Sector agroalimentario

Plantas biofactoría Informe de Vigilancia Tecnológica

Plantas biofactoría Informe de Vigilancia Tecnológica

El presente Informe de Vigilancia Tecnológica ha sido realizado en el marco del convenio de colaboración conjunta entre Genoma España y Parque Científico de Madrid (PCM), entidad que, por delegación de la Universidad Complutense de Madrid, gestiona el Círculo de Innovación en Agroalimentación (CIAA), perteneciente al Sistema de Promoción Regional madri+d.

Los autores de este informe agradecen la colaboración ofrecida por toda la comunidad científica y empresarial para la realización de este informe, en especial a: - Dra. Covadonga Alonso Martí (INIA) - D.ª Isabel Bronchalo Bronchalo (AGRENVEC) - Dra. Sonia Castañón de la Torre (NEIKER) - Dr. Juan Antonio García Alvarez (CNB - CSIC) - Dra. Dolors Ludevid Múgica (IBMB - CSIC) - Dr. Luis Enjuanes Sánchez (CNB - CSIC) - Dr. José Angel Martínez Escribano (INIA) - Dr. Angel Mingo Castel (Univ. Pública de Navarra) - Dr. Ignacio Moreno Echanove (Plant Bioproducts) - Dr. Juan Plana Durán (Fort Dodge Veterinaria) - Dr. Fernando Ponz Ascaso (INIA) - Dr. Javier Pozueta Romero (Instituto de Agrobiotecnología y Recursos Naturales. UPN) - D.ª Lucía Roda Ghisleri (Ministerio de Medio Ambiente) - Dra. Julia Rueda Muñoz de San Pedro (Univ. Complutense de Madrid) La reproducción parcial de este informe está autorizada bajo la premisa de incluir referencia al mismo, indicando: Plantas Biofactoría. GENOMA ESPAÑA / CIAA-PCM. Genoma España no se hace responsable del uso que se realice de la información contenida en esta publicación. Las opiniones que aparecen en este informe corresponden a los expertos consultados y a los autores del mismo.

© Fundación Española para el Desarrollo de la Investigación en Genómica y Proteómica / Parque Científico de Madrid. Autores: Olga Ruiz Galán (CIAA) Esther García Iglesias (CIAA) Lara Gago Cabezas (CIAA) Víctor González Rumayor (CIAA) Coordinador: Miguel Vega García (Genoma España) Edición: Silvia Enríquez (Genoma España) Referencia: GEN-ES05001 Fecha: Febrero 2005 Depósito Legal: M-10665-2005 ISBN: 84-609-4621-5 Diseño y realización: Spainfo, S.A.

4

PLANTAS BIOFACTORÍA

Índice de contenido

•

RESUMEN EJECUTIVO

7

1.

INTRODUCCIÓN. PLANTAS BIOFACTORÍA

9

2.

TECNOLOGÍAS PARA LA OBTENCIÓN DE PLANTAS BIOFACTORÍA

14

2.1. Sistemas de expresión de proteínas recombinantes. 2.1.1. Transformación genética estable de las plantas. 2.1.2. Expresión transitoria. 2.2. Estrategias tecnológicas para optimizar la obtención de proteínas recombinantes en plantas. 2.2.1. Aumento del rendimiento de producción. 2.2.2. Autenticidad estructural.

14 15 21

CULTIVOS DE INTERÉS EN AGRICULTURA MOLECULAR

35

3.1. 3.2. 3.3. 3.4.

36 37 38 39

3.

4.

Plantas de hoja y forrajeras. Semillas de cereales y leguminosas. Frutas, tubérculos y hortalizas. Oleaginosas y de fibra.

24 24 32

MOLÉCULAS DE INTERÉS

41

4.1. Proteínas recombinantes. 4.1.1. Proteínas de interés biosanitario. 4.1.2. Proteínas de interés industrial. 4.2. Ingeniería metabólica. 4.2.1. Modificación de rutas enzimáticas existentes. 4.2.2. Introducción de nuevas rutas enzimáticas.

41 41 55 56 56 60

5.

LEGISLACIÓN

61

6.

ASPECTOS DE MERCADO

67

7.

ASPECTOS SOCIOECONÓMICOS

74

5

8. EJEMPLOS DE GRUPOS DE INVESTIGACIÓN ESPAÑOLES

78

9. CONCLUSIONES

92

10. ANEXOS Anexo Anexo Anexo Anexo Anexo

I. II. III. IV. V.

94 Proyecto Pharma-Planta. Proyectos financiados por la Unión Europea. Centros públicos de investigación y proyectos. Empresas. Patentes.

94 96 102 103 108

11. REFERENCIAS

122

12. LISTA DE ABREVIATURAS

126

13. GLOSARIO

127

6

PLANTAS BIOFACTORÍA

Resumen ejecutivo La ingeniería genética de plantas surgió a

transformación del material vegetal hasta la

principios de los años 80, cuando se descubre

comercialización del producto final, presenta una

cómo transferir fragmentos de información

serie de factores críticos, que en ocasiones pueden

genética de un organismo vegetal a otro,

llegar a ser limitantes (riesgos ambientales,

permitiendo la expresión de caracteres deseables.

riesgos sobre la salud y rendimiento de

Desde entonces, el desarrollo de las tecnologías

producción). Se han diseñado distintas estrategias

de transformación y regeneración de plantas ha

tecnológicas que contribuyen a minimizar el

sido tal que ha permitido realizar modificaciones

impacto de estos factores.

que parecían impensables. Las aplicaciones en el campo biofarmacéutico son Las primeras aplicaciones comerciales de la

especialmente interesantes. La utilización de

modificación genética de plantas se encaminan a

microorganismos modificados genéticamente

la obtención de cultivos que presenten ventajas

para la obtención de moléculas de interés

agronómicas como tolerancias a herbicidas,

terapéutico comenzó hace dos décadas con la

resistencias a plagas y patógenos o tolerancia a

producción de insulina humana recombinante.

condiciones adversas como salinidad o sequía.

En 2002, veinte años después, ya existían

El cultivo de estas plantas proporciona beneficios

aproximadamente 90 fármacos desarrollados y/o

a los agricultores debido a que implican mayores

producidos por métodos biotecnológicos en el

rendimientos y/o menores costes de producción.

mercado, que movieron cerca de 35 billones de dólares. Las estimaciones indican que en el año

La segunda generación de plantas transgénicas

2010 los biofármacos serán un 35% del mercado

corresponde a plantas que presentan mejores

farmacéutico, con unos beneficios estimados de

propiedades organolépticas y nutricionales. Las

20 billones de dólares.

modificaciones que se realizan en estas plantas son más complejas, ya que se encuentra

Sin embargo, parece que el aumento de la

implicado un mayor número de genes.

demanda de este tipo de productos será tal que

Se considera que los beneficios de este tipo de

los actuales sistemas de producción no podrán

plantas repercuten tanto en los productores de

hacer frente a la misma. Por ello, será necesario el

alimentos como en el consumidor final.

desarrollo de nuevos sistemas de producción que permitan la obtención de estos biofármacos en

En ambos casos se trata de plantas modificadas

cantidades más elevadas y a un coste asequible.

genéticamente utilizadas para la elaboración de

La utilización de plantas como biofactorías de

alimentos destinados al consumo humano y animal.

estos productos se perfila como una posible solución. En el campo específico de plantas como

Existe una tercera generación de plantas

biofactorías, se estima que los primeros productos

transgénicas que corresponde a plantas

llegarán al mercado en el año 2006, y que el valor

modificadas genéticamente para producir

de mercado, sólo en EE.UU., alcanzará los 2.200

compuestos de alto valor añadido. En este caso no

millones de euros en 2011.

se busca la producción de alimentos, sino que se pretende que la planta se convierta en una

El desarrollo de plataformas biotecnológicas de

biofactoría de productos de interés en los campos

producción de proteínas recombinantes en plantas

biosanitario, farmacéutico o industrial. Este

se encuentra liderado por los Estados Unidos y

informe pretende describir de manera detallada

Canadá, donde ya existen productos comerciales.

cuál es el estado en el que se encuentra el

Europa sufre un retraso en la implantación de

desarrollo de esta tercera generación de plantas

estos sistemas, debido fundamentalmente a la

transgénicas, tanto en el ámbito tecnológico como

moratoria que impedía el uso de nuevos

en lo referente a los aspectos legislativos,

transgénicos. El sector se encuentra formado por

socioeconómicos y comerciales.

grupos de investigación de centros públicos y universidades, y por empresas generalmente de

La primera parte del informe analiza las

pequeño y mediano tamaño.

tecnologías que se están utilizando en la actualidad para la obtención plantas biofactoría.

Con el fin de reflejar el estado en el que se

El proceso productivo, que incluye desde la

encuentra actualmente este mercado se realiza

7

una descripción de algunas de las empresas tipo dedicadas a esta actividad. Dentro de esta descripción se incluyen las tecnologías que utilizan, los productos en desarrollo y la fase en la que se encuentran, así como las estrategias que siguen en cuanto a la propiedad industrial. La legislación aplicable a las plantas biofactoría condiciona extraordinariamente los sistemas de producción. La normativa europea referente al control de las actividades en las que se produzcan o empleen OMGs es muy estricta. Su objetivo es asegurar que estas actividades se lleven a cabo en condiciones en las que los riesgos para la salud y para el medio ambiente sean mínimos. Se ha dedicado un apartado a estudiar la legislación en el que se incluyen referencias a la normativa aplicable a la utilización confinada, liberación y comercialización de OMGs, así como a los procedimientos administrativos de autorización de las mismas. Por último, se analizará cuál es la posición de nuestro país en el desarrollo de plantas transgénicas de tercera generación. Para ello se ha realizado un mapa de las empresas y grupos de investigación que en la actualidad desarrollan sus actividades en este campo. Se han recogido los datos referentes a las líneas y proyectos de investigación y patentes desarrolladas por estos grupos, así como la percepción de los investigadores principales en cuanto al futuro de las plantas biofactoría en nuestro país.

8

PLANTAS BIOFACTORÍA

1. Introducción. Plantas biofactoría La utilización de plantas como biofactorías de productos de alto valor añadido despierta un elevado interés tanto en los científicos como en las empresas de biotecnología, debido a las ventajas de tipo económico, técnico y de seguridad que presentan las plantas para ser usadas como sistemas de producción1. Cuando hablamos de plantas como biofactorías nos referimos al cultivo a escala agrícola de plantas superiores que han sido transformadas de modo que pasen a expresar productos que no expresaban anteriormente (o que expresaban en cantidades muy pequeñas) y que poseen un

elevado valor añadido. Pueden usarse plantas tradicionalmente utilizadas para la obtención de alimentos, piensos u otros productos como fibras, u otras especies. La modificación genética de la planta da lugar a la expresión de una nueva proteína que la planta no poseía. Esta proteína puede ser el producto de interés que se desea obtener, o bien puede ser una enzima que modifique una ruta metabólica de la planta, y como consecuencia ésta pasa a expresar un nuevo compuesto que anteriormente no producía. En el primer caso se habla de agricultura molecular y en el segundo de ingeniería metabólica.

Agricultura molecular La expresión “agricultura molecular” procede de la expresión en inglés “molecular farming” y consiste en la aplicación de la biotecnología de plantas para introducir en una planta genes que codifican para determinadas proteínas con interés biomédico o industrial para el hombre, como vacunas, anticuerpos, biofármacos, polímeros o enzimas, de modo que la planta sea capaz de producirlos. Ingeniería metabólica La ingeniería metabólica consiste en la modificación de las rutas metabólicas de la planta para incrementar la síntesis de moléculas deseables, bien mediante la introducción de genes que codifican para enzimas que completan una ruta metabólica existente en la planta, o genes que codifican para todas las enzimas de una ruta metabólica que no posee la planta.

Para que la planta exprese estos productos es necesario introducir los genes que los codifican, lo cual puede hacerse mediante distintos sistemas que se indicarán más adelante. La planta transformada podrá cultivarse en el campo tal y como se hace con los cultivos tradicionales, o bajo distintos sistemas de confinamiento o de contención y una vez que alcance el desarrollo adecuado se recolectará. El material vegetal recolectado contendrá el compuesto de interés y en función de su uso, puede ser purificado para su envasado y comercialización en forma pura, o bien puede comercializarse sin purificar tal y como ocurre con las vacunas comestibles.

1

Twyman, R. M.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Fischer, R. (2003). Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends in Biotechnology, 21, 570-578.

9

Construcción de un vector de transferencia Introducción del vector en la célula vegetal

Célula modificada genéticamente

Aislamiento del gen de interés

Cultivo de las células

Trasplante a un campo de cultivo confinado

Consumo directo

Elaboración de fármacos

Consumo animal

Figura 1. Esquema general

10

Consumo humano

PLANTAS BIOFACTORÍA

Este informe se centra principalmente en la obtención de proteínas recombinantes de interés biosanitario e industrial mediante agricultura molecular, ya que es ésta la aplicación que concentra mayor número de empresas y mayor cantidad de productos cercanos a la comercialización. Nos referiremos a la ingeniería metabólica en el apartado dedicado a los productos, explicando los puntos más importantes. Las proteínas recombinantes son moléculas complejas cuya obtención a escala industrial mediante síntesis química es muy difícil o costosa. Por este motivo, en la actualidad se obtienen mediante la utilización de cultivos celulares de microorganismos (bacterias, levaduras y hongos) o células de organismos superiores entre los que se incluyen insectos, mamíferos o plantas. Uno de los principales inconvenientes que presentan estos sistemas es que implican costes elevados, debido a que requieren aportes de nutrientes y energía y deben llevarse a cabo en condiciones de esterilidad. Estos sistemas además presentan riesgos de contaminación de los productos con distintos agentes que pueden resultar peligrosos para la

salud de las personas y los animales. En el caso de las bacterias estos agentes son las endotoxinas bacterianas, mientras que cuando se trata de células de mamíferos son virus, priones y secuencias oncogénicas. Una alternativa a los cultivos celulares es la utilización de plantas y animales completos. En el caso de los animales se está investigando la expresión de las proteínas en huevos o leche, por ejemplo, lo cual permitiría una recolección continua relativamente sencilla. Sin embargo, este tipo de sistemas presenta inconvenientes relativos a la seguridad debido a la posible presencia de agentes contaminantes y patógenos. La utilización de plantas completas presenta ventajas de tipo económico, técnico y de seguridad del producto frente a los sistemas de expresión que se utilizan en la actualidad para obtener proteínas recombinantes, y además presenta ventajas de seguridad frente los animales transgénicos. A continuación se indican las principales ventajas que presentan las plantas para su utilización como biofactorías.

VENTAJAS DE LA UTILIZACIÓN DE PLANTAS BIOFACTORÍA 2, 3, 4 • De tipo económico5, 6, 7 – Permiten usar los recursos y la infraestructura agrícola existente (maquinaria para la siembra, cosecha y procesado del material vegetal, silos, etc.), lo que resulta en una reducción del capital inicial que se debe invertir. – Presentan costes de producción bajos. La energía necesaria para el crecimiento del cultivo procede del sol y los nutrientes son el dióxido de carbono atmosférico y los minerales del suelo o procedentes de la fertilización. – Permite un escalado sencillo tanto para aumentar la producción como para reducirla, simplemente aumentando o reduciendo la cantidad de terreno dedicada al cultivo. – El cultivo de plantas produce una gran cantidad de biomasa en la que se acumula la proteína recombinante, por lo que pueden alcanzarse producciones elevadas. – Las líneas transgénicas pueden mantenerse durante un tiempo largo en forma de semillas, de modo que la planta se encuentra en un estado de latencia en el que no se necesitan condiciones de mantenimiento costosas. Por el contrario otros sistemas de expresión requieren condiciones muy controladas o incluso es necesario reproducir las células con el consiguiente gasto de nutrientes y energía. – En el caso de proteínas que necesitan ser purificadas los costes de procesado son similares a los de otros sistemas de expresión, pero en el caso de proteínas que no se purifican estos costes se eliminan. (continúa en pág. siguiente)

2

3 4

5

6 7

Horn, M. E.; Woodard, S. L.; Howard, J. A. (2004). Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Rep., 22, 711-720. Giddings, G. (2001). Transgenic plants as protein factories. Current Opinion in Biotechnology, 12, 450–454. Daniell, H.; Streatfield, S. J.; Wycoff, K. (2001). Medical molecular farming:production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants. Trends in Plant Science, 6, 219-226. Yoshida, K.; Shinmyo, A. (2000). Transgene expression systems in plant, a natural bioreactor. Journal of Bioscience and Bioengineering, 90, 353-362. Maliga, P. (2002). Engineering the plastid genome of higher plants. Current Opinion in Plant Biology, 5, 164-172. Twyman, R. M.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Fischer, R. (2003). Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends in Biotechnology, 21, 570-578.

