Targeting histone deacetylases for cancer therapy Dr. Wilner Martínez-López Epigenetics and Genomic Instability Laboratory Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE) Montevideo - Uruguay

Respuesta celular al daño inducido sobre el ADN

Detención del ciclo celular

Completo Reparación del ADN

Mutación Incompleto

ADN

Apoptosis

Aberraciones Cromosómicas

cáncer y enfermedades hereditarias

El ADN es empaquetado por proteínas histónicas y no histónicas en cromatina.

La cromatina es un material altamente dinámico, que posee información epigenética.

ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LA CROMATINA

Cromatina

nucleosoma estructura superior de la cromatina regulación de la estructura de la cromatina Código de histonas – mecanismos epigenéticos

Nucleosoma – el ADN eucariota se enrolla 1.7 veces, empaquetándose en el nucleosoma Histonas – proteínas positivamente cargadas (20% de Lys o Arg) Núcleo de histonas: H2A, H2B, H3 y H4 Histona eslabón: H1

48 nm de ADN (145 pb) son empaquetados en un disco de 6 x 11nm nucleosoma

Dominios de plegamiento – 3 α-hélices separadas por lazos sin estructura.

Ensamblado del nucleosoma

nucleosoma

ESTRUCTURA SUPERIOR DE LA CROMATINA La histona H1 estabiliza la estructura de orden superior de la cromatina. Contacta al ADN espaciador y la región central del ADN en el nucleosoma

Fibra de cromatina de 30 nm

Seis nucleosomas por cada vuelta: Solenoide

H1 Condensinas Topoisomerasas Una vuelta completa: 1.2 Kb de ADN

Organización de la cromatina en interfase y en cromosomas mitóticos

Fibra de cromatina de 30 nm se une formando lazos a un armazón proteico

Interfase Matriz nuclear

Cromosomas mitóticos Scaffold

Existen por lo menos dos formas de información en el núcleo de la célula: A- Información genética B- Información epigenética

EPIGENETICA La epigenética es el estudio de los mecanismos heredables que afectan el estado transcripcional de un gene el cual no puede ser explicado por la secuencia de ADN y que puede persistir por una o más generaciones.

EPIGENETICA • Sistemas de metilación de ADN • Remodelación de la cromatina mediante modificaciones de las histonas: metilación, fosforilación, acetilación, ubiquitinación, ADP ribosilación • Mecanismos de remodelación de la cromatina dependientes de ATP: ISWI, SWI/SNF2 • ARN no codificante Metilación de ADN dirigida por ARN Silenciamiento génico postranscripcional ARN de interferencia

REGULACIÓN DE LA ESTRUCTURA DE LA CROMATINA

La interacción ADN-octámero de histonas es dinámica, permitiendo el acceso a regiones particulares del ADN  Complejos remodeladores del

nucleosoma  Modificaciones covalentes de las histonas

REMODELADORES DE LA CROMATINA DEPENDIENTES DE ATP switching (SWI) and sucrose non-fermenting (SNF)

Imitation SWI

Regulación

Clasificación según la identidad de la subunidad ATPasa: SWI2/SNF2 (“switch sucrose non fermenting”) ISWI (“imitation SWI”)

Variations in Human SWI/SNF Complexes

BRM/BAF

BRG1/BAF BAF170 BAF57 BAF53a

BRG1 BAF47

PBAF

BAF170 BAF60 Actin a Actin a

BAF57 BAF53a

BRM

BAF250a

BAF47

BAF170 BAF57

BAF60 Actin a

BAF53a

BAF250a

BAF155

EBAFb

EBAFa ENL

BAF170 BAF57 BAF53a

BRG1 BAF47

EBAF70

BAF60 a & b Actin

ENL

BAF170 BAF57 BAF53a

BRG1

BAF250a

BAF155

BAF47

EBAF70

BAF60 a & b Actin

BAF250b

BAF155 EBAF140

EBAF100

BRG1 BAF180 BAF47

BAF155

BAF155

BAF60 Actin a

EBAF140 EBAF100

a&b

Regulación

Los remodeladores ATP dependientes y las modificaciones covalentes de histonas trabajan juntas para incrementar la accesibilidad al ADN

Modificaciones covalentes – las modificaciones en las colas Nterminal de las histonas alteran el acceso a la cromatina Acetilación Deacetilación Modificaciones post-traduccionales

Metilación Fosforilación Ubiquitinación ADP-ribosilación

Las colas de histonas están involucradas en la formación de la fibra de 30nm sus modificaciones afectan la estructura de 30nm

Regulación

La hipótesis del Código de Histonas En general, el código genético incluye 4 nucleótidos, A G T y C, y el nivel de complejidad está basado en la combinación potencial de estas 4 bases.

