Hidrogeles obtenidos por radiación gamma como sistema de liberación sostenida de Flutamida María Emilia Széliga y Carlos Bregni Cátedra de Farmacotécnia I, Departamento de Tecnología Farmacéutica, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina.

ABSTRACT

The characteristics of poly(2-hydroxyethyl methacrylate) matrices for the controlled release of drugs have investigated using flutamide (FTD) as a model drug. Radiation-induced polymerisation of hydrophilic monomer (2-hydroxyethyl methacrylate: HEMA) at low temperature (-78 °C) was performed to immobilize FTD in the polymer matrix. The effect of the porosity and the swelling on “in vitro” drug release was studied in this work. The swelling of poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) was analysed by a mathematical model. The “in vitro” dissolution test showed that the material used in this study is suitable for controlleddrug release systems for use in biomedical applications.

INTRODUCCIÓN El gran avance en las últimas décadas en el desarrollo de nuevos polímeros y la posibilidad de obtener con ellos hidrogeles con capacidad de liberar un principio bioactivo en forma controlada y en el sitio de acción (órgano blanco), ha despertado la atención de numerosos investigadores en todo el mundo. Uno de los polímeros no biodegradables más extensamente estudiado con este fin es el poli(metacrilato de 2hidroxietilo) (PHEMA). Numerosos trabajos presentados a partir de 1960 por Hoffman (1, 2), Kaetsu (3) y Rosiak (4), entre otros, desarrollaron una técnica de polimerización por poliadición en estado supercongelado utilizando radiaciones gamma proveniente de una fuente de cobalto 60. El objetivo de este trabajo consiste en desarrollar un sistema polimérico monolítico, biocompatible y no biodegradable, con capacidad de liberar de manera controlada un principio activo anticancerígeno incluido en la matriz del hidrogel, obtenido mediante el empleo de radiaciones ionizantes.

Como fármaco modelo se eligió la flutamida (FTD) que es un compuesto no esteroide que es frecuentemente utilizada en el tratamiento paliativo del carcinoma de próstata (6). La flutamida es la 2-metilN-[(4-nitro-3-trifluorometil)-fenil]-α,α,α-trifluoro-2-metil-4´-nitro-m-propionotoluideno.

Es

un

sólido

cristalino, ligeramente amarillento, que se caracteriza por ser prácticamente insoluble en agua pero soluble en acetona, acetato de etilo, metanol, cloroformo y éter. Resulta sensible a la acción de la luz. Su punto de fusión es de 111,5 - 112,5 ºC.

Estructura molecular de la flutamida.

Parte Experimental Materiales. El metacrilato de 2-hidroxietilo (Mitsubishi Rayon Co Ltd.) utilizado tenía las siguientes características: Color (según APHA)

10 máx.

Densidad (20°C/4°C)

1,072 g/cm3

Indice de acidez

0,115

Pureza (por Cromatografía Gaseosa)

99,3%

Contenido de agua

0,03%

Inhibidores de la polimerización (metilhidroquinona)

50 ppm

Determinación por CG de: Etilenglicol

0,04%

Etilendiamina

0,07%

Metacrilato de dietilenglicolmetilo (DEGMMA)

0,47%

La flutamida (Sigma Co) utilizada tenía una pureza del 99,5% y se empleó tal y como lo suministró la casa comercial.

Preparación de los hidrogeles poliméricos. Las matrices se preparan a partir de una solución de los componentes (monómeros, agua, principio activo) colocada en moldes de PVC y congeladas a –78 °C. La composición de los cinco sistemas desarrollados se describen en la Tabla 1. Inmediatamente después de preparada la solución se coloca en un recipiente herméticamente cerrado que mantendrá la temperatura durante todo el proceso de irradiación. La irradiación se realiza empleando una fuente de Co 60 emisora de radiación electromagnética de energía promedio de 1,25 MeV y 400.000 psi, con velocidad de dosis máxima aplicada de 5 kGy/hora. Las matrices poliméricas difieren en el porcentaje de agua empleada en la elaboración del hidrogel (Tabla 1) a excepción de las muestras 1 y 2 que se diferencian en su contenido de flutamida.

Determinación de la porosidad del hidrogel. La porosidad de las matrices de poli(metacrilato de 2hidroxietilo) se determinó mediante el método de la inclusión de mercurio, que permite calcular la cantidad de volumen de mercurio que penetra en la matriz polimérica por efecto de la presión mediante un porosímetro Carlo Erba. El sistema polimérico 2 fue analizado después de permanecer 90 días en agua destilada a 37 °C.