11

VENTAJAS DE LA UTILIZACIÓN DE PLANTAS BIOFACTORÍA (continuación)

• De tipo técnico8, 9 – Las plantas son sistemas relativamente fáciles de transformar. – Puede aumentarse la estabilidad de las proteínas recombinantes mediante su acumulación o síntesis en determinados compartimentos celulares (orgánulos subcelulares) donde se encuentran protegidas de la degradación. – La síntesis de proteínas y sus modificaciones postraduccionales son semejantes a las que realizan los animales, existiendo sólo pequeñas diferencias en cuanto a glicosilación. – La pared celular protege a la proteína contra la degradación en el tracto gastrointestinal, permitiendo la administración por vía oral sin purificación. – Pueden utilizarse sistemas mediante los cuales las moléculas recombinantes se almacenen en determinados órganos o tejidos de la planta como raíces, semillas, tubérculos, frutos, etc. • Referentes a la seguridad de los productos obtenidos – Las proteínas procedentes de plantas no son susceptibles de estar contaminadas por virus animales o humanos, priones o secuencias oncogénicas que puedan afectar al ser humano o a animales.

Aunque la utilización de plantas completas como sistemas de expresión presenta ventajas muy importantes, existe una serie de factores críticos que es necesario tener en cuenta, ya que tienen un papel fundamental en el éxito de la agricultura molecular. Estos factores se refieren principalmente a problemas de seguridad ambiental, posibles efectos negativos sobre la salud humana y animal y retos técnicos, entendidos como aquellos que afectan al proceso de producción y purificación. De estos factores críticos, los retos técnicos están siendo abordados mediante el desarrollo de tecnologías que optimizan el proceso productivo.

8

9

Sin embargo, parece que algunos factores críticos relacionados con el medio ambiente y con la salud humana y animal necesitarán de esfuerzos adicionales, ya que no siempre es posible el desarrollo de tecnologías adecuadas que permitan reducir su impacto. Esto hace que, de momento, sea necesaria la utilización de buenas prácticas de cultivo y de medidas de confinamiento para poder prevenir algunos de los riesgos asociados a este tipo de cultivos. Además, al tratarse de riesgos sobre la salud y sobre el medio ambiente, entra en juego la aceptación de estos cultivos por distintos agentes socioeconómicos. Dentro de éstos se incluyen agentes implicados en la cadena alimentaria (agricultores y ganaderos, productores, distribuidores, consumidores, etc.), grupos ecologistas, legisladores y la opinión pública en general.

Koprowski, H.; Yusibov, V. (2001). The green revolution: plants as heterologous expression vectors. Vaccine 19, 2735–2741. Fischer, R.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Twyman, R. M. (2004). Plant-based production of biopharmaceuticals. Current Opinion in Plant Biology, 7, 152–158.

12

PLANTAS BIOFACTORÍA

FACTORES CRÍTICOS DE LAS PLANTAS BIOFACTORÍA10, 11, 12

• Ambientales – Riesgo de escapes por flujo de polen, que dan lugar a problemas de coexistencia con otros cultivos. El polen de las plantas modificadas genéticamente puede dispersarse por el viento, o a través de insectos polinizadores llegando a otros cultivos en los que podrá introducir los transgenes que contiene. – Contaminación cruzada por mezcla de semillas. Puede tener lugar en todas las fases del proceso de cultivo incluyendo contaminación a través de la maquinaria agrícola durante la siembra y recolección, y en el almacenamiento, transporte y procesado. Esta mezcla de semillas puede ocasionar problemas ambientales en caso de siembra de las mismas y podría tener implicaciones en la salud de animales y personas si se produjera el paso a la cadena alimentaria. – Riesgo de ingestión por los animales que existan en el campo de cultivo, como pequeños mamíferos, aves o invertebrados. – Riesgo de permanencia en el suelo de restos procedentes de las plantas transformadas como semillas o brotes, a partir de los que puede volver a crecer la planta. – Riesgo de permanencia en el medio de proteínas transgénicas potencialmente peligrosas que podrían acumularse en otros organismos. • Salud humana y animal – Posible riesgo de pasar a la cadena alimentaria. Este hecho podría producir distintos problemas en función del tipo de sustancia que se esté expresando (tolerancia en el caso de las vacunas u otros efectos en el caso de los fármacos). – Riesgo de contaminación con herbicidas o insecticidas que se utilizan en el cultivo de plantas. Como consecuencia de la utilización de estos compuestos pueden quedar residuos que pueden ser perjudiciales para la salud humana y animal en caso de ingestión. – Riesgo de contaminación con micotoxinas. Son toxinas que se producen como consecuencia del crecimiento de hongos sobre el material vegetal cosechado, principalmente durante el almacenamiento. Son sustancias que presentan efectos nocivos sobre la salud animal y humana. • Técnicos – El tiempo necesario para la obtención de la primera cosecha de la planta que expresa la proteína recombinante es mayor que en otros sistemas de expresión como microorganismos o células de mamíferos. Es necesario preparar los vectores de expresión, transformar, regenerar y cultivar las plantas, así como evaluar varias generaciones con el fin de asegurar que la expresión de estas sustancias es estable y que la sustancia de interés es bioquímicamente activa. – Pueden existir problemas de expresión baja para algunas proteínas. – Las modificaciones postraduccionales que llevan a cabo las plantas no son exactas a las que llevan a cabo los mamíferos, siendo las diferencias principalmente en la glicosilación. – Dificultad para la dosificación en el caso de vacunas comestibles. Cuando la administración de la molécula es mediante la ingesta de la planta, es necesario conocer con seguridad los niveles de expresión de la molécula en la planta con el fin de poder ajustar la dosis de manera adecuada.

10

11

12

Daniell, H.; Streatfield, S. J.; Wycoff, K. (2001). Medical molecular farming:production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants. Trends in Plant Science, 6, 219-226. Twyman, R. M.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Fischer, R. (2003). Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends in Biotechnology, 21, 570-578. Fischer, R.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Twyman, R. M. (2004). Plant-based production of biopharmaceuticals. Current Opinion in Plant Biology, 7, 152–158.

13

2. Tecnologías para la obtención de plantas biofactoría A continuación se explican los sistemas más utilizados para la expresión de proteínas foráneas en plantas, así como aquellos sistemas que permiten la optimización de la producción de moléculas de interés en plantas, principalmente encaminados a aumentar el rendimiento de la proteína y a mejorar la autenticidad estructural.

2.1. Sistemas de expresión de proteínas recombinantes13, 14

animales o microbianas), consiguiendo que la

La obtención de plantas para su utilización como

En este apartado distinguiremos entre las

biofactorías de moléculas de interés se lleva a

modificaciones genéticas estables transmisibles a

cabo mediante el empleo de la tecnología del ADN

la descendencia y modificaciones que dan lugar a

recombinante. Esta tecnología permite introducir

la expresión transitoria de proteínas

en una planta material genético procedente de

recombinantes, que no se transmiten a la

otros organismos (otras especies vegetales,

descendencia.

Vector

planta modificada pase a expresar nuevas proteínas o bien que modifique la expresión de sus propias proteínas.

Célula transformada

Semillas

Regeneración Planta transformada

Nueva planta transformada

Figura 2. Transformación estable.

13

14

Mason, H. S.; Warzecha, H.; Mor, T.; Arntzen, C. J. (2002). Edible plant vaccines: applications for prophylactic and therapeutic molecular medicine. Trends in Molecular Medicine, 8, 324-329. Koprowski, H.; Yusibov, V. (2001). The green revolution: plants as heterologous expression vectors. Vaccine, 19, 2735–2741.

14

PLANTAS BIOFACTORÍA

Vector

Semillas Planta no transformada

Planta transformada Figura 3. Expresión transitoria.

2.1.1. Transformación genética estable de las plantas

La transformación genética estable de plantas puede realizarse mediante la introducción del material genético en el núcleo celular o bien en los

Mediante transformación genética estable se

plastos, que son orgánulos característicos de las

obtienen plantas modificadas genéticamente en

plantas que poseen material genético que puede

las que el material genético introducido aparece

ser transformado.

en todas las células de la planta y se transmite a la descendencia. Son lo que se denomina

Lo más frecuente es realizar la transformación del

“plantas transgénicas”.

material nuclear. Mediante distintas técnicas que se explicarán a continuación es posible introducir

La principal ventaja que presenta este tipo de

en el núcleo de la célula el transgén de interés y

transformación es que la modificación se transmite a

conseguir que éste se exprese dando lugar a la

la descendencia, tanto por reproducción sexual

proteína foránea. A continuación se indican las

(mediante semillas), como por reproducción asexual

principales ventajas e inconvenientes de este tipo

(mediante esquejes, micropropagación, etc.).

de transformación.

VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA TRANSFORMACIÓN NUCLEAR Ventajas • Existen protocolos de transformación y regeneración para muchos vegetales, entre los que se incluyen muchas especies comestibles. Inconvenientes • La inserción del material genético ocurre al azar, existiendo fenómenos que disminuyen la producción como el efecto de posición o el silenciamiento. • La acumulación de las proteínas recombinantes en el citoplasma puede tener efectos tóxicos para la planta o interferir en el desarrollo. • Es necesario utilizar marcadores para seleccionar las plantas transformadas. • La modificación genética puede transmitirse a través del polen, lo que da lugar a riesgos de escape.

La transformación de plastos es una técnica relativamente nueva muy interesante en agricultura molecular, debido a que presenta múltiples ventajas frente a la transformación nuclear, en lo referente a seguridad ambiental o a los niveles de expresión. Los plastos son orgánulos subcelulares característicos de las células vegetales, que poseen varias copias de un cromosoma circular de pequeño tamaño denominado plastoma. Se encuentran en los distintos tejidos y órganos de las plantas pudiendo presentar distintas morfologías y funciones. Algunos ejemplos de plastos

15

son los cloroplastos de tejidos verdes y hojas, que

eficaces. Por este motivo, el interés principal

realizan la fotosíntesis, los cromoplastos de flores

se está dirigiendo hacia la transformación

y frutas maduras, los amiloplastos, que aparecen

de cloroplastos, aunque el potencial de transformar

en órganos de almacén como tubérculos o los

cromoplastos de frutas y verduras presenta ventajas

leucoplastos, que aparecen en raíces15.

obvias para la obtención de vacunas de subunidades comestibles16.

Aunque todos los tipos de plastos presentan varias copias del plastoma, no todos poseen la

Las ventajas e inconvenientes que presenta la

misma capacidad de expresar los genes

transformación genética de cloroplastos frente a la

que contienen, siendo los cloroplastos los más

transformación nuclear son las siguientes:

VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA TRANSFORMACIÓN DE CLOROPLASTOS17, 18, 19, 20 Ventajas • Integración del ADN transformante mediante recombinación homóloga, lo que previene el efecto de posición. • Ausencia de efectos epigenéticos como silenciamiento, cosupresión, etc. • Elevados niveles de expresión debido a que cada cloroplasto presenta un gran número de copias de su cromosoma, y cada célula presenta un número elevado de cloroplastos. El número copias del ADN del cloroplasto por célula puede ser hasta 10.000, lo que puede dar como resultado una acumulación de hasta el 47% de las proteínas totales solubles. • Las proteínas recombinantes se acumulan en el interior del cloroplasto previniendo problemas de toxicidad o interferencia en el desarrollo de la planta. • Permite la expresión de operones policistrónicos, por lo que se pueden introducir varios genes en un solo evento de transformación bajo el control de un solo promotor. Esto puede ser muy interesante en la ingeniería metabólica donde en ocasiones es necesario introducir varios genes que codifican para enzimas distintas de una ruta metabólica y se desea que se sinteticen de manera coordinada. • Los cloroplastos no se transmiten a través del polen ya que su herencia es materna en la mayor parte de las plantas, disminuyendo el riesgo de contaminación cruzada debido al aislamiento del transgén en el cloroplasto. • Permite eliminar los marcadores que se usan para seleccionar aquellas plantas en las que se ha introducido el ADN. Inconvenientes • Riesgo de transferencia horizontal de los transgenes a bacterias debido a la homología que presentan el genoma bacteriano y el de los cloroplastos. • La transformación de cloroplastos sólo se hace de manera rutinaria en tabaco y en el alga C. reinhardii y aunque se ha logrado transformar cloroplastos en algunas especies comestibles como zanahoria y tomate, todavía es necesario optimizar el proceso. • Los cloroplastos no son capaces de llevar a cabo algunas modificaciones postraduccionales como la glicosilación. • No se produce la exportación de las proteínas sintetizadas hacia otros orgánulos o compartimentos celulares.

15 16

17

18 19 20

Heifetz, P. B.; Tuttle, A. M. (2001). Protein expression in plastids. Current Opinion in Plant Biology, 4, 157–161. Fischer, R.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Twyman, R. M. (2004). Plant-based production of biopharmaceuticals. Current Opinion in Plant Biology, 7, 152–158. Daniell, H.; Khan, M. S.; Alison. L. (2002). Milestones in chloroplast genetic engineering: an environmentally friendly era in biotechnology. Trends in Plant Science, 7, 84–91. Maliga, P. (2002). Engineering the plastid genome of higher plants. Current Opinion in Plant Biology, 5, 164-172. Heifetz, P. B. (2000). Genetic engineering of the chloroplast. Biochimie, 82, 655-666. Heifetz, P. B.; Tuttle, A. M. (2001). Protein expression in plastids. Current Opinion in Plant Biology, 4, 157–161.

16

PLANTAS BIOFACTORÍA

Existen algunos ejemplos de productos obtenidos de plantas de tabaco en las que se han transformado los cloroplastos y se han conseguido rendimientos elevados21 como la producción de hormona del crecimiento humana (8% de la proteína soluble total o PST 22), albúmina sérica humana (11% PST 23), fragmentos de las toxinas colérica y tetánica (25% PST), y producción de una xilanasa termoestable (6% PST)24. La transformación de cloroplastos ha tomado un gran impulso en los dos últimos años. En 2002 se constituyó una empresa llamada Chlorogen dedicada a la obtención plantas transplastómicas mediante bombardeo con microproyectiles, para el desarrollo de fármacos y otros productos. A continuación se explican los sistemas de transformación estable más utilizados, entre los que se encuentran la transformación con Agrobacterium, microinyección, bombardeo con microproyectiles o transformación de protoplastos. Algunos de estos métodos permiten realizar transformación nuclear y de cloroplastos.

2.1.1.1. Transformación mediada por Agrobacterium 25 En la transformación mediada por Agrobacterium se utiliza este microorganismo como vector para introducir el material genético recombinante en la planta que se desea transformar. Agrobacterium es una bacteria del suelo patógena para plantas dicotiledóneas y algunas coníferas, capaz de inducir en estas plantas la formación de nódulos y agallas que pueden producir incluso la muerte de la planta. El mecanismo de infección de Agrobacterium consiste en la inserción en la planta de una parte de su material genético, conocido como T-DNA, y contenido a su vez en el

21

22

23

24

25

denominado plásmido Ti. El plásmido Ti es una molécula de ADN circular y contiene un grupo de genes denominados vir, que dirigen el proceso de infección, junto con genes implicados en la formación de los nódulos en la planta y genes implicados en la síntesis de aminoácidos denominados opinas que sirven de nutrientes para la bacteria. La inserción del T-DNA en la planta provoca la formación de nódulos y la síntesis de las opinas. Mediante manipulación genética del plásmido Ti, es posible eliminar los genes implicados en la formación de nódulos y de opinas y sustituirlos por los genes que deseamos que exprese la planta. Junto con los genes de interés es necesario introducir marcadores que permitirán seleccionar aquellas células que hayan sido infectadas y hayan integrado este material genético. Con estas bacterias recombinantes se pueden transformar células, tejidos e incluso órganos de plantas completas. Posteriormente se seleccionan aquellas células que han sido transformadas y a partir de ellas se regeneran plantas completas que presentarán la modificación en todas sus células. La regeneración de plantas es, en algunos casos, un proceso dificultoso que necesita un tiempo relativamente largo, respecto del cultivo de microorganismos o células animales, lo cual encarece el producto final. Por otra parte, existen fenómenos de variación somaclonal asociados al cultivo in vitro de células vegetales, que deben ser tenidos en consideración, puesto que pueden afectar a la producción final. Otro de los inconvenientes que plantea este sistema es que muchas monocotiledóneas se han mostrado tradicionalmente como resistentes a la infección por Agrobacterium. Las monocotiledóneas incluyen familias tan

Fischer, R.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Twyman, R. M. (2004). Plant-based production of biopharmaceuticals. Current Opinion in Plant Biology, 7, 152–158. Staub, J. M.; Garcia, B.; Graves J.; Hajdukiewicz, P.; Hunter, P.; Nehra, N.; Paradkar, V.; Schlittler, M.; Carroll, J. A.; Spatola, L.; Ward, D.; Ye, G.; Russell, D. A. (2000). High-yield production of a human therapeutic protein in tobacco chloroplasts. Nature Biotechnology, 18, 333-338. Fernández-San Millán, A.; Mingo-Castel, A.; Miller, M.; Daniell, H. (2003). A chloroplast transgenic approach to hyperexpress and purify Human Serum Albumin, a protein highly susceptible to proteolytic degradation. Plant Biotechnology Journal, 1, 71-79. Twyman, R. M.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Fischer, R. (2003). Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends in Biotechnology, 21, 570-578. Staub, J. M.; Garcia, B.; Graves J.; Hajdukiewicz, P.; Hunter, P.; Nehra, N.; Paradkar, V.; Schlittler, M.; Carroll, J. A.; Spatola, L.; Ward, D.; Ye, G.; Russell, D. A. (2000). High-yield production of a human therapeutic protein in tobacco chloroplasts. Nature Biotechnology, 18, 333-338.

