre académica, pocas serian las palabra que pudieran expresar mi agradecimiento a tan grata persona y gran profesional, quien ha inculcado en mí sus conocimientos. Al Laboratorio de Productos Naturales, lugar donde desarrollé la mayor parte de este trabajo, el cual ocupa un lugar muy especial mí. Al Dr. José Ortega, a quien aprecio verdaderamente y considero un hermano, Gracias compadre, Gracias hermano! A la Lic. Maybeline D. y Yaseli S. por toda la ayuda brindada en el desarrollo del presente trabajo. Al Dr. Miguel Petrangeli y su grupo de trabajo, por la identificación y recolección del material vegetal. Al Laboratorio de Farmacología y Neuroquímica del Instituto de Investigaciones Clínicas de la Facultad de Medicina de La Universidad del Zulia, lugar donde llevé a cabo la realización de las pruebas farmacológicas in-vivo, especialmente al Dr. Heberto Suárez Roca. Al Instituto de Investigaciones de la Facultad de Farmacia y Bioanálisis, de la Universidad de los Andes, en especial al Dr. Luis Rojas Beltrán por toda su colaboración en el análisis del aceite esencial.

11 Al Laboratorio de Microbiología General del Departamento de Biología, lugar donde llevé a cabo la realización de las pruebas biológicas in-vitro, a la Lic. Gisela Colina. Al laboratorio nacional de RMN, IVIC por la realización de los espectros de RMN. Al FONACIT, en el marco de la Misión Ciencia, por haberme otorgado la beca para mis estudios doctorales. Muchísimas gracias, su ayuda llegó en el momento más oportuno, jamás olvidare aquella llamada diciendo que había obtenido la beca. El autor

12 ÍNDICE DE CONTENIDO

Página Resumen

15

Abstract

16

Capitulo 1

17

1.1. Introducción Capitulo 2

17 20

2.1. Antecedentes

20

2.1.1. Lippia adoensis

20

2.1.2. Lippia alba

20

2.1.3. Lippia americana.

29

2.1.4. Lippia berlandieri (Orégano mexicano)

29

2.1.5. Lippia carviodora

31

2.1.6. Lippia chevalieri

31

2.1.7. Lippia citriodora

32

2.1.8. Lippia dulcis

36

2.1.9. Lippia fissicaliyx

40

2.1.10. Lippia geminata

40

2.1.11. Lippia grandis

41

2.1.12. Lippia grata

41

2.1.13. Lippia integrifolia

41

2.1.14. Lippia javanica

43

2.1.15. Lippia Juneliana

45

2.1.16. Lippia lacunosa y Lippia rotundifolia

46

13 2.1.17. Lippia laxibracteata

47

2.1.18. Lippia lupulina

47

2.1.19. Lippia mexicana

48

2.1.20. Lippia rehmannii

48

2.1.21. Lippia sidoides

48

2.1.22. Lippia stoechadifolia

52

2.1.23. Lippia turbinata

53

2.1.24. Lippia ukambensis

54

2.1.25. Lippia schlimii

54

2.2. Objetivos

55

2.2.1. Objetivo General

55

2.2.2 Objetivos Específicos

55

Capitulo 3

57

3.1. Parte experimental

57

3.1.1. Consideraciones Generales

57

3.1.2. Tratamiento del Material Vegetal

59

3.1.3. Extracción y Caracterización del Aceite Esencial

61

3.1.4. Análisis químico del aceite esencial (GC-MS)

61

3.1.5. Actividad antibacteriana de los extractos de L. schlimi

62

3.1.5.1. Método de difusión en discos de papel

62

3.1.5.2. Método de difusión en Pozo

63

3.1.5.3. Concentración mínima inhibitoria (CMI) del Aceite esencial de L. schlimi

64

3.1.6. Capacidad analgésica

65

3.1.6.1 Prueba del plato caliente

65

14 3.1.7. Capacidad antiinflamatoria

66

3.1.8. Capacidad antipirética

66

3.1.9. Análisis estadístico

67

3.1.10. Estudio Químico

67

3.1.10.1. Aislamiento de -sitosterol y estigmasterol

68

3.1.10.2. Aislamiento de la alantoína

68

Capitulo 4

69

4.1. Resultados y Discusión

69

4.1.1. Caracterización del Aceite Esencial

69

4.1.2. Actividad antimicrobiana del aceite esencial de L. schlimi

72

4.1.3. Capacidad antibacteriana de los extractos de L. schlimi

73

4.1.4. Capacidad analgésica

74

4.1.4.1. Prueba del plato caliente

74

4.1.5. Evaluación de la capacidad anti-Inflamatoria

76

4.1.6. Evaluación de la capacidad antipirética

77

4.1.7. Aislamiento y caracterización de metabolitos

79

4.1.7.1. Identificación de -sistosterol y estigmaterol

80

4.1.7.2. Identificación de la alantoína

87

Conclusiones

92

Recomendaciones

94

Literatura citada

95

Índice de figuras

111

Índice de tablas

113

Abreviaturas

114

15 Peña Andrade, Néstor Segundo: “FITOQUÍMICA Y FARMACOLOGÍA DE Lippia schlimii (VERBENACEAE)”. La Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias. Departamento de Química. Laboratorio de Productos Naturales. Maracaibo, Tesis para optar al Titulo de Doctor en Química. Noviembre de 2012. pp 115.