Existe tambien un “código de histonas” epigenético, el cual es mucho más complejo y es parcialmente responsable de la regulación funcional del código genético en una célula en particular y dentro de un ambiente determinado. El código de histonas incluye: Acetilación (mono-, Metilación (mono-, Fosforilación Ubiquitinación

di, di-,

and and

tri-) tri-)

Hipótesis Código de Histonas

• • • • •

Modificaciones de las histonas Variantes de histonas Enzimas responsables de las modificaciones de histonas Coordinación de la modificación de histonas Dominios de proteínas que se unen con las histonas modificadas

Hipótesis Código de Histonas Modificaciones de histonas •

Different combinations of histone modifications, especially located near or within a gene’s promoter, may be VERY SPECIFIC to the transcriptional state of the gene

Peterson CL et al, Current Biology, 2004

Modificaciones post-traduccionales de las histonas

Hipótesis Código de Histonas Enzimas que proveen la metilación de las histonas Methylated histones first described in 1964, Murray 1964 Biochemistry 3, 10-15

Hipótesis Código de Histonas Histona demetilasa LSD-1

Shi et al., (2004). Metzger et al. (2005)

H1

LAS HISTONAS

H2A

son proteínas básicas altamente conservadas

H2B hélice variable

H3 conservada

H4

La acetilación de histonas es una modificación reversible de los extremos N-terminal del octámero de histonas. Resultado: • reducción de la unión al ADN • desestabilización de la cromatina

N Histona

Peso molecular

Numero de aminoácidos

Contenido de aminoácidos básicos

ACETILACIÓN DE HISTONAS

Wolfe and Pruss Cell 84, 817-819 (1996)

Fibras de cromatina

Fibra de cromatina de 30 nm

ADN

+ extremos N-terminales cargados (unión al ADN sobre nucleosomas vecinos)

nucleosoma

Fibra nucleosómica de 11 nm

Histonas altamente acetiladas (especialmente H3 y H4)

solenoide

• ALTO nivel de histonas H1

• Nivel reducido de histona H1

• NO transcripción génica

•Posible transcripción génica

Hipótesis Código de Histonas Variantes de histonas

K. Sharma 2005,NATURE REVIEWS

“Interplay” entre diferentes mecanismos epigenéticos

Margueron ,Current Opinion in Genetics & Development (2005)

Histone Code Hypothesis • As proposed by Allis and Strahl: “that multiple histone modifications, acting in a combinatorial or sequential fashion on one or multiple histone tails, specify unique downstream functions”

Strahl, B.D. and Allis, C.D., Nature. 2000

Combinatorial histone modifications

35

Hipótesis Código de Histonas Something is writing this code….

and Something is reading this code…

Regulación

Las modificaciones generan sitios de unión a proteínas Bromodominios – reconocen histonas acetiladas Cromodominios – reconocen histonas metiladas

Proteins “read” histone code

bromodomain + acetylated lysine

chromodomain + methylated lysine Khorasanizadeh, 2004

Interdependencia entre modificaciones de histonas Phosphorylation of serine residues 10 and 28 on histone H3 is a marker for chromosomal condensation. The combination of phosphorylation of serine residue 10 and acetylation of a lysine residue 14 on histone H3 correlate with active transcription. Methylated lysine 9 and lysine 27 on histone H3 are associated with repressed genes. Methylated lysine 4, 36 and 79 of H3 are associated with “active” chromatin

epigenesis

Modificaciones de la superficie lateral La energía de hidrólisis del ATP de los remodeladores de histonas puede usarse para separar el ADN del octámero de histonas y exponer sus aminoácidos laterales para su modificación.

H3 Thr 118 se une por puente de hidrógeno al esqueleto de ADN y a H4 Arg45 . La fosforilación de Thr 118 altera la interacción de H4 Arg45 con el surco menor, permitiendo el deslizamiento del octámero sobre el ADN

Code Readers

Protein code readers bind to specific sets of modifications leading to downstream effects such as gene transcription, DNA synthesis and repair.

Cellular Decisions

Modified Histones

Nuestro Epigenoma • If epigenetic markers are dynamic and respond to environmental influences, do they change over time?

