UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR ÁREA DE CONOCIMIENTOS EN CIENCIAS DEL MAR DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA MARINA

Tesis de Licenciatura “Efecto in vitro del β-caroteno natural obtenido a partir de Dunaliella salina (Chlorophyta) sobre la línea celular de cáncer MDA-MB-231”

QUE COMO REQUISITO PARA OBTENER EL Título de Biólogo Marino

PRESENTA: Ilhui Rocío Gómez Pacheco

DIRECTOR: Jorge Olmos Soto

LA PAZ, BAJA CALIFORNIA SUR, AGOSTO DE 2013

Dedicatoria

A

Mi mamá Que nunca deja de sorprenderme con lo maravillosa que es.

Abuelita Lupita Que siempre cuido y amó a todos. Te llevo siempre conmigo.

Mi abuela Toña, El amor de mis amores. Gracias por estar siempre a mi lado.

Javier y Andrés, El regalo más bonito que tuve por mis padres. Los adoro.

A mi tía Laura Lilían, Porque las batallas más grandes, solo se pueden ganar con amor a la vida.

A mis tías María Elena e Ilhui, Por inspirarme siempre a seguir estudiando.

Mi papá, Y mis abuelos Sergio y Carlos Por todo su cariño.

Agradecimientos académicos

Al Dr. Jorge Olmos Soto por la dirección de esta tesis y por el apoyo brindado; pero sobre todo, por aceptarme y darme la oportunidad de

aprender cosas

nuevas.

A la M.C. Rosalía Contreras Flores técnico del laboratorio, durante el cultivo de Dunaliella salina y en toda mi estancia como estudiante del laboratorio. Gracias nuevamente. A la M.C. Silvia Viviana Pitones Rubios, por su enorme ayuda técnica y asesoría durante la fase de cultivo celular, en la elaboración de los ensayos y por la bibliografía compartida. Muchas gracias sin tu ayuda no podría haber realizado esta tesis.

Al M.C. Eduardo Morales Guerrero por toda su asesoría y ayuda brindada al realizar los análisis por HPLC.

Al M.C. Viktor Iván Rodríguez Abdalá, por su ayuda en el lenguaje de programación R.

Al Dr. Jose Luis Ortiz Galindo y al Dr. Noé Díaz Viloria, por la extensa revisión de la tesis. Mil gracias por todo.

Al comité revisor tesis: Dr. Sergio Flores Ramírez, M.C. Marco Antonio Medina López, al Dr. Noé Díaz Viloria y al Dr. Carlos Sánchez Ortiz.

A Beti y al Dr. Alejandro Gómez por su ayuda en los trámites administrativos. A la UABCS y al CICESE.

Agradecimientos personales A mi mamá, por todo su amor y todo el tiempo que me ha dedicado desde el día en que nací. Muchas gracias por estar siempre a mi lado, en las buenas y en las malas, por regañarme siempre que lo necesité, Por enseñarme todo cuanto sé.

A Silvia Viviana Pitones, por tu amistad, tu tiempo, tu compañía y gran ayuda no solo académica sino personal. Siempre estaré en deuda contigo, eres una persona muy especial y valiosa. Gracias por todo.

A José Luis Ortiz Galindo, muchas gracias tío por todo el cariño, tiempo y apoyo, que me has dado siempre, por ser parte de nuestra familia.

A mi tía María Elena Gómez Rojo, muchas gracias por todo tu cariño, apoyo y ánimos. Te quiero mucho madrina.

A toda mi hermosa familia que siempre me ha apoyado desde lejos.

A las familias Norzagaray-Navarro y Silva-Cruz por ser como mi familia.

A Laura Camacho, muchas gracias por animarme a hacer la tesis en ensenada; y por tu gran amistad. Te quiero mucho.

A Magaly Gómez, Malissa Fragoso, Angelina Lazcano, Betsabé Luna, Diana Zaleta, Mirelle Dávila, Rocío González, Casandra Gálvez, Marcela Valdovinos, Christian por su amistad.

A Iván Rodríguez, muchas gracias por estar a mi lado.

Índice

Lista de figuras

i

Lista de cuadros

iiI

Lista de anexos

iii

Glosario

iv

Resumen

vi

1. Introducción

1

2. Antecedentes

2

2.1. Los carotenoides

2

2.2. Dunaliella salina

5

2.3. Desarrollo del cáncer

8

3. Justificación

12

4. Hipótesis

12

5. Objetivo general

13

5.1. Objetivos particulares

13

6. Materiales y Métodos

14

7. Resultados

20

7.1 Cultivo de Dunaliella salina

20

7.2 β-Caroteno

21

7.3 Curva de crecimiento

26

7.4 Ensayo de viabilidad celular con β-caroteno

26

8. Discusión

30

9. Conclusiones

34

10. Recomendaciones

35

11. Bibliografía

36

12. Anexos

41

Lista de figuras

Figura 1

Molécula de β-caroteno.

Figura 2

Dunaliella salina. Contraste de fases con fluorescencia, objetivo

Figura 3

5

100X.

5

Línea celular MDA-MB-231. Microscopio de Contraste de fases, objetivo 10X.

Figura 4.

10

Línea celuar HaCat. Microscopio de Contraste de fases, objetivo de 10X.

Figura 5.

11

Curva de crecimiento poblacional del cultivo de Dunaliella

salina

hasta

alcanzar

la

fase

estacionaria. Figura 6

20

Cromatogramas obtenidos por HPLC a una longitud de onda de 450 nm.

Figura 7

22

Cromatogramas sobrepuestos del estándar y el extracto natural de D. salina.

Figura 8

23

Curva de calibración por HPLC para estimar la concentración de β-caroteno en el

extracto

natural. Figura 9

Resultados del ensayo de viabilidad celular realizado con β-caroteno sobre MDA-MB-231.

