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SPEED-OLIGO® MYCOPLASMA PNEUMONIAE SP001: Ensayo oligocromatográfico para la detección cualitativa de Mycoplasma pneumoniae en muestras clínicas. 40 tests. INTRODUCCIÓN: Mycoplasma pneumoniae es un patógeno común causante del 10-30% de los casos de neumonia adquirida en la comunidad. La mayoría de ellos son relativamente leves y aproximadamente el 15% de las infecciones cursan asintomáticas, pero también pueden ocasionar cuadros graves e incluso fatales. La neumonia producida por M. pneumoniae es mas frecuente en niños y adolescentes. El aislamiento del organismo por cultivo y la detección mediante tests serológicos han sido los métodos diagnósticos clásicos. La naturaleza fastidiosa del patógeno y la alta seroprevalencia son los principales inconvenientes de estos procedimientos. El aislamiento de M. pneumoniae es lento e insensible. La serología es una herramienta importante para el diagnóstico de la infección por M. pneumoniae. La detección de IgM o seroconversión a IgG en muestras pareadas son los métodos serológicos preferidos. La mayor desventaja es la ausencia de respuesta IgM en muchos adultos, mientras que el diagnóstico basado en IgG es solo posible retrospectivamente. La PCR es el método de elección para la detección de M. pneumoniae en muestras respiratorias, reemplazando otros métodos directos de diagnóstico debido a su alta sensibilidad basada en la amplificación. Esto posibilita la detección del patógeno en secreciones respiratorias durante los estadíos tempranos de la enfermedad, cuando no hay respuesta de anticuerpos. Aunque M. pneumoniae puede persistir en algunos pacientes en el tracto respiratorio durante meses, se detecta menos frecuentemente en estadios tardíos de la enfermedad. La detección de los productos amplificados por un método basado en una doble hibridación mejora la especificidad del test y refuerza su sensibilidad. La mayoría de los ensayos de PCR han usado sistemas de detección poco sensibles o muy trabajosos. El kit de detección SPEED-OLIGO® MYCOPLASMA PNEUMONIAE es un método basado en PCR acoplado a un dipstick que posibilita una detección rápida y altamente sensible y específica de M. pneumoniae en muestras respiratorias. Los PCR mix incluidos en el kit contienen un par de oligonucleótidos específicos para la amplificación de un fragmento del gen P1. EL kit ha sido diseñado para ser facilmente usado. Dependiendo del termociclador empleado, el paso de amplificación tardará entre 15 y 75 minutos, mientras que para la detección en dipstick solo se necesitan 5-10 minutos. La presentación del PCR mix liofilizada minimiza los procedimientos de manipulación y pipeteo para prevenir contaminaciones. FUNDAMENTO DEL MÉTODO: Método basado en la amplificación de un fragmento específico de un gen de M. pneumoniae, que permite un diagnóstico rápido de infecciones producidas por M. pneumoniae. El test incluye un control de amplificación interno para comprobar la correcta extracción de ADN, la ausencia de inhibidores de la amplificación en la muestra y la correcta amplificación. Para ello, se han incluido oligonucleótidos específicos frente al gen de la RNAsa P, junto con la línea correspondiente en el dipstick para su detección específica. Las muestras clínicas de origen humano deberían contener este gen y mostrar una línea positive para este control, si los pasos anteriormente mencionados se han realizado correctamente. La técnica tiene lugar en tres etapas: extracción de ADN, amplificación con una pareja de oligonucleótidos específicos y detección del producto amplificado. Para la detección se utiliza un dipstick.

Una vez realizada la doble amplificación, el control de amplificación y el amplicón específico del test son desnaturalizados facilitando su desplazamiento a lo largo de la membrana. Estos fragmentos de PCR reaccionan con oligonucleótidos específicos unidos a una suspensión coloidal de partículas de oro. Posteriormente, el complejo formado por los productos de PCR y el oro coloidal fluye a través de la membrana hasta encontrar las sondas específicas (línea test y línea control de amplificación de PCR), donde tiene lugar una segunda hibridación. Cuando se produce la hibridación del exceso de la sonda unida al oro con un oligonucleotido complementario absorbido en la membrana, aparece la línea control de producto. En las posiciones en las que el oro reacciona, aparecerán líneas rojas. Esta técnica es más sensible y específica que la PCR tradicional. La doble hibridación permite discriminar entre fragmentos amplificados específicos y no específicos.