– Evidence suggests the answer is yes. • Twin studies have been highly informative for this question.

Author Statement • “We found that, although twins are epigenetically indistinguishable during the early years of life, older monozygous twins exhibited remarkable differences in their overall content and genomic distribution of 5-methylcytosine DNA and histone acetylation, affecting their gene-expression portrait.”

Chromosomal Level • Comparative genomic hybridization for methylated DNA – Yellow = similar chromosome methylation pattern between twins. – Red = regions of hypomethylation in one twin compared to the other. – Green = regions of hypermethylation in one twin compared to the other.

Epigenetica y Medio Ambiente Evidencias epidemiológicas sugieren que la exposición ambiental temprana durante el desarrollo posee un rol en la susceptibilidad a enfermedades a lo largo de nuestra vida. Algunos de estos efectos podrían pasar a sucesivas generaciones Las modificaciones epigenéticas constituirían un “link” entre el medio ambiente y las alteraciones en la expresión génica que podrían conducir a las enfermedades

Epigenética y Cancer Los diferentes estados de la cromatina son esenciales para el control génico Es importante no solo encender los genes correctos sino tambien apagar aquellos que no deben ser expresados Los componentes de la cromatina poseen un papel fundamental en la decisión de estos procesos El silenciamiento epigenético de genes constituye una nueva herramienta para la terapia anti-neoplásica

Historicamente se consideraba que el cancer derivaba de cambios genéticos GENETIC

Example: Replication errors X

X

Altered DNA sequence Altered DNA/mRNA/proteins

Oncogenesis

Tumor

En las últimas décadas se ha demostrado que los cambios epigenéticos son tambien importantes en el desarrollo del cáncer GENETIC

EPIGENETIC

Example: Chromatin modification errors

Example: Replication errors X

X

Altered chromatin structure

Altered DNA sequence Altered DNA/mRNA/proteins

Oncogenesis

Tumor

Altered levels of mRNA/proteins

Epigenética Genome DNA

Epigenetics is: • Reversible changes in gene expression – Without changes in DNA sequence – Can be inherited from precursor cells

Chromatin

Epigenome

Gene Expression

• Epigenetic information is included in the epigenome Phenotype

Los mecanismos epigenéticos juegan un importante papel en el desarrollo de una célula normal como en una cancerosa EPIGENETICS

Normal epigenetic mechanisms

Normal differentiated cells, e.g. embryonic cells, hematopoetic cells

Deregulated epigenetic mechanisms

Malignant progenitor cell

Tumor

Epigenetic mechanisms can regulate genes involved in differentiation, cell cycle, and cell survival Deregulation of epigenetic mechanisms results in aberrant gene expression, which can lead to cancer Reversal of deregulated epigenetic changes is a rational strategy for targeting cancer

En el cáncer, cambios en la estructura de la cromatina pueden silenciar Genes Supresores de Tumores Normal cells

Ac

Ac

Ac

Ac

Ac Ac

Cancer cells

Ac Ac

Ac

Tumor suppressor gene expression

Tumor suppressor gene expression

Silencing of tumor suppressor genes, a major process in tumorigenesis, may result from epigenetic changes that condense chromatin structure

El balance en el proceso de acetilación de histonas es fundamental para la regulación transcripcional de una célula HAT

HISTONE ACETYLATION

TF Ac

Ac Ac

TF

Deacetylated Histones Closed chromatin Transcription factors cannot access DNA

HISTONE DEACETYLATION

Ac

Ac Ac

Ac Ac

Acetylated Histones HDAC

Open chromatin Transcription factors can access DNA

Increased HDAC activity or decreased HAT activity may result in aberrant gene expression, contributing to cancer

Ac

La metilación del ADN impide la expresión génica TF DNMT

DNMT

TF Ac

Ac

Ac

Ac

Gene expression

Ac

Ac

Ac

Me

Me Ac

Ac Ac

Ac

Ac

DNMT Me

Me

Me

Me

Ac

Ac

Ac

DNMT

Ac

Me

Ac

Ac

Gene expression

DNA methylation involves the transfer of methyl groups to cytosine residues in DNA by DNA methyltransferases (DNMTs) May prevent transcription factors from binding to DNA May serve as binding site for methylated DNA-binding proteins, such as MECP2, which then recruit HDACs

La inhibición de HDACs puede revertir la expresión génica alterada DAC Inhibitor HDAC

