BlOMEDlCA Vol. 2, No. 3

- 1982

REVISIONES

TECNICAS DE INMUNO-PEROXIDASA EN LA DETECCION DE MARCADORES TUMORALES Y ANTIGENOS VIRALES GENARINA ESCOVAR V..* HENRY HANSSEN V..

En las dos últimas décadas ha habido un notable desarrollo de la metodología diagnóstica por medios inmuno-histoquímicos. La introducción de estos métodos en la investigación biomédica ha contribuído a resolver numerosos problemas de diagnóstico en histopatología. Además han contribuído considerablemente al diagnóstico rápido y preciso de varias enfermedades infecciosas de importancia médica. El método inmunocitoquímico se basa esencialmente en explotar la exquisita especificidad de los anticuerpos como reactivos de diagnóstico en la visualización y localización de una g r a n v a r i e d a d de antígenos presentes e n los tejidos y en las células. APLICACION DE LOS METODOS INMUNOCITOQUIMICOS En esencia la aplicación de los métodos inmunocitoquímicos permite una expansión de l a s observaciones morfológicas e n s u correloción con los potronev bioquímicos y fisiolónicos. Como elementos de diannóstico. h a n sido ampliamente emplead& e n 1; clasificación y el diagnóstico de enfermedades del intersticio y del glomérulo renal, así como también en enfermedades mediadas

+

" GONZALO

URlBE BOTERO. "'

inmunológicamente (1, 2) y e n u n númer considerable de infecciones virales [3). Más recientemente h a n sido empleados e n el diagnóstico y clasificación de una variedad amplia de condiciones neoplásicas y preneoplásicas con base en la presencia o ausencia de una serie de marcadores tumorales [4). MARCADORES TUMORALES Los marcadores tumorales representan un grupo heterogéneo de sustancias que están presentes en los extractos de tejidos o en el plasma de pacientes con diferentes neoplasias 15). Las áreas de mayor interés en el diagnóstico inmunocitoquímico incluyen las varias clases de inmunoglobulinas en los tumores de origen linfo-reticular y en los procesos linfo-proliferativos atípicos, la identificación específica de polipéptidos y hormonas esteroides, así como receptores específicos en tumores endocrinos y no endocrinos y el estudio de antígenos carcinoembrionarios en lesiones neoplásicas y preneopltísicas en el colon y otros tejidos. Desde un punto de vista clínico, por la aplicación de estos procedimientos se espera una ayuda en el diagnós-

Profesora asistente, Departamento d e Morfología. Facultad d e Medicina, Universidad d e Antioquia, Mcdellín, Colombia. Actualmente en entrenamiento: Department o f Pathology M.O. Anderson Hospital and Tumor Research Institute. 'Sexas Medical Center, Housfon Tenas 7 7 0 3 0 . U.S.A.

'*

Profesor asociado, Departamento d e Microbiologia y Pararitología, Sección Virologia. Facultad d e Medicina, Universidad de Antioquia, Medellin, Colombia. Actualmente en entrenamiento: Department o f Virology Raylor College o f Medicine. Texas Medical Center. Houston T e x a s 7 7 0 3 0 , U.S.A.

* * S

Profesor Asistente, Deparlment o f Pathology Baylor College o f Medicine. Texas Medical Center and Staff Pathologist Veterans Administration Hospital Medical Center Houston Texas 7 7 2 1 1, U.S.A.

SOLICITUD DE SEPARATAS AL DR. HENRY HANSSEN.

TECNICAS O E INMUNO-PEROXIOASA EN LA DETECCION DE MARCADORES ....

tic0 temprano de las neoplasias, la predicción d e l p r o n ó s t i c o y l a p r e d i c c i ó n a l a respuesta de varias formas de terapia. En la tabla 1 se presenta un resumen de los principales marcadores tumorales y de los principales antígenos virales demostrables por métodos inmunocitoquímicos y su aplicación diagnóstica (5. 6, 7). Basados esencialmente en reacciones inmunocitoquímicas de radio-inmunoensayo y e n p r o p i e d a d e s fisiológicas, e s posible realizar una clasificación de los marcadores tumorales, dividiéndolos en varias clases: 1. Primero close d e morcodores tumoroles

Esta clase incluye substancias tales como hormonas, enzimas e inmunoglobulinas, que son producidas en células adultas normales Y q u e se e n c u e n t r a n i n c r e m e n t a d a s en e l s u e r o y e n los tejidos d e p a c i e n t e s con tumores derivados de este grupo específico de células. El incremento en la producción de hormonas adenohi~ofisiariasen tumores de la pituitaria, d e hormonas pancreáticas en tumores pancreáticos, de enzimas como la fosfatasa ácida potásica en neoplasmas de la y la presencia d e inmuneglohulinas monoclonales en el s u e r o de pacientes con mieloma y otras enfermedades linfoproliferativas, representan ejemplos de de esta ,-lase de marcala dores tumorales (Ver figuras 3, 4, 51

u7),

2. Segundo close de morcodores tumoroles

Una s e g u n d a c l a s e d e m a r c a d o r e s tumorales incluye los llamados antígenos oncofetales, presentes en altas concentraciones e n los e m b r i o n e s , e n e l feto y e n l a placenta y que no son detectables o están presentes en muy bajas concentraciones en el adulto. Este segundo grupo incluye una variedad de isoenzimas fetales o embrionarias como la fosfatasa alcalina placentaria [Isozima de Regan), el antígeno carcinoembrionario, la alfafetoproteína, la alfa-1-anti-tripsina, la hormona gonadotropina coriónica y una variedad amplia d e hormonas e iso-hormonas que pueden ser sintetizadas por los tumores endocrinos y no endocrinos (Ver figura No. 6).

