TESINA PARA OPTAR POR EL GRADO DE LICENCIADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS Aislamiento y caracterización de un marcador de proliferación específico (PCNA) en platelmintos parásitos

Germán Caurla Orientador de Tesis: Dra. Estela Castillo Sección Bioquímica - Facultad de Ciencias, Montevideo - Uruguay Tribunal Adriana Esteves María José Arezo Abril 2011 1

Agradecimientos Quiero agradecer en primer lugar a mis padres quienes de alguna u otra manera motivaron e incentivaron el poder realizar esta carrera, a mi madre por estar ahí día tras día y a mi padre por tener siempre la palabra justa.

A todos mis amigos en general aquellos a quienes conocí en facultad como los que ya venían de antes, gracias por tantos momentos de alegrías, encuentros, desencuentros, emociones, estudios, y por todos los que vendrán también, a la familia en general por estar siempre atentos y presentes.

También agradecer al laboratorio en general por estar siempre atentos y dispuestos a todo, por el excelente ambiente y la calidez humana generada diariamente, a Estela que de tener que realizar otra pasantía y otra y otra, creo que sin dudas la volvería a elegir como tutora una y otra vez, porque considero es más que eso.

Y agradecer a mi novia por tanto aguante.

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Indice Resumen ......................................................................................................................................5 Introducción ................................................................................................................................6 Echinococcus granulosus ..........................................................................................................7 Fasciola hepática ......................................................................................................................9 Mesocestoides Corti ...............................................................................................................10 Sanidad y salud.......................................................................................................................12 Células Proliferantes ..............................................................................................................12 Neoblastos en planarias .....................................................................................................13 PCNA ......................................................................................................................................15 OBJETIVOS .................................................................................................................................20 Objetivo general .....................................................................................................................20 Objetivo especifico .................................................................................................................20 Actividades específicas ...........................................................................................................20 Estrategia Experimental ............................................................................................................21 Materiales Y Métodos ...............................................................................................................22 Diseño de primers específicos ................................................................................................22 Diseño de primers degenerados.............................................................................................22 Amplificación de genes tipo PCNA por reacción en cadena de la polimerasa (PCR)...............22 Visualización de moléculas de ADN ........................................................................................23 Purificación de fragmentos de ADN .......................................................................................24 Ligación en vector pGem T Easy, Promega .............................................................................24 Transformación (Shock térmico) de los productos de ligación ...............................................25 Obtención de ADN plasmídico................................................................................................25 Digestiones con enzimas de restricción..................................................................................26 Secuenciación.........................................................................................................................26 Análisis de Secuencias ............................................................................................................26 RT con superscript II ...............................................................................................................27 ANÁLISIS POR SDS-PAGE 15% .................................................................................................27 Diseño de primers para la expresión de PCNA de Echinococus granulosus............................27 Expresión Proteína recombinante ..........................................................................................28 Inmunohistoquimica ..............................................................................................................28 Resultados y discusión ..............................................................................................................29

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Alineamiento de secuencias para el diseño de primers .........................................................29 Primers específicos .............................................................................................................29 Primers degenerados .........................................................................................................29 Aislamiento de genes tipo PCNA ............................................................................................30 Clonado de fragmentos de genes tipo PCNA ..........................................................................30 Análisis secuencia ...................................................................................................................34 Estudios de Expresión temporal .............................................................................................36 Estudios de expresión espacial ...............................................................................................37 Expresión de la proteína recombinante PCNA de Echinococus granulosus ............................38 Conclusión y perspectivas .........................................................................................................41 Referencias Bibliográficas .........................................................................................................43 Anexo I .......................................................................................................................................49

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Resumen Los estudios sobre células proliferativas en platelmintos de vida libre, han demostrado que no existe división entre las células somáticas diferenciadas, siendo células madre indiferenciadas (neoblastos) las responsables de la renovación celular durante el mantenimiento, crecimiento y regeneración de tejidos. Existen evidencias que indican que en platelmintos parasitos neodermados la renovación celular tendría un mecanismo similar al de platelmintos de vida libre. Sin embargo, no existen marcadores moleculares endógenos conocidos para células proliferativas en platelmintos parásitos. Uno de los genes que se ha mostrado como marcador especifico es el pcna (Proliferating Cell Nuclear Antigen) un cofactor de las ADN polimerasa. Su expresión en células proliferativas se encuentra ampliamente documentada a lo largo de la escala evolutiva. En este trabajo, planteamos contribuir a la caracterización de las células proliferativas, buscando un marcador molecular específico. Es así que para cumplir con lo ya mencionado hemos diseñado cebadores degenerados que nos permitieron aislar y clonar la secuencia correspondiente al gen pcna para los organismos Echinococus granulosus, Mesocestoides corti y Fasciola hepática. Se realizaron además estudios de expresión temporal utilizando un anticuerpo monoclonal comercial en ensayos de western blot. Estos estudios mostraron una presencia mayor de proteínas en etapas tempranas del desarrollo del organismo. Con el fin de estudiar la localización de la proteína se realizaron estudios de inmunohistoquímica para conocer la distribución espacial de células que expresan la proteína PCNA. No obtuvimos resultados positivos con este anticuerpo. Los resultados negativos de la inmunohistoquimica nos indujeron a clonar el gen correspondiente a E. granulosus en un vector de expresión (Pet14b) para obtener la proteína recombinante EgPCNA la cual será producida y purificada. Está proteína recombinante fue obtenida en forma insoluble. Este trabajo ha permitido aislar el ADNc de los genes PCNA de los tres platelmintos parásitos lo que permitirá profundizar en estudios del posible rol de este marcador durante la proliferación. 5

Introducción

Los platelmintos son un filo de animales invertebrados acelomados protóstomos triblásticos que comprende unas 20.000 especies. Son aplanados dorsoventralmente y presentan simetría bilateral. Su cuerpo es macizo y relleno de tejido parenquimático laxo. El espacio entre el ectodermo y el endodermo está lleno de mesénquima en donde se encuentran los órganos internos. No existe cavidad general como en el caso de los nemátodos y las estructuras intraparenquimatosas corresponden a los órganos genitales (Osimani, 1982). En la mayoría de los casos la organización del sistema genital es hermafrodita. El tubo digestivo carece de ano, actuando como cavidad gastrovascular la cual realiza las funciones digestivas y de distribución de los nutrientes, dado que carecen de aparato circulatorio. Muchas formas parásitas carecen de aparato digestivo. Tampoco tienen aparato respiratorio y el oxígeno que necesitan para su metabolismo lo intercambian a través de sus delgados tegumentos. Tienen un sencillo sistema nervioso bilateral que recorre el cuerpo y un aparato excretor rudimentario que está constituido por los protonefridios, que comienzan ciegos en el mesénquima.

Dentro del ciclo biológico de las formas parásitas se pueden presentar uno o más huéspedes intermediarios, pudiendo llegando en ocasiones a ser muy complejo.

Según la clasificación tradicional, el filo platelmintos, comprende cuatro clases. -

Turbelarios, platelmintos bentónicos, de vida libre, que ocupan el medio marino, lacustre o dulceacuícola.

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Trematodos o duelas, son una clase de platelmintos parásitos internos y externos, tanto de vertebrados como invertebrados.

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Cestodos o tenias son una clase de platelmintos endoparásitos. En su extremidad anterior está situado el denominado escólex, donde encontramos órganos de fijación para adherirse a su hospedero, el resto del cuerpo posee un número variable de segmentos llamados proglotis en número variado.

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Monogéneos, compuesta por especies parásitas, principalmente de peces y anfibios. Considerados durante largo tiempo como un orden de la clase 6

Trematoda, fueron separados de ellos, entre otros motivos, por presentar un ciclo biológico con un solo hospedador.

Los helmintos parásitos son organismos responsables de infecciones en varias especies de animales. Debido al impacto sanitario y económico han sido estudiados buscando dilucidar aspectos básicos referidos a su biología, inmunología, y epidemiología. Sin embargo, a pesar del conocimiento acumulado, ninguna de las estrategias diseñadas para erradicarlos han funcionado por lo que es imprescindible profundizar en el conocimiento de su biología.

Echinococcus granulosus

Corona de ganchos

Segmento grávido Huevos

a

b

Figura (1)- a- Estadio adulto de E. granulosus , donde se puede observar en la parte anterior, el escólex con las ventosas y la corona de ganchos , y en la parte posterior, el segmento grávido conteniendo los huevos del parásito b- Estadio larvario de E. granulosus, donde se puede observar las distintas capas del quiste. Figura a modificada de www.facmed.unam.mx/.../equinococosis.php, figura b tomada de wzar.unizar.es/Hidatidosis/hid/hid_info.html

E. granulosus fig. (1) es un cestodo también conocido como gusano de la hidátide, que parasita el intestino delgado de cánidos en su forma adulta, y del ganado ovino en su fase larvaria, aunque de forma secundaria o accidental ésta también parasita otros muchos animales, incluyendo al ganado caprino, bovino, equino, porcino, algunos roedores, ciervos, alces, marsupiales, y otros, así como los primates, produciendo la hidatidosis. Su morfología se caracteriza por la presencia de un órgano anterior de fijación, el escólex, provisto de ganchos y ventosas, que le permite fijarse a la mucosa intestinal, una zona posterior de forma cintada con aspecto segmentado, 7

denominada estróbilo, formado de una sucesión continua de proglótis. Desde la base del escólex, los proglotis del estróbilo quedan encadenados de modo que las más maduras van quedando hacia la parte posterior del estróbilo. Las proglótides cercanas al escólex crecerán paulatinamente en tamaño, formando un aparato reproductor masculino y femenino completo, o dos, a medida que van siendo desplazadas por la formación de nuevos anillos inmaduros.