TF

Ac

Ac

Ac

Cell-cycle arrest Differentiation

Gene expression

Growth control Apoptosis Adhesion

Cell nucleus

• Inhibition of HDAC activity can restore the balance of histone acetylation • Targeting HDAC activity may therefore allow re-expression of silenced genes to reverse oncogenesis

Una terapia combinada puede ser más eficiente DNMT Inhibitor DAC Inhibitor

DNMT

HDAC

TF Ac

Ac

Ac

Ac

Ac

Ac

Cell-cycle arrest Differentiation

Gene expression

Growth control Apoptosis Adhesion

Cell nucleus

Since DNA methylation and histone deacetylation can co-operate to silence tumor suppressors, inhibition of both DNMT and HDAC activities can synergize to restore expression of silenced genes

Resumen Los procesos epigenéticos regulan la expresión génica y conducta celular Los cambios epigenéticos que conducen al silenciamiento de genes es central en la patogénesis de la enfermedades malignas, tanto en tumores sólidos como hematológicos La deacetilación de histonas y la metilación del ADN representan dos modificaciones epigenéticas con relevancia clínica en oncogénesis Los blancos terapéuticos de la terapia epigenética pueden restaurar la expresión de genes que son críticos en el control del normal crecimiento de la célula Los inhibidores de HDACs muestran sinergismo con los agentes demetilantes del ADN para inhibir el crecimiento tumoral

EPIGENETICA Y FARMACOLOGIA • A diferencia de las patologías con base genética, las relacionadas con cambios epigenéticos son reversibles. • Las drogas epigenéticas pueden ser empleadas ya sea para activar o silenciar genes relacionados con patologías. • Diferentes estados epigenéticos pueden condicionar la respuesta a drogas • La farmacoepigenómica constituye un campo emergente.

Peedicayil 2006

Ensayo de terapias para incrementar la sensibilidad al tratamiento quimioterápico en líneas celulares derivadas de cáncer de vejiga

IIBCE-FMED CARACTERISTICAS MAS SALIENTES Tratamiento estándar: resección transuretral del tumor seguido de la instilación intravesical de agentes de quimioterapia. Recidiva: 70% con un 30% de neoplasias invasoras y mortalidad del 80% a 5 años (Swana et al., 1999). Sobre-expresión de SURVIVINA, hecho asociado con el elevado porcentaje de recidiva y su mal pronóstico en términos de sobrevida.

ESTRATAEGIA DE LA INVESTIGACION 1. Estudiar el efecto de la inhibición de expresión de survivina (mediante ARN de interferencia) en relación al tratamiento quimioterápico que habitualmente se emplea en la terapia anti-neoplásica en el cáncer de vejiga. 2. Analizar el efecto de la remodelación de la cromatina (mediante cambios en el patrón de acetilación de histonas) en la respuesta al tratamiento quimioterápico de líneas celulares derivadas de cáncer de vejiga que expresan diferentes niveles de survivina. 3. Asociación de ambas terapias con el fin de incrementar la sensibilidad al tratamiento quimioterápico en las líneas celulares derivadas de cáncer de vejiga.

Terapia con ARN de interferencia (ARNi) anti-survivina Diseño y sintesis de oligodeoxinucleótidos Exon IV

shRNA_3 (100.0%)

a partir de 5 secuencias del mensajero de survivina. Generación de un “shRNA” (“short hairpin RNA”) clonado en el plásmido pSilencer 1.0 para ser empleado como ARN de interferencia.

shRNA_1 (100.0%)

Generación de un anticuerpo policlonal específico contra todas las variantes de “splicing” de survivina con el fin de poder cuantificar su expresión en células tumorales mediante la realización de “western blots”.

Anticuerpo comercial

Recuento de aberraciones cromosómicas y porcentaje de células apoptóticas

Exon III shRNA_2 (100.0%) Exon II shRNA_5 (100.0%) Exon I shRNA_4 (100.0%)

ARNm de survivina

1619 bp

Control ()

Antisurvivina 1/16000

Antisurvivina 1/8000

Antisurvivina 1/4000

Co-transfección con lipofectamina de los plásmidos con un vector que produce la proteína fluorescente verde (pcEGFP, utilizada para determinar el porcentaje de células transfectadas)

Terapia cromatínica empleando inhibidores de deacetilasas de histonas (HDAC) El tratamiento con tricostatina A, previo a la exposición a etopósido, ellipticina, camptotecina, doxorubicina, cisplatino, 5-fluorouracilo o ciclofosfamida, incrementa la muerte celular producida por estas drogas (Kim et al. 2003). Datos preliminares obtenidos en nuestro laboratorio mostraron una disminución en la sobrevida de células 253J (línea celular derivada de un cáncer transicional de vejiga) expuestas a etopósido (5, 10 y 20 mM) en presencia de butirato de sodio (un inhibidor de deacetilasas de histonas). Recuento de aberraciones cromosómicas y porcentaje de células apoptóticas

COULD THE INCREASE IN GENETIC DAMAGE OR DECREASE IN DNA REPAIR BE RESPONSIBLE FOR HDACi SENSITIZATION?

