T ESIS DE M AESTRÍA (PEDECIBA)

D ESCRIPCIÓN DEL PATRÓN DE LA DESCARGA DEL ÓRGANO E LÉCTRICO DE SEIS ESPECIES DE G YMNOTUS A LEJO R ODRÍGUEZ

29 de Julio 2009

Orientador : D R . Á NGEL C APUTI Jefe del Departamento de Neurociencias Integrativas y Computacionales del Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable.

Miembros del Tribunal Presidente : Dr. Omar Trujillo-Cenóz Profesor Emérito, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable.

Vocales : Dr. Omar Macadar Jefe del Departamento de Neurofisiología del Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable.

Dr. Reynaldo Pinto Profesor adjunto del Instituto de Física de São Carlos, Universidade de São Paulo.

I

Algunos resultados de esta tesis fueron publicados en los siguientes artículos Rodríguez-Cattáneo, A; Pereira AC; Aguilera PA; Crampton WGR; Caputi, A.A. (2008). Species-specific diversity of a fixed motor pattern: the electric organ discharge of Gymnotus. PLoS ONE, 35, e2038. doi:10.1371/journal.pone.0002038. Castelló, M. E., Rodriguez-Cattaneo, Al, Aguilera, P. A., Iribarne, L.; Pereira, A. C., Caputi, A. A. (2009) Waveform generation in the weakly electric fish Gymnotus coropinae (Hoedeman): the electric organ and the electric organ discharge J Exp Biol. 212: 1351-1364. Rodriguez-Cattaneo, A., Caputi, A. A. (2009). Waveform diversity of the electric organ discharges: the role of electric organ autoexcitability in Gymnotus spp. J Exp Biol. (in press).

II

Índice general I

Introducción

2

1. Introducción 1.1. Antecedentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1.1. Causalidad de la DOE . . . . . . . . . . . . . 1.1.2. Ontogenia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1.3. Valor de supervivencia o función de la DOE 1.1.4. Evolución . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

II

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3 . 5 . 5 . 9 . 10 . 12

Hipótesis y Objetivos

2. Hipótesis y Objetivos 2.1. Objetivo General . . 2.2. Hipótesis . . . . . . . 2.3. Objetivos específicos 2.3.1. Hipótesis 1 . . 2.3.2. Hipótesis 2 . .

III

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15 . 15 . 16 . 16 . 17 . 18

Resultados

19

3. El campo eléctrico generado 3.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2. Métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.1. La DOE registrada en el campo lejano . . . . . . . . . 3.3.2. La DOE en el registro local . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.3. La DOE registrada en la fóvea electrosensorial . . . . 3.3.4. La DOEht es insuficiente para caracterizar la forma de onda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . III

21 21 23 24 24 27 33 36 38

4. La DOE registrada en el aire 4.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2. Métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.1. Análisis de la DOE en Trampa de aire Múltiple . . . . 4.3.2. Trampa de aire simple y con diodos . . . . . . . . . . 4.4. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4.1. Sobre el método de la trampa múltiple . . . . . . . . . 4.4.2. Comparación de las amplitudes relativas de los distintos componentes por región . . . . . . . . . . . . . 4.4.3. El método de trampa de aire simple y con diodos . . 4.4.4. Fuerza electromotriz de los diferentes componentes de la DOE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4.5. Fuerzas electromotrices dependientes de la carga . . 5. Anatomía e inervación del tejido electrogénico 5.1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2. Métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.4. Discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

IV

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Discusión

42 42 44 45 45 55 63 63 65 69 69 70 71 71 72 72 78

81

6. Discusión 6.0.1. Similitudes y diferencias en la anatomía e inervación del OE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.0.2. Similitudes y diferencias en los mecanismos de coordinación neural . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.0.3. Diversidad en la excitabilidad del OE . . . . . . . . . 6.0.4. Mecanismos electrogénicos neurales . . . . . . . . . . 6.0.5. Similitudes en la sLDOE y diferencias en la cLDOE . 6.0.6. Diversidad de las señales eléctricas, una ventana a la evolución del sistema electrogénico . . . . . . . . . . 6.1. Conclusiones y perspectivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.1. Conclusiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1.2. Perspectivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

IV

82 82 84 86 88 88 89 92 92 92 94

Resumen La Descarga del Órgano Eléctrico (DOE) de los peces del orden Gymnotiformes es un patrón de acción fijo. Este modelo tiene la ventaja de que el órgano efector (el órgano eléctrico, OE), es fácilmente identificable mediante métodos clásicos de anatomía. La función de este órgano es crear energía portadora de señales para el sistema sensorial propio y el de los congéneres. Además, la salida del sistema es un patrón electrogénico fijo, todo o nada, en el cual la variabilidad asociada a la intensidad del comportamiento, es suprimida para evitar ambigüedades. Este patrón electrogénico es único para cada especie; las diferencias son el resultado de la evolución de la estructura del OE y en los mecanismos de activación del mismo. Se estudió las similitudes y diferencias en el OE y en la DOE de seis especies de Gymnotus para determinar cómo y dónde residen estas diferencias. Los resultados indican que la estructura del OE, estudiada con microscopía de luz, está relativamente conservada, mientras que pequeños cambios en las propiedades electrofisiológicas del OE y las del generador central de patrones que controla la DOE, son responsables de las principales diferencias entre especies.

Abreviaturas: OE: Organo Eléctrico. DOE: Descarga del Organo Eléctrico. DOEht: DOE registrada con electrodos lejanos. sLDOE: DOE local registrada en la fovea electrosensorial. cLDOE: DOE registrada en la fovea electrosensorial de un congénere. PEN: Nervio Electromotor Posterior. PPF: Banda de frecuencia con mayor potencia (Peak Power Frequency). Nomenclatura de los componentes de onda. De acuerdo al concepto de homología funcional introducido en la tesis de Doctorado de Caputi (1994), dos componentes son funcionalmente homólogos si son generados por el mismo mecanismo (Tabla 1). Por lo tanto, el subíndice ‘1’ no refiere al primer componente de la DOE, ya que pueden ser diferentes en diferentes especies (por ej: G. pantanal comienza con V2 ), sino que refiere a un componente cabeza-negativo generado por los potenciales pos sinápticos (lentos) de las caras rostrales de los electrocitos; ’2’ refiere a los componente también cabeza negativos pero generados por los potenciales de acción (PA, rápidos), generados sinápticamente, de las caras rostrales; ’3’ refiere a los potenciales cabeza positivos generados por los PA de las caras caudales; ’4’ refiere a los potenciales cabeza-negativos generados por los PA de las caras rostrales, pero ’4’ (a diferencia de 2) es activado periféricamente por las corrientes de ’3’; por último ’5’ refiere a PA de las mismas caras que generaron ’3’, pero activadas por el mismo mecanismo que ’4’ y aparecen a continuación de ’4’. Para enfrentar la diversidad de ondas exhibidas por las especies estudiadas sin establecer un quiebre en la nomenclatura habitualmente aceptada, ha sido necesario agregar un segundo subíndice a los componentes relacionado con el origen espacial del mismo. A los subíndices anteriormente citados les agregamos letras que refieren a las tres regiones en que dividimos el cuerpo del pez: a (anterior), c (central) y p (posterior).