Figura 10

29

Variación dentro del tratamiento de 2h con βcaroteno en la línea celular MDA-MB-231

Figura 12

29

Resultados del ensayo de viabilidad celular realizado con β-caroteno sobre HaCat.

Figura 11

25

51

Variación dentro de grupos con el tratamiento de 2h con β-caroteno.

52

i

Figura 13

Variación dentro del tratamiento de 24h con βcaroteno en la línea celular MDA-MB-231.

Figura 14

54

Variación dentro del tratamiento de 24h con βcaroteno en la línea celular MDA-MB-231:

54

1)Células con BS, 2) Células con BN. Figura 15

Variación dentro del tratamiento de 24h con βcaroteno en la línea celular HaCat: 1)Células

55

HaCat con BS, 2)Células HaCat con BN. Figura 16

Variación entre grupos con el tratamiento de 24h con β-caroteno. Células MDA-MB-231 con BS, 2) Células MDA-MB-231 con BN, 3)Células HaCat con BS, 4) Células HaCat con BN.

56

List

a de cuadros

ii

Lista de cuadros

Cuadro I

Incrementos en la concentración de NaCl realizados en el cultivo L.

15

Cuadro II

Esquema general del ensayo con β-caroteno.

18

Cuadro III

Mediciones de absorbancia obtenidas en el cromatógrafo HPLC al analizar el estándar sintético de trans β-caroteno y el extracto natural de D. salina.

24

Lista de Anexos

Anexo I

Cultivo de D. salina.

41

Anexo II

Soluciones y medios empleados para el cultivo de las líneas celulares.

46

Anexo III

Ensayo con β-caroteno.

48

Anexo IV

Ensayo colorimétrico de MTT.

50

Anexo V

Resultados programa R.

del

ANOVA

realizado

con

el 51

iii

Glosario

Adenocarcinoma: Cáncer que empieza en las células glandulares. Las células glandulares se encuentran en el tejido que reviste algunos órganos internos y que producen y liberan sustancias en el cuerpo. La mayoría de los cánceres de mama, páncreas, pulmón, próstata y colon son adenocarcinomas (INC, 2013).

Antioxidante: Es una molécula capaz de retardar o prevenir la oxidación (pérdida de electrones) de otra molécula, sin llegar a perder su estabilidad (Holum, 1999).

Pro-oxidante: Es una molécula capaz de reducir a otra molécula (Holum, 1999).

Medio suplementado: Medio que ha sido complementado o enriquecido con suero fetal bovino; y que por ello cuenta con los nutrientes, cofactores y hormonas de crecimiento necesarios para el mantenimiento de un cultivo celular (Pitones-Rubio y Olmos-Soto, 2010).

Confluencia: La cantidad de células que crecen sobre la superficie de una caja o placa de cultivo; esta generalmente se expresa en porcentajes (Langdon, 2004).

Cultivo primario: El cultivo iniciado a partir de células, tejidos u órganos tomados directamente de un organismo (Langdon, 2004).

Pase: Consiste en tomar una fracción de células a partir de un cultivo establecido para colocarlas en una nueva placa o caja que cuenta con el medio y los nutrientes necesarios para poder iniciar un nuevo sub-cultivo celular (Langdon, 2004).

iv

Línea celular continua: Son células de un tipo único (humano, animal o vegetal), que han sido sub-cultivadas a partir de un cultivo primario del cual derivan. Estas células tienen alteraciones genéticas que les dan la capacidad de proliferar indefinidamente si se les brindan las condiciones ambientales y los nutrientes esenciales para su mantenimiento (Langdon, 2004).

v

Resumen

Dunaliella salina es una microalga Cholorophyta produce de forma natural grandes cantidades de β-caroteno. En humanos se ha observado que esta molécula tiene distintas funciones biológicas como estabilizador de membrana, antioxidante y precursor de la vitamina A; además puede actuar como quimio-protector y anticancerígeno. Por ello el objetivo de este trabajo fue demostrar si el β-caroteno tiene un efecto in vitro sobre la supervivencia de la línea celular para cáncer de mama MDA-MB-231. Para ello se realizó un ensayo en el que se aplicaron dos tratamientos de 6 µg/µl de β-caroteno, cada uno con dos condiciones de incubación con distintas duraciones de tiempo (2 y 24 horas). Los tratamientos consistieron en un extracto natural obtenido a partir de D. salina y en trans βcaroteno sintético. Ambos tratamientos disminuyeron significativamente la supervivencia de las células de MDA-MB-231; sin embargo el efecto se vio potenciado cuando se aplicó β-caroteno de origen natural. El mayor efecto se observó con un tiempo de incubación de 2 horas, en el cual la supervivencia de las células de MDA-MB-231 fue de un 27.9 %.

vi

1 Introducción En los océanos del mundo habita una gran diversidad de microorganismos conformada

por

bacterias,

virus,

hongos,

protozoarios

y

algas.

Estos

microorganismos producen en conjunto, un reservorio natural de sustancias bioactivas, que son producto de su metabolismo primario y secundario. Estas sustancias son muy novedosas, ya que tienen amplias aplicaciones en la industria y en las ciencias de la salud (Ireland et al., 1993; Paniagua-Michel, 2009).