CARACTERÍSTICAS: El kit está basado en la amplificación de ADN y los fundamentos de la hibridación. Debido al riesgo de contaminación, recomendamos leer atentamente el apartado de “Recomendaciones y precauciones”. El PCR mix y el control positivo están liofilizados. Es necesario reconstituirlos antes de usarlos (Ver “Preparación de los reactivos”). El resto de los reactivos están listos para su uso. CONTENIDO DEL KIT: 1 VIRCELL MPN PCR MIX: 5 viales con tampón de PCR, Cl2Mg, dNTPs, Taq polimerasa , oligonucleótidos específicos para M. pneumoniae y oligonucleótidos específicos para la amplificación del gen humano RNAsa-P. Liofilizados. 2 VIRCELL MPN POSITIVE CONTROL: 1 vial con ADN no infeccioso liofilizado, para usar como control positivo. Contiene ADN humano. 3 VIRCELL NEGATIVE CONTROL: 1 vial con 200 µl de agua desionizada, para usar como control negativo. 4 VIRCELL MPN STRIPS: 40 tiras para la detección de ADN específico. 5 VIRCELL PCR MIX RECONSTITUTION SOLUTION: 1 vial con 1 ml de solución acuosa para reconstituir la mezcla de PCR, contiene Triton X100. 6 VIRCELL POSITIVE CONTROL RECONSTITUTION SOLUTION: 1 vial con 500 µl de solución acuosa para reconstituir el control positivo, contiene Triton X-100. 7 VIRCELL MPN RUNNING SOLUTION: 2 viales con 1 ml de solución de hibridación, con Proclin. Conservar entre 2 y 8ºC y comprobar la fecha de caducidad. Material necesario no contenido en el kit: Kits de extracción de ADN (ver recomendaciones en “Procedimiento del ensayo”) Termociclador Aceite mineral (para termocicladores sin tapa calefactada) Micropipetas de precisión (10-200 µl) Puntas estériles con filtro Guantes desechables Termobloque 55ºC±2ºC

PRODUCTO PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO Fabricante: VIRCELL, S.L. Pza. Domínguez Ortiz 1. Polígono Industrial Dos de Octubre.18320 Santa Fe *GRANADA* SPAIN* Tel.+34.958.441264* Fax+34.958.510712

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Tubos de microcentrífuga de 1.5 ml Microcentrifuga Cabina de PCR (recomendable) Vortex CONSERVACIÓN: Conservar entre 2 y 8ºC. No utilizar los componentes del kit después de la fecha de caducidad. La caducidad indicada será válida siempre que los componentes se mantengan cerrados y conservados entre 2 y 8ºC. Tras la reconstitución de VIRCELL PCR MIX y VIRCELL POSITIVE CONTROL, almacenar a temperaturas inferiores a -20ºC y evitar congelaciones y descongelaciones innecesarias. ESTABILIDAD DE LOS COMPONENTES UNA VEZ ABIERTOS: 9. COMPONENTE VIRCELL PCR MIX y VIRCELL POSITIVE CONTROL reconstituidos Resto de componentes

ESTABILIDAD Almacenar a temperatura inferior a -20ºC y usar hasta su fecha de caducidad Almacenar a 2-8ºC y usar hasta su fecha de caducidad

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ESTABILIDAD Y USO DE LOS REACTIVOS: El kit es estable hasta su fecha de caducidad a 2-8ºC. Una vez reconstituidos el VIRCELL PCR MIX y VIRCELL POSITIVE CONTROL son estables hasta su fecha de caducidad a temperaturas inferiores a -20ºC. Usar todos los reactivos en condiciones asépticas para evitar contaminaciones microbianas. Utilizar sólo las cantidades de reactivos necesarias para la realización de la prueba. No devolver a los viales el exceso sobrante. VIRCELL, S.L. no se responsabiliza de la inadecuada utilización de los reactivos contenidos en el kit.