RESUMEN

La familia Verbenácea comprende un gran número de plantas, entre las cuales las pertenecientes al género Lippia constituyen un grupo de especies con variada actividad farmacológica. En el presente trabajo se estudia Lippia schlimii, que crece en las zonas altas del estado Táchira, 0.5 Kg de hojas secas mediante hidrodestilación produjeron el aceite esencial con rendimiento del 0.9%, el cual se analizó por (CG/MS). Se identificaron aproximadamente 33 componentes, de los cuales los mayoritarios fueron: 1-hydroxilinalool (31,26%), Linalool-L (2,96%), α-Guaieno (4,59%), α-Amorfeno (3,39%), -Cadineno (5,01%) y T-Cadinol (4,19%); estos resultados muestran variabilidad en la composición del aceite comparados con otro estudio sobre el mismo vegetal, indicando la presencia del primer quimiotipo para la especie estudiada en Venezuela. Se evaluo la actividad antibacteriana del aceite esencial por el método de difusión en agar con pozos, determinándose tambien la concentración minima inibitoria (CMI) frente a bacterias Gram + y Gram -. Los resultados muestran que el aceite inhibió el desarrollo de Staphylococcus aureus, Serratia marcescens y Micrococcus sp, a una concentración mínima inhibitoria (CMI) de 300 µg/ml y Bacillus subtilis con 200 µg/ml. De las hojas secas del vegetal (2,5Kg) se obtuvieron extractos de hexano y metanol; este último tratado con cloroformo generó las fracciones, S1 e I1. Los extractos fueron sometidos a pruebas de susceptibilidad bacteriana, mediante difusión en discos; el extracto de hexano fue activo sobre 4 de las 9 cepas bacterianas utilizadas, mientras que el extracto metanólico crudo (EMC) mostró efecto sobre tres cepas. Las fracciones S1 e I1 inhibieron el crecimiento en tres de las nueve cepas estudiadas. Los ensayos para la determinación de la capacidad analgésica mostraron que los extractos EMC e I1, no fueron activos a las dosis utilizadas, sin embargo ambos extractos presentaron actividad antiinflamatoria y antipiretica a la dosis de 300mg/Kg. Mediante cromatografías sucesivas, a partir del extracto S1 se separó una mezcla de -sitosterol y stigmasterol, mientras que del extracto I1 se separó alantoina.

Palabras clave: Lippia schlimii. Verbenacea. Actividad antibacteriana. Aceite esencial.

Email: [email protected]

16 Peña Andrade, Néstor Segundo: “FITOQUÍMICA Y FARMACOLOGÍA DE Lippia schlimii (VERBENACEAE)”. La Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias. Departamento de Química. Laboratorio de Productos Naturales. Tesis para optar al Titulo de Doctor en Química.Maracaibo, Noviembre de 2012. pp 115.

ABSTRACT

The family Verbenaceae comprises a large number of plants, including the genus Lippia, which are a varied group of species with pharmacological activity. In this work, we study that grows in the highlands of Tachira in our country. 0.5 kg of dried leaves, by hydrodistillation produced the essential oil, with a yield of 0.9%; this was analyzed by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC / MS). Approximately 33 components were identified, of which the majority were: hydroxilinalool (31,26%), Linalool-L (2,96%), α-Guaieno (4,59%), α-Amorfeno (3,39%), -Cadineno (5,01%) y T-Cadinol (4,19%); these resuls show variability in oil composition compared with other studies on the same plant and suggest we are in presence of a first chemotype for the studied species. We evaluated the antibacterial activity of essential oil by the agar-disk diffusion method to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) against Gram + and Gram – bacterium. The results show that the oil inhibited the growth of Staphilococcus aureus, Serratia marcescens and Micrococcus sp, at a minimum inhibitory concentration (MIC) 300 µg/ml, and Bacillus subtilis at 200 ug/ml. Of the dried leaves of the plant (2.5 kg) were obtained hexane and methanol extracts, the last treated with chloroform generated fractions S1 and I1 The extracts obtained were subjected to susceptibility testing by the agar diffusion method, whereupon the active hexane extract was about 4 of the 9 bacterial strains used, while the methanol extract showed effect on three strains; S1 and I1 inhibited growth in three of the nine strains. Assays for determining the analgesic ability of the extracts EMC and I1 showed analgesic were not active at the doses used, both extracts showed siembargo and antipireticaca inflammatory activity at a dose of 300mg/Kg, featuring a similar behavior between them. By successive chromatographies, from S1 extract was separated a mixture of -sitosterol and stigmasterol, the extract I1 was separated allantoin.

Key words: Lippia schlimii. Verbenacea. Antibacterial activity. Essential oil

Email: [email protected]

17 CAPÍTULO 1

1.1.