Entre estos microorganismos se encuentra Dunaliella salina, una microalga Chlorophyta que es uno de los eukariotas más extremófilos que se conoce y que bajo condiciones de estrés salino, alta irradianza y falta de nutrientes, produce grandes cantidades de β-caroteno, para proteger la clorofila a y el DNA nuclear (Ben-Amotz et al., 1987; Borowitzka, 1990; Olmos-Soto et al., 2002; Ben-Amotz et al., 2009). El β-caroteno es una molécula que presenta una fuerte actividad antioxidante, capaz de captar y destruir los radicales producidos por la quimioterapia durante el tratamiento del cáncer. Por esta razón, se le atribuye la propiedad de agente quimio-preventivo y anticancerígeno (Bendich y Olson, 1989; Lamson y Brignall, 1999). A este caroteno, también se le ha atribuido la capacidad de detener el proceso de metástasis en algunas clases de cáncer, como lo son: el de piel, boca y pulmón (Venugopal, 2009). Sin embargo, en lo que concierne a la aparición de este último tipo de cáncer, hay estudios que consideran que el consumo del βcaroteno junto con el tabaco y el alcohol es un factor de riesgo (Leo y Lieber, 1999).

En México el tipo de cáncer más común en mujeres mayores de 20 años es el carcinoma de mama (CaMa) (INEGI, 2013). Debido a lo anterior, en este trabajo

1

se busca probar si el β-caroteno producido por D. salina, al que ya se le han atribuido actividades anticancerígenas (Borowitska, 1990; Ben-Amotz, 2009; Venugopal, 2009); presenta un efecto in vitro sobre una línea celular de cáncer de mama.

2 Antecedentes

2. 1 Los carotenoides Los carotenoides son una familia de pigmentos de color amarillo- naranja o rojo que proveen de un intenso color a muchas especies de organismos (Asker et al., 2012). Estos pigmentos son los más ampliamente distribuidos en la naturaleza, ya que se les encuentra en las plantas, las bacterias, las algas, los hongos y los animales; sin importar si se trata de especies marinas, terrestres o de agua dulce (Mínguez-Mosquera et al., 2008; Venugopal, 2009). Hasta la fecha se han descubierto más de 700 carotenos distintos en la naturaleza (Asker et al., 2012), entre ellos el β-caroteno.

2. 1. 1 Función biológica En los organismos fotosintéticos los carotenoides sirven como pigmentos accesorios, ayudando a absorber la luz y transfiriendo la energía a la clorofila (Asker et al., 2012). Otra función de los carotenoides en organismos fototróficos y no-fototróficos, es la de proteger a las células contra daños en el núcleo causados por la producción de radicales libres, y que puedan originar mutaciones u otras alteraciones genéticas (Bendich y Olson, 1989).

En los miembros del reino animal incluyendo a los humanos, vacas, aves, peces y algunos crustáceos, los carotenoides no pueden ser sintetizados y tienen que ser

2

adquiridos en la dieta. Algunas de sus principales funciones son: Actuar como un precursores de la Vitamina A en todas sus formas activas (retinol, retinal y ácido retinoico) (Holum, 1999; Venugocopal, 2009; Asker et al., 2012), como antioxidantes y pro-oxidantes (Krinsky, 1988; Bendich y Olson, 1989).

Además, en los seres humanos los carotenoides son constituyentes normales de la sangre y algunos tejidos. Así, en el cuerpo de una persona bien nutrida la cantidad total de carotenoides varía de 100-150 mg. De ese total el 1% está presente en el suero sanguíneo, el 80-85% en el tejido adiposo, el 8-12% en el hígado (8-12%) y el 2-3% en los músculos. Los carotenoides que se encuentran en mayor cantidad en el suero humano son el β-caroteno, el α-caroteno, la cryptoxantina, el licopeno y la luteína de los cuales el β-caroteno es el más abundante (15 al 30%) (Bendich y Olson, 1989).

2. 1. 2 Uso de los carotenoides en la industria y ciencias de la salud Los carotenoides se emplean en la elaboración de alimento para aves de corral, para organismos cultivados por acuacultura y como colorante en la manufactura de alimentos para humanos (Venugopal, 2009). También se emplean como complemento nutricional y fuente de provitamina-A, de las cuales el β-caroteno tiene la mayor actividad. También se les emplea como aditivo en cosméticos (Holum, 1999).

En ciencias de la salud hay estudios que muestran que en humanos, los carotenoides reducen los niveles de colesterol, homocisteína, agregación plaquetaria y presión sanguínea, teniendo una función cardio-protectora debido a su alta actividad antioxidante. Hay evidencia que indica, que también ayudan a prevenir la aparición de úlceras gástricas, combatir enfermedades neurodegenetarivas, a la activación de las células T del sistema inmune, y que protegen

3

a las células-β de la presencia de radicales libres en pacientes con diabetes mellitus (Holum, 1999; Herchberg, 2005; Mínguez-Mosquera et al., 2008; Venugopal, 2009).

En relación al cáncer existen estudios epidemiológicos y oncológicos, en los que se muestra que algunos carotenoides como la Aztaxantina, el Lycopeno y el βcaroteno

tienen

una

actividad

anticancerígena,

ya

sea

como

agentes

quimiopreventivos contra el desarrollo del cáncer de piel, boca, pulmón y seno, como inhibidores del proceso de metástasis en casos de cáncer de hígado (Dimitrov et al., 1988; Mínguez-Mosquera et al., 2008; Emeish, 2012). Además, se ha observado que la administración de β-caroteno de origen natural potencia el efecto de la quimioterapia y la radioterapia, e incluso incrementa la supervivencia en pacientes enfermos de cáncer (Lamson y Brignall, 1999). 2. 1.3 β-caroteno: Molécula y propiedades generales El β-caroteno (C40H56) tiene un peso molecular de 536.9 umas y es uno de los carotenoides más ampliamente distribuido en la naturaleza (Figura 1). Es un hidrocarburo poli-insaturado compuesto por dos moléculas de retinol. Al tratarse de una molécula lipofílica, es insoluble en soluciones acuosas a menos que tengan cierto grado de polaridad, como los solventes orgánicos: acetona y diclorometano (Venugopal, 2009). La presencia de dobles enlaces conjugados en el β-caroteno hace que presente isómeros geométricos cis y trans (E/Z), que pueden ínter-convertirse cuando se encuentran en solución y que presentan sus enlaces dobles en distintas posiciones. Estos cambios en la geometría afectan el punto de fusión, el color, la solubilidad, la estabilidad y un poco sus propiedades ópticas de absorción de luz

4

(Venugopal, 2009). Así, aunque presentan un máximo de absorción a una longitud de onda de 450 nm, esta es interferida por la presencia de sus anillos β y enlaces dobles (Mínguez-Mosquera et al., 2008). Cuando la molécula del β-caroteno se encuentra en solución con presencia de luz y oxígeno se oxida, puede polimerizar y actuar agente quelante, además de formar isómeros (Venugopal, 2009).