3. Tercero close d e morcodores tumorales

Este grupo incluye los llamados antígenos específicos d e tumor o antígenos asociados a los tumores, los cuales son únicos p a r a un tipo particular de neoplasma ( ~ j . : melanoma, sarcoma), ~~t~~ tumores, que en su mayoría son definidos desde un punto de vista bioquímico, p u e d e n d e s p e r t a r u n a respuesta humoral o celular en el huésped (6). (Ver figura No. 7). ANTIGENOS VIRALES

Mediante la aplicación de los métodos de inmunoperoxidasa ha sido posible demostrar antígenos en el citoplasma o e n el núcleo de las células infectadas. Entre los principales se pueden señalar los antígenos de B., H e r p e s s i m ~ l e xY CitOm.9g a l o v i r u s ( T a b l a No. 1). (Ver f i g u r a No.

1' .

EMPLEO DE LAS TECNICAS DE INMUNOPEROXIDASA

de los mayores avances en campo de la inmunocitoquímica ha sido el desarrollo de l a s técnicas de inmunoperoxidasa aplic a d a s a l a demostración específica d e a n t í g e n o s i n t r a c e l u l a r e s Y t i s u l a r e s (8). Estas técnicas comparten varios principios con l a s ya establecidas Y ampliamente utilizadas técnicas de inmunofluorescencia (9); sin embargo, ofrecen mavores ventajas, como el uso de tejidos embebidos en parafina, la estabilidad del producto d e la reacción, l a obtención d e preparaciones permanentes y la utilización d e microscopía de luz o electrónica. Tales factores, además de su extraordinaria sensibilidad y especificidad han incrementado rápidamente la popularidad de su uso como ayuda diagnóstica en patología quirúrgica, d e autopsias y en enfermedades infecciosas de importancia clínica. LA ENZIMA PEROXIDASA COMO MARCADOR INMUNOCITOQUIMICO Los r e f i n a m i e n t o s t a n t o c o n c e p t u a l e s como técnicos sucedidos en las últimas dos d é c a d a s h a n permitido e l d e s a r r o l l o d e métodos más sensibles, tales como el uso d e

GENARINA ESCOVAR V.. HENRY HANSSEN V.. GONZALO URlBE BOTERO

TABLA

No.

1

APLlCAClON DIAGNOSTICA D E LOS METODOS INMUNOCITOQUIMICOS E N PATOLOGIA T U M O R A L MARCADOR TUMORAL

APLlCAClON DIAGNOSTICA

Tumores de la pituitaria anterior (hormonas adrenocorticotrópica, hormona prolactina. del crecimiento. estimulante de la tiroides, luteinizante foliculo-estimulante.

Clasificación de tumores de la pituitaria anterior (23, 24, 25, 26).

Hormonas de los islotes pancreáticos (insulina, glucagón, somatostatina) además, polipéptido pancreático, gastrina. colecistoquinina.

Clasificación de las células de los islotes pancreáticos y sus tumores y diagnóstico de tumores carcinoides (27. 28, 29. 30, 31).

Fosfatasa ácida

Identificación del carconoma prostático y sus metástasis (32) Carcinoma hepatocelular. Tumores de origen endodérmico (33). Carcinoma hepatocelular. Diagnóstico diferencial de tumores del ovario y tumores testiculares de la linea germina1 (34, 35).

Alfa-lacto-albúmina

Carcinoma del seno (36. 37, 38)

Calcitonina

Carcinoma medular de la tiroides. Hiperplasia de células C. (39. 40, 4 1 1.

Antigeno carcinoembrionario

Adenocarcinoma del cólon. Diferenciación de mesoteliomas de los carcinomas metastásicos (42, 43. 44).

Gonadotro~ina Coriónica

Neoplasmas del trofoblasto. Diferenciación de tumores ováricos y testiculares de la linea germina1 (45, 46, 47).

Factor V l l l

Tumores derivados de células endoteliales (481

Cadenas pesadas y livianas de lnmunoglobulinas

Identificación de linfomas de tipo B. Diferenciación de Linfomas de carcinomas indiferenciados. Diferenciación de linfomas malignos de hiperplasias atipicas. Caracterización de Mieloma múltiple y macroglobulinemia de Waldenstrom (49, 50. 51, 52, 53).

Lisozima o Muramidasa

Linfoma histiocitico. Leucemia Monocitica (54)

Mioglobina-Miosina

Tumores derivados de músculo esquelético y músculo liso (55).

Lactógeno placentario

Neoplasmas de trofoblasto (561.

Testosterona

Tumores de células de Leydig y Sertoli (57).

Estradiol

Tumores ováricos de la granulosa y de la teca (58)

Tiroglobulina

Nódulos tiroides adenomatosos adenomas y carcinomas (59).

MARCADORES V I R A L E S Antigeno de Hepatitis B.

Carcinoma hepatocelular. Infección Viral (60, 61).

Antigeno de Herpes Simplex

Carcinoma de c e ~ i xy vulva sospechosos de origen viral (62).

Figura No. 3. Reacción de Peroxidasa anti-peroxidasa (PAP) positiva en ladetección lnsulina en un Islote de Leangerhans (25 X).