Cuadro 1: características de los diferentes componentes homólogos de la DOE. PA:Potencial de Acción. Componente V1 V2c V3a V3c V3p V4c V4p V5 V1cp

Polaridad Negativa Negativa Positiva Positiva Positiva Negativa Negativa Positiva Positiva

Mecanismo Potencial de placa PA Post sináptico PA Post sináptico PA Post sináptico PA Post sináptico PA por Invasión PA por Invasión PA por Invasión neural

1

Región del pez Anterior Central Anterior Central Posterior Central Posterior Posterior Central/Posterior

Parte I Introducción

2

Capítulo 1 Introducción Algunas especies de peces han desarrollado órganos electrogénicos (OE) cuyas descargas generan campos eléctricos en el entorno del animal. Estos campos tienen distintas características según la especie y se ha postulado que cumplen al menos tres funciones: electro-predación (Darwin, 1866); como portadora de señales para la exploración activa del medio circundante (Lissmann, 1951; 1958) y comunicación intra-específica (Morhes, 1957). Existen dos grandes grupos taxonómicos de peces eléctricos, así llamados por su capacidad de generar corrientes eléctricas de manera controlada por el sistema nervioso. Estos dos grupos desarrollaron la capacidad de electro-generación de forma independiente, ellos son: los Mormyridos, originarios de África y los Gymnotiformes, ampliamente distribuidos en América del Sur y América Central. La forma de onda de la descarga del órgano eléctrico (DOE) de estos grupos es especie-específica (Coates et al, 1954). Algunas especies emiten pulsos breves a intervalos regulares, mientras que otros generan ondas continuas. Existen dos tipos de OE, aquellos derivados de tejido neural y compuestos de axones modificados y aquellos derivados de tejido muscular, compuestos de fibras musculares que han perdido su capacidad contráctil y se han diferenciado adquiriendo formas y repertorios de canales voltaje dependientes que les proveen su capacidad electrogénica (Couceiro y De Almeida, 1961; Bennett, 1971). La DOE es la respuesta del OE a su activación coordinada por el sistema nervioso. Es un acto motor balístico y altamente estereotipado. Como todo acto motor, la DOE implica la realización de un trabajo (en este caso un trabajo eléctrico) sobre una resistencia de carga. De esta forma, la DOE genera una potencialidad o fuerza electromotriz que se expresa como campo eléctrico. La fuerza electromotriz (FEM) es la potencialidad electrogénica de la DOE; y el campo es la actuación de dicha potencialidad fren3

te a una carga determinada. El término DOE es utilizado indistintamente cuando no lleve a confusión y se utilizará DOE, FEM y campo cuando se requiera ser más específico. La hipótesis más aceptada sobre la especificidad de las formas de onda de las DOEs y que vertebra esta tesis, es que existen tres factores que determinan la forma de onda: 1. la anatomía del OE y su inervación; 2. el repertorio de canales voltaje dependiente de las células electrogénicas y 3. los mecanismos de coordinación que determina los tiempos de activación de los diferentes componentes del OE (Bennett, 1971). En los gymnótidos de pulso, foco de este proyecto, la DOE presenta su mayor riqueza y complejidad debido a la importancia del control neural en el determinismo de su forma de onda. El control de la DOE en estos peces ejemplifica como diversas estrategias centrales y periféricas pueden ser combinadas para lograr la coordinación de centenares de unidades efectoras y generar, a partir de un impulso individual, un patrón de actividad electromotor estereotipado, temporal y espacialmente distribuida (Caputi, 1999). El estudio comparado del patrón electromotor en seis especies de peces eléctricos, pertenecientes al mismo género, es el primer objetivo general de esta tesis. Por otra parte, la DOE tiene dos funciones, implementadas ambas por el campo eléctrico generado en cada evento (aunque la tasa de descarga puede contener información adicional). La DOE es portadora de la energía para el sistema sensorial propio y para el de sus congéneres. ¿Cómo es implementada esta doble función con objetivos tan diferentes? El estudio de los campos locales en lugares clave, como son la fóvea electrorreceptiva del propio pez y la de un congénere colocado cerca permitió determinar que las dos funciones de la DOE están segregadas en dos portadoras originadas en diferentes regiones del pez, cuya forma de onda y contenido de frecuencias son distintos,(Aguilera et al, 2001). El estudio comparado de las formas de onda de los campos locales de seis especies y la extensión de las hipótesis realizadas en G. n. sp omari sobre las dos portadoras es el segundo objetivo general de esta tesis.

4

1.1.

Antecedentes

En su clásico discurso sobre objetivos y métodos en etología, Niko Tinbergen (1963) propuso una pregunta sencilla: ¿por qué los animales se comportan de la manera como lo hacen? Tinbergen sugiere cuatro aproximaciones posibles, o niveles de análisis que deberían ser utilizados para contestar esta pregunta: causalidad, valor de supervivencia (función), ontogenia y evolución. Todos estos puntos han sido explorados con mayor o menor profundidad en los peces eléctricos, más adelante se presenta un breve resumen acerca de estas cuatro perspectivas de estudio. Dado que esta tesis se basa en un género del orden Gymnotiformes, voy a poner mayor énfasis en los conocimientos sobre los peces americanos en desmedro de los africanos, sobre los que se conoce mucho, tal vez incluso más, respecto a cualquiera de los cuatro puntos planteados por Tinbergen. La principal excepción es sin duda Gymnotus n. sp. omari, el cual ha sido modelo de estudios del OE que van desde el nivel de repertorio de canales iónicos (Sierra, 2007) hasta su papel en el comportamiento social y reproductivo (Silva et al, 2007). Dado que G. n. sp omari es el Gymnotus que mejor se ha estudiado, voy a hacer un resumen sobre las principales características del sistema electrogénico y su función en esta especie. Además, será nuestra referencia para la descripción de las características del sistema electrogénico del resto de las especies estudiadas.

1.1.1.

Causalidad de la DOE

La DOE, como toda acto, depende de la estructura y organización del órgano efector (órgano eléctrico en este caso) y de sus mecanismos de control. Esto supone que la DOE depende de la forma y disposición de los electrocitos que componen al OE, del patrón de inervación de los mismos, y de la temporalidad de activación de los diferentes componentes, así como de la relación de resistencias y/o capacitancias del OE con los tejidos que lo rodean (Caputi et al, 2005). Las unidades que componen al OE son sincicios musculares modificadas (electrocitos), que perdieron su capacidad contráctil, pero conservan membranas excitables. La descarga coordinada de cientos de estas unidades, particularmente ordenadas, da lugar a la DOE. Los diversos elementos electrogénicos están distribuidos a lo largo del 90 % caudal del cuerpo de los peces. En G. n. sp omari se compone de cuatro pares de tubos con simetría bilateral y longitud desigual. Dichos tubos se denominan 1, 2, 3 y 4. El tubo de mayor diámetro (tubo 1) se origina en 5