Figura (2) - Ciclo de vida de Echinococus granulosus. En el ciclo exterior se muestran las distintas etapas del ciclo, mientras que en el ciclo interior se muestran los distintos huéspedes que corresponden a cada etapa de desarrollo

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Fasciola hepática Este parasito pertenece a la clase Trematoda subclase Digenea, caracterizado por su forma lanceolada, con dos ventosas, una bucal y otra ventral, y un ciclo biológico con dos generaciones (digeneo) en dos hospedadores, un molusco gasterópodo anfibio y un mamífero. En ambos las poblaciones del parásito pueden aumentar en número, dentro del huésped intermediario por la producción de cercarias y dentro del huésped definitivo por la puesta de huevos.

Figura (3) -Estadio adulto de F. hepática. En la figura se visualiza el adulto de Fasciola donde se aprecia el color parduzco por el contenido de sangre en los ciegos. Se señala en la figura el intestino con una flecha continua y la ventosa oral con una flecha discontinua.

Es parásito de los canales biliares y la vesícula biliar de herbívoros y omnívoros, incluido el hombre. Cada parásito adulto produce los huevos que son arrastrados por la bilis hasta el intestino para ser eliminados por la materia fecal. Según las condiciones de temperatura y de humedad del medio ambiente, dentro del huevo se desarrolla el miracidio, forma intermediaria que infecta al caracol Lymnaea viatrix. Dentro de éstos los estadíos del parásito se suceden de la siguiente manera: esporocisto, redia, redia hija, hasta alcanzar el estadio de cercaria que es expulsado del molusco. Es en esta forma que alcanza los vegetales que se encuentran a las orillas de ríos, lagos, lagunas gracias a la movilidad otorgada por la cola que posee. Una vez que se encuentra en la vegetación acuática se produce la perdida de la cola y se genera una membrana que la recubre y produce las formas infectantes, metacercarias. Las mismas al ser ingeridas por el hospedador definitivo llegan al intestino y se transforman en fasciolas jóvenes. Éstas atraviesan la pared intestinal y migran hacia el hígado a través de la cavidad peritoneal. Finalmente, perforan la cápsula hepática y continúan migrando a través del tejido hepático hasta llegar a los conductos biliares, donde el estadio adulto genera los huevos, completando así el ciclo. 9

Figura (4) - Ciclo de vida de F. hepática. En la figura se muestran las diferentes etapas del ciclo con sus hospedadores. Modificado de página Centers for Disease Control and Prevention

Mesocestoides corti

Este parásito está siendo incorporado como modelo alternativo para el estudio de cestodos debido a su fácil manejo en el laboratorio. El ciclo de vida completo de M. corti aún no ha sido completamente elucidado. El mismo es complejo y posee 3 hospedadores. El gusano adulto segmentado presenta cuatro ventosas y carece de rostelo. Éste produce huevos con oncósferas que infectan al primer hospedador intermediario, aún desconocido. Algunos autores proponen que sea un artrópodo (Webster, 1949). Luego de esto, este primer intermediario es ingerido por un segundo

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hospedador, que pueden ser cánidos, lagartijas y serpientes, en donde la larva infectante, tetratiridio, se desarrolla en la cavidad peritoneal. En estos huéspedes M. Corti es capaz de replicarse por fisión longitudinal. Al ser ingeridos por el huésped definitivo desarrollan el estadio adulto en el intestino del mismo.

Figura (5) - Ciclo de vida de Mesocestoides Corti. En la figura se muestran las diferentes etapas del desarrollo que es posible encontrar en este parásito. Modificada de http://www.ufrgs.br/depbiot/206a/Ciclo.htm

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Sanidad y salud Echinococus granulosus constituye un problema muy importante de salud pública en humanos y es una de las causas más importantes de pérdidas económicas en el ganado. En las últimas décadas, una cantidad importante de trabajo se ha consagrado al estudio de E. granulosus y la hidatidosis. A pesar de la incidencia que tiene aún la hidatidosis en Uruguay, la obtención de material parasitario presenta dificultades. Por esta razón en varios laboratorios el uso de Mesocestoides corti está siendo incorporado como modelo alternativo de estudio. Éste se mantiene en el laboratorio por infección de ratones, rindiendo grandes cantidades. El cultivo in vitro de M. Corti, induce en las larvas la segmentación y la formación de las gónadas. La Fasciola hepática, que parasita varios mamíferos como la oveja, cabra, vaca y otros rumiantes, y más raramente caballo y hombre, es el agente responsable de la fasciolasis, zoonosis con alto impacto económico por las pérdidas que genera en la producción ganadera vacuna y ovina. La Organización Mundial de la Salud estima que existen en todo el mundo 2.4 millones de personas afectadas y otros 180 millones corren riesgo de infección.

Células Proliferantes Los estudios sobre células proliferativas en platelmintos de vida libre ("turbelarios"), han demostrado que no existe división entre las células somáticas diferenciadas, siendo células madre indiferenciadas (neoblastos) las responsables de la renovación celular durante el mantenimiento, crecimiento y regeneración de tejidos (Peter R. et al., 2004). Esta estrategia de renovación celular en platelmintos turbelarios difiere con la existente en otros modelos animales, como por ejemplo en mamíferos, dónde dependiendo del tejido pueden además coexistir entre las células proliferantes células madre (con diversos niveles de compromiso para su diferenciación) con elementos celulares ya diferenciados (Peter et al. 2004). Las líneas de investigación se han centrado principalmente en planarias (orden Tricladida), de gran interés e importancia debido a su enorme potencial regenerativo, y 12

en especies del género Macrostomum. Existe un sistema de renovación celular similar, mediado por neoblastos, en acelomorfos (Egger et al. 2009; Reuter y Kreshchenko, 2004). Los neoblastos presentan características morfologías particulares: pequeño tamaño, alta relación núcleo/citoplasmática, nucleólo prominente, intensa basofilia debido a la abundancia de ribosomas libres, mitocondrias pequeñas, y escasez de Retículo endoplasmático rugoso y el complejo de Golgi. En el caso de planarias, los neoblastos se caracterizan además por la existencia de cuerpos cromatoides, ultraestructuralmente

evidenciados

como

estructuras

electrón-densas

compactas

perinucleares, no rodeadas por membranas.

Neoblastos en planarias Originalmente, los neoblastos de planarias fueron descriptos morfológicamente mediante métodos de histología clásica y microscopía electrónica. Los neoblastos se distribuyen en toda la región interior del parénquima, excepto en la región más anterior (por delante de los fotorreceptores) y en la faringe. En las formas asexuales, son especialmente abundantes en tres cordones dorsales (uno medial y dos laterales; figura 6). Durante la regeneración, se acumulan por detrás del blastema, en una región denominada post-blastema, dónde ocurre la proliferación celular (Peter et al. 2004; Reddien y Sánchez-Alvarado, 2004; Reuter y Kreshchenko, 2004).

Figura (6) Distribución de neoblastos en planarias. Los neoblastos fueron marcados con 5-bromo-2-deoxiuridina y luego detectados mediante inmunohistofluorescencia (color verde) en la planaria Girardia dorotocephala. La escala representa 450 µm. Modificada de Newmark y Sanchez Alvarado (2000).

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En lo que respecta a Mosocestoides Corti Se estudió la localización y características de las células proliferantes durante su desarrollo in vitro mediante experimentos de pulso y caza con bromodeoxiuridina (U. Koziol tesis maestría PEDECIBA, 2009).

Las células proliferantes se encuentran en la región del parénquima interior (medular), principalmente próximas a los cordones musculares internos. Estas células migran tras proliferar hacia las regiones periféricas (parénquima exterior, subtegumento) donde se diferencian, y se acumulan en los primordios genitales, en especial en la periferia de los mismos. La morfología de las células proliferantes putativas es coincidente con la descrita en otras especies de cestodos.