Figura No. 4. Fosfatasa ácida demostrada en un tejido prostátiw hiperplásico, utilizando el método inmunocitoquímico (PAP) (10 X).

Figura No. 5. Linfoma de tipo monoclonal productor de cadenas livianas tipo kappa detectado por el método de Peroxidasa anti-peroxi. dasa (40 X).

GENARINA ESCOVAR V.. HENRY HANSCEN V., GONZALO URlBE BOTERO

Figura No. 6. Fuerte reacción positiva de PAP en la detección de la detección de la enzima alfa-lantitripsina en un caso de cirrosis hepática.

Figura No. 8. Reacción positiva de PAP en la detección de antigeno superficial de Hepatitis B ( H Bs Ag) en el citoplasma de células hepáticas (10 X).

TECNICAS DE INMUNO-PEROXIOASA EN LA OETECCION DE MARCADORES

enzimas conjugadas a anticuerpos y procedi- tejido, lo c u a l dificulta a l g u n a s veces la mientos enzimáticos sin anticuerpos conju- interpretación y lectura de las áreas posigados. La enzima peroxidasa. glicoproteína tivas. extraída de las raíces del rábano, con peso molecular de 40.000 daltones y compuesta METODO DE ENLACE por mQs de 20 iso-enzimas con rango de INMUNOGLOBULINA-ENZIMA actividad enzimática entre los pH 5.5 a 7.6, Mason et a1 (121, desarrollaron un método ha demostrado ser un excelente marcador inmunocitoquímico, cuando se la conjuga que no requiere de la conjugación directa de con inmunoglobulinas del tipo G (IgG] (10). la enzima peroxidasa a moléculas de IgG, sino que depende de una reacción de enlace de los anticuerpos con moléculas libres de la METODOS DE INMUNOPEROXIDASA enzima. La reacción se verifica en cuatro etapas sucesivas. En la primera. los anti1 . Métodos de Inmunoperoxidasa con onticuerpos conjugados o marcodos cuerpos específicos reaccionan con determinantes antigdnicos e n el tejido. En la En 1968Nakane ( I I ) ,describió el uso de la segunda etapa se utilizan anticuerpos (IgG) enzima peroxidasa conjugada a anticuerpos contra l a especie animal e n l a c u a l f u e IgG, como m a r c a d o r inmunocitoquímico p r e p a r a d o el primer antisuero. En una aplicado a la demostración de hormonas t e r c e r a e t a p a s e adicionan anticuerpos adenohipofisiarias. La inmuno reacción es anti-peroxidasa. Finalmente. en la cuarta fácilmente reconocida a nivel tisular etapa. se adicionan moléculas libres de la mediante el empleo de un substrato cromó- enzima peroxidasa las cuales son captadas geno donador d e electrones, la 3,3' por los anticuerpos d e la t e r c e r a e t a p a . diaminobenzidina. Este procedimiento [Figura 1B).Este método también presenta el permite la utilización d e dos métodos: el problema de reacción inespecífica de fondo e n e l tejido debido principalmente a la directo y el indirecto. posibilidad de unión de las moléculas libres a . Método directo de inmunoperoxidasa con de peroxidasa con anticuerpos inespecíficos anticuerpos. conjugados o marcados: en el sistema. Consiste e n la utilización de un solo antisuero constituído por moléculas de IgG METODO DE PEROXIDASA conjugadas con moléculas de peroxidasa y ANTI-PEROXIDASA (PAP) dirieido esoecíficamente a la demostración del antígeno tisular en estudio. (Figura En 1970 S t e r n b e r g e r (13) modificó el método anterior, substituyendo las etapas 1A1). tercera y cuarta del mismo, con el uso de un b. Método indirecto de inmunoperoxidasa antisuero conformado por un complejo con anticuerpos conjugados o marcados. inmune de 2 moléculas IgG anti-peroxidasa. En este método se utilizan consecutiva- unidas a 3 moléculas de la enzima peroximente un primer antisuero constituído por d a s a . De e s t a f o r m a , la posibilidad d e anticuerpos específicos contra el antígeno reacciones de la enzima libre. con anticueren estudio y un segundo antisuero conju- pos inespecíficos en el sistema fue virtualgado con la enzima peroxidasa y dirigido mente eliminada. Le obtención de reacciones contra la especie animal e n el c u a l el limpias, sin problemas de reacciones inespeprimer antisuero h a sido p r e p a r a d o cíficas de fondo, facilitó la lectura e inter(Figura 1A2J pretación de las Qreas positivas en el tejido (Figura 1C). Aún cuando el grado de especificidad y sensibilidad de ambas métodos es mayor que SISTEMA INMUNO-ENZIMATICO el obtenido con las técnicas de inmunofluo- AVIDINA-BIOTINA rescencia, e s t e tipo d e reacciones por lo general exhiben un grado considerablemente Recientemente, Guesdon, e t a l (141, alto de reacción inespecífica de fondo en el describieron un método para la demostrau

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.~~~ ~~

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GENARINA ESCOVAR V.. H E N R Y HANSSEN

ción de antígenos tisulares, basado esencialmente en la interacción del sistema avidina- biotina. La biotina o vitamina H, con peso molecul a r de 244.3 daltones p r e s e n t a una g r a n avidez y afinidad para reaccionar en forma rápida y estable con moléculas de avidina. La molécula d e biotina puede s e r conjugada covalentemente con el residuo amino. carboxilo, sulfihidrilo o tirosilo de grupos protéicos, sin alterarse su capacidad de reacción con la molécula de avidina. Debido a esta propiedad ha sido posible su conjugación con moléculas de inmunoglobulinas (IgG) y también con enzimas como la peroxidasa (15).

