TEMA 10 ESTERILIZACION INDUSTRIAL Y CONTROL EN LAS FERMENTACIONES 1.- Introducción 2.- Esterilización del Medio de Cultivo I. Esterilización Discontinua II. Esterilización Continua 3.- Esterilización del Aire de Fermentación 4. Control en las Fermentaciones I. Oxígeno II. Temperatura III. pH 5. Agitación y mezclado _______________ 1. INTRODUCCION Para poder llevar a cabo una fermentación con éxito es imprescindible y obligatorio tener en todas las etapas cultivos libres de contaminantes, desde el cultivo preliminar hasta el fermentador de producción. - Deben estar estériles antes de la inoculación: fermentador y su equipamiento; medio de cultivo - Deben estar estériles durante la fermentación: aire, aditivos (antiespumantes)-porque los microorganismos pueden generar espuma cuando están en agitación No deben existir roturas mecánicas en el fermentador. - Agentes esterlizantes: calor, radiación, productos químicos, filtración. 2. ESTERILIZACION DEL MEDIO DE CULTIVO El medio nutritivo que se prepara inicialmente contiene células vegetativas y esporas que proceden de los constituyentes del medio, del agua y de los recipientes. Se les aplica calor, pero en el medio suele haber sustancias termolábiles como vitaminas, antibióticos, los componentes de la sangre... Lo que tenemos que hacer es separarlas y esterilizarlas aparte usando un sistema que no las altere, se suele usar la filtración. Una vez realizado todo esto y cuando el medio de cultivo esta a temperatura ambiente añadimos lo que hemos esterilizado por filtración.

TIEMPO DE ESTERILIZACION Y Tº DE DISTINTOS GRUPOS DE MICROORGANISMOS Usamos una temperatura que mate el microorganismo que aguanta más tiempo. Existen dos tipos de esterilización industrial: I.- ESTERILIZACION DISCONTINUA A 121ºC durante 30-60 minutos y se deja enfriar. Para conseguir que la temperatura sea asi de elevada se inyecta vapor de agua. Hay dos maneras de inyectar el vapor: - Indirecta: alrededor del fermentador, con lo que se calienta este. Inyectar vapor en la camisa del fermentador o en los serpentines interiores. - Directa: inyectar el vapor de agua en el interior del fermentador, es la peor porque se altera la composición del medio, hay que usar vapor de agua puro sin aditivos que son tóxicos y se quedan en el medio de cultivo y al inocular el microorganismo no va a crecer. Inconvenientes: alteración del medio de cultivo, alto consumo de energía, el tiempo es muy largo ya que tarda mucho tiempo en calentarse lo que se une al tiempo en si de la esterilización, al final 5 horas. Perfil de temperatura y cambios en el medio de cultivo en un fermentador de 3000L. Coeficiente de extinción: medimos procesos de alteración de los nutrientes en el medio, como la caramelización, en los cuales los nutrientes se combinan entre ellos y producen productos que no son asimilables por las bacterias que hemos inoculado.

II.- ESTERILIZACION CONTINUA Se suele utilizar esta, se basa en el principio de que cuanto más incrementemos la temperatura menos tiempo necesitamos. Usamos 140ºC durante 30-120 s. así reducimos el tiempo. Existen dos sistemas: 1- Inyección de vapor, con los mismos inconvenientes que el anterior 2- Intercambiadores de calor, los más utilizados; - Precalentamiento a 90-120ºC durante 20-30segundos - Calentamiento a 140ºC durante 30-120seg - Enfriamiento Tº del fermentador 20-30" El reservorio del medio del cultivo lo metemos en el circuito, tiene 20ºC, tº ambiente. Llegamos al primer intercambiador de calor, el medio de cultivo que ya esta esterilizado a 140º se lo transmite al nuevo, que pasa a 100º y el otro se reduce a 60ºC (precalentamiento) Este a 100º se pasa por otro intercambiador de calor, donde hay vapor a 140º para subirle al medio la temperatura a 140º y se pasa por el circuito para esterilizarlo, a esta temperatura se le mantiene segun la longitud del circuito o según el flujo por el circuito. Ahora pasamos este medio ya estéril a 140º por el primer intercambiador (mientras pasa otro medio nuevo a 20º) y baja a 60º. A continuacion pasa por otro intercambiador de calor que es un refrigerador, y se enfria la solucion a la temperatura que queremos usar en el fermentador. Se usan mucho en la industria biotecnologica para enfriar o refrigerar.