Fig. (7) Inmunodeteccion de células que incorporaron BrdU tras un pulso de 4 horas. Se visualiza el estróbilo (U. Koziol tesis maestría PEDECIBA, 2009)

Recientemente, los estudios sobre proliferación en neoblastos, y los mecanismos de regeneración en estos organismos han sido revolucionados por la aplicación de técnicas moleculares. Algunos de los avances más espectaculares se han logrado mediante la utilización de marcadores moleculares para los neoblastos y su progenie mediante hibridación in situ e inmunohistoquímica, el uso de citometría de flujo (Higuchi et al., 2007), la existencia de proyectos genoma y de expressed sequence tags (ESTs) que permiten el aislamiento sencillo de genes y la construcción de 14

microarrays (Morris et al., 2006; Robb et al., 2008; Rossi et al., 2007; Sanchez-Alvarado et al., 2002; Zayas et al., 2005), y el desarrollo de técnicas para el knock-down mediante interferencia de ARN de los genes involucrados (Newmark y Sánchez-Alvarado, 2002; Newmark et al., 2003; Reddien, Bermange et al., 2005). Entre los marcadores moleculares aislados se encuentran genes efectores y factores que participan en la regulación. Existen evidencias de un mecanismo similar al de platelmintos de vida libre en la renovación celular de platelmintos parásitos neodermados. Sin embargo, no existen marcadores moleculares endógenos conocidos para células proliferativas en platelmintos parásitos. Se han comenzado la caracterización de células proliferativas en estos parásitos y se aislaron algunos marcadores moleculares de estas (KOZIOL et al., 2008). Para alguno de ellos se ha mostrado que si bien se expresan en células proliferativas no parecen ser marcadores específicos de estas (Koziol, tesis maestría PEDECIBA, 2009). El estudio de células proliferativas en

platelmintos parásitos es de gran

importancia, debido al rol central de la proliferación celular durante las diferentes etapas y transiciones de sus ciclos de vida, y por su interés como modelos de proliferación celular continua.

PCNA

En el marco de este trabajo, planteamos contribuir a la caracterización de las células proliferativas, buscando un marcador molecular específico de estas células. Nos proponemos estudiar la proteína PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), un cofactor de las ADN polimerasas δ y ε (Ayyagari R., et al., 1995; McAlear M. et al., 1994) cuya función es aumentar su procesividad (George-Lucian Moldovan, et al., 2007). Su expresión en células proliferativas se encuentra ampliamente documentada a lo largo de la escala evolutiva. PCNA fue primero descubierta como un factor de relevante importancia en el proceso de elongación en la replicación del ADN del virus del simio 40 (SV40) (B. Stillman et al., 1988; M.D. Challberg et al., 1988; J.J. Li et al., 1984), permitiendo una mayor eficiencia de la misma en presencia de extracto citoplasmático de células 15

humanas. En ausencia de PCNA, la Polimerasa δ tiene una actividad limitada quedando resumida en cadenas de varias decenas de nucleótidos, pero con su adición es posible observar un importante incremento en los largos de las hebras de ADN sintetizadas (C.-K. Al Tan et al., 1986; G. Prelich., et al 1987). Tiempo atrás utilizando geles de electroforesis de dos dimensiones se encontró una proteína acida expresada diferencialmente durante el ciclo celular, en consecuencia fue propuesta como una proteína perteneciente a la familia de las ciclinas. Más tarde, se reveló que PCNA y la ciclina eran las mismas proteínas (MathewsM.B. et al., 1984). Y es así que ese factor esencial para la replicación del ADN del SV40 (virus del simio 40) in vitro fue identificado como PCNA (Tan C. Ket al 1986, Prelich Obtener et al., 1987). Su aparición periódica en núcleos en fase S, co-localizada con la incorporación de bromodesoxiuridina (Bravo R. et al, 1980; Bravo, R. et al 1987), sugiere una relación con la replicación del ADN. PCNA interactúa con varias proteínas que pueden estar implicados en el control del ciclo celular o en reacciones implicadas en la reparación del ADN (Z. Kelman et al., 1997, Hubscher U. et al., 1996), varios de estos motivos fueron los que años atrás hicieron que se la identificara equívocamente como una proteína dentro de la familia de las ciclinas, pero desde su identidad como PCNA esto se habría solucionado, ya que este nombre se ha utilizado para evitar todo tipo de eventual confusión con esa clase de proteínas que unen a CDK quinasas (M.B. Mathews et al., 1984). La estructura tridimensional de PCNA ha sido altamente conservada durante la evolución, su secuencia de aminoácidos en ratas y humanos difiere en tan sólo 4 de 261 aminoácidos como se puede ver en la (Fig. 8) donde se muestra por cristalografía de rayos X su estructura, PCNA tiene una organización en forma de toroide (Gulbis J. M et al., 1996, Krishna T. S. et. al, 1994, Schurtenberger P. et. al, 1998, Ellison V. and Stillman B, 2001). Otro ejemplo de esta identidad viene dado en que las estructuras de las proteínas de Saccharomyces cerevisiae y PCNA de humanos se encuentran estrechamente superponibles, más aun a nivel de los elementos estructurales secundarios, aunque la similitud en el plano de la secuencia de aminoácidos es tan solo del orden del 35%. Cada monómero de PCNA se compone de dos dominios unidos estrechamente formando una hoja B extendida a lo largo de todo el domino limite (Figura 8) (Gulbis J 16

et al., 1996, KrishnaT et al., 1994). Tres monómeros se unen en una interacción antiparalela entre ßD2 en una molécula y ßI1 en la siguiente, con lo que esto se traduce en un total de ocho principales cadenas de enlaces de hidrogeno amida-carboxilo a través de la superficie intermolecular del anillo trímero (Fig. 8) (Gulbis J. Met al., 1996, KrishnaTet al 1994). Además, presenta un núcleo hidrofóbico el cual es formado por la hélice αA2 en una molécula y el αB2 del monómero adjunto (KrishnaT et al., 1994). En cuanto al tamaño de la estructura general del trímero, PCNA se estima en ~ 34 Å para el diámetro interno, ~ 80 Å para el diámetro externo y ~ 30 Å de espesor. A pesar de que PCNA tiene una carga negativa general, la superficie interior está cargado positivamente, debido a la presencia de varios residuos de lisina y arginina (10 por subunidad). Esto sugiere que la carga negativa ADN puede pasar a través del anillo sin repulsiones.

Figura 8. Diferentes niveles de organización de PCNA. (A) Secuencia amino acídica PCNA humano. , IDCL (Interdomain connecting loop) (118LMDLDVEQLGIPEQEYSC135), Loop central (center loop, CL), CL (41DSSH44), C-terminal, C (254KIEDEEGS261) se muestra en rojo; back side loop, BL (184QTSNVDKEEEAV195) se muestra en rosado. (B) Modelo de la estructura tridimensional de PCNA. IDCL, CL, C; BL. Áreas de hélices (helix areas) (aA1, aB1, aA2, aB2) en rosado y hojas β (bA1, bB1, bC1, bD1, bE1, bF1, bG1, bH1, bI1, bA2, bB2, bC2, bD2, bE2, bF2, bG2, bH2, bI2) se muestran en amarillo. (C). Organización trimerica de PCNA (1XC) se muestra por delante. (D) vista lateral (E) Modelo del doble trímero de PCNA. IDLC, CL C, BL.

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En cuanto a la maquinaria de acción, en la figura 9 se representa el esquema enzimático básico necesario para la replicación del ADN. La replicación es un proceso complejo que tiene lugar durante la fase S del ciclo celular, y básicamente ocurre en dos etapas; iniciación y elongación. En los primeros momentos de la reacción se prepara un complejo ADN/Proteína el cual dará lugar a la iniciación, una ADN helicasa, topoisomerasas (encargadas de liberar la torsión generada por la doble hebra), proteína de replicación, las proteínas de unión al DNA de cadena simple SSBP (single strand binding protein) y una K/Pol primasa que cumple con dos funciones, la de sintetizar los primeros cebadores de ARN en la que será la hebra líder y en paralelo sintetizar pequeños ARNs discontinuos que darán lugar a los llamados fragmentos de Okazaki en la hebra rezagada). El ADN es desenrollado dando lugar a lo que se conoce como horquilla de replicación. PCNA, RFC y N pol son necesarias para cambiar el aparato de síntesis de la Pol K a la Pol N, quien será la encargada de completar la síntesis de ADN en ambas hebras. En eucariotas la replicación requiere de una enzima adicional llamada Polimerasa δ que se ha sugerido participa en la replicación del ADN indirectamente a través de la mediación de respuestas frente a daño en el ADN o en la transferencia incompleta de señales de replicación, ya que sus subunidades tienen un rol en los puntos de control (A. Sugino et al., 1995)

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Figura 9. Modelo del inicio de replicación eucariota con la ubicación hipotética de las diferentes enzimas que participan en el. (Toshiki et. Al, 1998)

Figura 10. Modelo de los cambios conformacionales de PCNA durante la síntesis del complejo que lleva la Pol N. Primero se da la unión de PCNA y el RFC (quien es el encargado de estabilizar la proteína con la ADN), una vez dado este paso se produce la abertura de PCNA, esto es lo hace a través del IDCL y con consumo de ATP. Por hidrolisis del ATP por RFC esta enzima cambia su afinida d hacia la Pol N, siendo este complejo quien sintetizara el Nuevo AND. De las funciones de FEN1 durante el procesamiento de las hebras de ADN, se especula que la pol N se vera desplazada de PCNA por FEN1 en esta etapa (paso 6). Al final de esta serie de reacciones de síntesis de ADN, PCNA será liberada del ADN (paso 7). En este paso se requiere nuevamente de la hidrolisis de ADN.