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estériles, puntas de pipeta con filtro, micropipetas, microcentrífuga y otros equipamientos necesarios) que no será usado en otros procedimientos o trasladado a otras áreas. B) Área de Amplificación: en esta área se realiza la reacción de PCR y los reactivos de PCR deben ser manipulados únicamente dentro de la misma. Para las actividades de amplificación se utilizará material específico (guantes, tubos estériles, puntas de pipeta con filtro, micropipetas, microcentrífuga, termociclador, cabina de flujo laminar y otros equipamientos necesarios) que no será usado en otros procedimientos o trasladado a otras áreas. Una vez terminada la amplificación, los tubos de PCR nunca deben ser abiertos en este área. C) Área de Postamplificación o detección: en este área se realiza la detección. Son necesarios un termobloque, tubos de centrífuga de 1.5 ml y una micropipeta. El material y equipamiento de este área deben permanecer en la misma. Debido a la alta sensibilidad analítica del test, hay que extremar las precauciones para preservar la pureza de los reactivos del kit y las mezclas de amplificación. Todos los reactivos usados deben tener el máximo nivel de pureza. Descartar cualquier reactivo sospechoso de estar contaminado. Este producto está indicado únicamente para personal con formación en técnicas de ensayos por PCR. No use el kit tras su fecha de caducidad. Todo el material no usado debe ser desechado de acuerdo a la regulación aplicable. Los componentes de este equipo podrán contener material genético o sustancias de origen animal y/o humano. A pesar de no ser infeccioso, este material debería ser manipulado como potencialmente infeccioso. Todo el material debe ser manipulado y desechado como potencialmente infeccioso. Observe la regulación local en materia de residuos clínicos. Las tiras reveladas deben ser almacenadas en un lugar apartado del área de preamplificación para evitar el riesgo de contaminación de la PCR. Se recomienda cortar los extremos de las tiras reveladas para una mejor conservación de las mismas.

TOMA DE MUESTRA: RECOMENDACIONES Y PRECAUCIONES: 1. 2.

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Este producto es sólo para diagnóstico in vitro y está destinado al uso por personal sanitario cualificado. Usar sólo componentes del kit. VIRCELL PCR MIX RECONSTITUTION SOLUTION, VIRCELL POSITIVE CONTROL RECONSTITUTION SOLUTION, y VIRCELL NEGATIVE CONTROL son compatibles con diferentes equipos SPEED-OLIGO® de VIRCELL. No intercambiar VIRCELL PCR MIX, VIRCELL POSITIVE CONTROL, VIRCELL STRIPS y VIRCELL RUNNING SOLUTION entre lotes y equipos. El uso de puntas de pipeta con filtro es esencial para evitar contaminaciones durante la extracción de ADN y realización de la PCR. Las muestras deben ser tratadas como si fuesen infecciosas utilizando procedimientos de seguridad del laboratorio. Mantener limpias y desinfectadas todas las superficies de trabajo con una solución recién preparada de hipoclorito sódico 0.5% en agua desionizada o destilada. Para obtener resultados más fiables es aconsejable ensayar las muestras lo antes posible después de la recogida de las mismas. No se han probado diferentes tiempos de almacenamiento durante el envío de las muestras. Usar guantes protectores desechables, batas de laboratorio, y protección ocular cuando se manipulen las muestras. Lavarse las manos adecuadamente tras la manipulación de las muestras. Retirar las alícuotas de los reactivos evitando contaminaciones microbianas. Para la realización del test es esencial tener tres áreas de trabajo independientes: área de Pre-Amplificación, área de Amplificación, y área de Post-Amplificación o Detección. El flujo de trabajo en el laboratorio debe ser unidireccional, desde el área de PreAmplificación hasta el área de Post-Amplificación. Es necesario llevar guantes en cada área, quitándolos y tirándolos antes de abandonar cada área. A) Área de Pre-amplificación: para la recogida de muestras y extracción de ADN. Para las actividades de preamplificación se utilizará material específico (guantes, tubos