17

importantes como las gramíneas, por lo que ha sido necesario desarrollar otros sistemas de transformación. No obstante se ha conseguido transformar mediante este método algunas monocotiledóneas muy importantes como maíz, trigo y arroz.

La inserción del material genético es aleatoria y puede ocurrir en varios sitios dentro de una misma célula, pudiendo originar problemas de silenciamiento o efectos posicionales. Por ello, es importante seleccionar posteriormente plantas con elevados niveles de expresión.

Construcción del plásmido Ti con el gen interés

Integración del ADN exógeno en el núcleo Agrobacterium

Infección de la célula vegetal con Agrobacterium modificado

Figura 4. Transformación mediante Agrobacterium.

2.1.1.2. Transformación biolística26 La transformación biolística consiste en el bombardeo del tejido que se desea transformar con partículas micrométricas o submicrométricas de oro o tungsteno recubiertas con el material genético que se desea insertar en la planta. Estas partículas penetran a través de la pared celular y la membrana plasmática llegando a zonas profundas de las células donde ocurre la inserción. Permite realizar la transformación del material genético del núcleo o del sistema plastidial (de hecho, es la técnica más utilizada para la transformación de cloroplastos y se ha probado su éxito con varias especies). Como en el caso de la transformación con Agrobacterium, se introducen los genes con un marcador y se seleccionan aquellas células en las que se ha insertado el material correctamente y a partir de ellas se regeneran plantas completas que presentarán la modificación en todas sus células. Normalmente este método implica la integración de un número de copias elevado, lo que potencia la expresión, aunque es necesario controlar el número de copias que se inserta, ya que un nivel de expresión muy elevado puede causar fenómenos de silenciamiento que llevan a una baja expresión. Por este motivo, se suelen seleccionar aquellas líneas que llevan entre una y tres copias del transgén, siempre y cuando estén en tándem.

26

Lessard, P. A.; Kulaveerasingam, H.; York, G.M.; Strong, A.; Sinskey, A. J. (2002). Manipulating Gene Expression for the Metabolic Engineering of Plants. Metabolic Engineering, 4, 67-79.

18

PLANTAS BIOFACTORÍA

Es el método de elección para la transformación de cereales como arroz, trigo y maíz, y para leguminosas como la soja.

Percutor

Pólvora Proyectil

Bolas de ADN

Se carga el proyectil con los fragmentos de ADN de interés

Célula vegetal

Los fragmentos de ADN traspasan las paredes y membranas celulares

Inserción del ADN en el cloroplasto o núcleo

Figura 5. Transformación biolística.

2.1.1.3. Microinyección

La incorporación del ADN puede facilitarse mediante distintos tratamientos que alteran la

La técnica de microinyección implica la inyección

permeablidad de la membrana. Entre estos

directa del material genético mediante

tratamientos se incluyen la aplicación de pulsos

microcapilares o microjeringas bajo control

eléctricos de elevado voltaje que inducen la

microscópico en la célula. Resulta poco efectiva

formación de poros reversibles en la membrana

porque es necesario inyectar las células una a una

del protoplasto (electroporación), o tratamientos

y es necesario inyectar al menos 10.000 células

con agentes químicos que desestabilizan la

para tener la seguridad de que al menos una de

membrana celular como el polietilenglicol (PEG).

ellas ha incorporado el material genético. En los protoplastos los plastos se sitúan cerca de Entre las ventajas principales de este sistema se

la membrana celular, por lo que se puede

encuentra la posibilidad de introducir el material

conseguir una permeabilización simultánea de la

genético en orgánulos distintos del núcleo como

membrana celular y de la doble membrana de los

los plastos.

plastos que permita la introducción del material genético en estos orgánulos.

2.1.1.4. Transformación de protoplastos27

La obtención de protoplastos con capacidad regenerativa puede hacerse a partir de distintos tejidos de la planta, aunque en el caso de cereales

Los protoplastos son células de cualquier tejido

sólo ha sido posible obtenerlos a partir de tejidos

vegetal a las que se elimina la pared celular

inmaduros.

mediante procesos químicos o enzimáticos, que en suspensión son capaces de incorporar de manera

La principal desventaja de este sistema es la

natural fragmentos de ADN que se encuentren en

dificultad de regenerar plantas a partir de

el medio.

protoplastos.

27

Lessard, P. A.; Kulaveerasingam, H.; York, G. M.; Strong, A.; Sinskey, A. J. (2002). Manipulating gene expression for the metabolic engineering of plants. Metabolic Engineering, 4, 67-79.

19

En algunos cereales como el maíz, se ha descrito una alternativa a la electroporación de protoplastos, que consiste en la electroporación de tejidos. Este tipo de electroporación presenta la ventaja de que la regeneración de plantas a partir de estos tejidos es más sencilla que a partir de protoplastos.28

COMPARACIÓN DE LOS DISTINTOS SISTEMAS DE TRANSFORMACIÓN ESTABLE

Transformación mediada por Agrobacterium

Ventajas

Inconvenientes

– Requiere regeneración mediante cultivo de tejidos. – Efectiva. – Barata. – Simple. – Número de copias bajo.

– Las plantas monocotiledóneas generalmente son reticentes a esta transformación. – La integración del transgén se produce al azar pudiendo dar lugar a efectos de posición, silenciamiento de genes, etc.

– Requiere regeneración mediante cultivo de tejidos. – Riesgo de silenciamiento y/o inestabilidad de genes.

Biolístico

– Eficiencia alta. – Simple. – Permite transformar monocotiledóneas. – Permite transformación plastidial.

– Riesgo de pérdida de material genético en el disparo o preparación de las partículas. – Riesgo de modificación del ADN por ataque químico del tungsteno. – Riesgo de inserción doble en plastos y núcleo. – Requiere equipos costosos. – En ocasiones puede conducir a una expresión transitoria difícil de superar.

Protoplastos

Microinyección

– Integración del transgén al azar.

– Puede optimizarse la cantidad de ADN que se introduce. – Permite la elección de la célula a transformar. – Descarga precisa y predecible.

– Requiere personal muy especializado. – Requiere instrumental. – Sólo una célula es transformada. – Integración del transgén al azar.

– Pueden transformarse plastos.

– Permite transformación plastidial. – Equipos relativamente sencillos comparado con biolísticos.

– Requiere regeneración. – Sólo existen protocolos de regeneración para determinadas especies. – Integración del transgén al azar.

Tabla 1. Ventajas e inconvenientes de los distintos sistemas de transformación estable.

28

Alexander, P. Sorokin; Xia-Yi, Ke; Dong-Fang Chen and Malcolm C. Elliott (2000). Production of fertile transgenic wheat plants via tissue electroporation. Plant Science, 156, 227-233.

20

PLANTAS BIOFACTORÍA

2.1.2. Expresión transitoria

La expresión transitoria de genes generalmente se utiliza para evaluar la funcionalidad de las

La expresión transitoria de genes en plantas

construcciones que se usan para transformar plantas

implica la expresión de proteínas recombinantes

de manera estable, y para evaluar la calidad del

sin necesidad de transformación del material

producto que se obtiene29. Sin embargo, debido a los

genético de la planta. El ADN recombinante no se

inconvenientes que presenta la transformación

inserta en el genoma o plastoma de la planta, sino

nuclear estable, principalmente en cuanto a tiempo,

que mediante distintos métodos se consigue

la expresión transitoria ha ido tomando mayor

producir grandes cantidades de ARN mensajero,

importancia para su utilización como sistema de

que se traduce a proteínas en el citoplasma de

producción de proteínas recombinantes30. Puede

parte de las células de la planta. Una vez que el

llevarse a cabo mediante la utilización de vectores

ARN mensajero es traducido a proteínas la planta

virales o mediante agroinfiltración.

lo degrada, de modo que no se transmite a la descendencia. Normalmente la expresión

También es posible la expresión transitoria en

transitoria no da rendimientos muy elevados y

plastos, como los sistemas in organello de

requiere un procesado rápido del tejido vegetal

introducción de ADN en plastos aislados y

para evitar la degradación de la proteína

métodos in vivo utilizando tecnologías de

recombinante.

bombardeo de microproyectiles o microinyección.

VENTAJAS DE LA EXPRESIÓN TRANSITORIA • Expresión rápida y flexible. • No está influida por efectos de posición. • Puede inducirse en plantas adultas, previniendo cualquier efecto negativo que la proteína recombinante pudiese tener en el desarrollo de la planta. • No es una modificación genética permanente, lo que desde el punto de vista de la seguridad es una ventaja. • Ideal para obtener pequeñas cantidades de proteínas “a medida” en pocas semanas31.

29

30

31

Twyman, R. M.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Fischer, R. (2003). Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends in Biotechnology, 21, 570-578. Fischer, R.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Twyman, R. M. (2004). Plant-based production of biopharmaceuticals. Current Opinion in Plant Biology, 7, 152–158.. Horn, M. E.; Woodard, S. L.; Howard, J. A. (2004). Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Report, 22, 711-720.

21

2.1.2.1. Agroinfiltración32, 33

2.1.2.2. Vectores Virales 35

Consiste en la infiltración mediante vacío de cepas de Agrobacterium tumefaciens recombinante que

La expresión transitoria de proteínas mediante

contengan los genes que se desean expresar en la planta. Como en el caso de la transformación

planta con virus recombinantes, que contienen las

estable mediada por Agrobacterium, las proteínas

bajo el control de promotores fuertes.

de la bacteria facilitan la transferencia de los genes de interés a algunas de las células de la

Los virus infectan la planta y utilizan su

hoja. El transgén se introduce en el núcleo celular, pero no se integra en el material genético de la planta.

vectores virales consiste en la inoculación de la secuencias que se desean expresar en la planta

maquinaria de síntesis proteica para expresar la secuencia que se ha introducido, dando como resultado la acumulación de la proteína

En este caso, no es necesario incluir marcadores

recombinante36. La secuencia que se desea

para seleccionar las células transformadas, ya que

expresar, por tanto, nunca se integra en el

no es preciso regenerar una planta, lo que permite utilizar plásmidos de menor tamaño. La utilización

genoma de la planta y se expresa sólo en la planta

de plásmidos permite introducir construcciones de mayor tamaño que utilizando vectores virales.

por polen o semillas. Puede elegirse el momento

Un inconveniente de la agroinfiltración es que permite producir elevados niveles de proteína recombinante pero durante períodos de tiempo muy

infectada, sin que se transmita a la descendencia del desarrollo en el que se desea infectar la planta con el fin de evitar posibles problemas que podría causar en el desarrollo la acumulación de la proteína recombinante.

cortos, que generalmente son insuficientes para la producción a escala comercial. Este hecho se debe a

Pueden usarse distintos tipos de virus vegetales

que se producen fenómenos de silenciamiento

para la construcción de los vectores, aunque lo

postranscripcional. Existen datos que indican que el silenciamiento postranscripcional puede reducirse

más frecuente es utilizar virus de cadena sencilla

mediante la coexpresión junto con la proteína recombinante de proteínas virales supresoras de

la alfalfa y del caupí, el virus X de la patata, el

éste, como es el caso de la proteína p19 del virus del

potyvirus de la viruela del ciruelo. Las ventajas

enanismo ramificado del tomate, que se ha demostrado que es efectiva en Nicotiana

que presentan los virus para ser utilizados como

benthamiana y en Arabidopsis34.

siguiente.

32

33

34

35

36

de ARN, como el virus del mosaico del tabaco, de virus del enanismo ramificado del tomate y el

sistemas de expresión se indican en la página

Fischer, R.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Twyman, R. M. (2004). Plant-based production of biopharmaceuticals. Current Opinion in Plant Biology, 7, 152–158. Fischer, R.; Vaquero-Martin, C.; Sack, M.; Drossard, J.; Emans, N.; Commandeur, U. (1999). Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry, 30, 113-116. Voinnet, O.; Rivas, S.; Mestre. P.; Baulcombe. D. (2003). An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. The Plant Journal, 33,949-956. Fischer, R.; Vaquero-Martin, C.; Sack, M.; Drossard, J.; Emans, N.; Commandeur, U. (1999). Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry, 30, 113-116. Sala, F.; Rigano, M. M.; Barbante, A.; Basso, B.; Walmsley, A. M.; Castiglione, S. (2003). Vaccine antigen production in transgenic plants: strategies, gene constructs and perspectives. Vaccine, 21, 803-808.

22

PLANTAS BIOFACTORÍA

VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA EXPRESIÓN MEDIANTE VECTORES VIRALES Ventajas • Presentan genomas pequeños fácilmente manipulables. • Poseen un elevado nivel de multiplicación que permite altos rendimientos. • Algunos tienen un rango de hospedadores elevado, lo que permite usar un mismo vector con distintas especies. • Puede realizarse una infección simultánea con varios vectores, consiguiendo la producción de distintas proteínas en una misma planta. • Al ser virus vegetales, no existe riesgo de infección a animales o personas. Inconvenientes • Es necesario inocular cada generación de plantas. • Algunas construcciones son inestables, existiendo el riesgo de que se pierdan los transgenes de un tamaño superior a 1 kb.

Introducción del vector en el virus

Virus transformado Se pone en contacto el virus modificado con la planta

Planta infectada con un virus transformado genéticamente Figura 6. Expresión transitoria de proteínas mediante vectores virales.

23

2.2. Estrategias tecnológicas para optimizar la obtención de proteínas recombinantes en plantas Como se ha indicado, uno de los factores críticos en la agricultura molecular es la obtención de una cantidad de proteína suficientemente elevada37 y, en algunos casos, además es necesario que la proteína que se obtiene sea estructuralmente idéntica a la proteína nativa.

mani

Purificación

c za i

Producto final

ón

Proteína recombinante (vacuna comestible)

Hu

Síntesis

Autenticidad estructural Degradación

A continuación se indican las estrategias que se

Además de obtener un rendimiento elevado de la

han desarrollado que permiten aumentar el

producción, en el caso de proteínas que serán

rendimiento de la producción de proteínas en

utilizadas en forma pura, es necesario optimizar la

plantas y asegurar la autenticidad estructural.

purificación del producto final. A continuación se explicarán de manera detallada las principales estrategias desarrolladas encaminadas a aumentar

2.2.1. Aumento del rendimiento de producción Para conseguir que el rendimiento final de la

la síntesis de la proteína recombinante, reducir su degradación y optimizar su purificación.

2.2.1.1. Aumento de la síntesis

proteína recombinante sea elevado es necesario optimizar todos los pasos implicados en su

Para obtener una elevada producción de la

síntesis, así como asegurar su estabilidad una vez

proteína recombinante, en primer lugar es

sintetizada protegiéndola de la degradación. Las

necesario que la expresión de los genes

estrategias para conseguir una síntesis proteica

introducidos sea elevada.

elevada se centran principalmente en optimizar la expresión génica mediante un diseño cuidadoso

El material genético que se introduce en la planta

del transgén que se va a introducir. En cuanto a la

incluye el gen o genes que codifican para la

protección contra la degradación, la principal

proteína de interés junto con secuencias

estrategia consiste en el direccionamiento de las

reguladoras que permiten que estos genes se

proteínas hacia compartimentos celulares en los

expresen correctamente y den lugar a la proteína.

que se encuentren protegidas de la degradación.