Este trabajo, el cual busca el aislamiento y caracterización de PCNA en platelmintos parásitos se centrara en el organismo modelo M. Corti, ya que permite estudios sobre proliferación celular durante la diferenciación y reproducción asexual in vitro. De aquí se extenderán los estudios a los organismos E. granulosus y F. hepática. 19

OBJETIVOS

Objetivo general El objetivo general de este trabajo es contribuir al estudio de los mecanismos moleculares del desarrollo de platelmintos parásitos. Dentro de ese marco proponemos profundizar particularmente en aspectos de la proliferación celular caracterizando las células proliferativas de platelmintos parásitos a través de la identificación y aislamiento de un marcador molecular exclusivo de estas

células

proliferantes.

Objetivo especifico Aislamiento y caracterización de un marcador molecular tipo PCNA, probable marcador específico de células proliferantes en platelmintos parásitos. Además se plantea el clonado en un vector de expresión y obtención de la proteína recombinante para el cDNA procedente de Echinococus granulosus.

Actividades específicas - Aislar genes tipo PCNA de E. granulosus, M. Corti y F. Hepática. - Clonación de fragmentos obtenidos por PCR en vectores procariotas. - Secuenciación y análisis de los plásmidos recombinantes. - Estudiar los niveles de expresión de la proteína utilizando anticuerpos anti-PCNA en diferentes etapas de sus ciclos de vida utilizando. - Clonar en un vector de expresión el ADNc aislado de E. Granulosus. - Expresión de la proteína recombinante EgPCNA de E. Granulosus. - Estudiar la localización de la proteína mediante ensayos de Inmuno-histoquimica.

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Estrategia Experimental Para cumplir con los objetivos antes presentados se diseñaron cebadores tanto específicos como degenerados según el organismo. Estos serán usados para realizar reacciones de PCR sobre ADNc y ADN genómico de los tres parásitos. Los fragmentos obtenidos serán clonados en vectores procariotas y se enviaran secuenciar al servicio de secuenciación del IP Montevideo. Para los estudios de expresión de la proteina se utilizara un anticuerpo monoclonal PC10 comercial el cual reconoce una región que se encuentra altamente conservada de la proteína PCNA de rata, por lo que se espera que reconozca también la de platelmintos parásitos en ensayos de western blot. Con el fin de estudiar la localización de la proteína se realizara una inmunohistoquímica para conocer la distribución de células que expresan la proteína PCNA. Se espera que la morfología de estas células y su distribución coincidan con las de las células marcadas con BrdU descriptas en (Koziol tesis maestría PEDECIA, 2009) Por otro lado se realizara una amplificación del gen de E granulosus, con la salvedad de que este nuevo juego de cebadores poseen adaptadores con sitios de corte para enzimas de restricción. El gen será clonado en un vector de expresión (Pet14b) y la proteína recombinante EgPCNA producida y purificada.

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Materiales Y Métodos

Diseño de cebadores específicos

Se utilizó el genoma de Echinococus multilocularis, organismo emparentado filogenéticamente con E. Granulosus esperando no existan grandes diferencias en las secuencias nuleotidicas del gen PCNA con el fin de diseñar un juego de primers específicos a ser utilizados en E. granulosus

Diseño de cebadores degenerados

Se alinearon secuencias correspondientes al gen PCNA de organismos filogenéticamente emparentados a modo de localizar las regiones en la secuencia más conservadas y lograr un diseño óptimo de cebadores. Las secuencias utilizadas se encuentran en la tabla (2). Estas últimas serán utilizadas para los genomas de Fasciola Hepática y Mesosestoides. Corti y Echinococus granulosus

Amplificación de genes tipo PCNA por reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Para la amplificación de los fragmentos de interés, partiendo de ADN genómico o de ADN copia de M. Corti, F, Hepática y E. granulosus, se realizó una mezcla donde se agregó 2.5 l de buffer 10X, 2mM de MgCl2, 0.4 mM de cada dNTP, 0.8M de cada cebador y 1.25 unidades de enzima Taq ADN polimerasa recombinante de Invitrogen. La reacción se realizó en un volumen final de 25 l. Las condiciones de amplificación se encuentran detalladas en la Tabla (1). La cantidad de muestra utilizada para ADN genómico y ADN copia fue de 100 ng. Los juegos de cebadores utilizados se detallan en la tabla 2.

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Tabla (1) - Condiciones del programa de amplificación primers específicos y degenerados programa 1 y 2 respectivamente

Programa 1 Tiempo Etapas Temp (ºC) Desnaturalización 94 5 min. inicial 45 seg. Desnaturalización 94 45 seg. Annealing 56 Extensión 72 1 min. Extensión final 72 10 min. Ciclos 35

Programa 2 Temp Tiempo (ºC) 94 5 min. 45 seg. 45 seg. 1 min. 10 min.

94 50 72 72 35

Tabla (2) - primers específicos y degenerados

Primer

Secuencia 5’- 3’

PCNAEmf PCNAEmr PCNAdf PCNAdr PCNAdf PCNAdr

GTTGCCGCAAGCCGATGT TCACGCCTCATCGTCCTC TTY GAR ACN TWY MGN TGY GAY TC RTC YTC DAT YTT NGG NGC FETY/FRCD LAPKIEDDE

Visualización de moléculas de ADN Se cargaron las muestras con buffer de carga 1X en un gel de Agarosa 1% o 2% en buffer TAE 1X (40mM Tris-Acetato, 10 mM EDTA pH 8), según el tamaño esperado de los fragmentos amplificados. Se dejó migrar en buffer TAE 1X, a aproximadamente 8 V/cm. El gel fue revelado con 0.5 ng/ml de Bromuro de Etidio y exposición a luz Uv en un transiluminador MacroVue UV-20 (Hofer) La comparación de los fragmentos con marcadores de pares de base conocido (figura 11) permite la estimación del tamaño y la concentración del los mismos.

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Figura (11) - Marcadores de peso molecular

Purificación de fragmentos de ADN

Para la purificación de fragmentos su utilizo el Kit QIAEX II Agarosa Gel Extraction Protocol, Qiagen, siguiendo las condiciones sugeridas por el fabricante.

Ligación en vector pGem T Easy, Promega El pGEM-T Easy (Figura 12) es un vector utilizado para la clonación de fragmentos, se encuentra linealizado y presenta en ambos extremos 3´ una timidina terminal. Esta timidina saliente en el sitio de inserción aumenta la eficiencia de la ligación, previniendo también la recircularización del vector y generando un extremo compatible con el producto de PCR generado por polimerasas termoestables. El producto de interés es ligado utilizando 0.5 l del vector (50 ng), 3.5l (200ng aproximado) de inserto, 5 l de tampón T4 ADN ligasa 2X y 1 l de T4 ADN Ligasa (3 l).

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Figura 12. Mapa restricción vector p-GEM T Easy

Transformación (Shock térmico) de los productos de ligación Se descongelaron células competentes, cepas de Escherichia coli preparadas con CaCl2, en hielo por 10 minutos. Se agregó el producto de la ligación y se deja incubar en hielo por 20 minutos. Se colocaron las células en baño a 42 ºC 90 segundos (shock térmico), luego se colocaron en hielo por 1-2 minutos. Se agrega 600 l de LB líquido termostatizado a 37 ºC, y se incubo con agitación durante 45-60 minutos. Se plaqueo con rastrillo en placa LB agar la cual contiene ampicilina 100 g/ml, 4 l de IPTG (2%) y 40l de X-Gal (20mg/ml). Obtención de ADN plasmídico Lisis Alcalina. Se realizó un precultivo en 3 ml de LB – ampicilina (100g/mL) a 37 ºC toda la noche. Se centrifugo a 13.000 rpm por 30 segundos y se descarto el medio de cultivo (2 veces). Se resuspendio el pellet en 200 l de Solución I (Tris –HCl 50 mM pH 8, EDTA 10 mM), con vortex, y se agregaron 10 l de RNAsa 1 mg/ml. Se agregó 200 l de Solución II (NaOH 200 mM, SDS 1 %), se mezcla por inversión y se incubo por 5 25

minutos a temperatura ambiente. Se agregaron 200 l de Solución III (Acetato de potasio 3 M pH 4.8) fría y se incubó 10 minutos en hielo. Se centrifugó 20 minutos a 12.000 rpm. El sobrenadante fue recuperado y se realizó un extracción con un volumen de Cloroformo - Isoamilico (24:1). Se centrifugo 5 minutos a 12.ooo rpm y se recuperó la fase acuosa. Luego se precipito el ADN con 400 l de isopropanol a temperatura ambiente durante 15-20 minutos. Se centrifugo nuevamente 20 minutos a 12.000rpm y se descarta el sobrenadante. Se lavo el precipitado con 500 l de EtOH 70%, y se centrifuga 5 minutos. El pellet se resuspendio en 30 l de agua miliQ.

