RESUMEN DE LA CLASE TEÓRICA (Sólo se explican los conceptos recientes. El resto de la información está en los libros de texto, aún desactualizados) VIRUS HERPES SIMPLEX Prof. Dr. Norberto Sanjuan

CARACTERÍSTICAS DEL VIRUS Y SU REPLICACIÓN El virus Herpes simplex (HSV) está clasificado, en base a su morfología, como un miembro de la familia Herpesviridae, de la cual forman parte más de 130 virus distintos que infectan a una amplia variedad de animales. El HSV-1 (un virus humano) fue descubierto en 1919 por Lowenstein y recién en 1962 Schneweiss describió al serotipo HSV-2. Estructuralmente está compuesto, de afuera hacia adentro, por una envoltura lipoproteica que se observa como una membrana trilaminar por microscopía electrónica de transmisión (MET), luego una zona amorfa denominada “tegumento” y por último una nucleocápside de simetría icosaédrica, de 100 nm de diámetro, organizada en 162 capsómeros y con forma toroidal, que contiene al DNA viral. El virión (que es la partícula viral infectante) mide entre 120 y 280 nm, dependiendo del espesor del tegumento. La envoltura, al ser la parte más externa de la partícula viral, no sólo recubre a la nucleocápside sino que también interactúa con los receptores celulares. Está compuesta por 11 proteínas de las cuales 10 son glicoproteínas, denominadas gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI, gK, gL y gM. El tegumento contiene proteínas no glicosiladas, algunas de ellas críticas en los procesos de replicación viral y de latencia, como VP-16 (“VP” indica “viral protein”). La cápside es también proteica y, en conjunto con las proteínas del tegumento, contiene los 20 péptidos restantes que forman el virión. El DNA viral es bicatenario y lineal, compuesto por 150 Kilopares de bases (Kpb) y estructurado en dos segmentos: el “largo” (UL) y el “corto” (US) que están separados por secuencias de DNA palindrómicas (es decir, repetitivas pero inversas). Estas secuencias tienen funciones regulatorias en la expresión del genoma. El HSV puede infectar una amplia variedad de células in vitro, aunque in vivo se acepta que tiene un tropismo preferencial por los tejidos derivados del ectodermo embrionario, especialmente la piel y el sistema nervioso. A nivel de una sola célula, el HSV-1 inicia su ciclo de replicación contactando las gB y gC con el receptor celular que es el componente glicosaminoglicano del heparan sulfato ubicado en la membrana plasmática. El siguiente paso es la interacción de gD con un co-receptor celular que puede ser de 3 tipos. El primer tipo corresponde a un miembro de la familia de receptores para el TNF (factor de necrosis tumoral). A este co-receptor originalmente se lo denominó HVEM (Herpes virus entry mediator) pero posteriormente se le cambió el nombre por el de HveA. El segundo tipo de co-receptores pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas y está relacionado con el receptor para el virus Polio. Este co-receptor puede, a su vez, tener 2 variantes: el HveB y el HveC. Se ha observado recientemente que estos co-receptores son