INTRODUCCIÓN Desde la antigüedad el hombre ha aprovechado las virtudes aromáticas de las plantas. Los

aceites esenciales extraídos de ellas, han servido de base para la aromatización de postres y guisos y para la elaboración de perfumes, remedios y medicamentos. Los aceites volátiles son mezclas muy complejas de compuestos, generalmente constituidos mayoritariamente por mono terpenos y sesquiterpenos; de hecho se ha estimado la presencia de más de 1000 mono terpenos y 3000 sesquisterpenos en los aceites esenciales de diversas plantas. Otros tipos de compuestos que se encuentran en los aceites son los hidrocarburos de formula general (C5H8)n y compuestos oxigenados derivados de dichos hidrocarburos como: alcoholes, aldehídos, esteres, éteres, cetonas fenoles y óxidos.1 En la actualidad se conoce un gran número de ellos cuyas estructuras se encuentran bien establecidas, sin embargo sólo a algunos se les ha comprobado alguna actividad biológica, por lo que es muy importante el continuo análisis y estudios de actividad biológica para este tipo de compuestos.1 El análisis químico de estos aceites así como su estudio biológico es muy importante dado el uso cotidiano dentro de la medicina folklórica, y el efecto positivo que ha demostrado el uso de estos aceites. Una de las virtudes más importante de los aceites esenciales es su efecto antioxidante y relajante; algunos pueden llegar a ser analgésicos suaves, los cuales son de vital importancia para el hombre.1,2 Es importante destacar la presencia de numerosas plantas aromáticas, endémicas o introducidas, en diferentes zonas geográficas, las cuales se han adaptado a diferentes tipos de clima y ambiente topográfico. Algunas de ellas se utilizan como fuente de aceites esenciales, sin embargo existen otras aún no explotadas, cuyos extractos o aceites podrían conducir a la creación de nuevos productos para sustituir importaciones o generar nuevos renglones exportables. 2 La composición del aceite esencial varía según el órgano de la planta de donde se aísle, y de la zona donde crece el espécimen; por ello si existe una mayor concentración de un

18 componente dentro del aceite, éste metabolito es considerado un quimiotipo que sirve para la identificación de la especie. El término quimiotipo alude a la variación en la composición del aceite esencial, incluso dentro de la misma especie. Un quimiotipo es una entidad químicamente distinta, que se diferencia en los metabolitos secundarios. Existen pequeñas variaciones (ambientales, geográficas, genéticas, etc.) que producen poco o ningún efecto a nivel morfológico pero sin embargo producen grandes cambios a nivel de fenotipo químico. Un caso típico es el del tomillo, Thymus vulgaris, que tiene 6 quimiotipos distintos según cuál sea el componente mayoritario de su esencia (timol, carvacrol, linalol, geraniol, 4-tuyanol o terpineol). Cuando esto ocurre, se nombra la planta con el nombre de la especie seguido del componente más característico del químiotipo, por ejemplo, Thymus vulgaris linalol o Thymus vulgaris timol.3 La variabilidad química de los aceites esenciales en el género Lippia es motivo de interés en el estudio de estas plantas en virtud de sus posibles usos fitoterapéuticos; además, los extractos de sus diferentes órganos poseen propiedades antioxidantes, sudoríficas, antiespasmódicas y antimicrobianas.2,4 De allí el interés en el estudio de otra especie de este género como lo es Lippia schlimii. La familia Verbenaceae, una amplia familia de plantas principalmente tropicales, de árboles, arbustos y hierbas, consta de alrededor de 91 géneros y 2.000 especies. Entre los géneros más conocidos se pueden citar:5            

Amasonia Avicennia Callicarpa Caryopteris Citharexylum Clerodendrum Coleonema Congea Cornutia Crowea Diostea Duranta

           

Garrettia Gmelina Holmskioldia Hymenopyramis Lantana callicarpa Lippia Nashia Oxera Petrea Phyla Premna Rhaphithamnus

        

Schnabelia Sphenodesme Stachytarpheta Symphoremaa Thamnosma Tectona Tsoongia Verbena Vitex

19 El género Lippia ha sido estudiado con insistencia debido a la marcada variabilidad que presenta la composición de sus aceites esenciales, estrechamente ligada a la diversidad de acciones que se atribuye a cada especie.

20 CAPITULO 2

2.1.

ANTECEDENTES 2.1.1 Lippia adoensis Es un hecho la importancia del estudio del aceite esencial para el género Lippia. La

especie Lippia adoensis, originaria de África, es una planta muy estudiada por la gran variabilidad en la composición de su aceite volátil; se habla de la existencia de alrededor de 12 tipos o quimiotipos para esta especie, donde los componentes mayormente encontrados han sido: linalool, mirceno, limoneno, ipsenona, 6,7-epoximirceno, geraniol y nerol6 ; sin embargo el componente mayoritario más común en esta especie es el linalool, el cual se ha encontrado en altas concentraciones tanto en las hojas como en sus flores. 7 Estudios como los reportados por Kasali y col. 6 afianzan el hecho de que la especie es rica en linalool, pues han reportado concentraciones de 83,5%, de éste en el aceite, específicamente de especies que crecen en suelos nigerianos. El reporte indica que el componente mayoritario fue el linalool seguido por geraniol, 1,8-cineole y germacreno D. Los extractos de esta planta han sido estudiados farmacológicamente para determinar o corroborar su efecto analgésico, ya que las infusiones de sus hojas son utilizadas como coadyuvantes en el tratamiento del dolor; se ha observado efecto analgésico moderado, dosis dependiente, por parte del extracto acuoso y su fracción etanólica, de las hojas del vegetal.8 2.1.2 Lippia alba Lippia alba (Figura 1), es una de las especies más estudiadas hasta los momentos; su aceite

esencial

contiene

componentes

que

pueden

considerarse

quimiotaxonómicos,9 lo cual permite su identificación botánica.