V..

GONZALO URlBE BOTERO

La avidina es una glicoproteína aislada de la clara del huevo, tiene un peso molecular de 67.000 daltones, está conformada por 4 subunidades cada una de las cuales present a u n sitio reactivo p a r a una molécula de biotina. Cada molécula de avidina reacciona con c u a t r o moléculas d e biotina, lo c u a l permite una amplificación de la inmunoreacción incrementándose la visualización, sensibilidad y especificidad en el sitio de localización del antígeno. El método inmunoenzim4tico avidinabiotina consiste esencialmente en un tratamiento secuencia1 de los tejidos con los siguientes reactivos: a. Incubación con un antisuero específico contra el antígeno en estudio.

F I G U R A S 1A , 1A , 1B

.

ID

METODOS DE IMMUNOPEROXIOASA

XX

XX

XX

O X

Determinante antig&ico

en tejido

&

XX Peroxidara

~ o l & u l ade biotina

TECNICAS DE INMUNO-PEROXIDASA EN LA DETECCION DE MARCADORES

b. Incubación con un ontisuero consistente en moléculas IgG conjugadas con hiotina y preparado contra la especie animal en la c u a l el p r i m e r a n t i s u e r o f u e obtenido.

ETAPAS DE LA REACCION DE PEROXIDASA ANTI-PEROXIDASA (PAP) PREPARACION DEL ESPECIMEN O TEJIDO

Uno d e l o s p r i n c i p a l e s p r o b l e m a s q u e enfrenta un inmunocitoquímico e s la prede los tejidos d e manera tal que los d. ~ ~ ~ con ~ moléculas b ~ de ~ biotina i ó paración ~ procesos d e fijación e inclusión e n parafina conjugadas a la enzima peroxidasa. no a l t e r e n a l a n t í g e n o e n e s t u d i o . La e. Desarrollo de la reacción cromógena con conservación de las características físicoperóxido d e h i d r ó g e n o y 3.3'-diamino- químicas d e los determinantes antigénicos en los tejidos e s un factor clave e n el éxito d e benzidina (Figura ID). la reacción, ya que cuando esto no s e logra, o t r o s f a c t o r e s i m p o r t a n t e s , como e l d e l a Warnke et a1 (15) también describieron el especificidad, pierden totalmente s u valor. sistema inmunoenzimático Avidina-BiotinaConjugado; e n e s t e p r o c e d i m i e n t o l a s 1. Proceso d e fijoción moléculas IgG s e conjugan a la biotina y la enzima peroxidasa a l a avidina. A pesar d e En el método PAP los siguientes fijadores que varias publicaciones señalan que este han brindado excelentes resultados: formamétodo e s m á s s e n s i b l e q u e e l s i s t e m a d e lina neutra, Bouin, solución d e BicloruroPeroxidasa-Anti-peroxidasa, su uso e s muy Formalina-Mercurio, B-5 formaldehído. limitado a ú n debido quizás e n gran p a r t e a lo muy reciente de su desarrollo. A pesar d e q u e la mayoría d e determinant e s a n t i g é n i c o s e n c u a l q u i e r tejido s o n Esencialmente los cuatro métodos descri- destruídos por los anteriores fijadores y por tos anteriormente representan variaciones los procedimientos de inclusión en parafina, d e uumismo principio, e s d e c i r , el u s o d e el método d e PAP e s extremadamente sensianticuerpos específicos en la detección d e ble como p a r a permitir la vizualización del antígenos tisulares y la incorporación de la antígeno en estudio porque los anticuerpos enzima peroxidasa al sistema como marca- en dilución son capaces d e reaccionar con d o r inmunocitoquímico. Al c o m p a r a r e l los pocos determinantes antigénicos q u e no g r a d o d e e s p e c i f i c i d a d l o g r a d a c o n e s t o s han sido destruídos por tales procedimientos métodos s e debe anotar que los que utilizan (16). moléculas IgG marcadas con la enzima peroxidasa, por lo general son menos 2. Inclusión en Parafina específicos q u e a q u e l l o s q u e utilizan inmuno-complejos tales como los d e peroxiD e s p u é s d e l a f i j a c i ó n , los tejidos s o n dasa anti-peroxidasa y el sistema inmuno- incluidos en parafina utilizando los procesos enzimático avidina-biotina. La decisión de estandares d e rutina. En la demostración d e e s c o g e r e n t r e ellos e n u n a investigación lípidos o antígenos asociados a materiales dada, depende de variables como la posibili- r i c o s e n lípidos, s e r e c o m i e n d a e l u s o d e dad de obtención de los antisueros utilizados cortes de tejidos obtenidos con vibrotomo e n l a inmunorreacción. ya s e a c o m e r c i a l - (171, pues el tratamiento con parafina y sus mente o preparados en el laboratorio. Otros solventes, extraen los lípidos presentes en el f a c t o r e s q u e d e b e n c o n s i d e r a r s e s o n l a tejido. naturaleza del antígeno en estudio y l a c o n c e n t r a c i ó n d e l mismo e n los tejidos. 3. Cortes en Parafina Debido a q u e e l método d e p e r o x i d a s a anti-peroxidasa ha sido el más ampliamente Se recomienda la obtención d e cortes d e 4 utilizado en los últimos años, consideramos micras d e espesor. con un micrótomo conde utilidad la descripción y discusión deta- v e n c i o n a l . Se r e c o g e n e n l á m i n a s p o r t a objetos l i m p i a s y p r e - t r a t a d a s c o n u n a llada d e su procedimiento. c. I n c u b a c i ó n c o n moléculas d e a v i d i n a .