la región peri-anal y se ubica longitudinalmente entre el peritoneo y la pared abdominal, en ambos flancos, por fuera del tubo medial (tubo 2). A la altura del origen rostral de la aleta anal, el tubo 1 describe un cuarto de vuelta de hélice dorso-caudo-medial y se ubica dorsal con respecto al resto de los tubos que componen el OE. Dicha relación topográfica se mantiene hasta el delgado extremo caudal del pez, compuesto en gran parte por el OE. El tubo 2 yace junto al anterior en toda su extensión; en la región abdominal ocupa una posición medial; caudalmente al límite abdominal se dispone por debajo del tubo 1. Los tubos 3 y 4 tienen la misma extensión que la aleta anal y se disponen cada uno ventralmente a los anteriores (Trujillo-Cenóz y Echagüe, 1989; Trujillo-Cenóz et al, 1984). El OE presenta tres regiones que se diferencian por la morfología, densidad y tamaño de los electrocitos y también por el patrón de inervación de los mismos. La región anterior está compuesta por dos tubos que corren de forma parasagital en la pared abdominal. Los electrocitos del tubo lateral (tubo 1) reciben doble inervación. La región central se extiende desde el nacimiento de la aleta anal hasta el 75 % de la longitud del pez y cuenta con cuatro tubos. En esta región, los electrocitos del tubo 1 mantienen la doble inervación, mientras que los electrocitos de los otros tres tubos reciben solamente inervación caudal. En la tercera región (posterior), el OE ocupa una gran porción del tejido total y todos los electrocitos son mono inervados caudalmente. La densidad de electrocitos crece exponencialmente en sentido rostro-caudal en todos los tubos. El centro neural que controla la emisión de cada DOE está compuesto de dos núcleos. El primero de ellos, el de las neuronas marca pasos propiamente dichas, controla la frecuencia de la DOE, dispara muy regularmente y sus células (de 70 a 100) están conectadas eléctricamente entre si, por lo que actúan como una unidad. El núcleo de las marca pasos recibe control superior del sistema motor y de colaterales sensoriales (Bullock, 1969; Bennett, 1971). Los axones del núcleo marcapasos activan un segundo núcleo: el núcleo electromotor bulbar o núcleo relé. Las proyecciones de las células de relevo forman el haz electromotor bulbar, e inervan dos poblaciones de electromotoneuronas (EMN) distribuidas a lo largo del 70 % rostral de la médula espinal (Caputi y TrujilloCenóz, 1994), ubicadas en un cordón supraependimario (Trujillo-Cenóz et al, 1986). Estas dos poblaciones de EMN se diferencian en tamaño y forma del soma, así como en la distribución a lo largo de la médula. La primera población está compuesta por neuronas pequeñas y esféricas, y están en la región de la médula que ocupa del 12 al 60 % del pez. La segunda población está compuesta por neuronas de forme ovoide, más grandes que el primer grupo, y su distribución se extiende en la médula desde el 25 % 6

al 80 % del pez. Los axones de las electromotoneuronas forman parte de las raíces motoras (Trujillo-Cenóz y Echagüe, 1989). En G. n. sp omari, los 7 primeros pares inervan las caras rostrales de los electrocitos doble inervados. Los axones de los pares VII al XXIV forman el nervio electromotor anterior (AEN) que corre rostralmente y también inervan las caras rostrales de los electrocitos aunque algunos hacen sinapsis con las caras caudales de los electrocitos de la región abdominal. A niveles más caudales, las raíces de cada lado forman el par de nervios electromotores posteriores (PEN), con un centenar de axones cada uno. Antes de alcanzar su destino se ramifican intensamente y entre siete y once fibras de diferentes axones alcanzan cada electrocito (Macadar et al 1989). La correlación anátomo-funcional y el estudio comparado de varias especies permitieron establecer que el dominio espacial de cada componente homólogo de la forma de onda coincide con el dominio espacial de un tipo electrocítico. Según la descripción de Trujillo-Cenóz et al (1984) la forma de onda de la DOE, que tiene un perfil trifásico en el registro de campo (DOEht, figura 1.1), está compuesta en realidad por cuatro ondas (de V1 a V4 , figura 1.1). El modelo actual sobre el funcionamiento del sistema electrogénico se resume en la figura 1.1, que refiere a la secuencia de activación de los diferentes elementos del sistema. La DPE comienza con la activación sincrónica de las células del núcleo de relevo (t=0, no mostrado). Los potenciales de acción (PA) de las células de relevo se trasladan a diferentes velocidades según su diámetro (Lorenzo et al, 1990): más corto el axón, menor diámetro y menor velocidad (figura 1.1-A). Las primeras EMN en activarse son las pequeñas, esféricas del 12 % rostral de la médula (figura 1.1-B, Caputi y Trujillo-Cenóz, 1994). A los 2 ms (figura 1.1-C) ocurre la activación de la sinapsis de las caras rostrales de los electrocitos abdominales, cuyo potencial post sináptico genera V1 (Lorenzo et al, 1988, Macadar et al, 1989). Al mismo tiempo los PA que viajan por los axones de las células de relevo están llegando a la región central, donde coexisten las dos poblaciones de EMN (Caputi y Trujillo-Cenóz, 1994). Estas EMN tienen blancos diferentes: las EMN pequeñas inervan las caras rostrales de los electrocitos del centro del cuerpo del pez, mientras que las EMN grandes inervan las caras caudales de los electrocitos abdominales. Por el principio de Henneman, la diferencia de tamaños entre las EMN determina que las pequeñas descarguen primero. Este desfasaje se ve aumentado por la via que siguen los axones: los axones que inervan las caras rostrales de los electrocitos centrales y del abdomen van de forma más directa, mientras que los que inervan las caras caudales de los electrocitos abdominales salen hacia atrás, luego 7

Figura 1.1: Modelo de la dinámica de activación del OE. A-F) secuencia de activación de los diferentes componentes a partir de la activación del núcleo relé. En rojo se muestran las estructuras en actividad, en celeste el sentido de las corrientes. A) Los axones viajan a diferente velocidad, cuánto más largo más rápido. B) Los axones del AEN ya están activos. C) Comienza V1 , resultado de la actividad de las caras rostrales de los electrocitos abdominales, mientras que en la zona central están activos los axones periféricos que van a las caras rostrales de los electrocitos. D) En la zona rostral está ocurriendo V3 mientras que en la central ocurre V2 , generando corrientes en sentido opuesto. En la zona caudal ha sido activado el PEN. E) Los mecanismos de retraso provocan que las zonas central y caudal disparan de forma simultánea. V3 de la zona rostral está aún activo. F) Las caras rostrales son activadas, generando V4 en la región de la cola, y en menor medida en la región central. Figura extraída de Caputi 1999.

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bajan formando el nervio electromotor anterior y vuelven hacia las regiones rostrales (Trujillo-Cenóz et al, 1984). Por lo tanto, a continuación de V1 se produce V2 , seguido muy de cerca por V3 abdominal. El desfasaje entre estos dos últimos componentes es menor a su duración, por lo que estos componentes de polaridad opuesta se superponen parcialmente (figura 1.1-D). En este momento las EMN más caudales fueron excitadas, y todas inervan caras caudales de los electrocitos centrales y posteriores (TrujilloCenóz et al, 1984), generando V3 (4 ms, figura 1.1-E). Las corrientes generadas en las caras inervadas de estos electrocitos (en la región posterior todos los electrocitos son monoinervados caudales), activan canales voltaje dependiente en sus caras no inervadas generando V4 (4.8 ms, 1.1-F), con sentido opuesto a V3 (Trujillo-Cenoz et al, 1984, Macadar et al, 1989). La coordinación espacio-temporal de la DOE presenta dos aspectos importantes: la secuencia de activación de los componentes no homólogos (evitando en lo posible la activación simultánea de componentes de polaridad opuesta) y la sincronización de los componentes homólogos, necesaria para la sumación de sus PA. Según el esquema presentado, esta coordinación está determinada por: 1. el diámetro y longitud de los axones descendentes y periféricos; 2. el tamaño (excitabilidad) de las EMN; 3. el camino que siguen los axones periféricos; 4. el tamaño y excitabilidad de los electrocitos. Dado que la estructura del OE tiene una distribución muy similar entre las diferentes especies de gymnotiformes, en aquellos cuya DOE es monofásica o bifásica, la coordinación del acto motor se limitaría únicamente a la sincronización de las caras homólogas.