Medida del grado de hinchamiento del hidrogel. El hinchamiento de los polímeros fue realizado en una solución tamp ón fosfato de pH 7,5. Los hidrogeles obtenidos fueron desecados en estufa a una temperatura de 40 ºC hasta peso constante. A continuación fueron pesados en estado anhidro (xerogel) y colocados en un recipiente conteniendo la solución tamp ón mantenido a temperatura ambiente. A cada uno de los tiempos experimentales, las matrices ensayadas fueron removidas de la solución quitando el excedente del liquido de la superficie del hidrogel, posteriormente pesadas y colocadas nuevamente en la solución.

Ensayo de disolución del principio activo. Las cinéticas de disolución de flutamida se realizaron en el equipo de flujo continuo codificado en la Farmacopea Europea, empleando 1000 mL de solución tamp ón

fosfato pH 7,5 a 37,0 ± 0,5°C y con velocidad de flujo de 20 mL/min. La cuantificación de la flutamida se realizó por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) según metodología descripta en la USP 24 (7).

Tabla 1. Composición porcentual de las matrices poliméricas. HEMA

AGUA

FTD

(%)

(%)

1

100

-

-

2

100

-

2,6

3

80

20

2,6

4

60

40

2,6

5

40

60

2,6

Polímero (mg/cm2 )

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Porosidad de los hidrogeles de poli(metacrilato de 2-hidroxietilo). El grado de porosidad porcentual de los hidrogeles puede verse en la Tabla 2.

Tabla 2. Porosidad (%) de los hidrogeles de PHEMA. Sistema polimérico

Porosidad

Muestra 1 Muestra 2

0,49 0,55

Muestra 2 después de 90 días en agua

0,59

Muestra 3

2,5

Muestra 4

5,4

En las matrices de poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) preparadas en ausencia de agua, la porosidad que presenta el sistema es relativamente baja (< 0,5%). La presencia del principio activo aumenta

significativamente la porosidad, dando en todos los casos estudiados valores superiores al 0,5%. Al mantener el implante de poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) conteniendo flutamida en agua destilada a 37 °C durante 90 días, se observa un aumento del 7,3% en el valor de la porosidad de la matriz, debido a la difusión del principio activo hacia el medio de disolución y al efecto del hinchamiento de la misma.

En el caso de las matrices de poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) sintetizadas con agua, se observa que la presencia de la misma aumenta la porosidad, siendo mayor a medida que se incrementa el contenido de agua en el hidrogel. Esto explica la importancia de su presencia en la técnica de polimerización por irradiación en estado supercongelado, donde el agua es la formadora de los poros. El aumento porcentual relativo de la porosidad del sistema a medida que aumenta el tenor de agua, es debido a la contracción volumétrica que presenta el agua al pasar del estado líquido al supercongelado (de 25 a -78ºC).

Hinchamiento de los hidrogeles de poli(metacrilato de 2-hidroxietilo). El grado de hinchamiento porcentual (Sw %) para los distintos hidrogeles obtenidos fue determinado aplicando el método descrito por Urushizaki (5) relacionando su funcionalidad con la raíz cuadrada del tiempo de inmersión del polímero en agua según la siguiente ecuación:

Sw =

W − Wo .100 Wo

(1)

siendo W el peso de la matriz después de estar inmersa en la solución y Wo el peso del polímero anhidro (xerogel).

Con los resultados experimentales obtenidos puede considerarse una cinética de tipo bifásica (véase la Figura 1) y por ende representar la misma como dos rectas continuas caracterizadas por sus respectivas pendientes:

%Sw =  A + k1 t  +  B + k 2 t 

(2)

donde A y B son las respectivas ordenados en el origen y representa los porcentajes de hinchamiento caracterizados por sus correspondientes constantes de velocidad k1 y k2 de la fase rápida y lenta respectivamente.

50 45 40

Sw (%)

35 30 25

Lineal (Políimero 2)

20

Lineal (Polímero 3)

15

Lineal (Polímero 4)

10

Lineal (Polímero 5)

5 0 0

2

4 6 1/2 1/2 Tiempo (horas )

8

10

Figura 1. Cinéticas bifásicas de hinchamiento de polímeros con flutamida en solución tamp ón fosfato pH 7,5.