We studied the induction/removal of DNA damage induced by anti-neoplasic agents, as well as cell cycle progression in the presence or absence of HDACi.

METHODOLOGY

Human and Chinese hamster cells were exposed to the HDACis sodium butyrate (NaB) or valproic acid (VA) before etoposide treatment or gamma rays exposure.

Cell survival Etoposide ( 20 mM, 1 hour)

Clonogenic assay

Cell cycle progression 24 hours

DNA content analysis by flow cytometry

Nº of events

Sodium butyrate (NaB) (1 and 5 mM)

G0-G1

G2-M S

Fluorescence intensity

Bladder cancer (253J) cell line Chinese hamster (CHOK1) cell line

DNA damage induction/removal Comet assay – alkaline version

RESULTS and DISCUSSION NaB (1 mM and 5 mM) + etoposide (20 µM) in CHOK1 and the 253J cell lines Cell survival 253J

CHOK1 CHOK1

NaB 5mM +Eto Eto NaB 1mM +Eto

100% 80% 60% 40% 20%

100% 80% 60% 40% 20% 0%

0%

a

Eto NaB 1mM +Eto NaB 5 mM +Eto

120%

Relative plate efficiency

Relative plate efficiency

253J

0

10

20

30

Etoposide (uM)

40

50

0

60

b

10

20

30

40

50

Etoposide (uM)

Figure 1 – Relative plate efficiency in 253J (a) and CHOK1 (b) cell lines after etoposide treatment, either with or without NaB pre-treatment (1 and 5 mM). Pool data from at least two independent experiments are shown. Bars represent 95% confidence intervals.

Cell cycle arrest induced by the higher dose of NaB could explain the uneven sensitivities to etoposide in terms of cell survival?

Nº of events

Cell cycle progression

G0-G1 G2SM

Fluorescence intensity 253J 253J

% G2 %S

a

CHOK1 CHO K1

%S % G1

100%

100%

90%

90%

80%

80%

% phases of cell cycle

% phases of cell cycle

% G1

% G2

70% 60% 50% 40% 30%

70% 60% 50% 40% 30%

20%

20%

10%

10%

0% Control

Eto

NaB 1

NaB 5

N 1 + Eto

N 5 + Eto

b

0% Control

Eto

NaB 1

NaB 5

N 1 + Eto

N 5 + Eto

Figure 2 – DNA content analysis evaluated by flow cytometry in 253J (a) and CHOK1 (b) cells treated with etoposide with and without NaB (N) (1 or 5 mM) pre-treatment.

Since cell cycle arrest produced by the higher dose of NaB could be involved in the decrease of the sensitization effect to etoposide, we analysed its effect on DNA damage induction/removal.

DNA damage induction 253J 20

T24

253J

16

18

Tail Moment

Tail Moment

T24 20

*

18

14 12 10

16 14

*

12 10

8

8

6

6

4

4

2

2 0

0 Control

NaB 1 mM

a

NaB 5 mM

Etoposide

NaB 1 mM + Eto

NaB 5 mM + Eto

Treatment

CHOK1

Control

b

NaB 1 mM

NaB 5 mM

Etoposide

NaB 1 mM + NaB 5 mM + Eto Eto

Treatment

CHOK1

Tail Moment

12 10 8 6

*

4 2

Figure 3 – DNA damage induced by etoposide (20 µM) with or without NaB (1 or 5 mM) pretreatment measured by comet assay (Tail moment) in two bladder cancer cell lines: a) 253J, b) T24 and c) in hamster cell line CHOK1. Pool data +/- SEM from at least two independent experiments are shown.

0

c

Control

NaB 1 mM

NaB 5 mM

Etoposide

Treatment

NaB 1 mM+Eto

NaB 5 mM+Eto

Therefore, in CHOK1 the higher dose of NaB applied in combination with etoposide produced less DNA damage which was correlated with the higher cell survival observed.