ESQUEMA DEL CIRCUITO

INCONVENIENTES DE LOS INTERCAMBIADORES: 1. Que se formen sales insolubles que se depositan sobre las paredes del tubo; disminuye el flujo y la transferencia de calor se altera. Solución: detener y tratar con ácidos y bases y reesterilizar el circuito. 2. Las soluciones con almidón se hacen viscosas al calentarlas, se suele usar el almidón o sustancias con alto contenido en azucares como fuente de carbono en los fermentadores industriales; la solución viscosa no circula bien, disminuye la velocidad. Solución: meter el polímero hidrolizado para que no se produzca la viscosidad. 3. Las partículas que hay en suspensión tienen distinto tiempo de calentamiento. En una partícula pequeña se alcanza mucho antes los 140º. Solución: limite en las partículas que se pueden introducir, es 1-2mm, ya que para tamaños mayores se necesita un tiempo muy superior a los 60 segundos.

3. ESTERILIZACION DEL AIRE DE FERMENTACIONES El microorganismo necesita oxigeno administrado por el aire. Normalmente en el aire hay entre 10 y 100000 partículas por metro cubico, que es 5-2000 microorganismo por metro cubico, de esto el 50% son esporas del hongos y el 40% son bacterias G-. La velocidad de aireación de 1vvm, significa que en un minuto metemos el mismo volumen de aire que hay en el medio de fermentación.

Si tenemos un medio de trabajo de 50m3, y una velocidad de aireación de 1vvm, suministramos 3000m3/h, cada hora metemos en el fermentador 6 millones de microorganismo. Métodos de esterilización de gases: 1. Filtración 2. Inyección de gas (ozono) 3. Depuración de gas 4. Radiación (UV) 5. Calor Filtración principal; puede ser de dos tipos: - Filtros en profundidad, como la lana de vidrio se retienen las partículas por distintas propiedades físico químicas de las partículas que hacen que se retengan. se usan para cosas gruesas - Filtros de membrana (en microbiología) son filtros absolutos, consisten en una membrana con poros que podemos determinar el tamaño de estos, si tenemos un tamaño de poro inferior a dos micras que pueda medir una bacteria, esa bacteria no va a atravesar el agujero y queda retenida. Podemos obtener tamaño de poros de todos los tamaños y se suelen usar esteres de células, polisulfona o lynon. En industria es muy importante que se filtre el aire que salga, el agotado, ya q puede llevarse el MO que nos interesa.

4.- CONTROL EN LAS FERMENTACIONES

OXIGENO Es el más importante porque es el que utilizamos para el metabolismo celular, es el ultimo aceptor de e. el CO2 es el producto del metabolismo a eliminar. El oxigeno del aire no es muy soluble en agua, es de 9 mg/L, esto viene determinado por la ley de Henry: la concentración máxima que se puede conseguir de un gas en una solución depende de la presión parcial del gas en la fase gaseosa (cantidad de gas que haya, de la pureza). Si usamos oxigeno puro, la solubilidad aumenta a 43mg/L. En la industria se usa aire, la solubilidad de este oxigeno también depende de los solutos disueltos, en el agua de mar la concentración de oxigeno disminuye un 20%, y en el medio de cultivo donde hay peptona disminuye un 40% También influye la tº, a mayor, menor la solubilidad. Normalmente se añade por debajo del tanque para que ascienda el aire, se forman burbujas.

BARRERAS A LA TRANSFERENCIA DE OXIGENO: hay que transferir el oxigeno de la burbuja de aire a la membrana plasmática de las bacterias y a medida que vamos transfiriendo de la burbuja al medio baja la concentración de oxigeno y cuando llega a la pared celular baja y después atraviesa la membrana y llega a la enzima. Al final hay menos aun disolución de oxigeno. Además tenemos células unicelulares y multicelulares (donde se forman agregados y las burbujas nunca se ponen en contacto con las células del interior de los grumos.