Manipular todas las muestras como si fueran agentes infecciosos trasmisores de enfermedades. Recogida de muestras Se pueden usar, como materiales para testar, escobillones nasofaringeos, secreciones faríngeas y nasales, esputos, esputos provocados, lavados broquiales, tejidos y células infectadas o cultivos. Los escobillones deberían ser mezclados con medio de transporte líquido (referencias Vircell TM). Los escobillones de alginato cálcico no deben usarse para recogida de muestras ya que inhiben la PCR. Recomendamos usar kits de extracción de ADN comerciales. Transporte de muestras Las muestras respiratorias humanas deben transportarse en medio de transporte (referencias Vircell TM). Para asegurar la llegada al laboratorio de muestras de alta calidad, estas deberían ser transportadas en el menor tiempo posible. Almacenamiento de las muestras Las muestras pueden ser almacenadas a 2-8ºC hasta 24 horas o congeladas a temperatura inferior a -20ºC durante periodos mas largos de tiempo. Los extractos pueden ser almacenados a una temperatura de al menos -20ºC durante al menos un año. Deben evitarse repetidas congelaciones y descongelaciones. Una vez usada, almacenar el resto de cada muestra procesada a 2-8ºC por si es necesario repetir el ensayo. Cualquier repetición de un ensayo debe ser realizado dentro de los 7 primeros días tras la recogida de la muestra. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS: Todos los reactivos suministrados están listos para su uso, excepto VIRCELL PCR MIX y VIRCELL POSITIVE CONTROL. 1 VIRCELL PCR MIX. Cada PCR mix contiene suficiente cantidad como para realizar 8 reacciones de PCR. Para su reconstitución, seguir los siguientes pasos:

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Añadir 150 µl de VIRCELL PCR RECONSTITUTION SOLUTION 5 a cada tubo. Mezclar usando el vortex durante 1-2 segundos

MIX

2.5.-Programa de PCR: Introducir los tubos de PCR en el termociclador e iniciar el siguiente programa*: 1 ciclo

Asegurarse de que la mezcla de PCR es completamente homogénea. 2 VIRCELL POSITIVE CONTROL. Para su reconstitución, seguir los siguientes pasos: -

Centrifugar el tubo correspondiente durante 5 segundos a 5000 g. Añadir 200 µl de VIRCELL POSITIVE CONTROL RECONSTITUTION SOLUTION 6 a cada tubo. Mezclar usando el vortex durante 1-2 segundos. Centrifugar el tubo durante 5 segundos a 5000 g.

40 ciclos 1 ciclo

92ºC 92ºC 55ºC 72ºC 72ºC

90 segundos 20 segundos 20 segundos 20 segundos 2 minutos

*(seguir las instrucciones provistas por el fabricante del termociclador, habilitando la opción de tapa calentada a una temperatura entre 95-105ºC). La detección de los productos de PCR se llevará a cabo mediante un dipstick. Si la hibridación no se realiza inmediatamente, los tubos de PCR pueden ser congelados a temperatura inferior a -20ºC. 3.-Detección en tira (realizada en el área de Post-Amplificación):

Una vez reconstituidos, el VIRCELL PCR MIX 1 y el VIRCELL POSITIVE CONTROL 2 pueden ser congelados a temperatura inferior a -20ºC para ser usados en reacciones posteriores. PROCEDIMIENTO DEL TEST 1.-Extracción de ADN (realizado en el área de Pre-Amplificación): Para la extracción de ADN, recomendamos usar kits de extracción comerciales siguiendo las instrucciones del fabricante. Este kit ha sido testado con los siguientes kits de extracción de ADN: High pure PCR template preparation kit (Roche), QIAamp DNA blood mini kit (Qiagen) y NucleoSpin Tissue (Macherey-Nagel). Pueden usarse otros kits comerciales. Consultar con el servicio de atención al cliente. 2.-PCR (realizada en el área de Amplificación): El PCR mix 1 está liofilizado. Cada vial contiene los componentes necesarios para la realización de 8 reacciones. 2.1.-Reconstituir los viales de PCR mix necesarios (ver “Preparación de los reactivos”) para el número de muestras y controles que vayan a ser analizadas.

Antes de llevar a cabo este paso, es necesario precalentar el termobloque a 55ºC. Se utilizarán tantos tubos como muestras y controles se pretendan analizar. Es conveniente sacar y rotular con el número de muestra, las tiras que se vayan a utilizar antes de comenzar. En el caso de utilizar la lectura automática de las tiras no escribir sobre el código de barras. Todo el proceso de detección debe realizarse seguido y sin interrupciones entre los distintos pasos. 3.1.-Precalentamiento de la solución de hibridación: Añadir 35 µl de VIRCELL RUNNING SOLUTION 7 en un tubo (tipo Eppendorf) de 1.5 ml que encaje correctamente en el termobloque utilizado. Incubar a 55ºC entre 2 y 5 minutos. Este tubo debe permanecer en el termobloque hasta el final de proceso de detección. 3.2.-Desnaturalización del producto de PCR: Al mismo tiempo que se realiza el paso anterior (Precalentamiento de la solución de hibridación), desnaturalizar durante 1 minuto a 95ºC en un termociclador, el producto de PCR generado según el apartado 2. Tras la desnaturalización, pasar el producto de PCR rápidamente a hielo o a una gradilla isofreeze. Proceder inmediatamente con el siguiente paso.