Digestiones con enzimas de restricción Para verificar la presencia del inserto clonado en el vector p-GEM T se realizó la digestión con EcoRI (10U/μL) (Fermentas), liberando así el inserto. Se colocaron 500ng de plasmido, 2 μl de Buffer M 10X, 4 unidades de enzima en un volumen final de 20μl. Se incuba 2 horas a 37 ºC. Los clones que presentan un fragmento del tamaño esperado serán seleccionados para su secuenciación.

Secuenciación Se obtuvieron las secuencias en el servicio de secuenciación del Instituto Pasteur de Montevideo.

Análisis de Secuencias Las secuencias obtenidas fueron analizadas y corregidas manualmente en el programa informático CROMAS, versión 2.32 (Technelysium). Posteriormente son cargadas en el programa Gene Runner 3.05 (Hastings Software, Inc) para eliminar la secuencia correspondiente al vector utilizado para el clonado. Para poder determinar si existe homología de secuencia se realiza un Blast en el banco de datos de secuencias de aminoácidos y de nucleótidos (disponible en página de NCBI, http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/).

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RT con superscript II Ver detalles en el anexo I ANÁLISIS POR SDS-PAGE 15% Ver detalles en el anexo I Diseño de primers para la expresión de PCNA de Echinococus granulosus Se utilizó el mismo juego de primers específicos para E. Granulosus, con la salvedad de que estos poseen adaptadores con sitios de corte para enzimas de restricción, PstI y BamHI con el fin de poder ligar los productos de PCR a un vector de expresión y dar una orientación especifica. Se muestra un esquema del mapa del vector donde fueron ligados. Estos productos fueron trasformados en células E. Coli DE3

27 Figura 13. Mapa de Restricción vector pet14b

Expresión Proteína recombinante Protocolo para expresión de proteínas, ver anexo I. Inmunohistoquimica 1) Se desparafinan los cortes con 2 lavados de 5´ Xilol 2) Se rehidrataron con lavados en EtOH 100%, 75%, 50%, 25% (2´c/u), seguido por dos lavados en PBS de 5´. 3) Para exponer los epitopes al anticuerpo Anti-PCNA (PC-10 monoclonal), se dejó hervir 20 minutos en buffer citrato 10 mM pH 6.0 (HIER, heat-induced epitope retrieval). 4) Luego se agregó H2O2 3% en PBS, dejándose 10 minutos a temperatura ambiente, para inactivar la peroxidasa endógena. 5) Se lavó durante 5´ con PBS 6) Se bloqueó utilizando PBS + BSA 1% + 5% suero oveja SIGMA + 0.05 % Tween-20, durante 1 hora 7) Se incubo con primario (1:100 anti-PCNA) en PBS + BSA 1% a 4 º C overnight (cubrir con parafilm); controles solo con PBS + BSA 1%. 8) Se realizaron 4 Lavados de 15 min c/u en PBS 9) La incubación con Ac. secundario (para PCNA, 1:100 con anti-ratón-HRP) en PBS + BSA 1% se dejó durante 2 horas. 10) Posteriormente se realizaron 4 Lavados de 15 min c/u en PBS 11) Y se Incubó 2 minutos con Acetato de Sodio 50 mM pH 5.0 12) El revelado se realizó con aminoetilcarbazol (AEC) de Sigma.

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Resultados y discusión Alineamiento de secuencias para el diseño de primers

Primers específicos Se utilizó el genoma de Echinococus multilocularis, organismo emparentado filogenéticamente con E. Granulosus esperando no existan grandes diferencias en las secuencias nuleotidicas del gen PCNA con el fin de diseñar un juego de primers específicos a ser utilizados sobre cADN de E. granulosus. Esto ya ha sido utilizado con éxito para otros genes conservados (Britos L. et. Al, 2000)

Primers degenerados Se alinearon secuencias correspondientes al gen PCNA de organismos filogenéticamente emparentados a modo de localizar las regiones en las secuencias más conservadas y lograr un diseño óptimo de primers. Las secuencias a utilizar se encuentran en la tabla (2). Estas últimas serán utilizadas para los cADN de F. Hepática y M. Corti y E. granulosus

PCNA_Echinococus Multilocularis PCNAFw MFEARLPQADVWKKVIDAIKELVQEATIDCSDTGISLQAMDSAHVSLVSLLMRSDGFETFRCDRNMSLGLNIASAAKILRCAGSTDSIT LKAGDKADTITFLFESKNQEKVSEFELKLMDLDVDHLGIPETDYKCVIRMPASELQRICRDLGQIGDSVVITVAKDGVGFSSTGDLGSGK IKLSPSGNADKPEESISIEMSESLTMTYSLHYFNIFAKAAPLSSQVILSLTADVPAVVEFPIEDLGHIRYYLAPKIEDDEA& PCNARev Figura 14. Representación del gen PCNA de E. Multilocularis donde se marcan los primers específicos a ser utilizados en E. Granulosus, se espera obtener una banda de 760pb aproximadamente: En rojo se representan los AA correspondientes al extremo N-terminal y en azul los correspondientes al C-terminal.

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Figura 15. Alineamiento (Clustal X) PCNA: fila 1. Dugesia japónica d; 2 Dugesia japónica s; 3 Macrostomum lignano; 4. Opisthorchis viverrini; 5. Homo Sapien; 6. Drosophila melanogaster PCNA I; 7. Drosophila melanogaster PCNA II; 8 Arabidopsis thaliana PCNA I; 9 Arabidopsis thaliana PCNA II. Las líneas negras corresponden a las zonas de hibridación de los primers PCNAFdeg y PCNARdeg respectivamente.

Aislamiento de genes tipo PCNA Clonado de fragmentos de genes tipo PCNA Para la amplificación de la secuencia en E granulosus se utilizó el par de primers específicos PCNAFw y PCNARevm (de los cuales se espera amplificar un fragmento de 760pb aproximadamente). Para los DNAc de F. Hepatica y M. corti se utilizó el juego de primers degenerados (de los cuales se espera obtener un fragmento de 605pb.) los cuales se encuentran en la tabla 2.

700pb

Figura 16. Electroforesis en gel 1% en buffer Tae de amplificación de PCR utilizando primers específicos para Echinococus granulosus. Carril. 1. PCR primers específicos sobre molde de ADNc Echinococus granulosus 2. MPM. 30

En el electroforesis de la figura 16, se observa producto de amplificación de PCR donde fueron utilizados un juego de primers específicos sobre molde de ADNc de E. granulosus. El fragmento obtenido tiene un largo de entre 700pb y 800pb aproximadamente, lo cual concuerda con lo esperado ya que se esperaba un fragmento de 760pb.

700pb 600pb

Figura 17. Electroforesis en gel 1% en buffer TAE 1X de PCR utilizando primers degenerados para Mesocestoides Corti y Fasciola Hepática. En cada carril se utilizaron los siguientes moldes Carril 1 –ADN g Mc, carril 2- ADNg Fh, carril 3- ADN c Mc, carril 4 - ADNc Fh, carril 5- ADN c Eg, carril 6- MPM

En la Figura 17 es posible observar un fragmento de 600 pb aproximadamente para los carriles 3, 4, 5 (todos los ADNc), mientras que para los ADN genómicos es posible visualizar una banda de 700 pb aproximadamente. Esto concuerda con los tamaños esperados (605pb, para ADNc), y la diferencia que se aprecia entre los cADN y los gADN es debida a 100pb aproximadamente correspondientes a los intrones presentes en el gen. Ya amplificados los fragmentos para cada uno de los organismos, se procedió a la purificación de los mismos para su posterior ligación en el vector p-Gem T Easy. Una vez ligado, se transformó el plásmido en E. Coli, de donde se purifico y realizó una

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digestión del mismo con la enzima EcoRI, la cual escinde el inserto (para todos los casos) y además a partir de este genera dos productos, uno de 300pb y otro de 400pb aproximadamente (únicamente E. granulosus) de esta manera se puede inferir de forma preliminar acerca de si el fragmento amplificado corresponde al gen de PCNA.

Figura 18. Electroforesis en gel 1% en buffer TAE de las digestiones con enzimas restricción de clones conteniendo el plásmido con el gen amplificado de cADN de Echinococus granulosus. Carriles, 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11,12 digestiones de clones correspondientes a E. Granulosus. Los carriles 5 y 13, corresponden a controles con plásmidos sin inserto. Carriles 5, 11 MPM.