En la industria farmacéutica se usan hongos filamentosos o actinomicetos que son eucariotas y ambos aerobios. Forman grumos y el suministro de oxigeno desde la burbuja hasta las células que están en el interior de los grumos es muy difícil, en las del interior va a haber poco oxigeno. MEJORAR LA TRASERENCIA DE OXIGENO 1. Aumentar el área interfacial (vamos a poner las burbujas de aire que sean muy finitas y muchas para que haya más contacto) 2. Aumentar el tiempo de contacto (que el flujo del aire que introducimos sea rápido para q vayan mas burbujas y por tanto más oxigeno 3. Disminuir la resistencia a la difusión entre la burbuja y la célula (con muchas burbujas se disminuye la distancia) 4. Moléculas tipo hemoglobina (tiene afinidad del oxigeno y lo lleva de donde mas concentración a menos, si obtenemos moléculas que sean capaces de captar el oxigeno y transportarlo). Las leguminosas producen leghemoglobina.

TEMPERATURA - CLASIFICACION SEGUN Tº (psicrofilos, psicrotrofos, mesofilos, termofilos e hipertermofilos). Si nos pasamos de la temperatura optima cae de golpe, por lo q hay que controlarla muy bien en el tanque porque si nos pasamos, la velocidad de crecimiento es inferior y encima el microorganismo muere.

- Tº INFERIOR A LA OPTIMA: retardo en el crecimiento y reducción de la producción celular. - Tº SUPERIOR A LA OPTIMA: hay un choque término que induce una respuesta de estrés, se producen proteasas celulares que degradan los productos proteicos ("suicidio") Las fermentaciones deben llevarse a cabo en un estrecho margen de temperatura y a ser posible constante. Ej. Con la producción de etanol, la temperatura es un factor crítico. Al aumentar la temperatura se reduce la producción de etanol. - TEMPERATURA-PRODUCCIÓN: Las fermentaciones deben llevarse a cabo en un estrecho margen de temperatura y a ser posible constante. - LA TEMPERATURA SE CONTROLA: la refrigeración se lleva a cabo por camisas de agua, los tanques están recubiertos por un circuito por el que se hace pasar agua, hay una transferencia de calor y si la temperatura aumenta por encima de una crítica se activa el flujo de agua hasta que se reduce la temperatura y se vuelve a apagar. La produccion de calor es por la agitacion y la actividad metabolica.

pH En general, las bacterias crecen a pH neutro y el hongo crece a pH acido. La mayor parte de los microorganismos crecen óptimamente entre pH 5.5 y 8.5. En un fermentador añadimos nutrientes y normalmente el pH del tanque es de un pH neutro. Pero como producto del metabolismo de los microorganismos se producen metabolitos que alteran el pH, si no hay una oxidación completa de la glucosa y esta es parcial se producen ácidos orgánicos que bajan el pH del fermentador. Si se destruyen proteínas por Pseudomonas por ejemplo se aumenta el pH por las aminas y los amonios, además produce putrescina y cadaverina.

PRODUCCION Lactobacillus: a pH acido produce acido láctico pero a pH básico produce acido acético y fórmico. Levaduras: a pH acido producen etanol y a básico glicerol Aspergillus: a pH 3-7 producen melanina de una forma constante y a pH 7-7.9 se multiplica por 30 la producción de melanina En el fermentador se mantiene el pH con un reservorio con acido y bases concentrados y según como varié el pH se añaden unos u otros

5.- AGITACION Y MEZCLADO La agitación es la operación que crea o acelera el contacto entre dos o varias fases. En una fermentación microbiana tenemos 3 fases: 1. Fase liquida con sales disueltas, sustratos y metabolitos 2. Fase sólida: con células individuales, agregados celulares, sustratos insolubles o productos del metabolismo que precipitan. 3. Fase gaseosa: proporciona un reservorio para el suministro de oxigeno, eliminación del co2 o ajuste del pH con amonio gaseoso. EFECTOS DE LA AGITACION EN LA FERMENTACION 1. Dispersión del aire en la solución de nutrientes 2. Homogeneización de la temperatura, pH y concentración de nutrientes en el fermentador 3. Suspensión de los microorganismos y de los nutrientes sólidos 4. Dispersión de los líquidos inmiscibles TIPOS DE AGITACION Hay tres métodos, el más usado es el agitador rotativo, que consiste en unas palas que estamos moviendo continuamente por la acción de un motor, que esta fuera del fermentador. También se pueden usar otros en los que no hay propulsores y se pueda aprovechar la entrada de aire para agitar todo lo q esta dentro, como el de columnas de burbujas (desde abajo metemos el aire y al ascender van a mover todo el tanque fermentador) o el de sistema aero-elevado (igual al anterior pero creando un circuito dentro del fermentador por el que van a pasar las burbujas de aire que se van a reciclar y esto hace que se mueva todo lo del interior del fermentador)