como

marcadores

21

Figura1

Lippia alba10

Es utilizada popularmente para el tratamiento de estados gripales, en casos de afecciones estomacales, disfunciones digestivas, como tónico, como antirreumático, y además posee propiedades antiinflamatorias y anti ulcerogénicas.9,11 L. alba es una planta bastamente extendida en América Latina, y se conoce su uso en la medicina popular. Se ha confirmado su actividad analgésica y su actividad pectoral, atribuidas ambas a su aceite esencial, sin que se hayan observado efectos tóxicos. 12,13,14 También se ha reportado actividad antimicrobiana a partir de los extractos (acetato de etilo, metanol y acuoso) de las raíces del vegetal.15 La composición del aceite esencial de esta especie difiere en su constitución, siendo los mayores constituyentes reportados: citral, limoneno, mirceno, 1,8-cineol, piperitona, -terpineno, germacreno y el linalool.16,17,18 La presencia mayoritaria de algunos de los componentes en el aceite esencial de la planta, permiten clasificar a L. alba de acuerdo a este; en tal caso la concentración de los componentes varía de una zona a otra, como es el caso de la especie ubicada en Amazonas del Brasil la cual posee altos porcentajes de germacreno y limoneno en sus hojas.2

22

CHO

O O

Citral

Limoneno

1,8-cineol

piperitona

OH

-terpineno

germacreno

linalool

mirceno

El análisis químico de los aceites esenciales de esta especie siempre ha arrojado la presencia de linalol, citral y mirceno; especies vegetales de estos quimiotipos crecen en Brasil, donde se realizan estudios químicos de sus aceites, y donde los diferentes quimiotipos, son cultivados bajo igualdad de condiciones. Los estudios han demostrado que la variabilidad en la composición del aceite esencial, se debe a variaciones genotípicas, ya que al ser cultivados los quimiotipos bajo las mismas condiciones, se mantiene la diferencia en la concentración del componente mayoritario de la especie.19 Actualmente se siguen realizando estudios de forma más profunda de estos quimiotipos, para entender un poco más el porqué de la variabilidad genética. Recientemente Pierre y col.20 en el 2011, realizaron análisis citogenéticos, de la viabilidad del polen y contenido de ADN nuclear, para estudiar tres quimiotipos de Lippia alba, a fin de comprender la variación genética entre ellos. Este reporte comprende el primer informe del número de cromosomas diferentes en L. alba, Mostrando la ploidia de las especies, algunas mostraron ser poliploides y otras mixoploides. En Guatemala también se han encontrado quimiotipos de L. alba; hasta el momento se han logrado detectar dos quimiotipos, una de ellas perteneciente al quimiotipo mirceno por contener mircenona, y (Z)-ocimenona, como compuestos principales, mientras la otra población

23 del vegetal se clasificó como perteneciente al quimiotipo citral, que contiene 1,8-cineol y geraniol. Estos estudios permitieron detectar la existencia de dos subespecies dentro de L. alba en Guatemala21. Algunas especies de en territorio uruguayo también han mostrado variabilidad en la composición del aceite esencial, presentando como componentes mayoritarios en sus aceites al 1,8-cineol y β-cubebeno.22 O CH3 H3C CH3 H2C

(Z)-ocimenona Ricciardi y col.23 compararon el aceite de diferentes especímenes de L. alba procedente de varias zonas de Argentina, encontrando, que la especie que crece en ese territorio también es fitoquímicamente variable, puesto que presenta diferencias significativas en la concentración de sus componentes según la zona donde se colecte el material. Los mismos autores atribuyen la actividad farmacológica general del vegetal a los terpenos presentes en el aceite esencial. Como se dijo anteriormente el linalol, citral y mirceno suelen ser los componentes moyoritarios en los aceites de L. alba; en el caso del linalol, como componente mayoritario del aceite, puede presentarse como una mezcla de sus isómeros ópticos. Algunos investigadores como Siani A. y col.24 no solo han detectado quimiotipos de L. alba con altos contenidos de Linalool, también han investigado la pureza óptica del mismo dentro del aceite con la finalidad de poder dar a conocer la abundancia de alguno de los isómeros que conforman el componente principal. Estudios farmacológicos demuestran que la mayoría de los aceites de L. alba son farmacológicamente activos, el linalool, citral y mirceno presentan efecto sobre el sistema nervioso central, generando relajación muscular y aumentando el tiempo de sueño en los animales de experimentación.25