En las primeras nueve horas se observa una correlación lineal entre el grado de hinchamiento y la raíz cuadrada del tiempo de inmersión en solución tampón fosfato a temperatura ambiente. Por extrapolación desde el punto de intersección de ambas rectas se determina el valor del tiempo al cual se produce el cambio de fase cinética (t k ) para cada uno de los polímeros ensayados siendo los resultados obtenidos descriptos en la Tabla 3.

Tabla 3. Valores obtenidos de la ecuación (2) que describe la cinética de hinchamiento de tipo bifásico. Polímero

HEMA

A

B

k1 (% h

-1/2

k2 )

(% h

-1/2

tk

(%)

(S w % )

(S w % )

)

(horas)

2

100

2,6455

29,477

7,8589

0,5082

13,32

3

80

3,6746

37,186

8,9477

0,4334

15,49

4

60

5,0019

36,019

9,1997

0.5692

12,92

5

40

7,8014

37,321

10,398

0,684

9,23

Cinética de disolución de la flutamida. Los datos obtenidos de las cinéticas de disolución con el equipo de flujo continuo fueron evaluados según distintos modelos cinéticos. Los perfiles de

liberación “in vitro” del principio activo en función de la raíz cuadrada del tiempo, mostraron óptimos índices de correlación al ser considerados como modelos de disolución bifásico con cinética de tipo Higuchi en ambas fases.

Por tal motivo fueron analizados los perfiles de disolución para cada una de las matrices poliméricas conteniendo flutamida, mediante la representación de la cantidad de fármaco disuelta por unidad de área en función de la raíz cuadrada del tiempo, de acuerdo al modelo de Higuchi con comportamiento de sistema bifásico (Figura 2). 6

6

A

Q (10-4 mg/cm2)

4

y = 0.547x + 0.9728 R 2 = 0.9984

3

4

2

1

1

y = 1.145x R2 = 0.9803 0

1

2

3

4

5

6

7

8

y = 0.4627x + 2.3043 R 2 = 0.994

3

2

0

B

5 Q (10-4 mg/cm2)

5

y = 1.2866x - 0.8078 R2 = 0.9923

0 0

1

2

3

8

5

6

7

8

1/2 )

5

C

7

D

4.5 4

6 5

y = 0.434x + 1.6535 R 2 = 0.9923

3.5

y = 0.5925x + 2.21 R2 = 0.9904

Q (10-4 mg/cm2)

Q (10-4 mg/ cm2)

4

Raiz Cuadrado de Tiempo (hs

Raiz Cuadrada del Tiempo (hs 1/2)

4 3

3 2.5 2 1.5

2

y = 1.3406x - 0.4337 R 2 = 0.9788

1

y = 1.0592x - 0.3762 R2 = 0.9987

1 0.5 0

0 0

1

2

3 4 5 6 Raiz Cuadrada de Tiempo (hs 1/2 )

7

8

9

0

1

2

3

4

5

Raiz Cuadrada de Tiempo (hs

6 1/2

7

)

Figura 2. Perfil de disolución de los polímeros 2 (A), 3 (B), 4 (C) y 5 (D).

En los polímeros de poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) conteniendo agua (Figuras 2 B, C y D), se observa la presencia de un tiempo mínimo necesario para que las matrices poliméricas comiencen a ceder el principio activo (tiempo de latencia). En el poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) sin agua

8

(Figura 2 A) no se observa tiempo de latencia y el punto de inflexión del cambio bifásico se alcanza a un tiempo significativamente menor (2,6 horas) en comparación con las matrices de poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) con agua (véase la Tabla 3). Esto demuestra la importancia del proceso de hinchamiento en los polímeros de poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), el cual resulta ser un factor condicionante de la liberación del principio activo.

Los polímeros de poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) se hidratan al ser puestos en contacto con el medio acuoso, el mismo penetra en el interior de la matriz y a medida que el proceso de hinchamiento progresa, la velocidad de disolución del principio activo disminuye. El punto de inflexión que marca el cambio en el valor de la constante de disolución, ocurre a partir del momento en que se alcanza el estado de equilibrio en el proceso de hinchamiento del polímero.