GENARINA ESCOVAR V.. H E N R Y H A N S S E N

V.

GONZALO URlBE BOTERO

solución acuosa de gelatina o albúmina para e n xilol, dos veces d u r a n t e 10 minutos e asegurar buena adherencia de los tejidos a bidratados en un gradiente descendente de la superficie del vidrio. Por lo general 1 etanol (lOOO/o,95%, 75%. 50010, 15%) y agua cucharadita de gelatina o albúmina añadida durante 5 minutos re~pectivarnente~en cada a l agua en donde se recogen los c o r t e s , solución. brinda buena adherencia de los tejidos a las láminas. Inmediatamente antes de realizar DESTRUCCION DE LA PEROXIDASA el proceso de PAP, los cortes deben s e r TISULAR ENDOGENA incubados d u r a n t e 2 a 3 h o r a s a 60°C., lo Con el objeto de evitar falsos positivos, es cual asegura una mayor adherencia. deseable destruir la ueroxidasa endónena existente en los tejidos antes de la realiza4. Uso de cortes por congelación ción del método d e PAP. Los eritrocito?. y en lo prueba PAP g r a n ~ ~ o c i t oposeen s niveles altos de peroxiExisten varios problemas cuando s e d a s a endógena q u e a p a r e n t e m e n t e no e s emplean cortes por congelación en el método destruída durante los procesos de inclusión de PAP y por lo tanto la recomendación de su en p a r a f i n a . En tejidos ricos e n células uso debe ser limitada a aquellos casos en los sanguíneas, e n cortes hemorrágicos, e n cuales no s e puedan obtener cortes de reacciones inflamatorias y en material de parafina. Entre los principales problemas se biopsia o autopsia, se recomienda la destrucción d e l a peroxidasa endógena señalan los siguientes: exponiendo los cortes histológicos. después a.Poca a d h e r e n c i a de los tejidos a l a s de que han sido desparafinados e bidrataláminas. En un proceso con numerosas dos, a la acción de una solución consistente etapas como lo es el método de PAP, los en 100 ml. de metano1 absoluto con 1 ml. de cortes por congelación tienden a flotar peróxido de hidrógeno al 30°/o, durante 30 cuando la fijación de los mismos no e s minutos. En los cortes muy hemorrágicos el total. tiempo de exposición puede ser prolongado hasta 45 minutos, sin afectar la morfología b. Formación de reacción inespecífica de bistológica (19). fondo, debida a la presencia de g r a n número de determinantes antigénicos BLOQUEO DE DETERMINANTES específicos y no específicos, conservados ANTIGENICOS NO ESPECIFICOS EN EL en el tejido [21). EN EL TEJIDO c. El uso de una dilución baja [o alta concent r a c i ó n ) del antisuero primario, usualmente conduce a la obtención de resultados negativos (18). En casos e n 10s cuales se h a g a imprescindible el uso de cortes por congelación, se recomienda fijar los tejidos en etanol al 95% durante 30 minutos para lograr una buena adherencia. Además es aconsejable el uso de diluciones altas del urimer antisuero luor Ejem: 1:1,000) con él objeto de eviiar reacciones inespecíficas d e fondo e n el tejido.

El bloqueo de determinantes antigénicos no específicos en los tejidos se logra tratando los cortes d u r a n t e 20 minutos con s u e r o normal (200101. de la misma e s ~ e c i eanimal en la cual se preparó el antisuero secundar i o , Este t r a t a m i e n t o reduce en f o r m a apreciable las reacciones inespecíficas de fondo en el tejido. I N ~ U N O - R PAP ~ ~ ~ ~ ~ ~ N 1. ~

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DESPARAFINIZACION E HIDRATACION DE LOS TEJIDOS

Se obtienen resultados excelentes en la inmuno-reacción de PAP cuando se observan cuidadosamente las siguientes recomendaciones:

Inmediatamente a n t e s de r e a l i z a r el método PAP los tejidos son desparafinadoa

a. Con el objeto de evitar que las soluciones expuestas al tejido se extravasen de

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TECNICAS DE INMUNO-PEROXIOASA EN LA OETECCION DE MARCADORES.

La óptima dilución de trabajo del primer antisuero se averigua haciendo una titulación (varias diluciones del mismo). contra un tejido que se sospeche contenga altas conb.Todas l a s soluciones utilizadas e n la centraciones del autígeno en estudio. Este inmuno-reacción son aplicadas en gotas método permite escoger la mejor dilución del sobre el tejido. Usualmente 0.2 ml. de la primer antisuero en la cual la concentración solución son suficientes p a r a c u b r i r de anticuerpos presentes reacciona con una concentración desconocida del antígeno en completamente el área. el tejido: de manera que la reacción positiva e s t á altamente e x p r e s a d a y la reacción c. Después de cada período de incubación con el respectivo antisuero y con el objeto inespecífica d e fondo e s mínima. Por lo de remover el exceso de anticuerpos en el general el método PAP trabaja con diluciotejido, l a s láminas se sumergen e n un nes altas del primer antisuero; el rango para lavado con solución tamponada Tris encontrar una dilución de trabajo determi(0.05 M , pH 7.6) [Schwarz/Mann Inc., nada puede estar comprendido entre diluSpring Valley N.Y.U.S.A.), durante 10 a 15 ciones desde 1:50 a 1:50,000, dependiendo de la concentración de a n t i c u e r p o s e n el minutos. antisuero (20). su área, dibuje una línea con un lápiz de diamante siguiendo el contorno de los tejidos en estudio.