24 Estudios demuestran que los quimiotipos, presentan actividad farmacológica, en este caso actividad analgésica y antiinflamatoria. Glauce y col.26 reportan el efecto analgésico sobre el modelo de plato caliente y formalina para dos de los quimiotipos (citral y carvona) del aceite de L. alba, demostrando que ambos presentan actividad analgésica significativa, no habiendo una clara diferencia en los tiempos de latencia para ambos aceites. Se han realizado estudios de los aceites y su efecto sobre el comportamiento a nivel del sistema nervioso central, encontrándose reportes del efecto sedante y relajante; do Vale y col.27,28 estudiaron el efecto del aceite de la mencionada especie, sobre el comportamiento en animales de experimentación, utilizando para ello tres quimiotipos (carvona, mirceno, limoneno). Los aceites aumentaron la permanencia de los animales en las zonas abiertas del laberinto, además de producir un efecto sedante; en el mismo ensayo se encontró que los aceites producen efecto anti estrés, por otra parte disminuyen la temperatura rectal de los animales de forma dosis dependiente. Estos resultados le confieren un efecto anti estrés, sedativo y antipirético a los aceites L. alba. Con la finalidad de corroborar la vía de acción e identificar la posible participación del sistema GABAérgico en el efecto anestésico y sedante27,28 del aceite esencial de L. alba, Heldwein y col.29 llevaron a cabo estudios con animales de experimentación, cuyos resultados demostraron la participación del sistema GABAérgico en el efecto anestésico de la planta. L. alba en Inglaterra es utilizada como ansiolítico, razón por la cual en el 2012 Hatno y col.30, realizaron un estudio para determinar la eficacia del uso tradicional de la planta como ansiolítico, encontrando que el aceite esencial del vegetal tiene propiedades similares a los ansiolíticos comerciales como el diazepan. Otro tipo de actividad por parte de esta especie, se ha observado sobre virus; así, Abad y col.31 en un estudio de actividad antiviral de varias plantas, sobre Herpes simplex tipo I, demostraron que L. alba posee un potente efecto inhibitorio sobre el virus. La especie ha demostrado poseer actividad antimutagénica actuando por la vía de los antioxidantes. 32 Entre los compuestos asociados a dicha actividad se encuentra el eudesmol.33

25

OH H

H OH

-eudesmol

-eudesmol

El eugenol uno de los compuestos más importante aislado de esta especies, ha sido objeto de estudio ya que ha presentado efectos farmacológicos importantes, como antioxidante, analgésico, sedativo y anestésico; en la actualidad, se siguen estos estudios, no solo para el eugenol sino también para el aceite que lo contiene. Parodi y col.34 comprobaron que el eugenol y el aceite presentan efecto anestésico sobre larvas de Litopenaeus vannamei, una especie de crustáceo; además se midió la actividad antioxidante mostrando que ambos, el compuesto y el aceite son activos. L. alba se ha caracterizado por poseer gran diversidad de compuestos en los extractos libres de aceites esenciales; los flavonoides son algunos de ellos. Barboza y col.35 realizaron un estudio espectroscópico por RMN de dos biflavonoides aislados de las hojas e identificaron 5,5´´dihidroxi-6,4´,6´´,3´´´,4´´´-pentametoxi-[C7-O-C7 ´´]-biflavona (I) y 4´,4´´´,5,5´´-tetrahidroxi6,6´´,3´´´-trimetoxi-[C7-O-C7´´]-biflavona (II). Continuando con los estudios, los mismos autores analizaron los extractos de los quimiotipos mirceno y citral logrando aislar una serie de iridoides y feniletanoides glicosídicos de las hojas del vegetal,36 los cuales fueron identificados como isonuomiósido (III), decafeoilverbascósido (IV) y shanzhisido metil éster (V). Zétola y col.37 en el 2004 reportan el efecto sedativo y relajante del extracto etanólico de las hojas L. alba, libre de compuestos volátiles. En este mismo trabajo se encontró una alta concentración de flavonoides. Como se ha podido notar la presencia de iridoides y flavonoides son bastante comunes para esta especie, los cuales en su mayoría presentan efecto antioxidante, relajantes y sedativos36, 37, 38.

26 RO

OMe O

O

O

OMe O

O

OH

CH3O OR´

I

R, R´ = CH3

II

R, R´ = H

OH OH H

O

H OH O

HO O

HO

H

HO

OH

H

OH

III

OH OH OH

O

HO

HO O

O OH

O H

HO IV

H

OH

H

27

HO

H

O HO

OH

HO O

OH

O

OH H

H V

Para corroborar el uso tradicional de plantas medicinales en Colombia, Guerrero y col.39 estudiaron el extracto etanólico de las partes aéreas de varias plantas, entre las que se incluye a L. alba; estas mostraron actividad antihipertensiva y vasodilatadora en ensayos in-vivo utilizando ratas. Recientemente se investigó la composición del aceite esencial y la actividad vaso relajante, de especies oriundas de Brasil, la cual es inducida por el aceite esencial de la planta; que además presenta altas concentraciones de geraniol y nerol.40 CH3

CH3 OH

CH2OH

H 3C

CH3

Geraniol

H 3C

CH3 Nerol

El efecto farmacológico más marcado de L. alba es el efecto antibiótico y anti fúngico corroborado a través de diferentes estudios in-vitro de los cuales existe diversidad de reportes Los extractos clorofómico, acetónico y metanólico de las raíces del vegetal han presentado actividad antimicrobiana sobre Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Mycobacterium smegmatis, Candida albicans e Monilia sitophila, inclusive los extractos menos polares como el de hexano también presentan actividad. 8,41