En lo que respecta a los resultados para los productos de los cortes con ER de E granulosus (Figura 18), se observan fragmentos en todos los carriles y sus tamaños concuerdan con lo esperado, ya que la enzima EcoRI no solo escinde el amplicon del vector sino que también genera (a partir del mismo) dos fragmentos, uno de 300pb y otro de 400pb aproximadamente (flechas). De estos clones posibles de contener el gen de interés se eligió uno para ser enviado a secuenciar al servicio de secuenciación del Instituto Pasteur de Montevideo.

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Figura 19. Electroforesis en gel 1% en buffer TAE 1X de las digestiones con enzimas restricción de clones conteniendo el plásmido con el gen amplificado de cADN de Mesocestoides Corti. Carriles, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 digestiones de clones correspondientes a Mesocestoides Corti, carriles 1,2 corresponden a controles negativos sin inserto. Carril 3 MPM.

En la Figura 19, es posible apreciar una banda del tamaño esperado (600pb aproximadamente) para los carriles 6, 7, 8, la cual correspondería al inserto ya escindido del plásmido. De estos clones posibles de contener el gen PCNA se seleccionó uno para ser enviado a secuenciar al servicio de secuenciación del Instituto Pasteur de Montevideo.

Figura 20. Electroforesis en gel 1% en buffer TAE 1X de las digestiones con enzimas restricción de clones conteniendo el plásmido con el gen amplificado de cADN de Fasciola Hepatica. Carriles, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, digestiones de clones correspondientes a Fasciola Hepatica. Carriles 7, 13 MPM.

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En la figura 20, al igual que lo visto para M. Corti se observan fragmentos producto de la digestión en los carriles 9,10,11 los cuales concuerdan con lo esperado, ya que se escindió un inserto de 600pb aproximadamente. De los clones posibles de contener el gen de interés se eligió uno para ser enviado a secuenciar al servicio de secuenciación del Instituto Pasteur de Montevideo.

Una vez obtenidas las secuencias del IP de Montevideo y verificada su naturaleza como correspondientes al gen PCNA (utilizando la herramienta bioinformática BLAST (Basic Local Serch Aligment Tool), http://www.ncbi.nhi.gov/BLAST/) se realizó un alineamiento de todas ellas y una ya descrita con el fin de poder establecer homologías e identidades en las secuencias, figura 21.

Análisis secuencia

Figura 21. Alineamiento (Clustal X) PCNA: fila 1. Echinococcus granulosus; fila 2 Mesocestoides Corti; fila 3 Fasciola Hepática; fila 4. Dujesia Japonica.; fila 5. Mus musculus; fila 6. Homo Sapien. En azul se representan los sitios conservados entre todas las especies, en verde los sitios conservados entre E. granulosus, M. Corti, F. Hepática y D. Japonica. La barra celeste muestra la región de reconocida por PC10 (anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente a PCNA)

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Las secuencias obtenidas fueron analizadas empleando el software Clustal X (Thompson JD et al, 1997), programa de alineamientos de múltiples secuencias.

Hasta ahora, para la caracterización de la proteína PCNA (Proliferating cell nuclear antigen) en Echinococcus granulosus se utilizó la secuencia nucleotídica de la misma en Echinococcus multilocularis para el diseño de primers específicos. Mediante el uso de la técnica PCR se obtuvo un fragmento de ADN del tamaño (pb) esperado, el cual (luego de purificado y clonado) fue enviado al Servicio de Secuenciación de Institut Pasteur, confirmando así su identidad como PCNA. Con el fin de verificar la existencia de dicha proteína en Mesocestoides Corti y Fasciola hepática

fueron

diseñados un pool de primers degenerados, con los cuales se logró amplificar el gen a partir de cADN. En pasos ulteriores se realizó un alineamiento con el fin de comparar dicha secuencia con otros organismos. De lo observado en la figura 21 se puede inferir que la secuencia aminoacidica de PCNA se encuentra muy conservada en organismos provenientes de linajes altamente divergentes, lo que habla de su importancia a nivel biológico ya que se ha visto prácticamente invariante a lo largo de la evolución (S. N. Naryzhny 2008) Estos resultados ciertamente contribuyen a la caracterización de PCNA en el estudio de platelmintos parásitos.

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Estudios de Expresión temporal Se estudió la expresión de la proteína utilizando anticuerpos anti-PCNA en diferentes etapas del ciclo de vida de M. Corti. Para esto, se utilizó un anticuerpo monoclonal comercial el cual reconoce una región conservada y lineal de la proteína PCNA de rata PC10, en ensayos de western blot. Se realizó un cultivo de M. Corti en donde para inducir el desarrollo estrobilar, se añadió al medio de cultivo tras dos días de cultivo (2d) Taurocolato de Sodio (T), esquema representado a continuación, de donde se extraen los parásitos del ratón, se colocan en medio de cultivo y se van extrayendo en paralelo tanto aquellos cuyo desarrollo estrobilar se vea inducido con taurocolato como los que no (-). Una vez hecho esto se obtuvo una muestra conteniendo la fracción total de proteína en el organismo según su estadio para así poder dar lugar al ensayo de Western Blot. 7d+T

9d+T

C

C

C

2d-

4d-

7d-

9d-

TC

TC

TC

TC

2d+T

4d+T

C

0d

Figura 22. Esquema ilustrativo del diseño del estudio para ver la expresión temporal de PCNA en M. Corti. Se representan los tetratiridios a los 0 días, y luego los estados más adultos a los 2d, 4d, 7d, y 9d con y sin taurocolato.

Figura 23. Western Blot de PCNA, controles negativos sin Anticuerpo 1º. Controles positivos con Hela. Arriba se muestran las diluciones de Ac. Utilizadas.

Figura 24. Western Blot de PCNA con el anticuerpo Monoclonal PC10. En c/carril se representa la muestra utilizada según el esquema superior.

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Los resultados muestran que este anticuerpo comercial es capaz de reconocer una proteína que por su masa molecular correspondería a PCNA. En cuanto a la expresión en los distintos tiempos del desarrollo, los resultados muestran un aumento en la expresión de PCNA en las primeras etapas del cultivo, al inicio de la inducción con taurocolato, seguido de un posterior decremento. Lo cual concuerda con lo que se esperaría ya que en etapas tempranas de su desarrollo el organismo se encuentra en plena actividad y recambio celular, esto acompasado de la formación de nuevas estructuras. Con lo que se espera un aumento de la replicación génica debido al gran número de células proliferantes, junto con una alta tasa de expresión de PCNA.

Estudios de expresión espacial Con el fin de estudiar la localización de la proteína, se realizó un ensayo de inmunohistoquimica utilizando el mismo anticuerpo monoclonal PC10 sobre cortes de M. Corti y cortes de tumores de piel humana como control positivo. a

b

Figura 25. a. Control positivo, muestra clínica de piel de humano con anticuerpo monoclonal PC10 de ratón b. anticuerpo monoclonal PC10, de ratón sobre cortes de M. Corti

Si bien en los estudios de expresión en el tiempo de desarrollo mediante estudios de western blot el anticuerpo funciono de manera correcta no fue posible 37

detectar ninguna señal dentro del organismo cuando fue utilizado para los experimentos de inmuno-histoquímica. La reacción se ve en el tegumento, lo que puede deberse a la presencia de anticuerpo de ratón unido. El ac. secundario utilizado es anti-ratón y la muestra de parásitos fue obtenida a partir de este animal, con lo que es probable que haya anticuerpos del mismo en el tegumento. Ante estos resultados para continuar los estudios de localización nos planteamos que el gen aislado de E. granulosus fuese clonado en un vector de expresión pet14b para obtener la proteína recombinante EgPCNA producida y purificada, lo que nos permitirá producir un anticuerpo policlonal especifico.

Expresión de la proteína recombinante PCNA de Echinococus granulosus

En el contexto de este estudio, la expresión de la proteína recombinante PCNA fue llevada a cabo en cepas de E. Coli Bl21 DE3 (star), el gen fue clonado en el vector Pet14b (previamente digerido con las correspondientes enzimas de restricción a modo de quedar en fase y no existan problemas de corrimiento de marco que puedan desplazar el sentido de lectura en la secuencia nuclotídica, ya secuenciado se continuo con el ensayo) y la expresión se indujo a diferentes temperaturas (30°C, 37°C) de donde se mostraran solamente los resultados para 37°C (ya que en ambas temperaturas fueron similares). Las muestras fueron estandarizadas mediante medidas de la Abs a 600nm con el fin de cargar la misma cantidad de proteína total por carril, para así poder tener datos comparables.

Figura 26. Expresion PCNA. Gel Poliacrilamida 15%., carriles 1, Pet/PCNA 1hr 30°C, 2 Pet 1hr 30°C , 3. Pet/PCNA 2hr 30°C, 4 Pet 2hr 30°C, 6 Pet/PCNA 1hr 37°C, 2 Pet 1hr 37°C , 3. Pet/PCNA 2hr 37°C, 4 Pet 2hr 37°C Se señala lo que se espera sea PCNA 38

De la figura 26 se puede observar una banda del tamaño esperado presente en los carriles correspondientes al vector con el inserto Pet/PCNA, no siendo así para el caso del vector solo, pudiendo de esta manera intuir preliminarmente que sea la proteína de interés. Para comprobar que dicha proteína corresponde a PCNA se realizó un ensayo de western blot (figura 27) con el anticuerpo monoclonal PC10 el cual como ya se mencionó reconoce una región altamente conservada y lineal de la proteína.