1.1.2.

Ontogenia

El OE en Gymnotus está compuesto por unidades sinciciales, similares y del mismo origen embrionario que las fibras musculares, pero han perdido el material contráctil. En efecto, Zakon y Unguez (1999) han demostrado la expresión de-novo de estriaciones correspondientes a complejos actina-miosina organizados en forma sarcomérica, provocadas por la denervación del OE. Lo mismo ocurre en el Torpedo, cuyos electrocitos también derivan del músculo y su denervación provoca la re-expresión de miofibrillas (Fox y Richardson, 1978; Gautron, 1974). Sin embargo, en 9

mormyridos, los electrocitos se diferencian de forma normal después de la denervación (Denizot et al., 1982; Szabo y Kirschbaum, 1983), por lo que su diferenciación no depende de la actividad neural. Los mormyridos estudiados hasta el momento (Szabo, 1960; Denizot et al., 1978; Denizot et al., 1982) y los gymnótidos de onda Eigenmannia lineata y Apteronotus leptorhynchus (Kirschbaum y Westby, 1975; Kirschbaum, 1977; Kirschbaum, 1983; Kirschbaum y Schugardt, 2002) poseen un OE larval que es sustituido más tarde por el OE adulto. Este fenómeno es más notable en Apteronotidae, en el cual el OE larval de origen miogénico es reemplazado por un OE adulto de origen neural, ubicado en un lugar diferente y con diferente mecanismo de electrogeneración (Kirschbaum, 1977). En gymnótidos de pulso, por otro lado, tanto los trabajos de Franchina (1997) en Brachyhypopomus pinnicaudatus como de Pereira et. al. (2007) en Gymnotus n. sp. omari muestran que estas especies tienen un único órgano a lo largo de la vida. Pereira et al (2007) muestran además que: a) tanto la electrorrecepción como la electrogeneración están presentes desde muy temprano en el desarrollo pos-natal; b) el orden de aparición de las diferentes ondas en G. n. sp omari está preprogramado (V3 -V4 -V1 -V2 ) y c) el ritmo de la descarga se vuelve similar al del adulto cuando alcanza los 45 mm de longitud. Esto tiene implicaciones en el análisis evolutivo, ya que V3 es la única onda presente en todas las familias de los Gymnotiformes, y V4 es la segunda onda con más presencia en las diferentes familias de Gymnotiformes.

1.1.3.

Valor de supervivencia o función de la DOE

La primera función descrita de la DOE fue la de su valor como arma para predar y para defenderse de los predadores, aunque su naturaleza eléctrica no fue conocida hasta el siglo XIX. Varias especies de diferentes familias han desarrollado OE capaces de generar descargas de intensidades de cientos de Voltios (las rayas eléctricas: Torpedinidae; Electrophorus electricus; Malapterurus electricus). Esta descarga mata o aturde durante algunos segundos a las presas, que quedan indefensas ante el predador. Hoy sabemos que esta función de la DOE es casi una excepción, y que tiene otras dos funciones, presentes en un número mucho mayor de familias y géneros de peces eléctricos. Estas dos funciones son: i) como portadora de señales reaferentes para la electrorrecepción activa (Lissman, 1958; Lissman y Machin 1958), ii) como portadora de señales exaferentes para comunicarse con sus conespecíficos (Mohres, 1957). Los Gymnotiformes tienen electrorreceptores distribuidos por toda la

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piel, y principalmente concentrados en la región peri-oral, donde forman una fóvea eléctrica (Castelló et al, 2000). Los electrorreceptores difieren en su respuesta a modulaciones de la amplitud, frecuencia y fase de la forma de onda de la corriente transcutánea (Bastian, 1976; Caputi et al, 2003). Este mosaico de electrorreceptores separa las señales generadas por el propio animal de las generadas por otros. Esta separación está pre-condicionada por la forma particular del cuerpo del pez (Caputi y Budelli, 1995). La forma del cuerpo hace que en la región de la fóvea circulen las corrientes generadas en la región abdominal del pez (en el caso de G. n. sp omari al menos, que es la especie más estudiada), mientras que las generadas en el centro y en la cola atraviesan la piel del animal antes de llegar a la cabeza, no influyendo en la electrorrecepción. i) Exploración activa. Los peces eléctricos tienen un mosaico de electrorreceptores sobre la piel de todo el cuerpo que les permite detectar las corrientes transcutáneas generadas por cada DOE. La estimulación de este mosaico de electrorreceptores genera una imágen eléctrica en el sistema nervioso del pez (Heiligenberg, 1975; Caputi y Budelli, 2006). Si un objeto de distinta conductividad del agua es colocado cerca del pez, se modificaran las líneas de corriente transcutáneas. En el caso de un objeto metálico, habrá un aumento de la densidad de corriente enfrente al objeto, a costa de las corrientes aledañas, por lo que el patrón espacial de corrientes tendrá forma de sombrero mexicano (Caputi y Budelli, 2006). Cuando esta nueva imagen es comparada con las anteriores en el cerebro del pez, éste es capaz de determinar las diferencias y de extraer información relevante para su supervivencia (la distancia al objeto o si es animado, entre otras). Tal cual se explicó previamente, en G. n. sp omari se describió la existencia de una fóvea eléctrosensorial en la región peri-oral. En esa fóvea se encuentran tres tipos de electrorreceptores (Castelló et al, 2000). ii) Electro-Comunicación, dentro de esta función se consideran dos aspectos: a) reconocimiento de especie: la DOE tiene ciertas características invariantes que podrían ser utilizadas por los peces para reconocer conespecíficos. Por ejemplo, podría ser la frecuencia de descarga, la amplitud pico a pico, el número de picos, o la duración. Diversos estudios indican que algunas especies utilizan más de una característica para el reconocimiento de coespecíficos; por ejemplo, Eigenmannia virescens, es capaz de diferenciar señales eléctricas tomando en cuenta la tasa de descarga (Kramer y Kauzinger, 1991) y también la forma de onda (Kramer y Zupanc, 1986, Kramer 1999). b) Comunicación intraespecífica. Tanto la tasa de descarga como la forma de onda de la DOE parecen estar implicadas en la comunicación in11

traespecífica. Se ha mostrado que la mayoría de las especies tienen DOEs sexualmente dimórficas con un claro rol en los rituales de cortejo y de dominancia en la época reproductiva (Hopkins et al, 1990; Franchina et al, 2001; Zakon et al, 2002; Quintana et al, 2004; Silva et al, 2007). Kramer y Otto (1988) mostraron que las hembras de Eigenmannia spp son capaces de discriminar entre machos y hembras de su especie por la forma de onda. Por otro lado, los machos de Sternopygus macrurus producen señales eléctricas de cortejo preferentemente ante ondas eléctricas que estén dentro del rango de frecuencias de las hembras de la propia especie (Hopkins, 1972). Triefenbach y Zakon (2003) mostraron que los individuos de Apteronotus leptorhynchus reconocen signos de status y sexuales, además de que tienen: “some internal representation of their own social status”. Poseen también señales eléctricas especiales (chirps) con función agresiva y/o de cortejo durante la época reproductiva. En G. n. sp omari, cuando la señal generada por el mismo pez (sLDOE) y la generada por un coespecífico (cLDOE) son registradas en la fóvea se ven diferencias significativas (Aguilera et al, 2001). La sLDOE tiene tres componentes V1 -V3 -V4 (V4 es muy pequeña, incluso menor que V1 ), mientras que en la cLDOE, V1 /V3 es cinco veces menor (con el coespecífico a 7 cm) y presenta una relación V2 /V3 y V4 /V3 similar a la DOEht. Por otro lado, el pico de V3 de la sLDOE ocurre antes que el pico de V3 de la cLDOE. Dado que el campo no se propaga, sino que es instantáneo, esta diferencia de tiempos apoya la tesis de que la sLDOE se genera fundamentalmente en la región abdominal o anterior, mientras que la cLDOE se origina fundamentalmente en la región central y tal vez parte de la posterior (activadas más tardíamente que la región abdominal, figura 1.1).