En ningún caso los productos de PCR deben ponerse en una gradilla a temperatura ambiente tras la desnaturalización a 95ºC. En el caso de no disponer de gradilla isofreeze o hielo, puede pipetearse el producto de PCR sin enfriarlo justo después de la desnaturalización a 95ºC e introducir inmediatamente la tira.

2.2.-Preparación de los tubos de PCR: Rotular y colocar en una gradilla el número de tubos necesarios. Serán necesarios un tubo para cada muestra más un tubo para el control negativo y un tubo para el control positivo. 2.3.-Adición del PCR mix: Pipetear 15 µl del PCR mix reconstituido por tubo.

El PCR mix reconstituido y no utilizado puede ser congelado a temperatura inferior a -20ºC para ser usado en reacciones posteriores.

3.3.-Adición del producto de PCR: Añadir 5 µl de producto de PCR desnaturalizado, al tubo de 1.5 ml que permanece en el termobloque y contiene la solución de hibridación precalentada a 55ºC.

Las muestras no deben permanecer durante más de 2 minutos a 4ºC sin ser añadidas al tubo de 1.5 ml. En el caso de que el producto de PCR no sea añadido al tubo de 1.5 ml antes de 2 minutos tras del paso de desnaturalización, será necesario repetir el paso 3.2. En el caso de que se estén analizando muchas muestras simultáneamente, y para evitar que transcurra más de 2 minutos desde la desnaturalización hasta la detección en la tira, se recomienda desnaturalizar y revelar las muestras en grupos de 3 a 5. De este modo se evitará la aparición de falsos negativos.

2.4.-Adición de la muestra: Añadir 10 µl de cada muestra extraída o control a cada tubo. El control negativo incluido en el kit es agua. Para cada ensayo, el control negativo debería ser el último reactivo en ser añadido.

El control positivo 2 está liofilizado. Es necesario reconstituirlo antes de usarlo (ver “preparación de los reactivos”). Tras la reconstitución, el control positivo puede ser congelado a temperatura inferior a -20ºC para ser usado en reacciones posteriores (ver “preparación de los reactivos”). Debido a la sensibilidad de la técnica y para evitar contaminaciones, el control positivo debe ser manipulado al final de la preparación de la PCR, cuando la PCR mix y las muestras han sido dispensadas. Recomendamos guardar el control positivo y los tubos de PCR mix en lugares separados, además de pipetear el control positivo en el área de post-amplificación justo antes de comenzar la PCR.

3.4.-Hibridación del producto de PCR: Justo tras la adición de la muestra, introducir inmediatamente en el tubo de 1,5 ml que permanece en el termobloque, la tira 4 en la orientación correcta (las flechas apuntando hacia la muestra: ver el esquema) e incubar a 55ºC durante 5 minutos. Cuando se revelen entre 3 y 5 muestras añadir todos los productos de PCR primero y después introducir los strips.

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El control positivo permite detectar fallos de los reactivos y comprobar el correcto funcionamiento del procedimiento básico. El control negativo permite detectar contaminaciones ambientales de los reactivos. Para la lectura del resultado colocar la tira en la posición indicada como S en la tarjeta de lectura. El test incluye 3 áreas de lectura: -

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3.5.-Interpretación del resultado: Sacar la tira e interpretar el resultado con la ayuda de la tarjeta de interpretación siguiendo las indicaciones del siguiente apartado. -

La interpretación de los resultados ha de llevarse a cabo justo después de sacar la tira. Si se deja secar pueden aparecer cambios en la intensidad de la señal y fondos en las muestras negativas. Las tiras reveladas deben ser almacenadas en un lugar apartado del área de preamplificación para evitar el riesgo de contaminación de la PCR.