Figura 1. Molécula de β-caroteno

2. 2 Dunaliella salina

2. 2. 1 Taxonomía De acuerdo al ITIS (2003), la clasificación de la especie es la siguiente: División

Chlorophyta

Clase

Chlorophyceae

Orden

Volvocales

Family

Dunaliellaceae

Género

Dunaliella

Especie

Dunaliella salina (Teodoresco, 1905).

5

Figura 2. Dunaliella salina. Contraste de fases con fluorescencia, objetivo 100X.

2. 2. 2 Características generales de la especie D. salina es una microoalga verde unicelular que tiene una forma ovoide, dos flagelos apicales y un color que varía de verde-amarillo a rojo profundo (Parra et al., 1990). Esta microalga pertenece al género Dunaliella conformado por 27 especies, las cuales comparten las siguientes características: Carecen de una pared celular rígida de polisacáridos, están rodeadas por una delgada membrana plasmática cubierta por una capa mucilaginosa, tienen un solo cloroplasto, pirenoide, un núcleo y nucléolo (Borowitzka, 1990; Wilcox y Graham, 2000; BenAmotz et al., 2009). Sin embargo solo D. salina y Dunaliella bardawil poseen la capacidad de acumular grandes cantidades de β-caroteno y glicerol en su interior, cuando se encuentra en ambientes extremos hipersalinos y en los que hay una intensa radiación solar (Olmos-Soto et al., 2012).

2. 2. 3 Estudios nutricionales con Dunaliella Entre los antecedentes más importantes se encuentran los de Ben-Amotz y colaboradores (1987) y Ben-Amotz y Avron (1992). En estos trabajos se encontró que D. salina produce una combinación de isómeros: 15-cis-β-caroteno (10%), 9-

6

cis-β-caroteno (41%), trans β-caroteno (42%) y 2 isómeros sin identificar (7%).

Ben-Amotz y Levi (1996) realizaron un estudio in vivo con humanos y observaron que la mezcla isomérica de β-caroteno producida por Dunaliella bardawil fue más absorbida, con respecto a otras formas de β-caroteno trans de origen sintético que fueron administradas. También descubrieron, que tuvo una actividad antioxidante más potente.

Diversos investigadores (Borowitska, 1990; Venugopal, 2009), mencionaron a D. salina como una fuente importante de β-caroteno y complemento nutricional para humanos, por su fuerte actividad pro vitamina A, entre otros beneficios.

2. 2. 4 Estudios previos en el noroeste de México Se han aislado e identificado bioquímicamente varias cepas locales pertenecientes al género Dunaliella, entre ellas D. salina en lagunas hipersalinas costeras ubicadas en los estados de Baja California (San Quintin, La Salina) y Baja California Sur (Salina de Guerrero Negro) (Gutiérrez-Millán, 1996; SánchezCastrejón, 1998).

En el 2004, Capa-Robles (2004) estudió la fisiología de la especie para inducir la producción de β-caroteno con fines comerciales. Para ello, estudió el efecto de la salinidad, así como la presencia o ausencia de vitaminas en condiciones no estresantes de cultivo; además de que identificó la presencia de tres tipos de βcaroteno: 1)trans-β-caroteno, 2)α-caroteno y 3)de tipo no trans.

Olmos y colaboradores (2002) identificaron molecularmente a la especie por medio del método de intron-zising finger-printing, demostrando que las especies de Dunaliella tiene un tamaño específico, de 18S ADNr (Olmos-Soto et al., 2012).

7

Contreras-Flores (2005) estudió la variabilidad intraespecie y en función a ella evaluó la acumulación de β-caroteno bajo distintas condiciones de cultivo.

2. 3 Desarrollo del cáncer

Cáncer es el nombre general que se da a más de 100 enfermedades distintas pero que presentan una característica: Todas se originan a partir de células anormales o neoplásicas que proliferan de forma continua y descontrolada, formando masas de tejido llamados tumores. Algunas de estas células adquieren la habilidad de invadir nuevos tejidos y órganos causando la enfermedad del cáncer (INC, 2013).

La proliferación celular que da origen al cáncer es ocasionada por una alteración de los eventos que comprenden el ciclo celular, y que dependen de los niveles apropiados de la transcripción y traducción de ciertos genes, cuyas mutaciones o fallas han sido estrechamente relacionadas con el desarrollo del cáncer. Estos genes se dividen en dos clases: 1) Los proto-oncogenes, o genes cuyas proteínas estimulan la división celular e inhiben la muerte celular programada o apoptosis; y 2) Los genes supresores de tumores, cuyas proteínas restringen el crecimiento celular o conllevan a la apoptosis (Lodish et al., 2002). Las mutaciones en estos genes son ocasionadas por diversos factores que dañan el ADN nuclear (Baba, 2007).