1.1.4.

Evolución

El estudio de la evolución de los peces eléctricos se remonta a Darwin, el cual plantea en la sección Dificultades a la Teoría de El Origen de las Especies (1859, y amplía la sección en la segunda edición, 1866) dos problemas acerca de la evolución de los órganos eléctricos. Por un lado, en esa época, la única utilidad que le veían a la descarga eléctrica era la de defensa o ataque, por lo que los peces con OE de descarga débil tendrían OE sin función, algo completamente en contra de la teoría de Darwin. De todas formas, afirma que "sería muy temerario sostener que no son posibles transiciones útiles mediante las cuales estos órganos pudieran haberse desarrollado gradualmente". Por otro lado, Darwin observó que el grupo de los peces eléctricos era polifilético, ya que estaba presente en especies

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muy alejadas filogenéticamente entre sí. Dada la diversidad en la locación del OE, de la estructura del mismo y de las diferencias en los nervios que controlan los OE, Darwin planteaba, acertadamente, que estos OE no podían considerarse como homólogos sino como análogos en su función. Los estudios evolutivos modernos se basa principalmente en análisis moleculares, morfométricos y geográficos (Albert y Crampton, 2005; Crampton y Albert, 2005). La diversificación de la forma de onda de la DOE es analizada como un corolario de la especiación o se analiza su posible rol como mecanismo de aislamiento o reconocimiento de especies durante el cortejo. Su estudio ha estado limitado a la comparación de los campos lejanos generados o a estudios aislados de electrocitos in vitro. Falta, sin embargo, el estudio detallado sobre los mecanismos subyacentes a la generación de las diferencias observadas entre las formas de onda de las diferentes especies. La carencia de información precisa sobre: a) los perfiles espacio temporales que caracterizan la electrogeneración en cada especie; b) las características electrofisiológicas de las fuentes involucradas y c) la importancia funcional de los distintos subcomponentes del acto electromotor motiva la presente tesis. En Mormyridos este tipo de estudios está más avanzado, ya que la complejización de la DOE reside en mecanismos periféricos, más específicamente en la forma, la inervación y la dotación de canales de los electrocitos (Hopkins, 1999; Lovoue et al, 2008). De hecho, Bennett (1971) muestra que el registro extracelular de un electrocito reproduce la DOEht. Los Mormyridos tienen el OE concentrado en el apéndice caudal, y la forma de onda es similar en todos los puntos del campo. Dicha forma de onda está determinada por la actividad sincrónica de los electrocitos. En los gymnotiformes de pulso, cuyo OE está distribuido a lo largo de todo el cuerpo (incluso algunas especies tienen órgano en la cabeza) la complejización de la DOE reside no solo a nivel electrocítico (donde aparece la novedad de la doble inervación) sino también a nivel del sistema nervioso, el cual exhibe un generador espinal-periférico de patrones que controla los tiempos de activación de las diferentes estructuras electrogénicas (Caputi, 1999). Dicha complejidad hace que la DOE de los gymnótidos de pulso sea un ejemplo atractivo para el estudio evolutivo de un patrón motor fijo. El primer Gymnotus descrito fue G. carapo por Linneus en 1758. Al día de hoy se conocen 32 especies dentro de este género (Albert y Crampton, 2005). Esta diversidad permite utilizar este patrón de acción fijo como ventana para identificar eslabones robustos y lábiles en el sistema nervioso desde el punto de vista evolutivo.

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Parte II Hipótesis y Objetivos

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Capítulo 2 Hipótesis y Objetivos 2.1.

Objetivo General

El campo eléctrico asociado a la DOE ha sido utilizado durante años como signo de especie. Se caracteriza por tener un patrón espacio temporal complejo. En los estudios de evolución de señales eléctricas ha sido utilizada únicamente la forma de onda del campo lejano como signo estándar. El análisis espacio-temporal de la DOE mediante diferentes técnicas puede revelar los mecanismos por los cuales es implementada. Nuestro primer objetivo fue explorar la diversidad en la causalidad de la DOE a través del análisis de las diferencias espacio temporales de la descarga entre seis especies del género Gymnotus spp. Por otro lado, en G. n. sp omari la DOE es portadora de señales para la electrocomunicación y para la electroexploración sensorial. Ambas señales consisten en la modulación de dos portadoras generadas en el mismo acto electromotor, pero en regiones del pez diferentes, con diferencia de fase y de forma de onda. Como consecuencia, el patrón espacio-temporal del campo en la región de la fóvea del pez emisor (energía portadora para la electroexploración sensorial), es diferente al campo en la región de la fóvea de otro pez (energía portadora de electrocomunicación). Nuestro segundo objetivo fue estudiar la diversidad entre las formas de onda de las portadoras de electrocomunicación así como la diversidad entre las portadoras de electroexploración activa en el genero Gymnotus spp. Para alcanzar estos objetivos se exploraron: a) tres especies formalmente descriptas (G. coropinae, G. carapo y G. pantanal) representativas de dos de los tres clados taxonómicos principales del genero Gymnotus spp y b) tres especies aún no formalmente descriptas, dos de la cuenca del río Paraná (G. n. sp. itapua, y G. n. sp. mamacha) y la especie autóctona mejor estudiada al

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presente: G. n. sp omari. El estudio se basó en los resultados obtenidos mediante el empleo de distintas técnicas electrofisiológicas y se articuló con otros estudios que se realizaron en paralelo en el laboratorio.

2.2.

Hipótesis

Se plantean las siguientes hipótesis con respecto a la evolución y a la diversidad de la DOE: 1. La diversidad de formas de onda en distintas especies de Gymnotus resulta de la expresión de: Distintos mecanismos electrogénicos de acuerdo a su origen (muscular y/o neural, pudiendo ambos estar asociados). En el caso de los mecanismos de origen muscular de las diferencias entre: • Los patrones tisulares y de inervación del OE, • Los mecanismos de coordinación neurales, • La excitabilidad del OE. 2. La DOE es portadora de dos tipos de señales: de exploración activa y de comunicación. Nuestra segunda hipótesis es que en todas las especies las portadoras de comunicación y de exploración activa poseen características espacio-temporales diferentes, y al estar ambas señales asociadas, debido a que son generadas en el mismo acto, puede ocurrir que durante la especiación: Ho) exista una co-variación de la forma de onda de ambas portadoras; H1) varíe una sola. Como corolario de esta segunda hipótesis, dado que la DOEht es especie específica y similar a la cLDOE, entonces la segunda hipótesis implica que la principal variación es en la forma de onda de la portadora de comunicación.