Para optimizar la expresión del gen introducido es

37

Twyman, R. M.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Fischer, R. (2003). Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends in Biotechnology, 21, 570-578.

24

PLANTAS BIOFACTORÍA

necesario elegir de manera adecuada estas

proteína en aproximadamente 24 horas. La

secuencias. Las principales secuencias reguladoras

empresa CropTech Corp. desarrolló un

de la expresión son secuencias promotoras,

sistema de producción utilizando este

secuencias terminadoras, y otras secuencias no

promotor, que denominaron MeGa (mechanical

traducidas como secuencias líder e intrones38.

gene activation) para la producción de glucocerebrosidasa en tabaco40, 41.

39

• Secuencias promotoras . Son secuencias que regulan la transcripción del ADN a ARN.

En cuanto a los promotores inducibles

Permiten controlar en qué momento y lugar y

químicamente existen varios tipos, pero no

bajo qué condiciones se expresa el gen

todos pueden utilizarse en cultivo de campo.

introducido. Se pueden diferenciar varios tipos

Las características que debe tener este tipo

de promotores:

de promotores son: niveles basales de expresión bajos, un tiempo de respuesta

– Promotores constitutivos. Son aquellos que

rápido, elevada expresión una vez que se

hacen que el gen se transcriba en todos los

activan y que el compuesto inductor no sea

tejidos y en todo momento, sin necesidad de

tóxico. En la tabla 2 se indican algunos de

estímulos. Se utilizan cuando se desea que la

estos promotores42.

planta produzca la proteína recombinante en todos sus tejidos.

– Promotores específicos de tejido o de órgano. Se trata de promotores que dirigen la

– Promotores (regulados) inducibles. Son

expresión del gen a determinados tejidos u

aquellos promotores que se activan bajo

órganos. Se han identificado promotores

determinados estímulos, que pueden ser

específicos de órganos como hojas, tubérculos,

químicos o físicos. En este tipo de promotores

frutos o semillas. Cada tipo de promotor

se incluyen promotores regulados por factores

presenta distintas ventajas y la elección del

ambientales o por condiciones fisiológicas de

mismo dependerá del tipo de producto que se

la planta, que se activan sólo en determinados

desee obtener, así como de la plataforma de

momentos del desarrollo. Son especialmente

producción. Así por ejemplo, pueden utilizarse

útiles para la producción de proteínas

promotores que se expresen en órganos que

recombinantes cuya acumulación en la planta

se forman antes de la floración como hojas y

tiene efectos desfavorables sobre el

tubérculos, previniendo la aparición en el

crecimiento, o para prevenir escapes.

polen. O bien promotores específicos de tejidos en los que la acumulación de proteínas

38

39

40

41

42

43

44

Un ejemplo de promotor inducible por

sea elevada, ya que estos órganos presentan

estímulos físicos es el promotor de la enzima

un ambiente protector frente a la degradación,

hidroxil-3-metilglutaril CoA reductasa 2

como es el caso de las semillas. La expresión

(HMGR2) de tomate. Esta enzima se activa

en órganos comestibles presenta ventajas para

cuando en la planta se produce un daño

la expresión de moléculas dirigidas a una

mecánico produciéndose la síntesis de la

administración por vía oral43, 44.

Sala, F.; Rigano, M. M.; Barbante, A.; Basso, B.; Walmsley, A. M.; Castiglione, S.(2003). Vaccine antigen production in transgenic plants: strategies, gene constructs and perspectives. Vaccine, 21, 803-808. Yoshida, K.; Shinmyo, A. (2000). Transgene expression systems in plant, a natural bioreactor. Journal of Bioscience and Bioengineering, 90, 353-362. Ma, J. K.; Drake, P.M.; Christou, P. (2003). The Production of Recombinant Pharmaceultical Proteins in Plants. Nature, 4, 794-805. Fischer, R.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Twyman, R. M. (2004). Plant-based production of biopharmaceuticals. Current Opinion in Plant Biology, 7, 152–158. Voinnet, O.; Rivas, S.; Mestre, P.; Baulcombe, D. (2003). An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. The Plant Journal, 33, 949-956. Lessard, P. A.; Kulaveerasingam, H.; York, G. M.; Strong, A.; Sinskey, A. J. (2002). Manipulating gene expression for the metabolic engineering of plants. Metabolic Engineering, 4, 67-79. Yoshida, K.; Shinmyo, A. (2000). Transgene expression systems in plant, a natural bioreactor. Journal of Bioscience and Bioengineering, 90, 353-362.

25

PROMOTORES UTILIZADOS EN AGRICULTURA MOLECULAR Promotores constitutivos Nombre

Origen

35 S

Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV)

Ubiquitina-1

Vegetal

Actina

Vegetal Promotores inducibles

Nombre

Inductor

Probado en

GVHvEcR

Tebufenozida

Tabaco

GVCfEcR

Metoxifenozida

Maíz y tabaco

AlcR

Etanol

Arabidopsis, tabaco y patata

ADEI

Cobre

Arabidopsis y tabaco

PR-1a

Benzotiadiazol

Tabaco

In2-2

Agroquímicos

Arabidopsis

MeGa

Daño mecánico

Tabaco

Promotores específicos de tejido Tejido

Nombre β-conglicinina Opaque-2 AmA27 OsGT1 Lox de guisante Psl de guisante NapA de colza Bn-III de colza

Semillas Arc5-I de judía Phas de judía α-bcsp de soja P-Lh de Lesquerella Amy1A de arroz GluB-1 de arroz Z4 de maíz Tapuro-b de trigo Fruto

2A11 de tomate Patatin

Tubérculos StMPI Hojas

Lhcb3 de Arabidopsis

Polen

Lat52

Tabla 2. Ejemplos de promotores utilizados en agricultura molecular45, 46. 45

46

Lessard, P. A.; Kulaveerasingam, H.; York, G. M.; Strong, A.; Sinskey, A. J. (2002). Manipulating gene expression for the metabolic engineering of plants. Metabolic Engineering, 4, 67-79. Yoshida, K.; Shinmyo, A. (2000). Transgene expression systems in plant, a natural bioreactor. Journal of Bioscience and Bioengineering, 90, 353-362.

26

PLANTAS BIOFACTORÍA

• Secuencias terminadoras de la transcripción. Son secuencias que influyen en la estabilidad del mRNA. Las secuencias terminadoras más utilizadas son las señales de poliadenilación derivadas del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens y del gen ssu del guisante47. Existen estudios que señalan otros terminadores que podrían ser más efectivos, al menos en dicotiledóneas, como las regiones no codificadoras en 3´ del gen Me1 y del gen H3 de la histona de trigo48. • Otras secuencias. En este tipo de secuencias se incluyen intrones y secuencias líder en 5’. Los intrones son secuencias de ADN que son transcritas a ARN y que posteriormente se eliminan durante el proceso de maduración, de modo que no se traducen a proteínas. No se conoce bien el mecanismo por el que producen el aumento de la expresión, pero distintos estudios señalan que influyen tanto el tipo de intrón del que se trate, como su posición, siendo los más adecuados los que se encuentran en la región 5’ codificante. Algunos ejemplos de intrones que se han utilizado para aumentar la expresión son el intrón 1 del gen de la actina de arroz, el intrón 1 del gen de la ubiquitina de maíz, el intrón 1 del gen de la sacarosa sintasa de maíz y el intrón 1 del gen de la alcohol deshidrogenasa de maíz49. Entre las secuencias líder en 5’ no traducidas que aumentan la expresión se encuentra la secuencia líder en 5’ derivada del virus del mosaico del tabaco, denominada secuencia omega50.

47

48

49

50

51

52

• Eliminación del silenciamiento. El silenciamiento es un conjunto de fenómenos epigenéticos que pueden inhibir la expresión de los transgenes tanto a nivel transcripcional como postranscripcional. Es muy importante tenerlo en cuenta a la hora de diseñar una planta transgénica, ya que puede dar lugar a la ausencia de expresión de la proteína recombinante. El silenciamiento transcripcional se relaciona con la inserción del transgén cerca de zonas de cromatina inactiva. La transformación de cloroplastos es la principal estrategia para eliminar este tipo de silenciamiento, ya que la inserción del transgén no se produce al azar, sino que ocurre por recombinación homóloga en lugares determinados51. El silenciamiento postranscripcional en plantas parece estar relacionado con mecanismos de defensa frente a virus vegetales, mediante la degradación del material genético de los mismos. Existen investigaciones que señalan la existencia de determinados virus que expresan proteínas virales supresoras del silenciamiento como es el caso de la proteína p19 del virus del enanismo ramificado del tomate. Se ha demostrado que la coexpresión de la proteína recombinante de interés junto con esta proteína supresora, es efectiva para reducir el silenciamiento postranscripcional en Nicotiana benthamiana y en Arabidopsis52. Se ha descrito otro tipo de secuencias denominadas MARS (matrix attachment regions) que facilitan la unión a la matriz nuclear. La

Ma, J. K.; Drake, P. M.; Christou, P. (2003). The Production of Recombinant Pharmaceultical Proteins in Plants. Nature, 4, 794-805. Lessard, P. A.; Kulaveerasingam, H.; York, G. M.; Strong, A.; Sinskey, A. J. (2002). Manipulating gene expression for the metabolic engineering of plants. Metabolic Engineering, 4, 67-79. Lessard, P. A.; Kulaveerasingam, H.; York, G. M.; Strong, A.; Sinskey, A. J. (2002). Manipulating gene expression for the metabolic engineering of plants. Metabolic Engineering, 4, 67-79. Fischer, R.; Twyman, R. M.; Schillberg, S. (2003). Production of antibodies in plants and their use for global health. Vaccine, 21, 820–825. Yoshida, K.; Shinmyo, A. (2000). Transgene expression systems in plant, a natural bioreactor. Journal of Bioscience and Bioengineering, 90, 353-362. Voinnet, O.; Rivas, S.; Mestre. P.; Baulcombe. D. (2003). An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. The Plant Journal, 33,949-956.

27

inclusión de estas secuencias en los extremos del

compartimentos celulares u orgánulos en los que

trasgén no sólo parece aumentar la expresión del

ésta se encuentre protegida. El direccionamiento

gen, sino que además reduce los fenómenos de

de proteínas se lleva a cabo mediante secuencias

silenciamiento.

denominadas péptido señal que se encuentran en la proteína y contienen información sobre el lugar

2.2.1.2. Protección contra la degradación. Aumento de la estabilidad53, 54 El rendimiento total se refiere a la proteína almacenada en los tejidos de la planta, por lo que además de conseguir una elevada síntesis de la

hacia el que debe dirigir55. Los compartimentos celulares que presentan un ambiente favorable para el almacenamiento de proteínas hacia los que se puede realizar un direccionamiento de las mismas son retículo endoplásmico (RE), vacuolas y cloroplastos.

proteína recombinante, es necesario lograr que permanezca estable y evitar que sea degradada

Existe otra estrategia para proteger a las proteínas

por los sistemas proteolíticos que posee la célula

de la degradación que es la acumulación en

para eliminar las proteínas foráneas.

semillas. Las semillas son órganos de la planta que presentan un alto contenido en proteínas y un

La síntesis de las proteínas nativas de la planta se

ambiente protector contra la degradación de las

produce en el citosol de la célula, donde pueden

mismas debido a su bajo contenido en humedad.

ser liberadas o bien dirigirse hacia otros

La acumulación en este órgano puede realizarse,

compartimentos celulares. Uno de los principales

tal y como se ha indicado en el apartado dedicado

sistemas que permiten proteger a las proteínas de

a los promotores, mediante el uso de promotores

la degradación es el direccionamiento hacia

específicos de semillas.

DIRECCIONAMIENTO DE PROTEÍNAS HACIA COMPARTIMENTOS CELULARES

Retículo endoplásmico (RE) Es un compartimento celular que presenta un ambiente favorable para la acumulación de proteínas debido a la baja cantidad de proteasas que contiene, así como a su ambiente oxidante. El direccionamiento de proteínas hacia este orgánulo permite una acumulación de varios órdenes de magnitud mayor que la acumulación en el citoplasma. Presenta otras ventajas relacionadas con la conformación y maduración de la proteína, que se explicarán más adelante. Para realizar el direccionamiento hacia el RE es necesario adicionar en el extremo amino terminal de la proteína péptidos señal. Una vez en el RE, en caso de que no existan más señales, la proteína pasará al aparato de Golgi y de aquí al espacio que existe entre la membrana plasmática y la pared celular (apoplasto), desde donde las proteínas de menor tamaño serán secretadas y las de mayor tamaño quedarán retenidas. Para conseguir que las proteínas queden retenidas en el RE se adiciona un péptido denominado H/KDEL en el extremo carboxilo terminal, consiguiendo que las proteínas que han pasado al aparato de Golgi regresen al RE. Este péptido es la señal que llevan las proteínas residentes en el RE y su adición a las proteínas evita que se produzcan las modificaciones que ocurren en el aparato de Golgi56, 57. (continúa en página siguiente)

53

54

55

56

57

Twyman, R. M.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Fischer, R. (2003). Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends in Biotechnology, 21, 570-578. Ma, J. K.; Drake, P.M.; Christou, P. (2003). The Production of Recombinant Pharmaceultical Proteins in Plants. Nature, 4, 794-805. Lessard, P. A.; Kulaveerasingam, H.; York, G. M.; Strong, A.; Sinskey, A. J. (2002). Manipulating gene expression for the metabolic engineering of plants. Metabolic Engineering, 4, 67-79. Twyman, R. M.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Fischer, R. (2003). Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends in Biotechnology, 21, 570-578. Fischer, R.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Twyman, R. M. (2004). Plant-based production of biopharmaceuticals. Current Opinion in Plant Biology, 7, 152–158.

28

PLANTAS BIOFACTORÍA

DIRECCIONAMIENTO DE PROTEÍNAS HACIA COMPARTIMENTOS CELULARES (continuación) Vacuolas Las células vegetales poseen distintos tipos de vacuolas con diferentes funciones, entre las que se incluyen vacuolas de acumulación de proteínas. La acumulación de proteínas en estas vacuolas se produce mediante secuencias específicas denominadas determinantes de direccionamiento vacuolar C-terminal (ct-VSD en sus siglas en inglés), que dirigen a las proteínas procedentes del RE o del aparato de Golgi hacia la vacuola. Se han identificado secuencias ct-VSD en pro-regiones de proteínas de almacenamiento como en la lectina de la cebada y la albúmina 2S de la nuez de brasil, y en proteínas relacionadas con patogénesis como la osmotina, chitinasa y β-1,3-glucanasa. A pesar de la identificación de estas secuencias, los datos sobre el direccionamiento de proteínas recombinantes a este tipo de vacuolas parecen insuficientes para el desarrollo de un sistema de acumulación de proteínas en elevada concentración en estos orgánulos58, 59. Cloroplastos En el apartado dedicado a las tecnologías de transformación se han explicado en detalle las tecnologías que permiten la expresión de proteínas en cloroplastos mediante la inserción del material genético que codifica para las mismas en el material genético del cloroplasto. Otra alternativa que permite acumular proteínas en este orgánulo es el direccionamiento de proteínas sintetizadas en el citosol hacia el cloroplasto, mediante la adición en el extremo amino terminal de la secuencia de los 23 primeros aminoácidos de la subunidad pequeña de la proteína rubisco de guisante60.

2.2.1.3. Aumento del rendimiento de la purificación

coste de su extracción y purificación es muy elevado, pudiendo llegar a ser el 95% del coste de producción, principalmente en proteínas en las

Puede ocurrir que el producto de interés que se

que se requiere un grado de pureza alto. El grado

produce en una planta pueda utilizarse sin

de pureza dependerá del tipo de uso que tendrá la

purificar, como sería el caso de la expresión

proteína recombinante. En el caso de productos de

productos de administración en tejidos

uso terapéutico que se administrarán por vía

comestibles. No obstante, lo más frecuente es que

parenteral se necesita un grado de pureza muy

el producto deba ser extraído y purificado.

elevado y se deben cumplir las indicaciones de la agencia de control correspondiente (FDA,

La extracción del producto de interés incluye una

EMEA, etc.). En los productos para uso industrial

serie de etapas comunes en la extracción de la

como enzimas, por ejemplo, generalmente no se

proteína que son el pre-procesamiento del

requiere un grado de pureza tan alto.

material mediante molienda o troceado, la extracción de las proteínas y una posterior

Un elevado contenido de proteína facilita la

purificación61.

purificación, pero como se ha indicado, no siempre es posible conseguirlo, de modo que es necesario

La etapa de purificación de las proteínas

el desarrollo de métodos de purificación que

recombinantes es una etapa clave, debido a que el

permitan recuperar gran parte de la proteína a

58

59

60

61

Yoshida, K.; Matsui, T.; Shinmyo, A. (2004). The plant vesicular transport engineering for production of useful recombinant proteins. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 28, 167-171. Jiang, L.; Sun, S-M. (2002). Membrane anchors for vacuolar targeting: application in plant bioreactors. Trends in Biotechnology, 20, 99-102. Lessard, P. A.; Kulaveerasingam, H.; York, G. M.; Strong, A.; Sinskey, A. J. (2002). Manipulating gene expression for the metabolic engineering of plants. Metabolic Engineering, 4, 67-79. Nikolov, Z. L.; Woodard, S. L. (2004). Downstream processing of recombinant proteins from transgenic feedstock. Current Opinion in Biotechnology, 15, 479-486.