Los factores carcinógenos pueden ser de tipo físico, como la radiación UV-A y UVB, los rayos X, y rayos Gama; químico, debido a la presencia de epóxidos, nitrosaminas, hidrocarburos aromáticos y minerales (As, Cr, Cd y Ni); biológico, lo que incluye a sustancias liberadas por parásitos, plantas, o microorganismos, o que se encuentran en alimentos y medicinas (Flavonoides, taninos, Ochratoxina A, caspacianina); y genético (Baba, 2007). Los factores genéticos pueden tener

8

distintos orígenes como son: mutaciones heredas en ciertos genes (genes BRCA1 y BRCA-2), la acción de algunos tipos de virus (Papilomavirus, herpesvirus y adenovirus), y la liberación de especies reactivas de Oxígeno ( 1O2 ) y otros radicales libres (1OH, -NO) durante el metabolismo celular (Baba, 2007; Musolino et al., 2007; Fiaschi y Chiaruggi, 2012).

El nombre que se le da a cada tipo de cáncer está determinado por el tipo de tejido y órgano en el cual se origina. Así, existe cáncer de seno, piel, de hígado, hueso y pulmón, entre muchos otros (INC, 2013).

2. 3. 1 Cáncer de mama El cáncer de mama (CaMa) es causado cuando hay una proliferación acelerada, desordenada y no controlada de las células de los tejidos de la glándula mamaria, y es causado por mutaciones que ocurren en los genes que actúan normalmente suprimiendo o estimulando la continuidad del ciclo celular (Rodríguez-Bandala, 2010).

De los tipos de cáncer que existen, el CaMa junto con el cáncer de próstata, son de los más agresivos, ya que hacen metástasis en los huesos y la mayoría de los pacientes mueren cuando esto sucede (Kowalski et al., 2003).

2. 3. 2. Incidencia del Cáncer de Mama en México El cáncer es una enfermedad que en muchos casos va asociada a la edad y a la senectud, por lo que desde el último siglo ha ido incrementándose junto con la edad de las personas y está en continuo aumento; siendo el cáncer de mama uno de los más comunes en el mundo (WCR, 2008). En México las cifras son alarmantes, ya que desde 2010 el CaMa es el tipo de cáncer más común en mujeres mayores de 20 años (24%) y actualmente es la segunda causa de muerte

9

natural en mujeres de 35 años y más (INEGI, 2013).

2. 4 Líneas celulares

MDA-MB-231 (ATCC® HTB-26) Esta línea celular fue aislada a partir de una paciente femenina de 51 años, de origen caucásico, que presentaba un adenocarcinoma grado III de glándula de mama; por lo que fueron elegidas como modelo para estudiar el efecto en ellas del β-caroteno de origen natural. Estas células carecen de la capacidad de diferenciarse, no forman tejidos, presentan un número cromosómico alterado (6469) y su forma es epitelial adherente (Cailleau et al., 1974).

Figura 3. Línea celular MDA-MB-231. Microscopio de Contraste de fases, objetivo 10X

10

HaCat Es una línea celular inmortal de queratinocitos humanos (QHA), cuyas células conservan la capacidad de diferenciarse y crecer de forma semejante al tejido de la piel humana (NHEQ) (Lehman, 1997). Debido a sus características las células de esta línea fueron empleadas como modelo, para ver el efecto del β-caroteno en células normales.

Figura 4. Línea celuar HaCat. Microscopio de Contraste de fases, objetivo de 10X.

11

3 Justificación Muchos de los tratamientos contra el cáncer en general y no solo de mama, son altamente invasivos y poseen muchos efectos secundarios. Por ello encontrar biomoléculas de origen natural como el β-caroteno producido por D. salina que puedan actuar como agentes preventivos, o curativos en el tratamiento, ya sea que inhiban la proliferación celular descontrolada o puedan inducir la apoptosis de las células neoplásicas, sin causar efectos tan dañinos como la quimio o radioterapia, aún es una panacea en la lucha contra todos los tipos de cáncer que existen. Por otro lado, hay estudios previos que indican que el β-caroteno puede ser un factor que predisponga a algunos tipos de cáncer y otros que indican que tiene una función preventiva. Este estudio puede ayudar a probar in vitro si esta molécula: 1) Tiene un efecto en la supervivencia de las células de cáncer de mama y 2) Si su origen sintético o natural causa alguna diferencia.

4 Hipótesis

Debido a que en otras especies de Dunaliella (Dunaliella bardawil) se demostró una mayor absorción y una actividad antioxidante más potente con respecto al βcaroteno de origen sintético; el β-catoteno natural obtenido a partir de Dunaliella salina puede tener un mayor efecto en la supervivencia de las células MDA-MB231 que β-caroteno de origen sintético.

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5 Objetivo General Demostrar el efecto que tendrá el β-caroteno de origen natural presente en un extracto obtenido a partir de la microoalga D. salina en la supervivencia de la línea celular MDA-MB-231.

5. 1 Objetivos particulares

-Estandarizar una fase móvil que permita detectar y cuantificar por medio de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), el β-caroteno sintético (comercial) y de origen natural. -Cuantificar el β-caroteno natural presente en el extracto natural de D. salina. -Evaluar el efecto del β-caroteno natural y sintético en la supervivencia de la línea celular MDA-MB-231. -Evaluar si hay un efecto diferencial entre el β-caroteno natural y sintético en la línea celular HaCat. -Observar si el tiempo de incubación con ambos tratamientos con β-caroteno, también causa un efecto sobre ambas líneas celulares.

13

6 Materiales y Métodos

6. 1 Dunaliella salina La cepa de D. salina (UTEX LB2538) empleada para este estudio, proviene de un lugar conocido como La Salina, localizada 35 km al norte de la ciudad de Ensenada, B.C. (Contreras-Flores, 2005) y forma parte de la colección del laboratorio de Microbiología Molecular del Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, B. C. lugar en donde se realizó este trabajo.