2.3.

Objetivos específicos

Los objetivos específicos fueron explorar el sistema electrogénico utilizando las siguientes técnicas electrofisiológicas:

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1. Campo lejano. Históricamente, los registros de la diferencia de potencial entre dos puntos alineados con el eje longitudinal del cuerpo del pez han sido utilizados como signo de especie. Estos registros son necesarios para correlacionar los hallazgos de esta tesis con la forma habitual de caracterización de la descarga. 2. Trampa de aire múltiple. Esta técnica permitió discriminar las fuerzas electromotrices generadas por cada región del cuerpo del pez, así como visualizar y cuantificar el retraso rostro-caudal en la secuencia de activación de los electrocitos. También exploramos con esta técnica los efectos del curare sobre la descarga de G. n. sp. itapua y G. n. sp omari. El curare permite discriminar entre los componentes generados por invasión de aquellos generados sinápticamente. 3. Trampa de aire simple. Los resultados obtenidos mediante el empleo de esta técnica nos aportó una medida global de la fuerza electromotriz y la resistencia interna longitudinal total de la fuente equivalente al cuerpo del pez. Su complemento con cargas no lineales (diodos) nos permitió explorar en forma global y no invasiva algunos aspectos de la excitabilidad electrocítica. 4. Análisis del campo cercano. El análisis de los campos cercanos complementó el estudio en trampa permitiendo identificar fuentes, sumideros y puntos de reversión en el pez descargando en el agua. Esto brindó información suplementaria para confirmar o refinar los hallazgos efectuados en el estudio en trampa de aire.

2.3.1.

Hipótesis 1

La hipótesis 1 es un conjunto de juicios particulares y su contraste empírico por lo tanto consiste en la identificación de ejemplos de diversidad de forma de onda a partir de un patrón general común, que sean representativos de taxones distintos, y que se expliquen por modificaciones en algunos de los cuatro mecanismos propuestos. Dicha identificación no implica la ausencia de otros mecanismos responsables de la diversidad de la DOE. Por lo tanto la validez de la hipótesis no excluye la existencia de otros mecanismos de organización de la descarga, cuya identificación en el futuro pueda ampliar el espectro conocido de potencialidades evolutivas. La prueba de hipótesis para cada uno de los mecanismos se basó en diferentes técnicas.

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1. Distintos patrones estructurales y de inervación del OE. La correlación del patrón espacio temporal de la descarga del OE explorado por regiones con la técnica de trampa múltiple y los registros locales de campo con los resultados anatómicos obtenidos con la técnica de Cajal y De Castro. 2. Comparación de los mecanismos neurales de coordinación. Estos se expresan de dos formas: i) el sincronismo de las caras homólogas; ii) La secuencia de activación de las caras no homólogas. Tomamos como medida de sincronismo la progresión de los tiempos de V3 de los distintos componentes a lo largo de las siete regiones contiguas exploradas con trampa múltiple. Como medida de secuencia de activación del OE tomamos el intervalo V2 -V3 de cada región. Diferencias especie específicas en alguno de estos índices indicaría cambios en los mecanismos de control neural durante la evolución. Además, comparamos los tiempos de aparición de un componente de aparente origen neural (V1cp ). 3. Propiedades electrociticas. Las ondas V4 y V5 son de origen electrocítico puro, por lo tanto el análisis de dichas ondas fue realizado considerando que derivan de la respuesta electrocítica a la onda inmediatamente precedente: i) la diferencia en la relación V4 /V3 sin carga sugieren diferencias en la excitabilidad del OE. ii) La dependencia de V4 de la corriente generada por V3 en experimentos de clampeo de corriente (utilizando diodos) confirmó las diferencias especieespecíficas en la excitabilidad del OE. 4. Componentes de origen neural. Detectamos un componente de posible origen neural, sin embargo al momento de finalizar este estudio esta hipótesis no fue puesta a prueba experimentalmente por las limitaciones impuestas por el escaso número de peces en relación con la diversidad de técnicas utilizadas.

2.3.2.

Hipótesis 2

Comparación de los campos locales registrados a nivel de la fóvea electrosensorial generados por la descarga del órgano eléctrico del propio pez y la de un co-específico de las especies estudiadas. Se pondrán a prueba comparando entre sí las sLDOE y las cLDOE de varias especies, así como la sLDOE con la cLDOE perteneciente a la misma especie.

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Parte III Resultados

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Se exploró la diversidad de los sistemas electrogénicos desde cuatro puntos de vista diferentes. Se analizó: 1) el campo eléctrico generado; 2) el perfil espacio temporal de las fuerzas electromotrices; 3) el patrón de inervación y densidad de electrocitos y 4) algunas características de las fuentes electrogénicas en relación con la carga. Los resultados están divididos por técnica en subcapítulos. Esto facilitará la comparación de los resultados obtenidos de cada especie con cada técnica con los resultados obtenidos en G. n. sp. omari. La descripción de los métodos se realiza al inicio de cada subcapítulo, con una descripción de las principales limitantes de cada uno de ellos.

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Capítulo 3 El campo eléctrico generado 3.1.

Introducción

El campo eléctrico generado es la expresión de la potencialidad de la descarga del OE en un contexto de carga dado. El campo eléctrico generado tiene un patrón espacio temporal de energía cuyas características generales son relativamente conservadas para cada especie (Caputi, 1999; Hopkins, 1999). No obstante la posibilidad que tienen los objetos de conductividad distinta que el agua de modular dicho patrón, hace posible que dicho campo ejerza la función de portadora de señales para la exploración activa (Lissman, 1958). Generalmente, en el estudio de la DOE se reduce la complejidad de la DOE mediante el análisis de la DOE cabeza cola. Este tipo de registro ha sido útil para la identificación de especies, y es el signo de especie más comúnmente utilizado, pero considera el OE como puntual y homogéneo. Con este tipo de registro se pierde importante información a la hora de caracterizar la DOE, ya que como dijimos en la introducción, en G. n. sp. omari (y todos los Gymnotiformes conocidos), el OE está distribuido espacialmente y su activación sigue un patrón temporal específico. Por lo tanto, el campo eléctrico asociado a la DOE tiene un patrón con tres dimensiones espaciales más la temporal, que pueden ser revelados solamente si cuando registramos tenemos en cuenta, además de la dimensión temporal, la espacial. Mediante el registro de los campos locales perpendiculares al cuerpo del pez es posible identificar las fuentes (corriente saliente) y sumideros (corriente entrante), así como la localización de los diferentes generadores (puntos de reversión) a medida que transcurre la DOE. Por otro lado, el potencial de campo eléctrico asociado a la actividad de cada uno de los diferentes generadores varía espacialmente, por lo que