28 Continuando los ensayos de actividad antimicrobiana, Filho y col.42 estudiaron en el 2006, los extractos acetato de etilo metanol y acuoso de la raíces, sobre bacterias Gram (+) y Gram (-) utilizando la técnica de difusión en pozo; los resultados mostraron que sólo los extractos de acetato de etilo y metanol fueron activos sobre Staphylococcus aureus (ATCC 6538P), Staphylococcus aureus (ATCC 6538) y Klebsiella pneumonia (ATCC 10031). En el mismo trabajo se comprobó la presencia de terpenoides, fenilpropanoides y azúcares. Otros estudios abordan la evaluación de las propiedades anti fúngicas del aceite esencial así como también de algunos aldehídos y mono terpenos de L. alba, contra hongos que contaminan y atacan a leguminosas; los reportes indican que los aceites y los compuestos (geraniol y nerol), pueden usarse de manera segura como conservante eficaz para las leguminosas en contra de infecciones por hongos y micotoxinas.43 La actividad antimicrobiana y antifúngica de las hojas y flores in vitro también han sido reportadas al igual que la actividad citotóxica, por Ara y col. 44 Utilizando el método de difusión en disco, mostraron que los extractos analizados presentan una potente actividad antimicrobiana inhibiendo el crecimiento de todas las cepas Gram (+) y Gram (-) estudiadas, además presentaron una leve a mediana actividad anti fúngica y efecto citotóxico leve. Los últimos estudios reportados para esta especie, revelan la actividad anti genotóxica45 del limoneno como componente mayoritario del espécimen que crece en Colombia, así como también el efecto anti-quorum, de dos quimiotipos, el carvona-limoneno y el citral (neral geranial).46 Otros estudios indican que el aceite esencial de L. alba influye de forma sinérgica, en la actividad de la eritromicina, pudiendo ser utilizado, como un adyuvante en la terapia antibiótica contra bacterias patógenas de las vías respiratorias.47 También se reporta el efecto anti convulsivo del aceite y los extractos de hojas del vegetal; los autores, han sugerido que las propiedades anticonvulsivas mostradas por L. alba podrían ser correlacionadas con la presencia de un grupo complejo de sustancias no volátiles (fenilpropanoides, flavonoides e inositoles), y también a los terpenoides volátiles (-mirceno, citral, limoneno y carvona), que han sido previamente validados como anticonvulsivos.48

29 Otros reportes varios, hacen referencia a los estudios de los aceites de flores en tres estados de crecimiento del vegetal.49 tambien se ha usado dimetildioxirano en la epoxidación de los principales constituyentes de los aceites esenciales de L. alba, para generar compuestos modificados con usos potenciales en varias áreas de la medicina y la industria 50. De forma muy interesante este aceite y el eugenol, han sido usados como sedante y anti estrés en el traslado y/o transporte del bagre plateado, debido a que estos compuestos con perfil anestésico aparentemente reducen el estrés en los peces. 51 Finalmente se ha reportado el uso del extracto hidroalcohólico, (quimiotipo geraniol y carvona) de L. alba como terapia altamente eficaz y barata, para reducir la intensidad y la frecuencia de los episodios de dolor de cabeza, sin que se presenten efectos secundarios en los pacientes con migraña.52 2.1.3 Lippia americana. Es una de las especies del genero Lippia que se ha comenzado a estudiar últimamente. En la actualidad, solo se conocen dos reportes para este vegetal: el presentado por Bueno y col., 53 quienes estudiaron una serie de aceites esenciales provenientes de varias plantas colombianas, donde figura la especie Lippia americana, cuyos componentes mayoritarios son germacreno D (15.4%) y trans--cariofileno (11.3%); dichos componentes presentaron leve actividad antimicobacteriana, sobre tuberculosis, sin mostrar efecto citotóxico sobre células de cáncer de mama. Continuando con los estudios sobre la misma especie se reporta la presencia de ácidos grasos, ácidos grasos libres, aminoácidos y la presencia de colina en el vegetal.54 2.1.4 Lippia berlandieri (Orégano mexicano) Lippia berlandieri Schauer, (Figura 2.), también conocido como orégano Mexicano, es una especie de planta que se desarrolla de manera silvestre en zonas áridas de México (Chihuahua, Tamaulipas, Durango, Zacatecas, San Luis Potosi, Queretaro y Jalisco); esta especie también es conocida como Lippia graveolens, los primeros estudios realizados sobre el vegetal, se remontan al año 1989, cuando Pino y col.55, realizan estudios sobra la composición del aceite esencial del vegetal, seguidamente en el 2000, Yousif y col.56, también evalúan la composición del aceite esencial y el efecto del método de secado por microondas de vacío en el contenido relativo de compuestos volátiles, la tasa de rehidratación, color, y la integridad estructural del

30 vegetal utilizado. Los principales componentes encontrados fueron -mirceno, -terpineno, terpineno, p-cimeno y timol.