PCNA

Figura 27. Detección de expresión de PCNA por western blot. Fracción total carril 1. Control positivo Hela, 2. Pet/PCNA 1hr 30°C, 3 Pet/PCNA 2hrs 30°C, 4 Pet/PCNA 4hrs 30°C 5. Control negativo Pet. 6 Pet/PCNA 4hrs 37°C, 7. Pet/PCNA 2hrs 37°C. 8. Pet/PCNA 1hr 37°C. Se señala el no reconocimiento de banda por el Ac. En el control

Como se puede apreciar en la figura 27 la banda correspondiente a PCNA es reconocida por el Ac, no siendo así para el control sin inserto, con lo que concluiríamos que la expresión tuvo éxito y la rPCNA se encuentra lista para ser purificada, pero sin antes comprobar el carácter de su solubilidad. Ya que el hecho de encontrarse en condiciones de insolubilidad dificultaría su purificación.

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PCNA

Figura 28. Gel Poliacrilamida 15%. Expression PCNA Soluble (Sol) vs insoluble (Insol) carriles 1. Pet/PCNA Insol 2. Pet/PCNA Sol 3. Pet/PCNA Insol 4. Pet/PCNA Sol 5. Pet/PCNA Insol 6. Pet/PCNA Sol 7. Pet/PCNA Insol 8. Pet/PCNA Sol 9. Pet/PCNA Sol 10. Pet/PCNA Sol 11. Pet/PCNA Insol 12. Pet/PCNA Sol 13. Pet/PCNA Sol 14. Pet/PCNA Insol 15 MPM . se señala PCNA.

Por este motivo se realizó un gel con las diferentes fracciones para comprobar en cual se encuentra la proteína. Del resultado de la figura 28, es posible concluir que rPCNA fue expresada pero fue registrada en la fracción insoluble, y como ya se mencionó anteriormente esto podría presentar complicaciones a la hora su purificación. Uno de los posibles factores causantes de esta precipitación puede atribuirse a la falta de los primeros cinco aminoácidos en el gen, estos serían de gran importancia para el correcto plegamiento de la proteína ya que algunos autores han descrito que la presencia de estos aminoácidos es importante para la solubilidad de la proteína.

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Conclusión y perspectivas En este trabajo hemos aislado fragmentos de ADNc de genes PCNA de los tres organismos parásitos E. granulosus, M. Corti F. hepática. En concordancia con lo ya estudiado se comprobó que PCNA se encuentra altamente conservada en clados altamente divergentes (S. N. Naryzhny, 2008), ya que sus secuencias muestran un alto porcentaje de identidad. Ciertamente estos estudios son de relevancia ya que hacen a la caracterización del gen en estos Platelmintos Parásitos cuyos genomas no están disponibles. Por otro lado es una importante contribución al estudio y caracterización de células proliferantes ya que este gen se ha mostrado como un marcador molecular de estas. Se ha confirmado la utilidad del anticuerpo monoclonal comercial PC10 para reconocer la proteína en ensayos de western blot tanto a nivel de extracto celular proveniente del organismo en si, como en ensayos de expresión. De aquí es posible concluir que existe un claro aumento en la expresión de PCNA en etapas tempranas del desarrollo del organismo pudiéndose deber a la gran actividad celular presente y necesaria para la formación de nuevas estructuras, recambio celular y desarrollo en si del organismo. Esto puede resultar de particular relevancia ya que arroja datos sobre los estadios donde la expresión de la misma es máxima. Aunque sería importante diseñar un ensayo de Western Blot cuantitativo donde se utilice como control una proteína cuya expresión permanezca constante con el tiempo. Sin embargo, no fue posible detectar ninguna señal cuando este Anticuerpo fue usado para experimentos de inmuno-histoquímica pudiéndose deber esto a la poca permeabilidad del tegumento y/o a la necesidad de generar variantes en los protocolos para este tipo de organismo. La reacción se ve en el tegumento, lo que puede deberse a la presencia de anticuerpo de ratón unido. El Ac. secundario utilizado es anti-ratón y la muestra de parásitos fue obtenida a partir de este animal, con lo que es altamente probable que haya anticuerpos del mismo en el tegumento. Los resultados anteriores llevaron a que el gen aislado de E.g fuese clonado en un vector de expresión pet14b para obtener la proteína recombinante EgPCNA producida y purificada, lo que nos permitirá producir un anticuerpo policlonal especifico.

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Como se vio en los resultados la proteína pudo ser expresada, pero en forma insoluble lo que dificulta su purificación, esto pudo deberse a que se omitieron los primeros Aminoácidos de la secuencia cuando se realizó el diseño de los primers, estos serían de gran importancia para su plegamiento. Nuevos oligos estas siendo sintetizados para así poder repetir el ensayo de expresión de la proteína recombinante PCNA con la salvedad de agregar esas bases faltantes en el extremo 5´. Los ensayos de hibridación in situ para los genes aislados están en proceso y junto a estudios de expresión temporal y espacial tanto a nivel de proteína con el anticuerpo especifico así como en el ARNm y la comparación de estos resultados con los obtenidos por Koziol y col., para células proliferativas, nos permitirán concluir si PCNA es válido o no como un marcador molecular especifico de “neoblastos”.

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48

Anexo I ANÁLISIS POR SDS-PAGE 15% 1) PREPARACIÓN DE LOS GELES a) Se arma la cuba de electroforesis de proteínas, de manera tal que el espesor del gel sea de 1,0-1.5 mm) b) Se prepara la solución del Gel Separador (15 %) i) Se mezclan: 

7.5 mL de solución acrilamida 30%/bisacrilamida 0.8%,



3.75 mL de Buffer 4X Tris-HCl/SDS pH 8.8



3.75 mL de Agua mQ



50 L de PSA 10% (o 55.6L de PAS 9%)



10 L de TEMED

ii) Con una pipeta pasteur transferir la solución al molde. Se llena hasta los 2/3 del alto del molde c) Se debe cubrir la superficie del gel añadiendo isopropanol (aproximadamente 100 L). d) Se deja polimerizar (aproximadamente 30 min) e) Una vez polimerizado se remueve el isopropanol y se lava con agua destilada. Se debe absorber con papel whatmman los posibles restos de agua del lavado con isopropanol f) Preparar la solución de Gel Concentrador i) Mezclar: 

650 L de solución acrilamida 30%/bisacrilamida 0.8%,



1.25 mL de Buffer 4X Tris-HCl/SDS pH 6.8



3.05 mL de Agua mQ



25 L de PSA 10% (o 27.8 L de PAS 9%)



5 L de TEMED

ii) Se transfiere la solución al molde. Se debe llena hasta el borde superior del molde g) Se coloca el peine y agrega más gel concentrador para rellenar los espacios que queden. 49

h) Se dejar polimerizar (aproximadamente 30-45 min) i) Una vez polimerizado se retira el peine. j) Se colocar el buffer de corrida (SDS electroforesis buffer 1X) hasta arriba del todo en la cámara superior, y hasta que cubra el electrodo en la cámara inferior

2) PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS a) Se descongelan las muestras guardadas a -20ºC b) Incubar 5 minutos a 100ºC para desnaturalizar las proteínas c) Se cargar las proteínas en el gel. El volumen a cargar se deduce del cuadro de las tablas

3) CORRIDA a) Se conecta la cuba a la fuente, se pone la corriente al máximo y se pone el voltaje a 60 V. Luego de 15 minutos (observamos si las muestras ya migraron por el gel de stacking) se sube el voltaje a 80 V como mínimo. Se puede subir a 100 V o 120 V. b) Una vez finalizada la corrida, se tira todo el buffer de corrida, se sacan los vidrios y con una regla o algo, se separan los vidrios. 4) TINCIÓN a) Se toma el gel con la mano, y se pone en un tapper con Azul de Commasie. Se deja tiñiendo Overnight. b) Luego se saca todo el Azul de Coomasie, y se le agrega decolorante varias veces.

WESTERN BLOT 1) Electroforesis y Transferencia Se corre un gel SDS-PAGE en buffer Tris Glicina (Ver protocolo SDS-PAGE) Buffer de Transferencia (para 500mL): Tris Base, 1.51g Glicina , 7.21g 50

Agua, c.s.p. 100mL Se agregan 100mL de Etanol y 300mL de agua. Se debe guardar en heladera. Cortar 6 papeles watman del tamaño del gel y 1 membrana (HibondC) y se sumerge la membrana y el gel 5 minutos en buffer de transferencia. Sobre un vidrio limpio colocar 3 hojas de papel watman, la membrana y el gel. Realizar un corte en el gel y la membrana para identificarlo. Colocar las 3 hojas watman restantes. Pasar una varilla de vidrio para quitar las burbujas de aire. Colocar el “sándwich” en el dispositivo, de forma tal que el lado negro quede el gel y del lado rojo la membrana. (rojo: ánodo (carga positiva); negro: cátodo (carga negativa)) Se coloca el dispositivo de transferencia en la cuba. Llenar de buffer de transferencia y realizar la transferencia en la heladera a 200mA durante 2 horas. Una Bloqueo TBST 1M Tris-HCl pH 7.5

10mL

NaCl 5M

30mL

Agua c.s.p.