Las leminas expuestas a diferentes antisueros deben s e r l a v a d a s todo el tiempo' separadamente con el objeto de evitar contaminación de un antisuero con otro. El método es t a n sensible que una momentánea exposicióu de los tejidos con altas diluciones de otro antisuero durante el lavado, puede resultar en una reacción positiva. Por la misma razón se recomienda mantener las láminas en cajas separadas y cubiertas durante todo el proceso. d. Con e l objeto de evitar que s e seque el tejido d u r a n t e la inmunorreacción. l a s láminas deben ser colocadas en cámaras húmedas. El uso de cajas de Petri con gasa húmeda en el fondo y envueltas en papel d e aluminio, proporciona u n ambiente óptimo de humedad para la incubación de las mismas. El resecamiento del tejido debe ser evitado pues altera la estructura terciaria de las inmunoelobulinas imoidiendo la inmuno-reacción.

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3. Uso del segundo antisuero

El segundo antisuero consiste enmoléculas de IgG contra la IgG de la especie animal en la c u a l se obtuvo e l primero. La dilución utilizada debe ser baja, por lo general con diluciones de 1:lOa 1:50 con el objeto de asegurar una buena concentración de anticuerpos ligantes de la inmunorreacción. La incubación de los tejidos se realiza durante media hora a 37°C. 4. Uso del tercer antisuero El tercer antisuero o complejo inmune de Peroxidasa anti-peroxidasa usualmente se utiliza diluído en un rango de 1:50 a 1:ZOO. La titulación del antisuero se puede verificar utilizando un primer y un segundo antisuero de títulos conocidos. La incubación de los tejidos se realiza durante media hora a 37°C. DESARROLLO DE LA REACCION CROMOGENA

2. Uso del antisuero primario 1. Principios Generales

Los cortes se incuban con 0.1-0.2 ml. de la dilución de trabajo del primer antisuero. por lo general d u r a n t e 24 h o r a s a 4°C. Este antisuero consiste en moléculas d e IgG específicamente dirigidas contra el antígeno en estudio. Se deben preferir antisueros que contengan la molécula total de IgG, a fracciones de la misma.

La reacción cromógena se desarrolla por la presencia de t r e s s u b s t a n c i a s . Una d e ellas es la enzima peroxidasa contenida en el tercer antisuero (Figura 2, etapa III), la cual reacciona con s u s u b s t r a t o específico, e l peróxido de hidrógeno [Figura 2. etapa IV), para formar un complejo enzima-substrato

GENARlNA ESCOVAR V.. H E N R Y HANSSEN V.. GONZALO URlBE BOTERO

(peroxidasa-peróxido de hidrógeno) (Figura 2, etapa VI. En presencia de una sustancia donadora de electrones (3.31-diaminobenzidina o 3-amino-9-etilcarbazol) (Figura 2 . e t a p a VI), ocurre un segundo complejo a través de la oxidación y polimerización de los mismos, (Figura 2, etapa VII), formándose un precipitado café o rojo (Figura 2, etapa VIII), el cual, por ser bastante insoluble, se mantiene pegado a l sitio de la inmunorreacción siendo fácilmente reconocido por microscopía de luz.

PRFCIPTTAX C-POLIIWO

4

1

I

mnarrn*

*#SOLUBLE

La solución d e diaminobenzidina más peróxido de hidrógeno debe ser incolora, antes de sumergir los tejidos en elia. El pH. 7.6 no es el óptimo para la actividad de la enzima peroxidasa, pero se escoge porque la oxidación e s ~ o n t á n e ade la diaminobenzidina es mínima en el tiempo de incubación fijado, lo cual evita la formación de precipitados muy gruesos sobre el tejido.

El tiempo d e incubación por lo general e s t e en los límites d e 3 a 8 minutos; sin PRECIPITW ROJO embargo s e recomienda o b s e r v a r , por 4 m i c r o ~ c o p í ade luz y en poco aumento-los tejidos, p a r a escoger la incubación que ermita una tinción f u e r t e d e l a s á r e a s (Dositivas v una mínima d e los teiidos

I

.

1

4

recomienda el uso de soluciones frescas y filtradas. La actividad oxidativa d e la diaminobenzidina u otro donador de electrones varía de lote y de acuerdo con la casa comercial donde se obtiene. Por lo tanto. su titulación (uso de varias concentraciones). contra tejidos positivos es lo más indicado. con el fin de escoger la concentración ideal.

I

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conejo.