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registramos en la fóvea electrorreceptiva el campo local generado por el propio pez y el potencial de campo generado por la descarga de un conespecífico. Es de destacar que la forma de onda de los campos locales autoemitidos (señal reaferente, vinculada con la electroexploración activa) y los campos locales emitidos por conespecíficos (señal exaferente, vinculada con la electrocomunicación) es distinta, al menos en G. n. sp. omari. Esto indica que las portadoras reaferente y de comunicación, si bien son generadas en el mismo acto electromotor, son diferentes (Aguilera et al, 2001). Las características de estos dos campos eléctricos determinan su capacidad de transportar información tanto para el propio sistema electrosensorial como para el sistema electrosensorial de otro pez (Caputi et al, 2002; Aguilera et al, 2001). Analizamos las diferencias en la forma de onda y en la temporalidad de estos dos campos para tratar de identificar cuál de los múltiples generadores es la fuente principal de estos potenciales de campo. En la primer publicación al respecto (Aguilera et al, 2001), a estos potenciales registrados en la fóvea se le denominó sLDOE (self Local DOE, DOE local propia) y cLDOE (coespecific Local DOE, DOE local de un coespecífico), acá mantenemos esa nomenclatura. A raíz de lo observado en los registros de campo local (actividades simultáneas en diferentes regiones y con polaridad opuesta) registramos la DOE a diferentes conductividades y distancias del cuerpo del pez. Se ha demostrado que la baja conductividad y la forma ahusada del cuerpo de G. n. sp. omari canaliza la corriente en la dirección longitudinal. Este es un mecanismo post-efector que modula la proporción en la cual la energía emitida por los diferentes componentes se expresa como corriente o diferencia de potencial (al igual que el sistema de palancas del esqueleto negocia la relación entre fuerza y acortamiento muscular). Dadas las similitudes anatómicas entre las especies, es altamente probable que el cuerpo de los peces pertenecientes a este género tenga el mismo tipo de acción post efectora sobre sus propias DOEs. Como corolario, dado que los diferentes componentes se originan en diferentes regiones del pez, el campo generado por cada componente decae con diferente constante de atenuación. Por otro lado, en cualquier caso, y en particular en el registro cabeza cola, los diferentes generadores están a diferente distancia de los electrodos de registro y por lo tanto la diferencia de potencial registrada es una fracción distinta de la registrada cerca del sitio de generación. Otro factor que influye sobre la constante de atenuación es la conductividad del agua: a mayor conductividad, mayor atenuación. Por lo tanto, si registramos la DOE a diferentes distancias del cuerpo del pez, o en aguas de distinta conductividad, vamos a observar diferentes amplitudes relativas entre los diferentes componentes, debido a las diferentes constantes de atenuación. 22

3.2.

Métodos

Utilizamos 10 individuos de G. n. sp. omari, 6 G. carapo, 12 G. coropinae, 10 G. n. sp. itapua, 10 G. n. sp. mamacha y 1 G. pantanal. Estas especies fueron clasificadas por especialistas asociadas a este proyecto (W.G.R. Crampton y J. Albert). Registro cabeza-cola. Los peces fueron colocados en un acuario de 45x26cm con 5 cm. de agua a 30µS/cm, y 24◦ C, salvo cuando se estudien los efectos de estas variables (ver más abajo). Para evitar el movimiento del pez lo colocamos dentro de una malla de nylon, paralelo al eje mayor del estanque y equidistante a los extremos. Se utilizó un tiempo de habituación de 15 minutos y registramos durante 2 minutos. Las señales fueron captadas usando electrodos colocados en la misma línea que el eje mayor del pez. Dado que uno de los electrodos se coloca frente a la cabeza y el otro frente a la cola, este tipo de registro es llamado normalmente como ’cabeza cola’ o campo lejano. La señal captada por estos electrodos fue amplificada diferencialmente y la salida del amplificador fue digitalizada a 50 kHz o más. Tomamos promedios peri-evento de 8-64 DOEs para analizar la forma y amplitud de la DOE. Para estudiar el espectro de potencias tomamos 0.04128 s ((1:2064)*1/50Khz). Teniendo en cuenta la variabilidad del registro cabeza cola con la conductividad y distancia, en tres de estas especies registramos y analizamos las DOE a distancias progresivas de 4 cm (desde 0 a 16) a tres conductividades diferentes (10, 50, y 100µS/cm). Campo cercano: Los peces fueron colocados en las mismas condiciones que para el registro cabeza cola. Utilizamos dos electrodos con una referencia común, de manera tal que los tres electrodos (el de referencia común más los dos activos) determinen un ángulo de 90◦ en el plano horizontal, con el electrodo de referencia en el vértice, separados 2.5 mm. Los electrodos eran de cobre, aislados excepto en la punta. Los electrodos fueron movidos sobre una recta paralela el eje mayor del pez, a 2 mm de distancia en el punto más cercano del pez. Registramos los campos locales cada 5 mm, o cada 2, dependiendo de la complejidad del campo. Utilizamos el registro cabeza cola para alinear los registros locales.

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3.3.

Resultados

3.3.1.

La DOE registrada en el campo lejano

Debido a que la mayoría de la bibliografía se encuentra en inglés y refiere al registro cabeza-cola como DOEht (head-tail), mantendré esta sigla en lugar de DOEcc que sería la sigla en español. Como en otros capítulos, se toma G. n. sp. omari como referencia y se contrasta las DOEs de cada especie contra la DOE de G. n. sp. omari , normalizadas al pico de V3 (3.1, izquierda). Esto facilita comparar y visualizar las similitudes y diferencias de la forma de onda. De igual manera se presentan los espectros de potencia (3.1, derecha), en este caso normalizados por el valor RMS. De esta manera podemos ver la contribución de cada banda de frecuencias a la potencia total de la DOEht, independientemente de su potencia total. Es importante notar que con esta forma de presentación de los datos se pierden las diferencias de amplitud que pudiesen ser especies específicas. Dado que el rango de longitudes exploradas varió entre un 25 % y un 75 % de la distancia interelectrodo, la comparación de amplitudes crudas puede dar lugar a interpretaciones equivocadas ya que la amplitud aumenta con el largo del pez y cae con el cuadrado de la distancia. Otra forma de comparar las amplitudes de cada componente de onda es utilizando el procedimiento de trampa de aire, tanto simple como múltiple, el cual permite estimar la fuerza electromotriz de cada uno de los picos (se muestra en el capítulo de registro en el aire). En el recuadro, a la izquierda de la DOEht se muestra el inicio del mismo registro amplificado para observar los componentes más débiles. Todas las especies estudiadas presentan el patrón básico V2 -V3 -V4 , que puede ser más breve o más duradero según la especie. En cuatro de las cinco especies comparadas con G. n. sp. omari la DOE comienza con V1 y termina con V5 (G. n. sp. itapua, G. n. sp mamacha, G. carapo y G. coropinae). Tres de ellas (G. coropinae, G. carapo y G. n. sp. mamacha) presentan un componente temprano positivo entre V1 y V2 . La especie que presenta menos componentes de onda es G. pantanal, la cual no presenta V5 , al igual que G. n. sp. omari, y es la única que no tiene V1 . En la figura 3.1-A (izquierda) se muestra la DOE de G. n. sp. itapua superpuesta con la DOEht de G. n. sp. omari. Como puede verse son muy similares excepto en el final de la onda. G. n. sp. itapua presenta una V4 de mayor amplitud, pero más breve y finaliza con una V5 de baja amplitud y muy lenta. Esto se refleja en el espectro de potencias (3.1-1A derecha), corrido hacia frecuencias más altas, pero con el mismo perfil. El rango de las modas del espectro de potencias (PPF, por sus siglas en inglés, peak 24

Figura 3.1: DOE registrada en el agua. A-E) Izquierda: forma de onda normalizada por el pico principal (V3 ). En rojo se muestra como referencia la forma de onda de G. n. sp. omari. Derecha: espectro de potencias normalizados por el RMS. Ancho de barra=24.14 Hz. En rojo se muestra el espectro de potencias de G. n. sp. omari. Notar que G. carapo y G. coropinae tienen escala diferente al resto de las especies, pues sus espectros de potencias tienen rangos mucho mayores.