6. 1. 1 Condiciones iniciales de Cultivo En dos matraces Erlenmeyer de 250 ml se colocaron por separado dos inóculos iniciales de aproximadamente 13,800 células de D. salina a los que se les nombró como cultivos F y L . A cada cultivo se les agregó 50 ml de un medio nutritivo, el cual fue elaborado con la mezcla de los de medios cultivo para microalgas F2 (Guillard y Ryter, 1962) y Erdschreiber's (1:1) a una concentración 1.0 M de NaCl. Los cultivos F y L fueron mantenidos con un fotoperiodo de luz-oscuridad de 12 horas, una temperatura de 25°C y un flujo luminoso de 20 quanta m-2 seg-1 hasta que alcanzaron su fase de crecimiento estacionario. Durante este periodo, cada cultivo fue agitado manualmente por la mañana y por la tarde, para favorecer el intercambio gaseoso (Ver ANEXO I).

6. 1. 2. Cálculo de la densidad poblacional Cada tres días se realizaron conteos directos a los cultivos F y L al microscopio óptico con ayuda de una cámara de Neubauer. Para ello, se tomó una alícuota de 1 ml a partir de cada cultivo y se le agregaron 70 μl de solución de Lugol ácido para inmovilizar las células y contarlas.

14

Para calcular la densidad celular del cultivo se utilizó la siguiente ecuación: D= C * 104

En donde: D= Densidad del cultivo en células/ml C= Número de células en toda una cuadrícula de 1mm2 104= Factor de dilución (Voltolina-Lobina et al., 1989).

6. 1. 3. Inducción Una vez que se logró la fase estacionaria del cultivo, se eligió al cultivo F como control, mientras que el cultivo L fue tomado como experimental. Al cultivo experimental (L) se le realizaron incrementos graduales de salinidad en el medio nutritivo hasta llegar a una concentración final de 3.0 M NaCl en el matraz y además se incrementó el flujo luminoso a 26 quanta m-2 seg-1 sin alterar la temperatura. Al cultivo control F, no se le alteraron las condiciones iniciales. Esta fase tuvo una duración de 28 días. Cuadro I. Incrementos en la concentración de NaCl realizados en el cultivo L Día de cultivo

Concentración Molar NaCl

NaCl adicionado

12

1.5 M

2.61 g

15

2.0 M

1.46 g

18

2.5 M

1.32 g

21

3.0 M

1.61 g

15

6. 2 Betacaroteno En este estudio se emplearon dos fuentes de β-caroteno: Una de origen natural contenido en un extracto de D. salina obtenido con solventes orgánicos; cuya elaboración no se describe ampliamente por motivos de patente. El segundo tipo fue β-caroteno trans de origen sintético, fabricado por la empresa Sigma®.

6. 2. 1 Detección y cuantificación por HPLC Para cuantificar e identificar el β-caroteno natural y sintético se empleó la técnica de Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). El análisis se realizó en un cromatógrafo Hewlett Packard serie 1100 con inyector manual, un sistema cuaternario para solventes y un detector múltiple para longitud de onda. Se empleó una columna Zorbax C8 de fase inversa con un tamaño de partícula de 5 μm, una elución isocrática con metanol al 100% a una velocidad de flujo de 0.5 ml/min y 25 minutos de corrida. Para cuantificar el β-caroteno natural presente en el extracto, se realizaron diluciones con metanol al 100% del estándar sintético (0.5, 1, 1.5 y 3 µg/µl) con las cuales se obtuvo una curva de calibración con las mediciones obtenidas en el cromatógrafo.

6.3 Cultivo celular

6. 3. 1 Condiciones de crecimiento Para su crecimiento, las líneas HaCat y MDA-MB-231 (ATTC® HTB-26®) fueron sembradas en cajas de cultivo (Corning®) con 7 ml (GIBCO®)

del medio RPMI-1640

suplementado con 10% de SFB (Suero fetal bóvino) inactivado

16

(GIBCO®) y 1% del antibiótico comercial anti-ant (Invitrogen®). Las líneas celulares siempre fueron incubadas en un ambiente estéril, a una temperatura de 37°C y una atmósfera húmeda con 4% de CO2 (Ver Anexo II). 6. 3. 2 Desprendimiento de líneas celulares Cuando los cultivos presentaron una confluencia aproximada de un 85%, las células fueron lavadas con 2 ml PBS y se les aplicó un tratamiento con una solución de tripsina-EDTA y Verseno (1:1) (1 ml) (Ver Anexo II). Enseguida se tomó una porción de las células desprendidas, y se les sembró en una caja nueva con medio RPMI-1640 suplementado. Para realizar los ensayos posteriores con el β-caroteno, solo se emplearon las células obtenidas a partir de un cuarto pase, siguiendo lo propuesto por Pitones-Rubio y Olmos-Soto, 2010.

6. 3. 3. Curva de crecimiento Para estimar la cantidad de células adecuada para realizar el ensayo con βcaroteno fue necesario obtener una curva de crecimiento basada en la confluencia. Para esto se utilizó una placa de cultivo de 96 pozos (Corning®), en donde se colocaron en cada pozo, diferentes cantidades de células de MDA-MB231 (1000, 2000, 3000, 4000 y 5000) en 100 µl de medio RPMI suplementado, las cuales fueron incubadas durante 4 horas a una temperatura de 70°C y una atmósfera húmeda de CO2 al 4%. Transcurrido ese tiempo, a las células se les realizó el arresto celular, para lo cual se les cambió el medio a RPMI sin suplementar. Después con ayuda de un microscopio invertido Axiovert Zeiss se observó de forma visual la confluencia celular. De inmediato, las células nuevamente fueron incubadas durante 20 horas bajo las mismas condiciones de crecimiento. Al cabo de ese tiempo la confluencia fue revisada nuevamente.