Línea de control de producto: Siempre debe ser positiva y legible si el test ha sido realizado correctamente. Esta línea indica que el oro coloidal ha funcionado correctamente, la viabilidad de la sonda es adecuada y que la solución de hibridación fluye correctamente. Línea control de amplificación de PCR: La ausencia de una banda roja en esta posición indica la presencia de inhibidores en la muestra que podrían haber interferido con la reacción de amplificación, la inadecuada extracción de ADN de la muestra o la ausencia de células humanas en la muestra. En este caso, se debería repetir el ensayo con una segunda alícuota de la muestra o con una nueva muestra. En muestras fuertemente positivas la línea podría ser débil o negativa, debido a un alto contenido de diana específica en la muestra, no invalidando el resultado final. Línea test: Una banda roja en esta posición indica la presencia de material genético de M. pneumoniae en la muestra.

CONTROL DE CALIDAD INTERNO: Cada lote se somete a control de calidad interno antes de su liberación asegurando el cumplimiento del protocolo de validación por el usuario mediante especificaciones más estrictas. Los resultados de control final de cada lote están disponibles. VALIDACIÓN DEL MEDIO DE TRANSPORTE DE CULTIVO Y ESCOBILLONES DE RECOGIDA DE MUESTRAS Todos los lotes nuevos de medio de transporte de cultivo usados para transportar muestras al laboratorio para ser testadas deben estar validados para su uso con el test para asegurar que el medio no contiene sustancias que interfieran con la PCR (hay un protocolo de validación disponible). Todos los medios de transporte de VIRCELL (referencias Vircell TM) han sido testados para garantizar la ausencia de sustancias que interfieran. CONTROL DE PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA Para comprobar la efectividad del procesamiento de muestras, debe añadirse una cantidad de microorganismo o control de ADN purificado de M. pneumoniae (ref. VIRCELL MBC035) a un tubo de medio de transporte de cultivo validado e incubarse durante una hora a temperatura ambiente. Esta muestra artificial debe ser procesada y testada.

Las tiras incluyen un código de barras para su lectura automática mediante un escáner y un programa de lectura específico. En el caso de utilizar la lectura automática de las tiras no escribir sobre el código de barras. Consulten con el servicio de atención al cliente para más detalles. LIMITACIONES DEL MÉTODO:

Se debe usar un control negativo en cada ensayo desde el paso de aislamiento del ácido nucleico para descartar contaminaciones en el producto artificial. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Y PROTOCOLO DE VALIDACIÓN POR EL USUARIO: Siempre debe incluirse un control negativo en cada ensayo. El control negativo es agua, por lo que sólo aparecerá una banda roja en la posición de la línea control de producto. Este resultado no debe ser considerado como inválido. Debería incluirse un control positivo en cada ensayo que será positivo para las dos líneas test así como para la línea control de amplificación de PCR. Siempre que se abre un nuevo kit, debe incluirse un control positivo al menos en el primer ensayo.

1.-Este método está diseñado para ser utilizado con muestras respiratorias humanas. 2.-El uso de este kit requiere la cuidadosa lectura y comprensión del folleto de instrucciones. Es necesario seguir estrictamente el protocolo para obtener resultados fiables, en particular el correcto pipeteo de muestras y reactivos, y tiempos y temperaturas de incubación. Es especialmente importante realizar cada paso del ensayo en las áreas descritas en el procedimiento del ensayo. 3.-El test no indica el lugar de la infección. No pretende sustituir al aislamiento. 4.-La detección del microorganismo depende del número de organismos presentes en la muestra y podría verse afectado por los métodos de recogida de muestras, factores del paciente, estadío de la infección y/o cepa.