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proteínas que intervienen como moléculas de adhesión intercelulares, por lo cual se las denominó “nectinas”. De tal forma que la nomenclatura más actual es “nectina 1-alfa” para designar a HveC y “nectina 2-alfa” para denominar a HveB. Estas nectinas (sobre todo la 1alfa) son importantes no sólo para determinar el tropismo del HSV-1 (dado que están presentes en la piel, el cerebro, los ganglios raquídeos, etc) sino, además, para permitir el pasaje intercelular del virus. El tercer tipo de co-receptor con el que HSV-1 puede interactuar es el heparán sulfato 3-O-sulfatado. El último paso para el ingreso de la partícula viral a la célula es la fusión de la envoltura viral con la membrana plasmática celular. Si en vez de ingresar por la mencionada fusión el virus entrara por endocitosis la infección productiva no tendría lugar. Posteriormente, las nucleocápside y algunas proteínas del tegumento son transportadas hacia los poros nucleares, probablemente a través de su interacción con dineína, que es una proteína motora asociada a microtúbulos. No obstante, este punto es aún oscuro, porque fue demostrado en pocos sistemas de cultivos celulares. En el borde del poro nuclear, las nucleocápsides liberan al DNA viral que, en consecuencia, ingresa al núcleo por mecanismos aún hoy poco conocidos, quedando la cápside vacía en el citoplasma. Dentro del núcleo el genoma viral se circulariza uniéndose por sus extremos palindrómicos. El genoma del HSV-1 ubicado en el núcleo celular se expresa en forma de cascada, con 3 grupos de genes diferentes que se denominan alfa (o inmediatamente tempranos), beta (o tempranos) y gamma (o tardíos). Los genes alfa y gran parte de los beta son reguladores de la síntesis del DNA viral, mientras que los gamma son genes que codifican para la síntesis de proteínas estructurales. Los 3 grupos de genes regulan su expresión entre sí, induciendo o reprimiendo la expresión de los otros. El comienzo de la transcripción de los genes alfa está dado por la presencia en el núcleo de la proteína del tegumento VP-16, mientras que la proteína UL41 bloquea la síntesis de las proteínas celulares. Una vez sintetizadas las proteínas en el citoplasma, regresan al núcleo donde se unen al DNA viral que se obtuvo por replicación previa y ensamblan nuevas nucleocápsides. Inmediatamente las proteínas que formarán el tegumento recubren a las nucleocápsides y las partículas se acercan a la membrana interna de la envoltura nuclear, donde VP-16 es esencial para que las partículas broten desde esa membrana. Es incierta la ruta de egreso de los viriones una vez ubicados en el espacio formado entre las membranas interna y externa de la envoltura nuclear. La más aceptada afirma que las partículas envueltas migran por el citoplasma dentro de la luz del retículo endoplásmico o en vesículas pertenecientes al aparato de Golgi o del sistema trans-Golgi, donde maduran las glicoproteínas. De esta forma el virus saldría de la célula siguiendo el aparato secretor celular, a través de vesículas que se fundirían con la membrana plasmática y liberarían a las partículas virales o, alternativamente, cambiando su envoltura por una nueva obtenida de la membrana plasmática celular. Como consecuencia de todo este proceso, el virus induce en la célula infectada cambios morfológicos sustanciales, tales como el redondeamiento, la eventual formación de sincicios y alteraciones nucleares que, en conjunto, constituyen el efecto citopático viral (ECP).

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LA INFECCIÓN LÍTICA Y LA LATENCIA VIRAL Desde el clásico trabajo de Lascano y Berría donde se aplicó por primera vez el método de inmunoperoxidasa (PAP) para el seguimiento de una infección experimental por HSV-1, se confirmó desde el punto de vista histopatológico e inmunocitoquímico lo que había sido propuesto anteriormente por métodos no tan precisos: el HSV replica inicialmente en un epitelio y posteriormente avanza por el sistema nervioso periférico hasta alcanzar la médula espinal y el encéfalo cuando el virus había sido inoculado, por ejemplo, en la almohadilla plantar de la pata del ratón. El método PAP permite realizar estudios in situ de la presencia de antígenos virales que son casi siempre incontrovertibles, ya que los antígenos aparecen coloreados en los cortes histológicos, y los tejidos y células infectadas pueden caracterizarse simultáneamente contracoloreando ténuemente los preparados con hematoxilina. Este método permitió reemplazar al clásico procedimiento de aislamiento de virus de cada uno de los órganos mediante la homogeneización de los distintos tejidos supuestamente infectados y la posterior inoculación en cultivos celulares. La aplicación sistemática del método PAP, permitió determinar con precisión la progresión de la infección intravaginal por el HSV-2 en ratones, el estudio experimental de la infección de HSV-2 durante la preñez o el compromiso de los linfocitos T en la infección genital a través del seguimiento de la infección intravaginal en ratones genéticamente atímicos. Una vez alcanzado el sistema nervioso central (SNC), en los modelos murinos habitualmente el HSV-1 provoca la muerte del animal debida a una encefalitis. En otros modelos, en cambio, se establece un tipo de infección similar al que ocurre en el humano, denominada “latente”. La infección latente se caracteriza porque el virus se encuentra en el núcleo de las neuronas en forma episomal (es decir, circularizado y extracromosómico), con la sola transcripción de 3 intrones denominados LATs (latency-associated transcripts), que tienen 8,3, 2 y 1,5 Kpb. Es decir que el DNA viral se encuentra en el núcleo de las neuronas latentemente infectadas en forma circularizada, sólo transcribe los LATs (que no se traducen en la síntesis de proteína alguna ya que no tienen la polaridad del RNA mensajero) y no expresa proteínas en la membrana plasmática celular. Este es un verdadero mecanismo de evasión del virus para no ser detectado dentro de las neuronas por la intensa respuesta inmune celular y humoral concomitante que se observa durante el estadio de latencia. Otros mecanismos de evasión han sido descriptos, incluyendo uno recientemente detectado que implica el aumento de la liberación de Galectina-1 luego de la infección por HSV-1, lo que lleva a la apoptosis de los linfocitos T. Simultáneamente los LATs contribuyen a evitar la apoptosis de la neurona que alberga al HSV-1 durante la fase de latencia, hecho que sería esperable luego de una infección viral aguda de esas células, y estarían también involucrados en el tropismo viral. Otros genes de importancia son el GRE (elemento de respuesta a los glucocorticoides) que responde al contacto con el receptor de glucocorticoides aumentando la replicación viral, y el gen que codifica para la enzima Timidina Kinasa (TK). Esta enzima es la responsable de la acción del fármaco aciclovir e interviene en la neurovirulencia del HSV. Los mecanismos moleculares que hacen mantener el estado de latencia son todavía desconocidos en su mayor parte. Existen básicamente 2 teorías para explicarlos (seleccionadas de las múltiples especulaciones e hipótesis publicadas). Una de ellas se basa en que, dado que el DNA del HSV-1 es bicatenario y que sus genes alfa son esenciales para iniciar la replicación viral y en consecuencia un ciclo lítico, es curioso el hecho de que en la cadena complementaria a los genes alfa 0 y alfa 4 se encuentra la secuencia nucleotídica 3