17

6. 3. 4. Ensayo con β-caroteno El ensayo estuvo compuesto por dos tratamientos sobre cada uno de los linajes celulares (MDA-MB-231 y Hacat). El primer tratamiento consistió en una solución elaborada con β-caroteno de origen natural; mientras que el segundo en una solución realizada con β-caroteno de origen sintético. Para cada tratamiento hubo dos condiciones en el tiempo de incubación: 2 y 24 horas. Los tratamientos con la condición de 2 horas (h) iniciaron 22h después del arresto celular; mientras que los tratamientos con la condición

de 24h se aplicaron sin esperar a que se

cumpliera un tiempo previo al arresto celular (Cuadro II). El ensayo fue realizado en multi-placas para cultivo celular de 96 pozos (Corning®), en los que se colocaron 5,000 células del linaje celular correspondiente, y a las que se les aplicaron 100 µl de cada uno de los dos tratamientos de β-caroteno con sus respectivas condiciones. Como control positivo se utilizó DMSO al 100% y como control negativo medio RPMI sin suplementar. El ensayo se realizó en condiciones de oscuridad, por triplicado para cada tratamiento y condición, a 37°C en una atmósfera húmeda con 4% de CO2. Para medir el efecto del β-caroteno de origen natural y sintético en la supervivencia celular, fue llevado a cabo el ensayo colorimétrico de MTT, de acuerdo al método de Pitones-Rubio y Olmos-Soto (2010) (Ver Anexos III y IV). Cuadro II. Esquema general del ensayo con β-caroteno Línea celular MDA-MB-231

HaCat

Tratamientos con sus condiciones de incubación 1. β-caroteno natural 2h

24 h

2. β-caroteno sintético 2h

24 h

β-caroteno natural

β-caroteno sintético

2h

2h

24 h

24 h

18

6.3.5 Análisis estadísticos Las absorbancias obtenidos en el ensayo final de MTT fueron analizadas con los programas Calc de Libre Oppen Office y con R (Ihaka y Gentleman, 1996). En el primero, se realizaron los estadísticos básicos y se probó la normalidad y homocedasticidad de los datos. Con el programa R se realizaron varios análisis de variancia (ANDEVA), mediante el uso de matrices, con el fin de establecer si existió una diferencia entre los tratamientos de β-caroteno con base al estadístico F.

19

7 Resultados

7.1 Cultivo de Dunaliella salina La fase de cultivo inicial, duró 12 días. Los cultivos llegaron a una fase estacionaria y alcanzaron un número máximo de 410,000 y 421,250 células/ml (Ver Anexo V) al cabo de 9 días de cultivo. Durante esta fase las células de D. salina midieron en promedio: 9-11µm de largo, presentaron una coloración verde y

Densidad poblacional (Cél/ml)

con una forma ligeramente ovalada.

500000 400000 Cultivo F

300000

Cultivo L

200000 100000 0 1

3

6

9

12

Día de Cultivo

Figura 5. Curva de crecimiento poblacional del cultivo de Dunaliella salina hasta alcanzar la fase estacionaria

El proceso de betacarogénesis en el cultivo L de D. salina fue completamente visible hasta el día 37 de cultivo. En esta fase las células incrementaron su tamaño, adquirieron una forma redonda, perdieron sus flagelos y presentaron grandes glóbulos de β-caroteno y glicerol. El cultivo experimental L cambió su coloración de verde a amarillo, y de este a rojo en el día 40 de cultivo.

20

7.2 β-caroteno

En los cromatogramas obtenidos por HPLC el β-caroteno presentó su mayor pico de absorción a una longitud de onda de 450 nm. Al analizar el estándar sintético se observó un pico mayor correspondiente al trans β-caroteno, el cual tuvo un 8.105 min. En el extracto natural, se identificó un pico muy semejante, pero con un tiempo de retención de 8.432 min. (Figura 6). Sin embargo, al sobreponer los cromatogramas obtenidos con dos diluciones del estándar y una muestra del extracto natural, se pudo confirmar la presencia trans β-caroteno en D. salina tal y como se puede ver en la Figura 7.

21

A

B

C

Figura 6. Cromatogramas obtenidos por HPLC a una longitud de onda de 450 nm. A) Estándar de trans β-caroteno, B) Extracto natural de D. salina y C) Blanco de metanol al 100%

22

Figura 7. Cromatogramas sobrepuestos del estándar y el extracto natural de D. salina. Las líneas punteadas (…) corresponden al estándar sintético, mientras que la línea continua inferior (__) al extracto natural.

23

En el siguiente cuadro se muestran los datos de absorbancia obtenidos en el cromatógrafo al analizar el estándar sintético del trans β-caroteno, así como las concentraciones de β-caroteno estimadas en distintas diluciones del extracto natural de D. salina:

Cuadro III. Mediciones de absorbancia obtenidas en el cromatógrafo HPLC al analizar el estándar sintético de trans β-caroteno (ES) y el extracto natural de Dunaliella salina (BN).

Fuente de

Concentración β-caroteno Área (mAU*min)

β-caroteno

(µg/µl)

ES1

0.5

227.682

ES2

0.75

673.028

ES3

1.5

1759.24

ES4

3

3518

BN1

0.64

513.841

BN2

2.95

3511.8

BN3

4.21

5150.46

24

En la figura 8 se muestra la curva de calibración obtenida a partir de las mediciones anteriores con el estándar sintético y el extracto natural. Esta curva presentó una relación lineal, en cuya ecuación de la recta se obtuvo una r2 de 0.99796 dando certeza del método de cuantificación empleado.

Área cromatograma (mAU*min)

6000

y = 1298.6x - 322.26 R² = 0.998

5000

Estándar sintético

4000

BN1

3000

BN2

2000 BN3

1000 0 0

1

2

3

4

5

Concentración betacaroteno (ug/ul)

Figura 8. Curva de calibración por HPLC para estimar la concentración de β-caroteno en el extracto natural

25

7.3 Curva de crecimiento

Al realizar la curva, se determinó que la cantidad óptima de células para realizar los ensayos fue de 5,000 células debido a las confluencias iniciales y finales obtenidas, como se puede observar en el siguiente cuadro:

Cuadro IV. Resultados obtenidos para la curva de crecimiento con la línea celular MDA-MB-231.