Otro factor que contribuye a una liberación más rápida del principio activo, especialmente en los primeros tiempos experimentales, es el denominado "efecto Burst". Al ser puesto en contacto un polímero con el medio de disolución, y previo a la penetración de agua en el interior de la red estructural polimérica a través de los canalículos de la misma, se produce la disolución del fármaco adsorbido superficialmente. Este fenómeno puede llegar a modificar significativamente el trazado de la curva de disolución “in vitro”, especialmente en los primeros minutos del ensayo. Es por ello que algunos autores mencionan como conveniente considerar como cero el porcentaje de principio activo liberado hasta los primeros dos o tres minutos de iniciado el ensayo. De este modo es posible desestimar el efecto Burst para poder establecer con mayor precisión la cinética de disolución del fármaco ensayado.

Hinchamiento del hidrogel y disolución del principio activo. En todos los casos se observó que a partir de un tiempo determinado se producía un cambio significativo en el valor de la constante de velocidad de disolución, pudiendo establecerse un valor de K1 y otro de K2 a partir del punto de inflexión en el tiempo mencionado. Además de los valores de K1 y K2 , es posible determinar el tiempo al cual se produce la modificación en el valor de la pendiente de la recta de la representación gráfica correspondiente (Tabla 3). En las matrices de poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) que contienen agua, el tiempo al cual cambia la cinética de

disolución (TK de disolución) aumenta a medida que disminuye el contenido de agua en la matriz. Teniendo en cuenta que estos tiempos son similares a los valores en los cuales se alcanza el equilibrio en el proceso de relajación viscoelástica durante el hinchamiento de estas matrices poliméricas, podríamos asegurar que el Tk de disolución, se correlaciona con el tiempo al cual se alcanza el estado de equilibrio en el proceso de hinchamiento del material polimérico (Tabla 4). Esta relación no se encontró en el caso del polímero B sintetizado con 100% de metacrilato de 2-hidroxietilo.

Tabla 4. Datos experimentales de los valores de K1 , K2 y de los tiempos a los cuales ocurren los cambios de las cinéticas de disolución e hinchamiento.

K1

K2

Tk Disolución

Tk Hinchamiento

(hs)

(hs)

Polímero (10-4 mg .hs 1/2 /cm2 ) (10-4 mg .hs 1/2 /cm2 ) 3

1,2866

0,4627

14

15

4

1,3406

0,5925

12

13

5

1,0592

0,4340

11

9

Sobre la base de los resultados obtenidos es posible concluir que el porcentaje de agua contenido en la matriz durante la etapa de irradiación, desempeña un importante papel tanto en el proceso de hinchamiento como en la cinética de liberación de la flutamida, encontrándose además una correlación lineal entre el porcentaje de fármaco liberado y el porcentaje de agua contenido en la matriz. Como la cinética de liberación del principio activo es bifásica, al compararse los porcentajes disueltos a las ocho horas (primera fase) y a las 48 horas (segunda fase), se encontró una óptima regresión lineal en ambos casos (véase la Figura 3).

70

Droga liberada (%)

60 y = 0.443x + 38.961 2 R = 0.9819

50 40 30 20

y = 0.2588x + 19.863 2 R = 0.9926

10

Fase inicial Fase final

0 0

10

20 30 40 50 Contenido de agua en el polimero (%)

60

70

Figura 3. Efecto del contenido de agua sobre el porcentaje de fármaco disuelto.

CONCLUSIONES La polimerización del poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) mediante poliadición radioinducida permite la obtención de un hidrogel capaz de liberar en forma prolongada el principio activo incluido físicamente en el interior de la matriz. La radiación en estado supercongelado del monómero junto con la flutamida y el agua presenta ventajas, entre las que se destacan la minimización del efecto de la radiación sobre el principio activo, la formación de poros en la matriz polimérica a expensas del agua presente, la posibilidad de obtener diferentes formas geométricas, trabajar con fármacos termolábiles y producir eventualmente un sistema terapéutico estéril.

El hidrogel obtenido libera en forma prolongada el principio activo incluido y puede destinarse a ser implantado en tejidos ó sitios “blanco” del organismo.

Agradecimientos. Los autores expresan su agradecimiento a la Secretaría de Ciencia y Técnica de la Universidad de Buenos Aires (Argentina) por el apoyo financiero (Proyecto UBACyT FA 125).

BIBLIOGRAFÍA

1

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2

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3

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4

J. M. Rosiak, J. Controlled Release, 31, 9-19. (1994).

5

F. Urushizaki y col., International J. Pharmaceutics, 58, 135-142 (1990)

6

E. Beyssac, y col., Drug Dev. Ind. Pharm., 22, 439-444 (1996).

7

USP 24