1L

Agregar Tween 20 al 0.1% Solución de bloqueo: 3%BSA, 2% Glicina en TBST Se sumerge la membrana en solución de bloqueo. Incubar ON a 4ºC o 2horas a Temp ambiente con agitación

2) Incubación con Anticuerpos Se prepara la dilución apropiada de Anticuerpo primario en solución de bloqueo. Sobre un vidrio limpio colocar un parafilm de tamaño mayor que la membrana. Humedecerlo por debajo para pegarlo al vidrio. Colocar la membrana centrada sobre el parafilm y colocar encima el anticuerpo primario. Cubrirlo con una tapa que no toque el líquido. Incubar 2 horas a temperatura ambiente, sin agitación Realizar 6 lavados de 5 minutos con abundante TBST 51

Realizar el mismo procedimiento con el anticuerpo secundario. Incubarlo 1 hora a temperatura ambiente. Realizar 12 lavados.

3) Revelado (Quimioluminiscente) Se armar el mismo dispositivo con el parafilm sobre el vidrio. Mezclar 1 parte de reactivo de revelado con una parte de buffer de revelado. Cubrir la membrana con esta solución e incubar 5 minutos a temperatura ambiente. Colocar la membrana entre dos nylon, de modo que no se moje la placa fotográfica En el cuarto de revelado, distribuir los recipientes para las soluciones (1: Revelador; 2: Agua destilada; 3: Fijador). Cortar un trozo de placa fotográfica del tamaño de la membrana. Colocar la membrana dentro del cassette y colocar encima la placa, sin moverla. Exponer el tiempo necesario. Quitar la placa y sumergirla en reveladora hasta que se vea señal. Enjuagar en agua destilada y sumergir en la solución fijadora por 5 minutos. Enjuagar con agua destilada y dejar secar.

PROTOCOLO PARA EXPRESAR PROTEÍNAS DÍA 1 PREPARACIÓN DE LA INDUCCIÓN 1) Inocular una colonia aislada en 3 mL de LB-Ampi (100 g/mL). Realizar varios tubos por si alguno no crece o crece poco… 2) Incubar a 37ºC con agitación ON.

DÍA 2 INDUCCIÓN Y PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS 1) INDUCCIÓN a) Medir la DO600 del precultivo. b) Agregar a los tubos o matraces Ampicilina (Cf:100 µg/mL). Inocular con un volumen de precultivo de modo que se obtenga uno Dilución 1/100. De acuerdo a la DO medida estimar la DOinicial. (para estimar cuanto demorarán en crecer) c) Incubar a 37ºC con agitación. d) Mientras crecen preparar IPTG fresco para inducir. 52

e) Tomar uno de los tubos para medir DO 600 cada 1 hora. (Realizarlo mezclando para asegurarse que sea una suspensión homogénea). Descartar el tubo f) Cuando DO600 = 0.6 tomar un tubo (anotar la DO en el cuadro) para procesarlo como FRACCIÓN NO INDUCIDA. g) Agregar IPTG de manera tal que la concentración final sea 1mM (Realizarlo en condiciones estériles) h) Incubar a la temperatura elegida para la inducción, con agitación. Tomar tubos cada una hora para procesar distintos tiempos de inducción.

2) PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS (manual pET, protocolo de Beton) 3) Para cada uno de los tubos repetir el procedimiento a continuación (NI, 1h IND, 2h IND… etc) a) Mezclar el cultivo proveniente de 2 tubos. Tomar una alícuota de 1.5 mL y medir DO600. Anotarla en el cuadro (puede ser necesario tener que diluir la alícuota con el mismo medio utilizado para crecer). Procesar el resto del cultivo b) Tomar 1mL del cultivo y centrifugar a 10 000g por 1 minuto para bajar las células. Realizarlo por duplicado (1 para FT y FM y otro para FS y FI) c) Transferir el sobrenadante de uno de los tubos a un tubo limpio. Medir el volumen. Descartar el sobrenadante del otro tubo d) Secar bien el pellet (secando sobre toalla de papel absorbente) e) FRACCIÓN TOTAL (FT) i)

Resuspender el pellet de células en 100L de Tris-HCl 30mM pH 7.5. (Esto da un factor de concentración 10X)

ii)

Agregar 100L de 4X Sample Buffer.

iii)

Alternativa: Se puede preparar una mezcla de 1 volumen de Tris-HCl 60mM con 1 volumen de 4X SB. Resuspender el pellet de células en 200L de esta preparación.

iv)

Guardar a -20ºC hasta el análisis por SDS-PAGE

f) FRACCIÓN MEDIO (FM) (concentración del medio por precipitación con TCA) i)

Agregar 1/20 volumen de TCA 100% al sobrenadante obtenido en 2.b

ii)

Vortexear por 15 segundos

iii)

Incubar a -20ºC ON 53

iv)

Centrifugar a 14 000g por 10 minutos

v)

Remover y descartar el sobrenadante.

vi)

Lavar el pellet dos veces con 100L de acetona. Para esto agregar la acetona, mezclar y centrifugar por 5 minutos a 14000g; remover la acetona del pellet (suelto) y dejar secar al aire por aproximadamente 60 minutos

vii)

Agregar 100L de Tris-HCl 30mM pH 7.5. (Esto da un factor de concentración 10X)

viii)

Agregar 100L de 4X Sample Buffer.

ix)

Alternativa: Se puede preparar una mezcla de 1 volumen de Tris-HCl 60mM con 1 volumen de 4X SB. Resuspender el pellet de células en 200L de esta preparación.

x) Resuspender vigorosamente con vortex xi)

Guardar a -20ºC hasta el análisis por SDS-PAGE

g) FRACCIÓN SOLUBLE (FS) i) Congelar el sedimento de células obtenido en el paso c). ii) Descongelar las células completamente y resuspender en 100µL de buffer de lisis (50mM Tris-HCl o NaH2PO4, 5% glicerol, 50mM NaCl, pH 7-8). Vortexear a temperatura ambiente o pipetear arriba y abajo. iii) Agregar 250µg/mL de lisozima preparada fresca (stock 2 mg/mL) iv) Incubar la suspensión celular por 30 minutos en hielo. v) Sonicar en hielo al 100% de amplitud. Realizar 3 ciclos de 20 segundos con un descanso de 1 minuto. vi) Remover los restos celulares insolubles por centrifugación a 4º C por 20 minutos a 16000g. Guardar el sedimento en hielo para utilizar en la preparación de la fracción insoluble. vii) Transferir el sobrenadante a un tubo limpio. Mezclar con 100µL de 4X SB. viii) Guardar a -20ºC hasta el análisis por SDS-PAGE.

h) FRACCIÓN INSOLUBLE (FI) i) Lavar el sedimento insoluble obtenido en el paso 4 de la sección anterior con 750µL de 20mM Tris-HCl pH 7.5. Centrifugar a 10000g por 5 minutos, remover el sobrenadante y repetir el paso de lavado 54

ii) Resuspender el sedimento final en 100µL de 1% SDS calentando y vortexeando o por sonicación si es necesario. De esta forma se obtiene un factor de concentración 10X. M. Mezclar con 100µL de 4X SB. Calentar inmediatamente por 3 minutos a 85º C para desnaturalizar las proteínas. Guardar a -20º C hasta el análisis por SDS-PAGE.

DÍA 3 ANÁLISIS POR SDS-PAGE 15% y cálculo de volúmenes a cargar [1] Factor de concentración: FC=Volumen de cultivo original usado para producir la fracción Volumen final de la fracción [2] Factor de dilución usado para medir OD 600 de la alícuota de cultivo [3] OD600 de la dilución [4] OD600 total = FD x OD600 dil [5] Z= FC x OD600 tot

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RT con superscript II 1-Agregar : -1ul de oligo dT - 50-250ng de RNA total ( generalmente agrego 10ul de muestra, se resuspende la extracción en 12 ul , uso 2 para correr en gel y el resto en la RT ) - 1ul de dNTPs - agua csp 12ul

2- Calentar a 65ºC por 5 min, e incubar en hielo 1 min

3- Agregar al tubo -

4ul de 5X First Strand buffer

-

2ul de DTT (aca es en lo unico que cambia )

-

1ul de RNasa OUT

Mezclar 4- Incubar a 42ºC por 30-60 minutos 5-Inactivar la enzima por calor, calentar por 15 min a 70ºC.

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