29

costes económicos. A continuación se indican

lipídicos del grano, pasando a formar parte de

algunas de las estrategias:

esta estructura. Posteriormente las semillas se molturan y mediante centrifugación se separa la fracción lipídica en la que está incluida la

• Proteínas de fusión. Consiste en fusionar la

proteína de fusión.

proteína de interés a una proteína que presenta afinidad por distintos componentes celulares. A continuación se indican algunos ejemplos:

La purificación de la proteína recombinante se realiza finalmente mediante tratamiento con

– Proteínas de fusión con oleosinas. Las

una endoproteasa que rompe la proteína de

oleosinas son proteínas lipofílicas que se

fusión, quedando la proteína recombinante

expresan en semillas oleaginosas y forman

libre y la oleosina unida a los cuerpos lipídicos,

parte de estructuras denominadas cuerpos

que se separan de nuevo por centrifugación.

lipídicos, en los que se almacenan aceites. La

La proteína de fusión permanece estable en

fusión se realiza mediante ingeniería genética

las semillas desecadas durante largos períodos

añadiendo al gen de la proteína de interés el

de tiempo y en los cuerpos lipídicos durante

gen de la oleosina, y se combina con una

3 ó 4 semanas de media62. Es un método

expresión dirigida en el grano, donde la

patentado por la empresa SemBioSys

concentración de aceite es mayor.

Genetics Inc.; que se ha utilizado para la producción de hirudina, proteína

La presencia de la oleosina hace que la

anticoagulante producida por las glándulas

proteína de fusión se dirija hacia los cuerpos

salivares de la sanguijuela.

Secuencia genética de la oleosina

Secuencia genética de la proteína de interés

Material genético de la planta

Célula modificada genéticamente

Proteína de interés

Oleosina Cártamo

Cártamo modificado genéticamente

Cuerpo lipídico Semillas

Adición de la proteasa Fracción lipídica

Fracción proteica Molturación de las semillas

Centrifugación Figura 7. Proteínas de fusión con oleosinas.

62

Van Rooijen, G. J.; Moloney, M. M. (1995). Plant seed oil-bodies as carriers for foreign proteins. Biotechnology, 13, 72-77.

30

PLANTAS BIOFACTORÍA

– Fusión de oleosinas con la proteína A para purificación de anticuerpos. Esta tecnología es una adaptación de la fusión con oleosinas para la purificación de anticuerpos producidos en cártamo. En la planta se producen dos proteínas recombinantes que son el anticuerpo de interés y una proteína de fusión compuesta por una oleosina fusionada a la proteína A, que es una proteína con gran afinidad por los anticuerpos. La producción de las proteínas se dirige para que se sinteticen en compartimentos celulares

Secuencia genética de la oleosina

distintos y no exista contacto entre ambas durante el crecimiento de la planta. Una vez que se muele el grano y las proteínas entran en contacto, se forman complejos entre el anticuerpo y la proteína A que está anclada a los cuerpos lipídicos a través de la oleosina. Al igual que sucede con la hirudina, se separa la fase lipídica y, en este caso, mediante tratamiento con ácido se produce la disociación de los complejos formados por el anticuerpo y la proteína A unida a la oleosina.

Secuencia genética de la Proteína A

Célula modificada genéticamente

Material genético de la planta

Anticuerpo

Retículo endoplásmico

Cártamo Proteína A Oleosina Cártamo modificado genéticamente

Cuerpo lipídico

Semillas Complejos Anticuerpo y Proteína A-Oleosina

Anticuerpos libres

Acidificación y lavados Molturación de las semillas

Anticuerpo

Proteína A Oleosina Figura 8. Fusión de oleosinas con la proteína A.

31

– Fusión de la proteína recombinante a

2.2.2. Autenticidad estructural 66

dominios de membrana. Los dominios de membrana permiten anclar la proteína de fusión a la membrana plasmática, que se puede aislar de una manera sencilla. Una vez aisladas las membranas en las que se encuentra la proteína de fusión, ésta se extrae mediante el uso de detergentes y disoluciones reguladoras. Además, el anclaje de las proteínas a la membrana las protege de la degradación. Existen distintos dominios con estas funciones como el dominio de membrana del receptor de la célula T humana63, o los motivos dilisina o diarginina64. • Direccionamiento a la vía secretora. Existen dos estrategias descritas recientemente que son la rizosecreción y la filosecreción y consisten en la secreción de la proteína recombinante por exudados de las raíces o de las hojas. Estas estrategias permiten obviar el paso de extracción de los tejidos, aunque presentan otros inconvenientes relacionados con la

Existen proteínas relativamente simples como es el caso de la insulina, el interferón o la hormona de crecimiento humano que no requieren un procesamiento postraduccional o plegamientos para tener actividad biológica, pero en la mayor parte de los casos este tipo de modificaciones son necesarias para que la proteína sea activa. Las plantas son capaces de realizar algunas de estas modificaciones postraduccionales, siendo ésta una de sus principales ventajas frente a otros sistemas de expresión como bacterias y levaduras. Los anticuerpos son un ejemplo de proteínas formadas por varias cadenas que deben plegarse y ensamblarse con el fin de que la molécula sea funcional. El retículo endoplásmico posee el ambiente necesario para que se produzca el plegado y ensamblado de las cadenas, por lo que es preciso el direccionamiento de las cadenas que forman los anticuerpos hacia este compartimento.

recolección de los exudados. En el retículo endoplásmico además del plegado y En el caso de la rizosecreción puede dirigirse la

ensamblado de las cadenas de los anticuerpos se

producción de la proteína recombinante hacia las

produce una modificación postraduccional

raíces e inducirse la formación de raíces aéreas,

denominada glicosilación.

de modo que la proteína puede recuperarse mediante cultivo hidropónico.

La glicosilación consiste en la adición de precursores de oligosacáridos, denominados

En el caso de las secreciones por las hojas se

N-glicanos, en aminoácidos específicos de la

trata de la gutación, que es un fenómeno que

cadena polipeptídica. Las proteínas en el retículo

ocurre de manera natural en las plantas. La

endoplásmico se van transportando hacia el

gutación consiste en el exudado de gotas de

aparato de Golgi y durante este transporte el

líquido en los márgenes de las hojas,

N-glicano añadido va sufriendo reacciones de

principalmente en estructuras denominadas

maduración que consisten en la eliminación y

hidátodos, aunque puede ocurrir también a

adición de distintos residuos de azúcares.

través de la cutícula y de los estomas. Mediante el direccionamiento de la proteína recombinante

La N-glicosilación en plantas es ligeramente diferente

hacia el retículo endoplásmico, se consigue la

a la glicosilación que realizan los mamíferos debido a

secreción de la proteína hacia el apoplasto de las

las modificaciones que ocurren en el aparato de Golgi

hojas, de donde pasa al fluido secretado

lejano. Las diferencias consisten en la adición de

mediante la gutación65.

residuos de xilosa y cambios en los enlaces que unen las fucosas, que en mamíferos son de tipo α-(1,6) y

63

64

65

66

Ambos sistemas constituyen sistemas de

en plantas son de tipo α-(1,3). Además, en el caso

producción de proteínas recombinantes

de mamíferos se añade ácido siálico, que parece que

continuos y no destructivos.

está implicado en tiempos más largos de eliminación

Fischer, R.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Twyman, R. M. (2004). Plant-based production of biopharmaceuticals. Current Opinion in Plant Biology, 7, 152–158. Lessard, P. A.; Kulaveerasingam, H.; York, G. M.; Strong, A.; Sinskey, A. J. (2002). Manipulating gene expression for the metabolic engineering of plants. Metabolic Engineering, 4, 67-79. Komarnytsky, S.; Borisjuk, N. V.; Borisjuk, L. G.; Alam, M. Z.; Raskin, I. (2000). Production of Recombinant Proteins in Tobacco Guttation Fluid. Plant Physiology, 124, 927–933. Gomord, V.; Faye, L. (2004). Posttranslational modification of therapeutic proteins in plants. Current Opinion in Plant Biotechnology, 7, 171-181.

32

PLANTAS BIOFACTORÍA

de las proteínas del torrente circulatorio. Estas

dar lugar a la aparición de respuestas alérgicas en

diferencias, aunque parecen pequeñas, podrían tener

personas, debido a que los residuos de fucosa

efectos en la actividad, la distribución y la vida media

α-(1,3) y xilosa forman parte de epítopos de

de las proteínas recombinantes.

determinados alérgenos de plantas y se han encontrado anticuerpos en suero humano que son

Existen estudios que indican la existencia de

reactivos contra estos residuos. Aunque la

diferencias en la glicosilación entre distintas

existencia de anticuerpos contra este tipo de

especies, y dentro de una misma especie en

glicanos en el suero no implica una reacción

diferentes estados del desarrollo. Este hecho debe

adversa, parece que su presencia podría inducir

ser tenido en cuenta a la hora de elegir la planta

una eliminación más rápida de este tipo de

que se usará como biofactoría, aunque todas las

proteínas del torrente sanguíneo, lo cual unido a la

especies que se han usado hasta ahora para

ausencia del ácido siálico, que aumenta el tiempo

producir proteínas terapéuticas tienen la

de eliminación, podría comprometer su eficacia

capacidad de asociar los residuos de fucosa y de

terapéutica in vivo 68.

67

xilosa tal y como se ha indicado . Todo esto ha llevado a la búsqueda de estrategias Se ha considerado también la posibilidad de que

que permitan “humanizar” el patrón de

los glicanos específicos de las plantas pudiesen

glicosilación de las proteínas en plantas.

ESTRATEGIAS DE “HUMANIZACIÓN” DE PROTEÍNAS EN PLANTAS

• Almacenamiento de las proteínas en el retículo endoplásmico, evitando que pasen al aparato de Golgi donde se añaden este tipo de residuos. Se consigue mediante la adición de secuencias H/KDEL, como se ha explicado en el apartado de protección contra la degradación. • Inhibición de las enzimas glicosiltransferasas de plantas, que son las enzimas que catalizan la unión de los residuos de N-glicanos. Se han clonado los genes de varias enzimas de este tipo y se ha comprobado en el musgo Physcomitrella patens, que el bloqueo de los genes de dos de estas enzimas previene la producción de los epítopos específicos de plantas sin afectar a la secreción de la proteína. • Expresión de glicosiltransferasas de mamíferos en las plantas. La expresión de estas enzimas en plantas permitiría completar la maquinaria del aparato de Golgi para la maduración de proteínas y podría competir con la maquinaria que realiza las modificaciones específicas de las plantas. • Eliminación de las secuencias de reconocimiento para la N-glicosilación. Esta estrategia se utiliza en aquellos casos en los que no se requiere la glicosilación de la proteína para que sea funcional69.

67

68

69

Elbers, I. J. W.; Stoopen, G. M.; Bakker, H.; H. Stevens, L.; Bardor, M.; Molthoff, J. W.; Jordi, W. J. R. M.; Bosch, D.; Lommen, A. (2001). Influence of growth conditions and developmental stage on N-glycan heterogeneity of transgenic immunoglobulin G and endogenous proteins in tobacco leaves. Plant Physiology, 126 1314–1322. Ma, J. K.; Drake, P. M.; Christou, P. (2003). The Production of Recombinant Pharmaceultical Proteins in Plants. Nature, 4, 794-805. Stoger, E.; Sack, M.; Fischer, R.; Christou, P. (2002). Plantibodies: applications, advantages and bottlenecks. Current Opinion in Biotechnology, 13, 161-166.

33

TECNOLOGÍAS DISEÑADAS PARA REDUCIR EL IMPACTO DE LOS FACTORES CRÍTICOS DE LAS PLANTAS BIOFACTORÍA Factores Críticos

Tecnologías Uso de promotores constitutivos, inducibles y específicos de tejido. Secuencias terminadoras. Intrones y secuencias líder. Eliminación del silenciamiento.

Baja producción

Direccionamiento a orgánulos (retículo endoplásmico, vacuolas, membranas celulares y cloroplastos). Transformación de cloroplastos. Proteínas de fusión. Direccionamiento a la vía secretora. Direccionamiento a retículo endoplásmico. Inhibición de las enzimas implicadas en la glicosilación en plantas.

Autenticidad estructural

Expresión de enzimas implicadas en la glicosilación en mamíferos. Inhibición de la glicosilación mediante la eliminación de los lugares de glicosilación.

Tiempos de desarrollo largos

Expresión transitoria. Transformación de cloroplastos.

Riesgos por flujo de polen

Expresión transitoria. Androesterilidad.

Riesgo de ingestión por animales silvestres Riesgo de contaminación de semillas Riesgo de entrada en la cadena alimentaria

Promotores inducibles tras el cosechado por daño mecánico. Expresión de la proteína en forma inactiva que debe ser procesada (proteínas de fusión).

Uso de genes “terminator”.

Promotores inducibles tras el cosechado. Direccionamiento a retículo endoplásmico. Inhibición de las enzimas implicadas en la glicosilación en plantas.

Riesgos de alergias

Expresión de enzimas implicadas en la glicosilación en mamíferos. Inhibición de la glicosilación mediante la eliminación de los lugares de glicosilación.

Tabla 3. Resumen de las tecnologías diseñadas para reducir el impacto de los factores críticos de las plantas biofactoría.

34

PLANTAS BIOFACTORÍA

3. Cultivos de interés en agricultura molecular Existe un número elevado de cultivos, entre los

cuanto a pureza. Por ejemplo, para proteínas que

que se incluyen tabaco, cereales,

tienen un elevado valor económico se podría

leguminosas, frutas, hortalizas, etc., que son

justificar la utilización de plantas cuyo cultivo resulte

susceptibles de ser utilizados como biofactorías de

más caro, o para proteínas que se administren por

moléculas de interés.

vía oral sería necesario usar plantas comestibles70. Por tanto, la elección del cultivo que se va a utilizar

Aunque existen una serie de factores importantes a

para la expresión de una proteína recombinante

tener en cuenta a la hora de realizar la elección del

debe hacerse de manera individual para cada tipo de

cultivo, como el rendimiento, la estabilidad del tejido

proteína.

en el que se expresa la proteína, el coste de almacenaje y distribución, la facilidad de purificación,

Una vez seleccionado el cultivo, en función del

riesgos ambientales, etc., no existe una norma

órgano o tejido en el que se desee expresar la

general que pueda seguirse, ya que no todas las

proteína recombinante se deberán utilizar los

proteínas recombinantes tendrán el mismo precio en

promotores más adecuados tal y como se ha

el mercado ni tienen los mismos requerimientos en

explicado en el apartado de tecnologías.

FACTORES A TENER EN CUENTA PARA LA ELECCIÓN DE UN CULTIVO PARA SU USO COMO UNA BIOFACTORÍA • Disponibilidad de protocolos de transformación que permitan expresar la proteína que se desea obtener de la manera más sencilla posible. • Velocidad de escalado. • Rendimiento del cultivo por unidad de superficie cultivada (rendimiento de biomasa). • Rendimiento de la proteína transgénica por unidad de biomasa cosechada. • Coste del cultivo (necesidad de invernaderos o requerimientos de nutrientes especiales). • Existencia de infraestructura que permita la recolección y procesado. • Estabilidad de la proteína en el tejido en el que se acumula. • Coste del almacenamiento y transporte del órgano o tejido de la planta en el que se encuentra la proteína recombinante. • Coste de purificación. • Presencia de sustancias tóxicas que haya que eliminar en el procesado. • Riesgos ambientales de escapes a través de polen o de consumo por animales herbívoros o insectos del tejido que contiene la proteína recombinante.

70

Ma, J. K.; Drake, P.M.; Christou, P. (2003). The Production of Recombinant Pharmaceultical Proteins in Plants. Nature, 4, 794-805.