Figura 2

Lippia berlandieri57

Vernin, y col.58, 2001 también evalúan la composición del aceite esencial del vegetal en este caso de especies que crecen en el Salvador, las muestras fueron tomadas a mitad de noviembre y finales de diciembre, para observar el rendimiento según la fecha de recolectado; Los dos componentes principales de ambas muestras eran carvacrol (71% y 34,6%, respectivamente) y timol (5-7%, respectivamente). Se observo que según el mes de recolección variaba la concentración de los componentes de forma apreciable. Además la especie era diferente en su composición a la estudiada previamente por Yousif y col.56 Seguidamente se reporta la actividad antimicrobiana y la composición del aceite de especies de dos muestras guatemaltecas, Salgueiro y col.59, reportan los compuestos carvacrol, timol y p-cimeno como componentes mayoritarios. Los aceites mostraron actividad significativa contra todas las bacterias estudiadas Gram-positivas y Gram-negativas, siendo activos también contra hongos. Sin embargo, el aceite con el mayor contenido de carvacrol se encontró que fue más activo que el tipo timol. Rivero-Cruz y col.60, 2011, también reportan la composición química y propiedades antimicrobianas y espasmolíticas; El carvacrol, resulto ser el componente mayoritario, además de p-cimeno, β-cariofileno y óxido de β-cariofileno. Las muestras presentaron una moderada actividad antibacteriana in vitro, con valores de concentración mínima inhibitoria que oscilaron

31 entre 128 y 512 mg/ml. Además, el aceite presentó una actividad marginal antiespasmódica in vivo de forma dosis dependiente de la concentración, sin presentar toxicidad. En ese mismo año, se determinó la actividad antifúngica del aceite esencial de esta especie por contacto gaseoso sobre el crecimiento de Aspergillus flavus utilizando diversas concentraciones del aceite con variación simultánea de la temperatura.61, previa la actividad antioxidante y reevaluación de la actividad antimicrobiana. 62 Los agentes antimicrobianos pueden incorporarse a películas comestibles para proporcionar estabilidad microbiológica, puesto que estas películas se pueden utilizar como portadores de una variedad de aditivos para prolongar la vida útil del producto y reducir riesgo de crecimiento microbiano en la superficie del alimento. La adición de agentes antimicrobianos a películas comestibles ofrece ventajas tales como el uso de pequeñas concentraciones de dicho agente antimicrobiano y bajas tasas de difusión. En este particular, Ávila y col. en el año 2012 reportan la adición de concentraciones seleccionadas del aceite esencial de Lippia berlandieri al amaranto, quitosano y almidón o películas comestibles. La caracterización del aceite se llevó a cabo por CG-Masas.63 Otro tipo de actividades que se reportan son, la actividad acaricida y parasitaria del aceite esencial y los compuestos fenólicos presentes.64,65 Los compuestos más comunes en sus extractos son los flavonoides como: luteolina-7-Oglucósido, apigenina-7-O-glucósido, floridzina, taxifolina, eriodictiol, escutellareina, luteolina y quercetina; asi como los iridoides: oganin, secologanina, secoxiloganina, dimetil secologanósido, ácido logánico, ácido 8-epi-logánico y carioptósido.66,67,68 2.1.5 Lippia carviodora Para esta especie solo se ha reportado el estudio de la composición de su aceite esencial, el cual consistió principalmente de sesquiterpenos hidrocarbonados. La β-cubenona, es el componente mayoritario para el aceite de este vegetal. 69 2.1.6 Lippia chevalieri Lippia chevalieri, (Figura 3). Es un arbusto que crece en el oeste de África. Esta planta es morfológicamente muy similar a Lippia multiflora. En la medicina popular, se utiliza como

32 antipalúdico, sedante y para el tratamiento de infecciones respiratorias; se ha estudiado su efecto analgésico, antipirético y antiinflamatorio. 70

Figura 3

Lippia chevalieri71

Para el año 2003, Bassolea y col.72 reportan la obtención por hidrodestilación y el análisis por CG y CG-MS del aceite esencial proveniente de las hojas de las especies L. chevalieri y L.multiflora. Se demostró que la especie L. chevalieri pertenece al quimiotipo timol/p-cimeno/2fenil propionato de etilo mientras que la especie L. multiflora corresponde al timol/pcimeno/acetato de timilo. También se evaluo su actividad frente a nueve cepas bacterianas demostrando mayor sensibilidad frente a las cepas Gram negativas. El aceite de la especie L. multiflora fue más activo. En fecha más reciente, 2007, Mevy y col.73describen la obtención por hidrodestilación y el análisis por CG y CG-MS del aceite esencial proveniente de las hojas y las flores de Lippia chevalieri encontrando que la mayoría de los componentes eran estructuras sesquiterpenoidales. Se evaluó la actividad antibacteriana y antifúngica de ambos aceites. El elemol, 1,8-cineol, alcanfor y p-cimenos pueden considerarse como los componentes antimicrobianos de estos aceites. 2.1.7 Lippia citriodora Lippia citrodora llamada también Aloysia o Lippia triphylla, (Figura 4), es conocida comúnmente como “Lemon verbena”; es oriunda de América del sur, sus hojas presentan un

33 característico olor a limón, por lo cual son utilizadas como aromatizante en te de hierbas; es utilizada tradicionalmente como antipirético, antiespasmódico, sedante y tiene propiedades digestivas, se utiliza en el tratamiento de asma, espasmos, flatulencia, cólicos, diarrea, indigestión, insomnio y ansiedad,74, 75 inclusive se ha reportado el efecto hipnótico y su propiedad sedante, dando validez científica del uso de esta planta como sedante y como tónico para los nervios.76