Cuando se utilizan substancias tales como el 3-amino-Q-etilcarbazol y otros donadores de electrones como e l 4-cloro-1-naftol, s e debe tener en cuenta que sus productos de polimerización no son completamente insolubles y que s e verifica una difusión de productos desde el sitio de liberación. En estos casos se sugiere fotografíar las áreas positivas inmediatamente después d e la reacción. Además, estas sustancias difieren de l a diaminobenzidina en que son liposolubles. por lo tanto se debe evitar el uso de alcoholes y xilol, para la deshidratación y clarificación de los tejidos (20). CONTRATINCION, DESHIDRATACION Y MONTAJE

2. Procedimiento Como donador d e electrones s e emplea una solución al 0.05% de diaminobenzidina y peróxido de hidrógeno al O.OiO/odisueltos en solución tamponada de Tris 0.05 M, pH 7.6 y en él se sumergen los cortes histológicos. Se

Después de la incubación con la diaminobenzidina, las láminas son sumergidas durante 5 minutos en solución Tris. 1. Contratinción

La contratinción con hematoxilina de Harris durante 5 minutos elimina significativamente la reacción inespecífica de fondo.

TECNICAS DE INMUNO-PEROXIOASA EN LA DETECCION DE

Para tratar trabajos con cultivos celulares, está indicado el uso d e colorantes más fuertes como la hematoxilina de Gil1 No. 3. Además s e logra un mayor c o n t r a s t e del color azul, incubando los tejidos en solución saturada de carbonato de litio durante un minuto. 2. Deshidratación y montaje

La deshidratación de los tejidos se realiza en u n gradiente ascendente de etanO1 de 15%, 50%, 75%. 95%. 100% y la clarificación en xilol, durante 5 Y respectivamente e n c a d a solución. Las láminas así tratadas se montan en Permount. Cuando se trabaja con substancias liposolubles. después de la contratinción las láminas son sumergidas en agua y montadas en glicerol. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS L~ reacción PAP realizada con diaminobenzidina imparte un color café a las áreas positivas. el amino-etil-carbazol da un color rojo, y el cloro naftol un color azul. Por lo general las reacciones intracitoplasmáticas positivas se ven a la microscopía de luz como granulares, ya que la mayoría de los antígenos se encuentran contenidos en gránulos secretorio$. La intensidad del color guarda relación directa con la concentración de antígeno celular. En la detección de antígenos intranucleares se sugiere evitar el uso de hematoxilina para favorecer la visualización de los mismos.

Las reacciones inespecíficas de fondo son homogéneas, difusas y por lo general poco intensas. Sitios comunes para este tipo de reacción son: el tejido colágeno. materiales acumulados en vacuolas citoplasmáticas, en el lumen de glándulas y en secreciones extracelulares. FOTOGRAFIA

MARCADORES.

LIMITACIONES DE LA PRUEBA DE PAP El método de PAP demuestra antígenos que conservan su estructura antigénica a través de los rigores de la muerte, procesos de fijación, inclusión en parafina, cortes histológicos y tinción. No se pueden esperar resultados satisfactorios en las siguientes situaciones: autolisis en material de autoosia, inadecuada fijación, soluciones con ácidos o muy alcalinos y excesivo calor durante los procesos de inclusión. E1 material necrótico o células en proceso de degeneración conllevan reacciones no específicas; por ello, en la interpretación de resultados, solamente se deben estudiar células intactas.

PH

CONTROLES DE ESPECIFICIDAD EN EL METODO PAP Con el fin de evaluar la especificidad de la inmunorreacción de PAP se requiere de la utilización de rigurosos controles (22). CONTROLES PARA PROBAR LA MONOESPECIFICIDAD DEL PRIMER ANTISUERO Tres métodos se pueden utilizar para probar la monoespecificidad primer 1. Adsorción con antígeno específico

En este procedimiento, previa realización del método de PAP, el primer antisuero se adsorbe con su antígeno específico. Se utiliza el antígeno en exceso, en relación con la concentración de anticuerpos presentes en el antisuero. El antisuero así tratado se incuba durante 24 horas a 4°C y se centrifuga durante 10 minutos en centrífuga Eppendorf (15.000 r.p.m.1, conservándose el sobrenadante para la prueba de PAP. Si el antisuero es mono-específico. los resultados al realizar el método de PAP deben ser negativos.

Con el uso de película Tungsteno Ektachrome de Eastman-Kodak, se obtienen fotografías casi similares en colorido a la reacción 2. Substitución por suero original. Cuando se trabaja con cultivos pre-inmune o no inmune celulares o en caso de reacciones débiles. el uso de filtros puede ayudar a contrastar las En este método se substituye el primer áreas positivas. antisuero por suero pre-inmune o no inmune

GENARlNA ESCOVAR

V..

HENRY HANSSEN

del mismo animal o de la misma especie animal en el cual se obtuvo el primer antisuero. Se deben obtener resultados negativos al aplicar el método de PAP. 3. Substitución por antisuero no relacionado

El método consiste en la substitución del antisuero primario por un antisuero no relacionado con el antígeno en estudio. Además de comprobar la monoespecificidad, este método permite investigar problemas de inmunidad c r u z a d a e n t r e antisueros primarios. CONTROLES PARA EL SEGUNDO Y TERCER ANTISUERO 1. Supresión del segundo antisuero

La supresión del segundo antisuero en el método de PAP, permite determinar la especificidad de la reacción con los antisueros primero y tercero. Deben obtenerse resultados negativos. 2. Actividad de Peroxidosa en el

tercer antisuero Para determinar la actividad de la peroxidasa contenida en el tercer antisuero, se tratan cortes bistológicos con éste, diaminobenzidina y peróxido de hidrógeno siguiendo las recomendaciones del método de PAP. Se deben esperar reacciones inespecíficas en estructuras tales como cclágeno y fibras reticulares (21). Este tipo de reacciones son imposibles de eliminar en el sistema. Las presuntas áreas inmunorreactivas del tejido deben resultar negativas con el anterior tratamiento. Para la interpretación de los resultados, se advierte que solo deben utilizarse cortes histológicos en los cuales previamente se haya bloqueado la acciór, de la peroxidasa endógena. REACCIONES INESPECIFICAS DE FONDO EN LOS TEJIDOS CON EL METODO DE PAP Reacciones inespecíficas del tejido Las reacciones inespecíficas de fondo por lo general interfieren con la interpretación

V.