35

A continuación se indican los cultivos más usados

proteínas es necesario realizar un procesado

en agricultura molecular. La clasificación no se ha

inmediato tras la recolección y, si esto no es

realizado teniendo en cuenta la familia a la que

posible, debe desecarse o congelarse el tejido.

pertenecen, sino el órgano en el que se expresan las proteínas71.

Otros posibles inconvenientes que puede presentar la expresión de las proteínas recombinantes en las hojas estarían relacionados con una posible

3.1. Plantas de hoja y forrajeras

interferencia en el desarrollo de la planta o con riesgos ambientales debido al consumo de estas hojas por insectos o animales herbívoros.

En este grupo de cultivos se incluyen aquellas plantas que se usan en agricultura molecular en las que se produce la acumulación de proteínas en la parte aérea de la planta, principalmente en el tejido foliar, como es el caso del tabaco, alfalfa, lechuga o soja. Las ventajas que presenta este tipo de plantas en general son el elevado rendimiento en biomasa, el

Tabaco72 El tabaco (Nicotiana tabacum) es un cultivo con una gran importancia en biotecnología de plantas ya que se utiliza como modelo de experimentación debido principalmente a la facilidad que presenta para ser transformado. Éste es el motivo principal

gran potencial para escalado que poseen y la

por el que el tabaco es el cultivo más utilizado en

existencia de infraestructura para su procesado.

agricultura molecular, ya que existen distintos protocolos de expresión de proteínas

El inconveniente principal que presentan es debido

recombinantes que pueden usarse de manera

al elevado contenido en agua que posee el tejido

rutinaria en este cultivo. En el siguiente cuadro se

foliar, que hace que las proteínas sean inestables y

indican las principales ventajas e inconvenientes

pueda producirse una disminución del

que presenta el tabaco para ser usado como

rendimiento. Para evitar o reducir esta pérdida de

biofactoría de proteínas recombinantes.

VENTAJAS E INCONVENIENTES DEL TABACO COMO BIOFACTORÍA

Ventajas • Existe una tecnología muy desarrollada para la transferencia y expresión de genes en tabaco. • Única especie en la que la transformación de cloroplastos se hace de manera rutinaria. • Posee un alto rendimiento de biomasa. • Produce gran cantidad de semillas. • Fácil reproducción. • Potencial para un escalado rápido. • Disponibilidad de infraestructuras para el procesado a gran escala. • No es una planta comestible, por lo que se reduce el riesgo de paso a la cadena alimentaria. • No es necesario completar el ciclo biológico para obtener la proteína recombinante, lo que disminuye el riesgo de contaminación cruzada. Desventajas • Baja estabilidad de las proteínas en el tejido una vez cosechado, por lo que debe ser congelado o secado para su transporte o procesado. • Posee compuestos fenólicos que se liberan durante la extracción de las proteínas recombinantes. • Produce elevados niveles de alcaloides tóxicos, aunque existen variedades con bajo contenido en alcaloides. • No es comestible, de modo que es necesario purificar la proteína.

71

72

Twyman, R. M.; Stoger, E.; Schillberg, S.; Christou, P.; Fischer, R. (2003). Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends in Biotechnology, 21, 570-578. Ma, J. K.; Drake, P. M.; Christou, P. (2003). The Production of Recombinant Pharmaceultical Proteins in Plants. Nature, 4, 794-805.

36

PLANTAS BIOFACTORÍA

En la mayor parte de los casos se usa transformación nuclear para la producción de

Existe una compañía canadiense llamada

proteínas en tejido foliar pero, como se ha

permiten acumular niveles elevados de proteínas

indicado en el apartado de tecnologías, puede

en las hojas de alfalfa.

Medicago, que ha aislado nuevos promotores que

realizarse un direccionamiento hacia la vía secretora consiguiendo que las proteínas se exuden por las hojas o por las raíces. Esta tecnología está bajo desarrollo comercial para la producción de fosfatasa alcalina humana

Otras especies

secretada por la empresa Phytomedics Inc.

Existen otras especies de plantas de hoja que se

Otras empresas que han elegido el tabaco como

están usando para producir proteínas

plataforma son Planet Biotechnology, Meristem Therapeutics, Plant Biotechnology

recombinantes como por ejemplo la lechuga, la

Inc y Chlorogen, así como la empresa española

ventaja frente a la alfalfa y el tabaco de ser

Plant Bioproducts.

comestibles. Se están utilizando para la expresión

soja y las espinacas. Estas plantas presentan la

de antígenos para elaborar vacunas comestibles. Como se ha indicado en el apartado de tecnologías se puede hacer transformación de cloroplastos de

En el caso de la lechuga se han realizado ensayos

manera rutinaria generalmente mediante

hepatitis B73 y el caso de las espinacas se ha

bombardeo con microproyectiles con las ventajas

expresado un antígeno del antrax74.

clínicos para una vacuna contra el virus de la

que presenta este tipo de transformación. La soja al igual que la alfalfa pertenece a la familia de las leguminosas y puede fijar nitrógeno de la

Alfalfa

atmósfera. Se ha utilizado para producir la fitasa de un hongo llamado Aspergillus.

La alfalfa (Medicago sativa) es una planta perteneciente a la familia de las leguminosas, que posee un enorme rendimiento de biomasa debido a que es perenne. Esto significa que la planta puede ser segada sin que muera, pudiendo realizarse hasta nueve siegas por año, tras las cuales la planta vuelve a crecer produciendo hojas exactamente iguales a las que se segaron. Además, se puede propagar de manera vegetativa, lo que permite la obtención de

3.2. Semillas de cereales y leguminosas En este tipo de cultivos se incluyen plantas en las que la acumulación de la proteína recombinante se realiza en las semillas como es el caso de las leguminosas de grano y los cereales. Estos

“clones” idénticos, sin necesidad de que exista

cultivos se caracterizan por producir semillas que

floración o formación de semillas. Es además una

presentan un elevado contenido de proteínas, que

planta capaz de fijar el nitrógeno atmosférico, de modo que permite reducir los aportes de nitrógeno

pueden secarse fácilmente y almacenarse a

en forma de abonos.

durante muchos meses, debido a que presentan

temperatura ambiente sin pérdida de propiedades un ambiente protector frente a la degradación

La alfalfa se emplea para alimentación animal, lo

proteica. La utilización de promotores específicos

cual tiene la ventaja de que podría utilizarse para

de semillas hace que la producción en este tipo de

la expresión de vacunas comestibles para animales, pero tiene el inconveniente de que

cultivos pueda llegar a ser muy elevada.

puede pasar a la cadena alimentaria. Otro

Los cereales en los que se ha investigado son

inconveniente que presenta esta planta es que contiene grandes cantidades de ácido oxálico.

arroz, trigo y maíz, y entre las leguminosas

73

74

destacan el guisante y la soja.

Kapusta, J.; Modelska, A.; Figlerowicz, M.; Pniewski, T.; Letellier, M.; Lisowa, O.; Yusibov, V.; Koprowski, H.; Plucienniczak, A.; Legocki, A. B. (1999). A plant-derived edible vaccine against hepatitis B virus. The FASEB Journal, 13, 1796-1799. Sussman, H. E. (2003). Spinach makes a safer anthrax vaccine. Drug Discovery Today, 8, 428-430.

37

Desde el punto de vista económico la soja y el

La principal desventaja que presenta la patata es

maíz son los cultivos más eficientes para la

que aunque los tubérculos pueden consumirse

producción de proteínas recombinantes.

crudos, son poco palatables, por lo que sería necesario cocinarlos ligeramente lo que puede

El maíz es el cereal elegido por Prodigene Inc

llevar a una pérdida de proteínas por

para la producción de proteínas. Las ventajas que

desnaturalización.

presenta este cereal son el elevado rendimiento en biomasa y la existencia de infraestructuras y

Se han realizado al menos tres estudios clínicos

maquinaria para su recolección y transformación.

hasta el momento en los que se han administrado patatas transgénicas que expresan proteínas de interés biosanitario a personas.

3.3. Frutas, tubérculos y hortalizas75

Hortalizas

En este grupo se incluyen plantas en las que la acumulación de la proteína recombinante se hace

La hortaliza más utilizada para expresar proteínas

en órganos comestibles de la planta, que pueden

recombinantes es el tomate. Al igual que ocurre

consumirse crudos o con un procesado mínimo,

con la patata, existen sistemas de expresión de

como es el caso de las frutas, tubérculos y

proteínas recombinantes muy eficientes y se

hortalizas. El interés de expresar proteínas

dispone de promotores específicos para la

recombinantes en órganos comestibles es la

expresión en el fruto. Otras ventajas son la

obtención de productos que puedan administrarse

posibilidad de consumo en crudo y la posibilidad

por vía oral sin necesidad de purificación, lo que

de expresar varios antígenos en una misma planta

les hace especialmente útiles para la obtención de

mediante cruzamiento.

vacunas de subunidades, aditivos y proteínas utilizadas en inmunoterapia pasiva tópica.

Entre los inconvenientes principales se encuentra el bajo contenido en proteínas que presenta el fruto. Además algunos frutos pueden contener

Tubérculos Los principales tubérculos en los que se pueden expresar proteínas recombinantes son patatas y zanahorias. La patata es una planta muy útil para expresar

elevadas cantidades de ácidos, que son incompatibles con muchos antígenos y pueden hacer que los frutos no sean adecuados para su administración a niños de corta edad. Otro inconveniente es la ausencia de un sistema in vitro para evaluar la expresión de la proteína recombinante en el fruto.

proteínas recombinantes, ya que es fácil de transformar y existen promotores específicos que permiten expresar las proteínas en el tubérculo.

Frutas

Además se puede propagar de manera clonal mediante la siembra de tubérculos sin que exista

Existe un gran interés en expresar proteínas

floración ni formación de semillas, previniendo el

recombinantes en bananas, debido a que el

riesgo de contaminación cruzada.

banano es un árbol muy cultivado en países en

75

Mason, H. S.; Warzecha, H.; Mor, T.; Arntzen, C. J. (2002). Edible plant vaccines: applications for prophylactic and therapeutic molecular medicine. Trends in Molecular Medicine, 8, 324-329.

38

PLANTAS BIOFACTORÍA

desarrollo. Este árbol puede ser propagado de manera clonal y una vez que ha alcanzado la madurez produce frutos de manera abundante con ciclos de 10 a 12 meses. Estos frutos pueden ser consumidos tanto por adultos como por niños. Este cultivo presenta algunos inconvenientes ya que no existen sistemas de transformación eficientes y se dispone de pocos datos sobre expresión génica, especialmente en lo referente a promotores específicos del fruto. Además requiere espacios muy grandes que resultan muy caros si es necesario cultivar en invernadero.

3.4. Oleaginosas y fibra En este apartado se incluyen especies que se caracterizan por producir semillas con un elevado contenido en aceites como soja o cánola y otras que además producen fibras como es el caso del algodón y el lino. Este tipo de plantas es muy interesante para su utilización en ingeniería metabólica de lípidos, ya que de manera natural contienen rutas de síntesis de compuestos lipídicos y producen éstos en cantidades elevadas. Además, como se ha indicado existen estrategias de purificación que se basan en el anclaje de la proteína recombinante a cuerpos lipídicos que conviene utilizar en plantas que produzcan semillas con alto contenido en aceites. Las especies productoras de fibras como el lino tienen interés en ingeniería metabólica para la producción de materiales formados por combinación de fibras y bioplásticos76.

76

Wróbel, M.; Zebrowski, J.; Szopa, J. (2004). Polyhydroxybutyrate synthesis in transgenic flax. Journal of Biotechnology, 107, 41-54.

39

VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LOS CULTIVOS UTILIZADOS EN AGRICULTURA MOLECULAR Plantas de hoja

Ventajas

– Gran potencial para el escalado.

Inconvenientes

– Elevado rendimiento de biomasa.

– Elevado contenido en agua que hace las proteínas inestables.

– Existencia de infraestructura para su procesamiento. – Se puede cosechar antes de la floración previniendo la liberación de polen y los riesgos de contaminación cruzada que esto implica.

– Necesidad de congelado o desecación inmediatos de las hojas para evitar la degradación. – La acumulación de proteínas recombinantes en las hojas podría interferir en el desarrollo de la planta. – Riesgos ambientales por un posible consumo de las hojas por animales herbívoros o insectos.

Inconvenientes

Ventajas

Semillas de cereales y leguminosas – Permiten almacenar las proteínas en las semillas de manera estable durante años incluso a temperatura ambiente. – No contienen los compuestos fenólicos que presentan las hojas de tabaco. – La exposición a herbívoros es menor que en plantas de hoja.

– Es necesario que ocurra un ciclo floral para producir semillas. – La purificación es más compleja que en hojas y tiene un coste mayor.

Ventajas

Frutas, tubérculos y hortalizas – Son órganos que pueden consumirse crudos o semicocinados, permitiendo la producción de vacunas de subunidades, nutracéuticos y anticuerpos para aplicaciones orales. – Los tubérculos pueden almacenarse a temperatura ambiente. – No presentan compuestos tóxicos.

Inconvenientes

– Purificación más económica que en semillas.

– Muchas necesitan cultivarse en invernadero, lo que aumenta el coste.

Inconvenientes

Ventajas

Fibra y oleaginosas

– Muy útiles para la purificación mediante fusión a oleosinas. – Existencia de infraestructura para su procesamiento. – Permiten almacenar las proteínas en las semillas de manera estable durante años incluso a temperatura ambiente.

– La fibra y el aceite pueden interferir en el procesado por lo que se aplica para proteínas que no necesitan estar muy purificadas. – Es necesario que ocurra un ciclo floral para producir semillas.

Tabla 4. Ventajas e inconvenientes de los distintos cultivos utilizados en agricultura molecular.

40

PLANTAS BIOFACTORÍA

4. Moléculas de interés El número de moléculas que potencialmente se pueden obtener utilizando plantas modificadas genéticamente como biofactorías es muy elevado. Como se ha indicado se pueden diferenciar a grandes rasgos dos tipos de biofactorías. Por una parte, aquellas en las que la modificación genética conduce a la expresión de una proteína foránea, que es la molécula de interés; y aquellas en las que la modificación genética conduce a la modificación del metabolismo de la planta, como resultado de la cual se sintetiza un compuesto que es la molécula de interés.

MOLÉCULAS DE INTERÉS

Proteínas recombinantes

Interés biosanitario

Ingeniería metabólica

Interés industrial

Modificación de rutas enzimáticas existentes

Introducción de nuevas rutas enzimáticas

Vacunas Anticuerpos Biofármacos

4.1. Proteínas recombinantes Las proteínas son moléculas complejas formadas por pequeñas subunidades denominadas aminoácidos, cuya secuencia se encuentra codificada en los genes. En muchos casos, para que la proteína sea funcional, es necesario que ocurra una serie de modificaciones postraduccionales. Éstas pueden ser relativamente sencillas como el establecimiento de puentes disulfuro y puentes de hidrógeno entre distintos aminoácidos que conducen a la adquisición de una estructura tridimensional adecuada. Otro tipo de modificaciones más complejas incluye la modificación de aminoácidos concretos y la adición de determinados grupos como fosfatos (fosforilación) o hidratos de carbono (glicosilación), procesos proteolíticos y otros procesos no enzimáticos. Estas modificaciones más complejas en muchas ocasiones ocurren en determinados orgánulos subcelulares y no son comunes en todos los organismos.

Esta complejidad estructural hace que la obtención de proteínas mediante síntesis química sea prácticamente imposible, excepto para pequeñas cadenas peptídicas, de modo que sea necesario utilizar sistemas vivos.

4.1.1. Proteínas de interés biosanitario Las plantas presentan un gran potencial para la obtención de moléculas para uso terapéutico debido a sus ventajas en cuanto a seguridad, capacidad de producción y coste. Las principales proteínas de interés biosanitario que pueden obtenerse mediante la modificación genética de plantas son antígenos para elaborar vacunas, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, proteínas estructurales y otro tipo de biofármacos. En la tabla 5 se incluyen las proteínas de interés sanitario que se están expresando actualmente en plantas.

41

PROTEÍNAS DE INTERÉS BIOSANITARIO EXPRESADAS EN PLANTAS Proteínas de Interés Biosanitario Contra enfermedades infecciosas. Vacunas

Contra tumores. Contra enfermedades autoinmunes. Inmunoglobulina G.

Anticuerpos

Inmunoglobulina A secretora. Fragmentos de anticuerpos. Productos sanguíneos humanos. Hormonas. Reguladores del crecimiento.