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5.-Como cualquier test diagnóstico, los resultados deben ser valorados considerando todos los datos clínicos y de laboratorio. Los resultados del kit deben ser usados junto con la sintomatología clínica y otros procedimientos diagnósticos. 6.-Este producto está indicado para ser usado sólo por personal formado en técnicas de PCR. 7.-Los resultados del test son cualitativos. No existe correlación entre la magnitud del resultado positivo y el número de microorganismos en la muestra. 8.-Este test ha sido verificado para ser usado con muestras respiratorias humanas. No ha sido verificado con otros tipos de muestras. 9.-La fiabilidad de los resultados dependerá de una adecuada recogida de las muestras, transporte, almacenamiento y procedimientos de procesamiento. 10.-Las prestaciones no han sido determinadas para todos los genotipos. 11.-El test solo funciona dentro de los límites de las regiones genómicas en las que las sondas han sido elegidas. Debido a la alta variabilidad de los genomas bacterianos es posible que ciertos subtipos no sean detectados. Cambios en las secuencias de los oligonucleótidos de PCR o las sondas podrían producir falsos negativos. 12.-Un resultado negativo no excluye la presencia del microorganismo en niveles por debajo del límite de detección del ensayo. 13.-Un test positivo no excluye la posibilidad de que otros patógenos estén presentes. 14.-El control interno incluido en el ensayo no elimina todos los resultados falsos negativos. 15.-La detección de M. pneumoniae en muestras respiratorias no indica necesariamente la implicación del patógeno en el episodio de neumonia. Sin embargo el conjunto de datos clínicos junto con un resultado positivo de PCR sugieren una neumonia causada por el microorganismo detectado. 16.-Este test ha sido validado para ser usado con kits comerciales de extracción.

REACCIÓN CRUZADA E INTERFERENCIAS: Se ensayaron muestras artificiales que contenían diferentes microorganismos (Aspergillus fumigatus, Bacillus cereus, Bordetella pertussis, Brucella abortus, Candida albicans, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Coxiella burnetii, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, HSV1, HSV2, Legionella pneumophila, Neisseria meningitidis serogrupos A, B y C, Rickettsia conorii, Salmonella typhi, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Toxoplasma gondii) algunos de ellos frecuentes en muestras respiratorias. No se obtuvo ningún resultado falso positivo. SÍMBOLOS UTILIZADOS EN EL PRODUCTO: Producto para el diagnóstico in vitro Fecha de caducidad yºC Conservar entre x-yºC

xºC ∑ x

Contiene suficiente para pruebas

Lote Referencia (catálogo)

Consultar instrucciones de uso

Reconstituir en µl

PRESTACIONES

Tarjeta de lectura de test monolínea

SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD:

Tarjeta de interpretación

Sensibilidad analítica:

Línea de Control de Producto

Diluciones seriadas de ADN purificado de M. pneumoniae en muestras negativas se procesaron y ensayaron. EL kit fue capaz de detectar hasta 20 copias de ADN por reacción.

Línea control de amplificación de la PCR

Línea Test

Sensibilidad diagnóstica: Se ensayaron 60 muestras frente a REAL TIME PCR en un ensayo externo, obteniendo los siguientes resultados: Sensibilidad diagnóstica=100%

Muestra

Muestra Positiva

Especificidad: Muestra Negativa

Se ensayaron 60 muestras frente a REAL TIME PCR en un ensayo externo, obteniendo los siguientes resultados: Especificidad=98% 50 muestras de donantes sanos fueron procesadas y analizadas. No se detectaron resultados positivos.

Ensayo Inválido

Fecha

PRECISIÓN INTRAENSAYO: 2 muestras (una positiva cercana al límite de detección y una negativa) fueron amplificadas 5 veces en un único ensayo realizado por el mismo operador en condiciones de trabajo idénticas. En todos los ensayos se observaron resultados similares. PRECISIÓN INTERENSAYO: 2 muestras (una positiva cercana al límite de detección y una negativa) fueron amplificadas individualmente durante 3 días consecutivos por 2 operadores diferentes. En todos los ensayos se observaron resultados similares.

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BIBLIOGRAFÍA: 1. Daxboeck, F; Krause, R; Wenisch, C. 2003. Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection. Clinical Microbiology and Infection 9: 263–273. 2. Loens, K; Ursi, D; Goossens, H; Ieven, M. 2003. Molecular diagnosis of Mycoplasma pneumoniae respiratory tract infections. J. Clin. Microbiol. 41: 4915-4923. 3. Pitcher, D; Chalker, VJ; Sheppard, C; George, RC; Harrison, TG. 2006. Real-time detection of Mycoplasma pneumoniae in respiratory samples with and internal processing control. J Med Microbiol 55: 149-155. 4. Stralin, K; Bäckman, A. Holmberg, H; Fredlund, H; Olcén, P. 2005. Design of a multiplex PCR for Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Mycoplasma pneumoniae and Chlamydophila pneumoniae to be used on sputum samples. APMIS 113: 99-111. Para cualquier aclaración o consulta, contactar con: [email protected]

REVISADO: Septiembre-12

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