MDA-MB-231

Células/ml

Confluencia 4h

Confluencia 20h

1000

10%

20%

2000

15-20%

35%

3000

20-25%

50%

4000

30-35%

65-70%

5000

40-45%

85-90%

7.4 Ensayo de viabilidad celular con β-caroteno

Al analizar estadísticamente los resultados obtenidos, los datos presentaron en todos los casos una distribución normal, al realizar intervalos de confianza para un α de 0.05. 7.4.1 Tratamiento de β-caroteno: 2 horas En la línea celular MDA-MB-231 el β-caroteno natural tuvo un fuerte efecto, ya que la supervivencia fue del 27.9%, contra una supervivencia del 64.45% originado por el trans β-caroteno sintético (Figura 9). Al realizar el ANDEVA se obtuvo una F=

26

1148.3 con un valor de P=4.45e-6 (P n=rep(3,2) >group=rep(1:2,n) >data=data.frame(y=y,group=factor(group)) >fit=lm(y ~ group,data) >anova(fit) Analysis of Variance Table Response: y Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) group 1 0.033302 0.033302 1148.3 4.524e-06 *** Residuals 4 0.000116 0.000029 Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1

Figura 11. Variación dentro del tratamiento de 2h con β-caroteno en la línea

51

celular MDA-MB-231. 1)Células con β-caroteno trans sintético (BS), 2)Células con β-caroteno natural (BN).

b ) MDA vs control negativo >y1=c(.249, .258, .264) >y2=c(.107, .108, .109) >y3=c(.401, .414, .302) Analysis of Variance Table Response: y Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) group 2 0.105375 0.052687 41.483 0.0003068 *** Residuals 6 0.007621 0.001270 c) Hacat >y1=c(.288, .260, .246) >y2=c(.276, .227, .237) >y=c(y1,y2) >n=rep(3,2) >group=rep(1:2,n) Analysis of Variance Table Response: y Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) group 1 0.0004860 0.00048600 0.862 0.4057 Residuals 4 0.0022553 0.00056383

Figura 12. Variación dentro del tratamiento de 2h con β-caroteno en la línea celular HaCat 1)Células con BN, 2)Células con BS

52

d) HaCat con control interno >y1=c(.276, .227, .236) >y2=c(.288, .260, .246) >y3=c(.296, .271, .275) Analysis of Variance Table Response: y Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) group 2 0.0017709 0.00088544 .0154 0.214 Residuals 6 0.0026360 0.00043933 e) MDA-MB-231 Vs HaCat Beta Natural >y1=c(.107, .108, .109) >y2=c(.276, .227, .236) >y3=c(y1,y2) Analysis of Variance Table Response: y Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) group 1 0.0287042 0.0287042 84.259 0.0007822 *** Residuals 4 0.0013627 0.0003407

f) MDA-MB-231 Vs HaCat (Todos los tratamientos) >y1=c(.249, .258, .264) >y2=c(.107, .108, .109) >y3=c(.276, .227, .236) >y4=c(.288, .260, .246) >y=c(y1,y2,y3,y4) >n=rep(3,4) >group=rep(1:4,n) >data=data.frame(y=y,group=factor(group)) >fit=lm(y ~ group,data) >anova(fit) Analysis of Variance Table Response: y Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) group 3 0.049793 0.0165976 55.526 1.065e-05 *** Residuals 8 0.002391 0.0002989

53

Figura 13. Variación dentro de grupos con el tratamiento de 2h con βcaroteno: 1)MDA-MB-231 con BS 2)MDA-MB-231 con BN, 3)HaCat con BS, 4)HaCat con BN.

2.

Tratamiento: 24 Horas con β-caroteno a) MDA

>y1=c(.388, .387, .381) >y2=c(.278, .279, .291) Analysis of Variance Table Response: y Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) group 1 0.0158107 0.0158107 474.32 2.63e-05 *** Residuals 4 0.0001333 0.0000333

Figura 14. Variación dentro del tratamiento de 24h con β-caroteno en la línea celular MDA-MB-231: 1) Células con BS, 2) Células con BN.

54

b) MDA con control interno >y1=c(.388, .387, .381) >y2=c(.278, .279, .291) >y3=c(.401, .414, .382) Analysis of Variance Table Response: y Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) group 2 0.0242607 0.0121303 111.74 1.787e-05 *** Residuals 6 0.0006513 0.0001086

c) Hacat >y1=c(.246, .216, .228) >y2=c(.228, .216, .217) Analysis of Variance Table Response: y Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) group 1 0.00014017 0.00014017 1.0294 0.3677 Residuals 4 0.00054467 0.00013617

Figura 15. Variación dentro del tratamiento de 24h con β-caroteno en la línea celular HaCat: 1)Células HaCat con BS, 2)Células HaCat con BN.

55

d) Hacat con control interno >y1=c(.246, .216, .228) >y2=c(.228, .216, .217) >y3=c(.296, .271, .275) Analysis of Variance Table Response: y Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) group 2 0.0063007 0.00315033 20.878 0.001983 ** Residuals 6 0.0009053 0.00015089

e) MDA vs HaCat (Todos los tratamientos) >y1=c(.388, .387, .381) >y2=c(.278, .279, .291) >y3=c(.246, .216, .228) >y4=c(.288, .216, .217) Analysis of Variance Table Response: y Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) group 3 0.045275 0.0150916 30.198 0.0001031 *** Residuals 8 0.003998 0.0004997

Figura 16. Variación entre grupos con el tratamiento de 24h con βcaroteno. Células MDA-MB-231 con BS, 2) Células MDA-MB-231 con BN, 3)Células HaCat con BS, 4) Células HaCat con BN

56