Biofármacos

Enzimas para uso terapéutico. Antitumorales. Antivirales. Analgésicos opiáceos.

Proteínas estructurales

Colágeno y gelatina.

Tabla 5. Proteínas de interés biosanitario expresadas en plantas.

4.1.1.1. Vacunas77 Una vacuna consiste en una preparación de un organismo patógeno completo (atenuado o muerto), o de alguno de sus componentes, que se denominan antígenos, que administrado sea capaz de inducir una respuesta inmune duradera y protectora contra este patógeno. En el caso de que se administre el organismo completo muerto, se trata de vacunas inactivadas, y si está vivo pero atenuado, se habla de vacunas atenuadas. En el caso de las vacunas elaboradas a partir de componentes del patógeno que dan lugar a una respuesta inmune en lugar del patógeno completo, se habla de vacunas de subunidades. Mediante la tecnología del ADN recombinante es posible identificar y aislar los genes del organismo patógeno que codifican para proteínas capaces de inducir la respuesta inmune (antígenos). Estos genes pueden introducirse en plantas y fabricar una biofactoría capaz de producir grandes

77

78

cantidades del antígeno que servirán para elaborar la vacuna contra ese patógeno. El antígeno producido en la planta puede purificarse para su administración por vía parenteral, tal y como se hace en otros sistemas de expresión, o puede realizarse la expresión en plantas o en tejidos comestibles que puedan consumirse crudos o con un procesado mínimo, evitando la etapa de purificación. En este último caso se habla de vacunas comestibles. Además de las ventajas generales de la expresión de proteínas en plantas, la expresión de proteínas o péptidos antigénicos en plantas comestibles presenta ventajas adicionales relacionadas con la facilidad de administración y almacenamiento y con la eliminación de la fase de purificación, que suponen una reducción en el coste. A continuación se incluye un cuadro con las principales ventajas de la expresión de antígenos en plantas para la elaboración de vacunas comestibles78.

Sala, F.; Rigano, M. M.; Barbante, A.; Basso, B.; Walmsley, A. M.; Castiglione, S.(2003). Vaccine antigen production in transgenic plants: strategies, gene constructs and perspectives. Vaccine, 21, 803-808. Streatfield, S. J., Howard, J. A. (2003). Plant-based vaccines. International Journal for Parasitology, 33, 479-493.

42

PLANTAS BIOFACTORÍA

VENTAJAS DE LAS VACUNAS COMESTIBLES

• Permiten una administración en una forma segura y palatable, tal y como se hace con un alimento o con un pienso en el caso de los animales. • Al evitar el uso de jeringuillas y agujas se reducen los costes de material y personal asociados, así como los riesgos relacionados con este tipo de administración. • Su expresión en órganos que se puedan almacenar a temperatura ambiente (semillas de cereales o tubérculos) permitiría eliminar los costes que conlleva la cadena del frío. • Es posible expresar más de un antígeno por planta pudiendo administrarse varias vacunas de forma simultánea. • En el caso de los animales, al evitarse las inyecciones se previenen posibles pérdidas de calidad en las canales de animales de abasto. • Posibilidad de inmunización de animales silvestres reservorio de enfermedades como la rabia (murciélagos y ratas).

Todas estas características hacen que este tipo de

Por último, la producción de vacunas en plantas

vacunas sea muy interesante para su aplicación a

comestibles presenta el riesgo de que éstas pasen

gran escala, por ejemplo para realizar

a la cadena alimentaria con las implicaciones que

vacunaciones en zonas subdesarrolladas o para

esto tendría para la salud de las personas. La

vacunaciones masivas en caso de epidemias o

ingestión accidental de este tipo de plantas podría

riesgo de ataques terroristas.

dar lugar a la inducción de tolerancia oral, que consiste en la inhibición de la respuesta inmune

Los principales retos técnicos de la expresión de

del organismo frente a determinados antígenos

antígenos en plantas para elaborar vacunas

presentados por vía oral, como consecuencia de

comestibles se refieren a la concentración de

una exposición repetida a los mismos. Para evitar

antígeno. En primer lugar, es necesario conseguir

estos riesgos es necesario realizar un control muy

una concentración elevada del antígeno, con el fin

estricto de los cultivos y las plantas una vez

de reducir la cantidad de tejido vegetal que debe

cosechadas.

ingerirse para obtener una dosis efectiva. Por otra parte, debe conseguirse una concentración

A continuación se incluyen varias tablas en las que

homogénea para que se pueda ajustar la dosis de

se recogen los antígenos que se han expresado en

manera adecuada.

plantas para la elaboración de vacunas contra enfermedades infecciosas. Las tablas 6 y 7

La administración por vía oral supone que la

contienen información sobre plantas transgénicas

proteína debe ser resistente a los jugos gástricos

que expresan antígenos para elaborar vacunas

e intestinales, lo cual puede conseguirse mediante

contra enfermedades humanas y animales. Las

la expresión de las proteínas en semillas, donde

tablas 8 y 9 se refieren a expresión mediante

existe una matriz de polímeros de hidratos de

vectores virales de antígenos para elaborar vacunas

carbono que la protegen.

contra enfermedades humanas y animales.

43

ANTÍGENOS PARA ELABORAR VACUNAS CONTRA ENFERMEDADES HUMANAS EXPRESADOS EN PLANTAS TRANSGÉNICAS Enfermedades humanas Nivel de expresión Agente patógeno

Antígeno

Planta

Órgano

Proteína soluble total (%)

Peso fresco (g)

Hojas

0,001

0,0002

Cloroplastos

2,5

—

Patata

Tubérculo

0,2

0,001

Maíz

Semillas

10

0,1

Tabaco

Hojas

8

1

Patata

Tubérculo

0,3

0,002

Tabaco

Hojas

4

0,5

Tomate

Hojas y frutos

0,04

0,005

Tabaco

Hojas

0,07

0,0008

Patata

Tubérculo

0,002

—

Patata

Tubérculo

0,006

0,00004

Lechuga

Hojas

—

0,0000006

Patata

Tubérculo

0,001

0,000009

Tabaco

Hojas

0,2

0,03

Patata

Tubérculo

0,4

0,003

Tabaco E. coli enterotoxigénica79 (*)

E. coli enteropatógena

Vibrio cholerae

Hepatitis B

Subunidad B de la toxina termolábil

Subunidad A estructural del BFP

Subunidad B de la toxina colérica

Antígeno de superficie

Proteína media

Virus Norwalk

Proteína de la cápsida

Sarampión

Hemaglutinina

Tabaco

Hojas

—

—

Citomegalovirus humano

Glicoproteína B

Tabaco

Semillas

0,1

0,00007

Virus respiratorio sincitial

Proteína de fusión

Tomate

Fruto

—

0,003

Bacillus anthracis

Antígeno protector

Tabaco

Hojas

—

—

Clostridium tetani

Fragmento TetC de la toxina colérica

Tabaco

Cloroplastos

25

—

VIH80

Péptido de la región V3 de la proteína gp120 fusionada con la subunidad B de la toxina colérica

Patata

Tubérculos

0,0041

—

Rotavirus81

VP7

Patata

Hojas

38,4

—

82

Tabla 6. Antígenos de enfermedades humanas expresados en plantas transgénicas . (*) Enfermedad humana y animal. 79 80 81 82

Tregoning, J.; Maliga, P.; Dougan, G.; Nixon, P. J. (2004). New advances in the production of edible plant vaccines: chloroplast expression of a tetanus vaccine antigen, TetC. Phytochemistry, 65, 989-994. Kim, T-G.; Gruber, A.; Langridge, W. H. R. (2004). HIV-1 gp120 V3 cholera toxin B subunit fusion gene expression in transgenic potato. Protein Expression and Purification, 37, 196-202. Wu, Y-Z.; Li, J-T.; Mou, Z-R.; Fei, L.; Ni, B.; Geng, M.; Jia, Z-C.; Zhou, W.; Zou, L-Y.; Yan Tang, Y. (2003). Oral immunization with rotavirus VP7 expressed in transgenic potatoes induced high titers of mucosal neutralizing IgA. Virology, 313, 337-342. Streatfield, S. J.; Howard, J. A. (2003). Plant-based vaccines. International Journal for Parasitology, 33, 479-493.

44

PLANTAS BIOFACTORÍA

ANTÍGENOS PARA ELABORAR VACUNAS CONTRA ENFERMEDADES ANIMALES EXPRESADOS EN PLANTAS TRANSGÉNICAS Enfermedades animales Nivel de expresión Agente patógeno

Antígeno

Planta

Órgano

Virus de la rabia(*)

Glicoproteína

Tomate

Proteína estructural VP1 Fiebre aftosa Péptido de la proteína estructural VP1 fusionado a β-glucuronidasa

Virus de la gastroenteritis transmisible porcina

Proteína soluble total (%)

Peso fresco (g)

Hojas y frutos

1

0,1

Arabidopsis

Hojas

—

—

Alfalfa

Hojas

—

—

Patata

Hojas

0,01

0,001

Alfalfa

Hojas

0,004

0,0005

Arabidopsis

Hojas

0,06

0,008

Patata

Tubérculo

0,07

0,0005

Tabaco

Hojas

0,2

0,03

Maíz

Semillas

2

0,02

Glicoproteína S

Rotavirus grupo A bovino

Proteína VP6 de la cápsida

Patata

Tubérculo

0,002

0,00001

Pasteurelosis neumónica bovina

Leucotoxina fusionada a una proteína fluorescente

Trébol blanco

Hojas

0,5

0,0009

Enfermedad hemorrágica de los conejos

Proteína estructural VP60

Patata

Hojas

0,3

0,04

Péptido de la proteína de la cápsida VP2 fusionado a β—glucuronidasa

Arabidopsis

Hojas

0,1

0,0003

Péptido 2L21 fusionado con la subunidad B de la toxina colérica

Tabaco

Hojas

31

7,49 mg/g

Virus de la diarrea epidémica porcina84

Epítopo neutralizador

Tabaco

—

—

—

Virus de la bronquitis infecciosa aviar85

Proteína S de IBV

Patata

Tubérculo

—

—

Cacahuete

Hojas

—

—

Peste bovina86, 87

Hemaglutinina Tabaco

—

0,75

—

83

Parvovirus canino

Tabla 7. Antígenos de enfermedades animales expresados en plantas transgénicas88. (*) Enfermedad humana y animal. 83

Molina, A.; Hervás-Stubbs, S.; Daniell, H.; Mingo-Castel, A. M.; Veramendi, J. (2004). High-yield expression of a viral peptide animal vaccine in transgenic tobacco chloroplasts. Plant Biotechnology Journal, 2, 141-153. Bae, J-L.; Lee, J-G.; Kang, T-J.; Jang, H-S.; Jang, Y-S.; Yang, M-S. (2003). Induction of antigen-specific systemic and mucosal immune responses by feeding animals transgenic plants expressing the antigen. Vaccine, 21, 4052–4058. 85 Ji-Yong Zhou, Li-Qin Cheng, Xiao-Juan Zheng, Jian-Xiang Wu, Shao-Bin Shang, Jin-Yong Wang and Ji-Gang Chen (2004). Generation of the transgenic potato expressing full-length spike protein of infectious bronchitis virus. Journal of Biotechnology, 111, 121-130. 86 Khandelwal, A.; Renukaradhya, G. J.; Rajasekhar, M.; Sita, G. L.; Shaila, M. S. (2004). Systemic and oral immunogenicity of hemagglutinin protein of rinderpest virus expressed by transgenic peanut plants in a mouse model. Virology, 323, 284-291. 87 Khandelwa,l A.; Sita, G. L.; Shaila, M. S. (2003). Expression of hemagglutinin protein of rinderpest virus in transgenic tobacco and immunogenicity of plant-derived protein in a mouse model. Virology, 308,207-215. 88 Streatfield, S. J.; Howard, J. A. (2003). Plant-based vaccines. International Journal for Parasitology, 33, 479-493. 84

45

ANTÍGENOS PARA ELABORAR VACUNAS CONTRA ENFERMEDADES HUMANAS EXPRESADOS MEDIANTE VECTORES VIRALES Enfermedades humanas Nivel de expresión Agente patógeno

Antígeno

Virus**

Planta

E. coli enterotoxigénica89

Subunidad B de la toxina termolábil

TMV

Hepatitis C

Región hipervariable de la proteína 2 de la cubierta fusionada a la sub B de la toxina colérica

Rotavirus

Proteína soluble total (%)

Peso fresco (g)

Tabaco

0,75

-

TMV

Hojas de tabaco

0,04

0,005

Proteína VP6

PVX

Hojas de tabaco

—

0,005

Péptido de la proteína gp41

CMV

Hojas de caupí

—

—

Péptido de la región V3 de la proteína gp120

AMV

Hojas de tabaco

—

—

Péptido de la región V3 de la proteína gp120

TBSV

Hojas de tabaco

—

0,03

CMV

Hojas de caupí

—

0,002

PVX

Hojas de tabaco

—

—

Nucleocápsida proteína p24

TBSV

Hojas de tabaco

0,4

0,05

Proteína p2490

TMV

Hojas de tabaco

2,5 mg/25 g de hojas

—

Rinovirus tipo 14

Péptido de la proteína VP1

CMV

Hojas de caupí

—

—

Virus respiratorio sincitial

Péptidos de la proteína G

AMV

Hojas de tabaco

—

0,006

CMV

Hojas de caupí

—

0,005

Staphylococcus aureus

Péptido D2 de la proteína de unión a fibronectina FnBP

PVX

Hojas de tabaco

—

0,0003

CMV

Hojas de caupí

—

0,005

TMV

Hojas de tabaco

—

—

VIH tipo 1 Péptido de la proteína transmembrana gp41

Pseudomonas aeruginosa

Péptido de la proteína F

Plasmodium falciparum

Péptidos de la proteína del Circumsporozoito

TMV

Hojas de tabaco

—

0,003

Virus del papiloma humano tipo 16

Oncoproteína E7

PVX

Hojas de tabaco

—

0,0004

Linfoma de la célula B

Fragmento Fv de la inmunoglobulina

TMV

Hojas de tabaco

—

0,003

Tabla 8. Antígenos de enfermedades humanas expresados mediante vectores virales91. 89

Wagner, B.; Hufnagl, K.; Radauer, C.; Wagner, S.; Baier, K.; Scheiner, O.; Wiedermann, U.; Breiteneder, H. (2004). Expression of the B subunit of the heat-labile enterotoxin of Escherichia coli in tobacco mosaic virus-infected Nicotiana benthamiana plants and its characterization as mucosal immunogen and adjuvant. Journal of Immunological Methods, 287, 203-215. 90 Perez-Filgueira, D. M.; Brayfield, B. P.; Phiri, S.; Borca, M. V.; Wood, C.; Morris, T. J. (2004). Preserved antigenicity of HIV-1 p24 produced and purified in high yields from plants inoculated with a tobacco mosaic virus (TMV)-derived vector. Journal of Virological Methods, 121, 201-208. 91 Streatfield, S. J.; Howard, J. A. (2003). Plant-based vaccines. International Journal for Parasitology, 33, 479-493.

46

PLANTAS BIOFACTORÍA

ANTÍGENOS PARA ELABORAR VACUNAS CONTRA ENFERMEDADES ANIMALES EXPRESADOS MEDIANTE VECTORES VIRALES Enfermedades animales Nivel de expresión Agente patógeno

Antígeno

Virus**

Planta

Virus de la rabia(*)

Péptidos de la glicoproteína y nucleoproteína

TMV y AMV

Proteína estructural VP1

Proteína soluble total (%)

Peso fresco (g)

Hojas de tabaco y espinaca

-

0,0005

TMV

Hojas de tabaco

-

0,02

Péptido de la proteína estructural VP1

CMV

Hojas de caupí

-

-

Virus de la enteritis del visón (visones, gatos y perros)

Péptido de la proteína de la cápsida VP2

CMV

Hojas de caupí

-

0,002

Enfermedad hemorrágica de los conejos

Proteína estructural VP60

PPP

Hojas de tabaco

-

-

PPP

Hojas de tabaco

-

-

Parvovirus canino (perros)

Péptido de la proteína de la cápsida VP2

CMV

Hojas de caupí

-

0,002

Fiebre aftosa

Virus de la hepatitis del ratón

Péptido de la glicoproteína S

TMV

Hojas de tabaco

-

-

Herpesvirus bovino tipo I92

Glicoproteína D

TMV

Hojas de tabaco

-

-

Virus de la diarrea epidémica porcina93

Epítopo neutralizador

TMV

Hojas de tabaco

5

-

Tabla 9. Antígenos de enfermedades animales expresados mediante vectores virales94. (*) Enfermedad humana y animal. ** AMV: Virus del mosaico de la alfalfa. CMV: Virus del mosaico del caupí. PPP: Potyvirus de la viruela del ciruelo. PVX: Virus X de la patata. TBSV: Virus del enanismo ramificado del tomate. TMV: Virus del mosaico del tabaco.