que codifica a los LATs. De acuerdo a esta teoría, la síntesis de los LATs sería de naturaleza anti-RNA mensajero de los genes alfa mencionados, inhibiendo de esta manera el comienzo de la transcripción del genoma viral por la inhibición de la expresión de los genes alfa 0 y alfa 4. Una segunda teoría, más reciente, propone una mayor participación de algunos factores celulares en el mantenimiento del estado de latencia. En este sentido, es sabido que un factor crítico para que el genoma del HSV-1 ubicado en el núcleo celular comience su transcripción es su activación por una proteína del tegumento del virus, la VP16, que viaja hacia el núcleo en forma independiente del trayecto realizado por la nucleocápside viral. Existen evidencias experimentales que indican la presencia de VP-16 conjugada con un factor celular denominado “Oct-1” y otra proteína celular denominada “HCF” (de “host cell factor”) en el citoplasma de las células latentemente infectadas con HSV-1. Si estas células reciben en forma experimental algunos de los estímulos conocidos para la reactivación de la infección herpética (todos ellos tendientes a un estado de “stress” celular) el complejo formado por VP-16, Oct-1 y C se translada del citoplasma al núcleo y actúa como un factor de transcripción del genoma viral, especialmente sobre los genes alfa 0 y alfa 4, permitiendo iniciar de esta manera la síntesis de nuevas moléculas de DNA viral, su posterior encapsidación intraneuronal y su migración intra-axonal hacia el epitelio del dermatoma correspondiente a la neurona infectada. Si, en cambio, el estímulo no existiera, el complejo mencionado permanecería en el citoplasma y, en consecuencia, los genes alfa no serían transcriptos, manteniendo de ese modo el estado de latencia. Durante el año 2006 se descubrió el primer factor exclusivamente neuronal humano que estaría involucrado en la latencia viral: la proteína Zanghfei. Esta proteína actúa sobre VP-16, impidiendo la formación del trímero VP-16-Oct-1-HCF y, de esta forma, impidiendo la replicación viral. Esto contribuiría al mantenimiento de la latencia. Otro hecho reciente fue la observación de que, durante la latencia, los genes LATs promueven el ensamblado de heterocromatina celular sobre los promotores de los genes virales involucrados en la lisis celular. Este mecanismo epigenético está asociado a la metilación de algunas histonas celulares y también contribuiría al mantenimiento de la latencia, así como la codificación por parte del virus de micro RNAs, que anulan la expresión de algunos genes virales. Más recientemente se detectaron poblaciones oligoclonales de linfocitos T CD8+ infiltrando a las neuronas latentemente infectadas en el ganglio de Gasser y obtenidos de cadáveres humanos. No obstante, no está claro cómo estas células, que pueden liberar sustancias líticas, no lo hacen en este caso y de esa forma no destruyen a las neuronas. Lo reciente de esta publicación (2007) hace que todavía sea prematuro analizar el papel de estos linfocitos en la latencia. Cualesquiera sean los mecanismos involucrados en el mantenimiento del estado de latencia el hecho es que, luego de su reactivación, el HSV-1 migra hacia el epitelio que forma parte del dermatoma y replica activamente en él, provocando la lisis de las células de la capa de Malpighi y la posterior espongiosis (edema intercelular), que llevará más tarde a la formación de vesículas múltiples repletas de virus. Estas vesículas por último se resolverán con la formación de costras, dando fin al episodio de reactivación.

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