Figura 4

Lippia citriodora77

La composición química del aceite esencial de las hojas de L. citriodora también se ha estudiado y revisado detalladamente llegando a variar entre especies y según la estación de recolección.78 Entre los componentes que comúnmente son encontrados en su aceite están: 1,8cineole, geraniol, nerol.79 Crabas y col.80 reportan la presencia de phytol, spatulenol, óxido de cariofileno, citronelol y α-curcumeno. En hojas de especies oriundas de Chile, previamente, Monte y col.81 habían reportado la presencia de: -limoneno, citral, p-cimeno,  y  pineno. En 1996, Özek y col.82 reportan la composición del aceite esencial del vegetal que crece en Turquía, del cual identificaron citral, (17% en hojas y 27% en ramas con hojas) y limoneno (14,8 y 18,6%, respectivamente). Kaiser y Lamparsky83 identificaron el sesquiterpenoide cariofileno-2,6-β-óxido en el aceite de verbena, el cual contenía también cariofileno e isocariofileno.

34 También se han realizado estudios, para medir el rendimiento y composición del aceite, según la variación estacional; Vogel y col. 84, en 1999, determinaron que la mayor concentración de citral (64%) para el vegetal que crece en Chile, se obtiene en el mes de noviembre. Más tarde, Argyropoulou y col.85 realizaron estudios sobre especies cultivadas en USA, encontrando como principales componentes geraniol, nerol y limoneno, que constituye el 66,3% de la producción total de aceite esencial en mayo, y aumenta a 69% en septiembre. El aceite esencial de esta especie ha mostrado actividad antibacteriana moderada contra Staphylococcus aureus y la levadura Candida albicans;86 también ha sido efectiva contra Helicobacter pylori.87 Recientemente Giner y col.88 evaluaron la actividad antimicrobiana del quitosano con algunos extractos vegetales, entre los que se nombra a Lippia citriodora, utilizando bacterias, levaduras y hongos filamentosos presentes en el zumo de tomate crudo. Los ensayos confirmaron el potencial antimicrobiano de los extractos de las plantas, incluyendo a L. citriodora, y llegaron a la conclusión que éstas pueden ser utilizadas como multi-barreras para sistemas de preservación de alimentos. Caturla y col.,89 en el 2011, revelaron el uso de verbena en combinación con ácidos grasos omega-3; los autores sugieren que estas combinaciones deben ser consideradas como un tratamiento complementario y alternativo para mejorar el estado de sujetos con molestias en las articulaciones. Siguiendo la misma línea de estudios, Funes y Col.,90 el mismo año, observaron que los suplementos con niveles moderados de un extracto antioxidante protege contra el daño oxidativo de neutrófilos, disminuye los signos de daño muscular en el ejercicio crónico; la suplementación de “limón verbena” mantiene o disminuye el nivel de actividad de las transaminasas en suero lo que indica una protección del tejido muscular. El análisis y la identificación de los diferentes extractos de la planta han confirmado la presencia de compuestos fenólicos (flavonoides y ácidos fenólicos) para el vegetal, que se han asociado a la actividad antioxidante de la planta. 91,92 Quirantes y col.93 identificaron los compuestos fenólicos de uno de los extractos de verbena mediante cromatografía líquida con matriz de diodos y de detección de ionización por electro espray acoplado a espectrometría de masas. Determinaron gran cantidad de compuestos

35 fenólicos conocidos como: gardósido (VI), tevedósido (VII), verbascósido (VIII), cistanósido F (IX).

OH

OH HO

HO

OH

OH O

O

OH

OH O

O

CH2

CH2OH

O

O

OH

OH COOH

COOH

VI

VII

HO O

HO O H3C HO

OH

O

OH

O

OH

HO OH

XV

HO HO HO

O O HO

CHO OH HO

O

O

OH CH3

OH

IX Al año siguiente, el mismo grupo de trabajo caracteriza los compuestos fenólicos y otros compuestos polares en un extracto de verbena, mediante electroforesis capilar y espectrometría

36 de masas, encontrando por primera vez en la verbena los compuestos: asperulósido, glucósido de ácido tuberónico o ácido 5'-hidroxijasmónico-5'-O-glucósido, shanzidósido y el ixósido.94 Los extractos de esta especie han sido utilizados en la síntesis de nano partículas; Cruz y Col.95 desarrollaron un método biológico sencillo para la síntesis de nanoparticulas de Ag (AGNPS) con un extracto acuoso de hojas de Lippia citriodora como agente reductor. 2.1.8 Lippia dulcis Lippia dulcis (Figura 5) es una planta de origen americano, originaria de Cuba, una especie tropical presente en climas cálido y semicálido desde el nivel del mar hasta los 1800 m. Se ha comprobado experimentalmente su acción expectorante, tos, catarros y bronquitis. L. dulcis ha mostrado poseer una alta concentración de compuestos de tipo terpenoidal, específicamente sesquiterpenos dulces del tipo bisabolano como la hernandulcina y su epímero (-)-epihernandulcina, los cuales se han encontrado en altas proporciones en el aceite esencial del vegetal, siendo los componentes principales de estas hierbas. Por otro lado el aceite contiene cantidades trazas de alcanfor (