92

Pérez-Filgueira, D.M.; Zamorano, P.I.; Domınguez, M.G.; Taboga, O.A.; del Médico Zajac, M.P.; Puntel, M.; Romera, S.A.; Morris, T.J.; Borca, M.V.; Sadir, A.M.; (2003). Bovine Herpes Virus gD protein produced in plants using a recombinant tobacco mosaic virus (TMV) vector possesses authentic antigenicity. Vaccine, 21, 4201–4209. 93 Kang, T-J.; Kang, K-H.; Kim, J-A.; Kwon, T-H.; Jang, Y-S.; Yang, M-S. (2004). High-level expression of the neutralizing epitope of porcine epidemic diarrhea virus by a tobacco mosaic virus-based vector. Protein Expression and Purification, 38, 129–135. 94 Streatfield, S. J.; Howard, J. A. (2003). Plant-based vaccines. International Journal for Parasitology, 33, 479-493.

47

Además de la expresión de antígenos para la elaboración de vacunas contra patógenos bacterianos y virales, es posible expresar antígenos para elaborar vacunas contra otro tipo de afecciones como enfermedades autoinmunes y contra tumores humanos95.

VACUNAS CONTRA ENFERMEDADES AUTOINMUNES

Las enfermedades autoinmunes son aquellas en las que el sistema inmune reconoce como extrañas algunas estructuras propias y reacciona contra ellas produciendo lo que se conoce como autoanticuerpos. Algunos ejemplos son la artritis, la esclerosis múltiple, la miastenia gravis o la diabetes tipo I. Como se ha indicado, la administración por vía oral de antígenos puede dar lugar a fenómenos de tolerancia. En el caso de las enfermedades autoinmunes, el fenómeno de tolerancia oral provocado por la administración de autoantígenos por vía oral podría conducir a una disminución de la respuesta inmune alterada, lo cual podría mejorar los síntomas. Existen trabajos pioneros en la producción de autoantígenos en plantas, principalmente contra la diabetes tipo I, como la expresión de la enzima ácido glutámico decarboxilasa (GAD, en sus siglas en inglés) y la IL-4, que se expresan mediante fusión con la subunidad B de la toxina colérica96. También se ha producido la expresión en plantas de alérgenos, que podrían aplicarse para el desarrollo de vacunas para el tratamiento de las alergias tipo I, mediante la inducción de tolerancia por vía oral. Algunos ejemplos son la expresión mediante un vector viral de alérgenos del abedul (la proteína Bet v 1), del látex (las proteínas Hev b 3 y Hev b 1), y de la manzana (la proteína Mal d 2), en N.benthamiana97.

VACUNAS ANTITUMORALES En la superficie de algunos tumores, como melanoma y cáncer de mama, aparecen determinadas proteínas denominadas antígenos tumorales contra los que algunas personas pueden desarrollar anticuerpos. En la actualidad se está investigando sobre la posibilidad de usar estos antígenos para la elaboración de vacunas y sobre su producción mediante distintos sistemas. Un ejemplo de un antígeno de este tipo es el antígeno GA733-2, producido en plantas de tabaco mediante la utilización del virus del mosaico del tabaco como vector viral98.

95

Sala, F.; Rigano, M.M.; Barbante, A.; Basso, B.; Walmsley, A.M.; Castiglione, S.(2003). Vaccine antigen production in transgenic plants: strategies, gene constructs and perspectives. Vaccine, 21, 803-808. 96 Ma, S.; Huang, Y.; Yin, Z.; Menassa, R.; Brandle, J. E.; Jevnikar, A. M. (2004). Induction of oral tolerance to prevent diabetes with transgenic plants requires glutamic acid decarboxylase (GAD) and IL-4, human GAD65. PNAS, 101, 5680-5685. 97 Wagner, B.; Fuchs, H.; Adhami, F.; Ma, Y.; Scheiner, O.; Breiteneder, H. (2004). Plant virus expression systems for transient production of recombinant allergens in Nicotiana benthamiana. Methods, 32, 227-234. 98 Verch, T,, Hooper, D. C.; Kiyatkin, A.; Steplewski, Z.; Koprowski, H. (2004). Immunization with a plant-produced colorectal cancer antigen. Cancer Immunology, Immunotherapy, 53, 92-99.

48

PLANTAS BIOFACTORÍA

4.1.1.2. Anticuerpos99 Los anticuerpos son glicoproteínas producidas por el sistema inmune de los vertebrados superiores, capaces de reconocer y unir antígenos diana de manera altamente específica. Esta capacidad de reconocer y unir de manera específica distintas moléculas hace que los anticuerpos puedan utilizarse para gran cantidad de aplicaciones que incluyen el diagnóstico, tratamiento y prevención de distintas enfermedades infecciosas, autoinmunes y otro tipo de trastornos100. Son moléculas complejas formadas por distintas cadenas polipeptídicas que se encuentran plegadas y ensambladas. Es fundamental que el plegamiento y ensamblaje sean correctos, ya que de lo contrario el reconocimiento del antígeno no se producirá de manera adecuada. La estructura típica de un anticuerpo es la de las inmunoglobulinas (Igs) séricas. Consisten en tetrámeros formados por dos cadenas pesadas

99

100

idénticas y dos cadenas ligeras idénticas, unidas mediante puentes disulfuro. Cada tipo de cadena presenta una serie de dominios constantes y otros dominios variables, que son los responsables del reconocimiento y unión del antígeno. Las cadenas pesadas presentan cuatro dominios, dos de los cuales forman una bisagra denominada región Fc, que permite que el anticuerpo adopte una estructura típica en forma de Y. En la región Fc se encuentra un residuo de asparagina conservado que es el lugar en el que se produce la glicosilación. Además de este tipo de Igs existen otras moléculas derivadas con capacidad de unir el antígeno. Dentro de estas moléculas derivadas se incluyen moléculas de menor tamaño (fragmentos de anticuerpos), así como otras de mayor tamaño como la IgA secretora que es un dímero de las Igs típicas. En la figura 9 se incluyen algunos tipos de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos expresados en plantas.

Fischer, R.; Twyman, R. M.; Schillberg, S. (2003). Production of antibodies in plants and their use for global health. Vaccine 21, 820–825. Ma, J. K.; Drake, P.M.; Christou, P. (2003). The Production of Recombinant Pharmaceultical Proteins in Plants. Nature, 4, 794-805.

49

Fragmento Fab

Fragmento Fab’

Dominio variable sencillo

scFv unido al péptido líder

Fragmentos de anticuerpo de tipo camélido

Cadena larga sencilla

IgG

scFv

scFv biespecífico

Minibody

scFv de fusión

scFv unido a los péptidos líder y KDEL

IgA. Dímero de IgG unidas por los extremos constantes mediante dos cadenas polipeptídicas denominadas componente secretor y cadena J.

Diabody

IgA

Región constante de la cadena pesada

Cadena J

Fragmentos de anticuerpos tipo camélido. Igs características de los camélidos, formadas exclusivamente por dos cadenas pesadas que carecen de uno de los dominios.

Región variable de la cadena pesada

Componente secretor

Fragmentos Fab y F(ab’). Extremos N terminal de las dos cadenas pesadas y de las dos cadenas ligeras.

Región constante de la cadena ligera

Punto de glicosilación

Minibodis y diabodis. Dímeros que se forman de manera espontánea. Fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv). Contienen regiones variables de las cadenas ligera y pesada unidas por una cadena peptídica flexible. Existen también scFv biespecíficos y de fusión con proteínas como enzimas o toxinas.

Región variable de la cadena ligera

Proteína de fusión

Bisagra

Péptido líder

Puente disulfuro

Péptido KDEL

Figura 9. Anticuerpos y fragmentos de anticuerpos producidos en plantas.

50

scAbs

PLANTAS BIOFACTORÍA

Los fragmentos de anticuerpos en ocasiones son más efectivos como fármacos que los anticuerpos completos, ya que penetran mejor en los tejidos que los anticuerpos completos y se eliminan de los tejidos de manera más rápida. Las cadenas ligeras, pesadas y el componente secretor y la cadena de ensamblaje de los anticuerpos secretores están codificadas por distintos genes, de modo que para conseguir que una planta exprese este tipo de moléculas es necesario introducir todos los genes en la planta que se desea usar como biofactoría. Existen dos estrategias para conseguirlo. La primera consiste en introducir los genes que codifican para las cadenas en distintas plantas y luego realizar cruzamientos entre las plantas, seleccionando aquellas que posean todos los transgenes que se desea. Otra estrategia es utilizar métodos que permitan introducir todos los transgenes necesarios, como por ejemplo la coinfección de la planta con distintos vectores virales. La síntesis de este tipo de inmunoglobulinas mediante células de mamíferos requiere de dos tipos celulares distintos. La acumulación de anticuerpos en el citosol de la célula no es posible, debido a que en este ambiente no se produce un ensamblado correcto o

101

completo de las cadenas ligeras y pesadas que forman el anticuerpo, lo que lleva a su degradación. Tan solo se ha conseguido una acumulación de anticuerpos recombinantes en el citosol en el caso de cadenas polipeptídicas sencillas o scFvs. Para que se produzca un plegado y ensamblaje correcto de las cadenas polipeptídicas es necesario dirigirlas hacia el retículo endoplásmico tal y como se ha indicado en el apartado de tecnologías, mediante la adición de secuencias diseñadas a este efecto en el extremo amino terminal de la proteína. La glicosilación es especialmente importante en los anticuerpos y, como se ha indicado en el apartado de tecnologías, el direccionamiento hacia el retículo endoplásmico permite que se realice una glicosilación adecuada. Se han utilizado distintas plantas para expresar anticuerpos y se han llevado a cabo numerosas comparaciones para determinar los parámetros óptimos para la expresión. Existen varios tipos de anticuerpos recombinantes producidos en plantas que han pasado la fase preclínica de ensayos y se encuentran en fases de ensayo clínico, algunos en fase II101. A continuación se incluye una tabla con los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se han obtenido utilizando plantas como biofactorías.

Ma, J. K.; Drake, P.M.; Christou, P. (2003). The Production of Recombinant Pharmaceultical Proteins in Plants. Nature, 4, 794-805.

51

ANTICUERPOS Y FRAGMENTOS DE ANTICUERPOS OBTENIDOS UTILIZANDO PLANTAS BIOFACTORÍA Nombre o tipo de anticuerpo

Aplicación

Antígeno

Tratamiento contra la caries dental

Antígeno estreptocócico superficial I/ II

Guy 13 (IgAS)

Diagnóstico glóbulos rojos de donantes y receptores

IgG anti-humano

C5-1 (IgG)

Planta

Órgano

Nicotiana tabacum

Hojas

500 µg/g

IgG 1

1,1% en PST Alfalfa

—

1% PST

Hojas

900 ng/g

Semillas

1,5 µg/g

Trigo

Tratamiento del cáncer

Antígeno carcinoembriónico (CEA)

Nivel de expresión máximo

scFvT84.66 (scFv)

T84.66 (IgG) 102

T84.66/GS8

29,0 µg/g Hojas Arroz

27,0 µg/g

Semillas

32 µg/g

Guisante

Semillas

9 µg/g

Nicotiana tabacum agroinfiltrado con Agrobacterium

Hojas

1,0 µg/g

Hojas

—

Tratamiento del linfoma de célula B

Vacuna idiotípica

38C13 (scFv)

Nicotiana benthamiana

Hojas

30,2 µg/g

Tratamiento del cáncer de colon

Antígeno de superficie

CO17-1A (IgG)

Nicotiana benthamiana

—

—

Vacuna contra el linfoma no-Hodgkins103

—

scFv

Tabaco infectado con el TMV

—

100 µg/ml en fluido intersticial

Virus del herpes simplex 2

Proteína HSV-2

Anti-HSV-2 (IgG)

Soja

—

—

scFv

Nicotiana tabacum

Hojas

0,01% PST

Nicotiana tabacum

Hojas

0,044% PST

Arabidopsis thaliana

Hojas

0,2-0,4% PST

MAK33 Fab

Arabidopsis thaliana

—

6,53% PST

MAK33 scFv

N. tabacum

—

6-25 µg/mg PST

Arabidopsis thaliana

—

1,3% PST

N. tabacum

—

0,044% PST

Afecciones cardiacas, miastenia, polimiosistis, enfermedad de McArdle, miopatías inflamatorias y desórdenes mitocondriales, distrofia muscular

MAK33 IgG1 Creatina kinasa humana

Fab

—

Sustancia P (neuropéptido)

dAb

Nicotiana benthamiana

Hojas

1% PST

Actividad antirrábica

Virus de la rabia

Anticuerpo monoclonal mAb S057

Nicotiana benthamiana

Hojas

0,07% PST

Inmunización pasiva de los animales

Zealerona

scFv

Arabidopsis thaliana

—

—

Vacunas inmunocontraceptivas para herbívoros

Epítopo ZP3

ZP3

Tabaco infectado con el TMV*

—

—

Tabla 10. Anticuerpos y fragmentos de anticuerpos expresados en plantas104, 105, 106. 102

103

Vaquero, C.; Sack, M. Schuster, F.; Finnern, R.; Drossard, J.; Schumann, D.; Reimann, A.; Fischer, R. (2002). A carcinoembryonic antigen-specific diabody produced in tobacco. FASEB J., 16, 408-410. McCormic, A. A.; Reinl, S. J.; Cameron, T. I.; Vojdani, F.; Fronefield, M.; Levy, R.; Tusé, D. (2003). Individualized human scFv vaccines produced in plants: humoral anti-idiotype responses in vaccinated mice confirm relevance to the tumor Ig. Journal of Immunological Methods, 278, 95-104.

(Ver notas 104, 105 y 106 en página siguiente)

52

*TMV: Virus del mosaico del tabaco.

PLANTAS BIOFACTORÍA

4.1.1.3. Biofármacos

La utilización de la biotecnología permitió obtener estos productos de forma más segura, a través del

Además de anticuerpos y vacunas existen otras

cultivo en biorreactores de células de

proteínas con interés biosanitario que pueden

microorganismos o de mamíferos modificados

expresarse en plantas como productos

genéticamente, pero aún así estos sistemas

sanguíneos, hormonas, reguladores del

presentan riesgos de contaminación con toxinas o

crecimiento y enzimas con potencial terapéutico

virus peligrosos para la salud de las personas y los

para tratar distintas enfermedades.

animales. Además, según algunas previsiones, se estima que para 2010 este tipo de fármacos

Según la Sociedad Española de Biotecnología en el

ocupará un 35% del mercado farmacéutico. Este

año 2000 el número de proteínas y péptidos

aumento de la demanda posiblemente no pueda

terapéuticos fabricados mediante técnicas de

ser cubierto por los actuales sistemas de

ingeniería genética en el mercado eran

obtención.

aproximadamente 50, con unas ventas anuales del orden de decenas de miles de millones de dólares.

Las plantas debido a sus características

En la mayor parte de los casos no se trata de

de seguridad, capacidad de producción

fármacos nuevos, sino que son proteínas humanas,

y coste, podrían ser muy adecuadas para la

que hasta la década de los 80 se obtenían en

producción de este tipo de productos.

muchos casos a partir de sangre de donantes o de

A continuación en la tabla 11 se indican las

órganos humanos, o a partir de animales, con el

proteínas de interés biosanitario que se han

consiguiente riesgo de contaminación.

expresado en plantas modificadas.

104

105

106

Daniell, H.; Streatfield, S. J.; Wycoff, K. (2001). Medical molecular farming: production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants. Trends in Plant Science, 6, 219-226. Gomord, V.; Sourrouielle, C.; Fitchette, A-C.; Bardor, M.; Pagny, S.; Lerouge, P.; Faye, L. (2004). Production and glycosilation of plant-made pharmaceuticals: the antibodies as a challenge. Plant Biotechnology Journal, 2, 83-100. Schillberg, S.; Fischer, R.; Emans, N. (2003). “Molecular farming” of antibodies in plants. Naturwissenschaften, 90, 145-155.

53

PROTEÍNAS BIOFARMACÉUTICAS EXPRESADAS EN PLANTAS Proteína

Aplicación

Planta

Nivel de expresión

Proteína C humana

Anticoagulante

Tabaco