GONZALO URIBE BOTERO

precisa de las inmunorreacciones. Una variedad de causas se pueden citar coma las productoras de estos problemas. Causas y Acciones correctivas 1. Medio de inclusión residual

Los residuos de parafina en los cortes conducen a reacciones inespecíficas en el método de PAP. El problema se evita con calentamiento previo de los cortes durante 10 minutos, antes de ser expuestas al xilol o extendiendo el tiempo de tratamiento con xilol. 2. Acción de la peroxidasa endógena

Ver el bloqueo de su actividad. 3. Inmunoglobulinas no específicas

La presencia de inmunoglobuliuas no específicas en los antisueros puede eliminarse mediante tratamiento de los mismos con macerados de tejidos obtenibles comercialmente (por ej.: polvo de hígado de ratón). La incubación del antisuero con el macerado de tejido en proporción de 1 ml. de antisuero por 1 mg. de tejido durante 24 horas a 4°C y seguida de centrifugación (centrífuga Eppendorf) son suficiente para eliminar el problema. 4. Anticuerpos de especificidad no deseada

La presencia de anticuerpos de especificidad no deseada en un antisuero puede ser eliminada mediante adsorción de los mismos con antígenos específicos. El empleo de anticuerpos manoclonales (obtenidos de hibridomas). asegura totalmente la monoespecificidad de un antisuero, eliminando este tipo de problema. 5. Actividad del complemento

Los antisueros primarios utilizados en el método de PAP deben ser inactivados en su actividad de complemento durante 30 minutos a 56°C previa realización del método de PAP.

TECNICAS DE INMUNO-PEROXIDASA EN LA DETECCION DE MARCADORES

PRECAUCIONES AL TRABAJAR CON LOS METODOS DE 1NMUNOPEROXlDASA Algunos de los reactivos utilizados en estai pruebas pueden ser tóxicos y por lo tanto se recomienda observar ciertas precauciones en su manipulación. La 3.3'-diaminobenzidina (DAB), si se inhala o absorbe a través de la piel puede causar irritación severa; sus vapores producen irritación intensa en los ojos; por consiguiente debe manipularse en cámaras especiales con sistema de extracción y ventilación adecuadas, además del empleo de lentes protectores, máscaras faciales y guantes de vinilo o caucho. Aún cuando no se ha podido probar su actividad carcinogénica en ratas controles, este factor no puede ser descartado (63). Se sugiere que todo el material contaminado con DAB se sumerja durante 6 horas en una solución de 1:1 (agua y clorox), pues aparentemente el cloro inactiva la sustancia. El peróxido de hidrógeno al 30% es un oxidante fuerte y deben tomarse precauciones para evitar el contacto con la piel.

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INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES 1. Biomédica la revista del Instituto Nacional de Salud recibirá para publicación

únicamente artículos originales e inéditos. 2.

La revista aceptará artículos que contribuyan a ampliar los conocimientos sobre biomedicina realizadas. tanto en el Instituto Nacional de Salud como en cnalauier otro centro investigativo.

Dichos artículos deberán llenar los siguientes requisitos: a ) Ser enviados al editor de la revista, Apartados 80334 y 80080, Zona 6, Bogotá, D.E., Colombia S.A. b) Ser escritos a máquina, a doble espacio, en original y una copia, dejandomárgenes de 4 cms. a la izquierda y 2cms. a la derecha. El original en papel blanco, grueso, tamañocarta. c! Ser escritos en español con resúmenes en español e inglés. d ) Tener un titulo conciso. Podrán tener, si fuere necesario, un subtitulo explicativo e ) Llevar los nombres del autor 010s autores inmediatamente después, indicando con asteriscos, en el pié d e página, su titulo acad6mico y l a institución en la cual se realizó e l trabajo. Incluir en el texto del trabajo: Introducción, Materiales y Metodos, Resultados, Discusión, Conclusiones y Referencias Bibliográficas.

f)

g ) L a s citas bibliográficas s e harán en e l texto en forma consecutiva, utilizando números arábigos s deberán aparecer. en el mismo orden numérico de citación. La referencia se presenta asi: apellido del autor, seguido de las iniciales de su nombre, titulo del articulo, nombre abreviado de la revista. año de publicación, volumen, número y pagina. Ejemplo: Barrow CH. Criptococcosis inanimals. J.A. M.A. 1955,127: 125. P a r a la citación de libros se seguirá un orden similar, asi: Pearse A., Texbook of Biochemistry. Saunders Edt., 1979; pp 49-50. h) Los cuadros, gráficas y figuras deben numerarse en forma consecutiva con números arabigos y ser presentados en papel fotografico brillante. en blanco y negro. maniqniendo individualmrnte una proporcion de 2 x 3. Dicho material debe ser decalidad y presentación impecables. En hoja aparte s e incluirá la leyenda respectiva. 3.

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