DNA damage removal in human peripheral blood lymphocytes H2AX foci inmunodetection  rays

Valproic acid (VA) (0,7 mM)

(0,5 Gy)

24 hours

DNA damage induction/removal (H2AX foci)

Mean number of H2AX foci per cell

0,5 Gy VA+0,5 Gy 12

0,5 Gy + VA

10 8 6

Figure 5 – Mean number of -H2AX foci per cell with or without valproic acid (0,7 mM) pre- (VA+0,5 Gy) or post-treatment (0,5 Gy + VA) at 30 minutes and 3 hours after 0,5 Gy  irradiation. Pool data from two independent experiments are shown. Bars represent SD.

4 2 0 0

30

60

90

120

Time (minutes)

150

180

210

CONCLUSIONS

• Depending

on the dose of HDACi applied, HDAC inhibition could lead to a higher sensitivity to anti-cancer agents.

•

The sensitizing effect of NaB to anti-neoplasic agents could be explained by an increase in genetic damage, which seems to be inversely related to cell cycle arrest induced by high doses of HDACis.

• Depending

on the cell type, the dose of HDACi should be carefully adjusted when they are used as sensitizers to anticancer therapy in order to increase treatment efficacy.

Desarrollo de terapias antineoplásicas sensibilizadoras para células tumorales hipóxicas

Hipoxia tumoral

Los tumores sólidos se encuentran formados por una masa celular que como resultado de la insuficiente neovascularización y las alteraciones de la vasculatura tumoral resultan en un flujo sanguíneo muy irregular y caótico, que lleva a la hipoxia tumoral reversible o aguda. La hipoxia está confinada en el tumor sólido y por lo tanto representa un blanco único que puede ser explotado para eliminar selectivamente las células tumorales en los tumores sólidos.

iHDACs El pre-tratamiento de algunas líneas celulares tumorales con inhibidores de deacetilasas de histonas (iHDAC) produce un aumento en la sensibilidad a agentes quimioterápicos

Linker

Grupo quelante de Zn+2

Agrupamiento hidrofóbico

Estos compuestos tienen en común la presencia de tres agrupamientos esenciales para la interacción de los mismos con las HDACs, que son un grupo quelante de Zn+2 (i.e. ácido carboxílico o ácido hidroxámico) una cadena alifática como linker y un agrupamiento hidrofóbico apolar (i.e. agrupamiento fenilo).

En condiciones de hipoxia, HIF-1 activa la transcripción de genes relacionados con la supervivencia celular. Las HDACs del grupo II, 4, 6 y 7, modulan la actividad de HIF-1 regulando la acetilación del mismo, de forma que su inhibición generaría una disminución en la transcripción de estos genes. De esta forma las HDACs 4, 6 y 7 constituyen un nuevo factor de regulación de la transcripción de genes relacionados con la supervivencia del fenotipo hipóxico. De esta manera el desarrollo de inhibidores de HDACs es un atractivo blanco terapéutico para el tratamiento de células tumorales hipóxicas.

Objetivos del proyecto O LINKER

N R N O

O LINKERS

C N H NH

Agrupamientos quelantes de Zinc

N N H

NHNH2

1) Determinación de la afinidad de los Agrupamiento compuestos por HDAC7 por estudio teórico quelante de Zinc de docking para diseñar la síntesis de los compuestos. 2) Síntesis de los compuestos. 3) Determinación de la LD50 de los compuestos O O en las líneas celulares de cáncer en S N H condiciones de normoxia e hipoxia. 4) Determinación de la capacidad de actuar como NOH iHDACs de los compuestos a estudiar en condiciones de normoxia e hipoxia. Efecto de NOH los iHDACs en la expresión de HDAC7 y HIF-1 en condiciones de hipoxia.

ACKNOWLEDGEMENTS Mag. Leticia Méndez Acuña Dr. María Laura Lavaggi PEDECIBA (Program for Sciences Development)

Basic

National Agency for Research and Innovation (ANII) National Commission Against Cancer (CHLCC – Uruguay)

IILA Fellowship - University of Tuscia (Italy) in Prof. Palitti’s lab. Marie-Curie Program – European Community IAEA Fellowship – Institute for Radioprotection and Nuclear Security (IRSN), Fontenay Aux Roses (France) in Dr. Voisin’s lab.

Muchas gracias !!!

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOLOGICAS CLEMENTE ESTABLE MONTEVIDEO - URUGUAY