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power frequency) fue de 0.793 a 1.0185 kHz (media 0.866) para G. n. sp. omari y de 0.920 to 1.160 kHz (media 1,046) para G. n. sp. itapua. G. n. sp. mamacha (3.1 B izquierda) presenta varias diferencias significativa con respecto a G. n. sp. omari y es similar a G. n. sp. itapua salvo en el peso de V1 , de menor amplitud. Con la magnificación de la figura principal no es posible apreciar V1 , y aún en el recuadro es apenas visible, aunque su existencia es claramente demostrada en el registro local (ver más adelante). A diferencia de G. n. sp. itapua en G. n. sp. mamacha se observa componente positivo lento entre el componente V1 (3.1 B izquierda, flecha) y V2 . La DOE finaliza con una V4 de mayor amplitud relativa que V4 de G. n. sp. omari y una V5 lenta y débil. El espectro de potencias dominado por el complejo V2 -V5 es muy similar a G. n. sp. itapua, es decir está levemente corrido hacia frecuencias mayores, pero de perfil similar G. n. sp. omari. La forma de onda de la DOEht de G. carapo (3.1 C) es muy similar a G. n. sp. mamacha, presentando las mismas diferencias más una adicional, o más marcada, que es la brevedad del complejo V2 − V3 − V4 − V5 . V1 , presente en el registro local cefálico esta sustituido por una deflexión positiva lenta similar a la observada en G. n. sp. mamacha. V5 es más rápida y de mayor amplitud relativa. El espectro de potencias se muestra corrido hacia la derecha (el eje de las frecuencias es más amplio) y el PPF es 1.8 (rango 1.606 a 1,961kHz) y su potencia relativa por bin no llega a 1,5 % (3/5 del valor del PPF de G. n. sp. omari ), indicando un espectro de potencias más distribuido. G. coropinae (3.1 D) es la especie que presenta la DOE más compleja, junto con el OE más diferente. La DOE es la más breve de las estudiadas, y es también, como veremos más adelante, la más débil. La onda comienza con V1 (recuadro), seguida de un pico positivo con dos orígenes (ver campo local y efecto de la conductividad más adelante) y continúa con el complejo V2 − V3 − V4 − V5 . Es de destacar que este complejo dura lo mismo que el componente V3 de G. n. sp. omari. El PPF es aún mayor (media 3.014, rango 2.759 a 3,246kHz) que el de G. carapo y el espectro de potencias es el de mayor rango. La última especie estudiada, aunque no profundizaremos mucho en ella, ya que obtuvimos un solo ejemplar es G. pantanal (3.1 E). La DOEht es muy parecida a G. n. sp. omari , pero con una diferencia muy importante: no presenta V1 ni en la DOEht (ver recuadro) ni en el registro local (ver mas adelante). Por el espectro de potencias no es posible diferenciarla de G. n. sp. omari

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3.3.2.

La DOE en el registro local

Cada una de las especies mostró amplitudes, tiempo de activación y lugar de origen característico de cada uno de los componentes y reveló de forma inequívoca la presencia de múltiples generadores. Es importante destacar que en varias especies se observó la presencia de varios generadores de polaridad opuesta activados al mismo tiempo en diferentes lugares del cuerpo. Este hallazgo ha forzado una modificación a la nomenclatura de los componentes de onda. Nomenclatura a utilizar. De acuerdo al concepto de homología funcional introducido en la tesis de Doctorado de Caputi (1994), dos componentes son funcionalmente homólogos si son generados por el mismo mecanismo (Tabla 1). Por lo tanto, el subíndice ‘1’ no refiere al primer componente de la DOE, ya que pueden ser diferentes en diferentes especies (por ej: G. pantanal comienza con V2 ), sino que refiere a un componente cabezanegativo generado por los potenciales pos sinápticos (lentos) de las caras rostrales de los electrocitos; ’2’ refiere a los componente también cabeza negativos pero generados por los potenciales de acción (PA, rápidos) generados sinápticamente de las caras rostrales; ’3’ refiere a los potenciales cabeza positivos generados por los PA generados por las caras caudales; ’4’ refiere a los potenciales cabeza-negativos generados por los PA de las caras rostrales, pero ’4’ (a diferencia de 2) es activado periféricamente por las corrientes de ’3’; por último ’5’ refiere a PA de las mismas caras que generaron ’3’, pero activadas por el mismo mecanismo que ’4’ y aparecen a continuación de ’4’. Para enfrentar la diversidad de ondas exhibidas por las especies estudiadas sin establecer un quiebre en la nomenclatura habitualmente aceptada, ha sido necesario agregar un segundo subíndice a los componentes relacionado con el origen espacial del mismo. A los subíndices anteriormente citados les agregamos letras que refieren a las tres regiones en que dividimos el cuerpo del pez: a (anterior), c (central) y p (posterior). Es importante aclarar que confirmamos mediante el uso de curare en G. n. sp. omari y G. n. sp. itapua que los diferentes componentes son homólogos, pero no lo corroboramos en las restantes especies. Las similitudes encontradas en la anatomía y en las cuatro técnicas electrofisiológicas diferentes utilizadas apoyan la extensión de la homología (ver más adelante). En las figuras 3.2 (G. n. sp. omari ), 3.3 (G. carapo), y 3.4 (G. coropinae) se representan los campos perpendiculares registrados a lo largo del pez cada 0,2 cm e interpolados. En el eje vertical se muestra la posición relativa al pez y en el horizontal la evolución temporal. La amplitud y dirección del campo está codificada en colores (amarillo-rojo: saliente al pez, i.e., fuente; 27

Cuadro 3.1: características de los diferentes componentes homólogos de la DOE. PA:Potencial de Acción. Componente V1 V2 V3 V4 V5

Polaridad Negativa Negativa Positiva Negativa Positiva

Mecanismo Potencial de placa PA Post sináptico PA Post sináptico PA por Invasión PA por Invasión

Región del pez Anterior Central Anterior/central/posterior Central/posterior Posterior

celeste-azul: entrante, i.e, sumidero). La escala de colores fue ajustada de forma no lineal para maximizar el contraste. Se muestra también la forma de onda (trazos blancos) de algunos registros seleccionados a modo de referencia. En la figura B se muestra el patrón de corrientes a lo largo del pez en los instantes indicados en A. Los tiempos indicados son en relación al pico de V3 en la DOEht. Las flechas ubicadas en el punto de reversión indican la localización de la fuente responsable del patrón de corrientes en ese instante.

G. n. sp. omari. Con este tipo de registro es posible observar el dominio espacial y temporal de cada uno de los componetentes observados en la DOEht. Puede observarse que V1 tiene su punto de reversión al inicio de la aleta anal (figura 3.2 B, -1.2) por lo que la denominamos V1a . 0.6 ms después puede verse como el sumidero se alarga espacialmente y la fuente se desplaza rápidamente hacia una región más caudal, indicando la activación de V2c . Cuando este componente aún no ha finalizado, en la región caudal comienza V3a , superponiéndose parcialmente ambas actividades. En 0 ms ocurre el máximo de V3acp , este componente cabeza-positivo ocurre a lo largo de todo el cuerpo. El punto de reversión está más atrás que el de V2 (70 % del pez, flecha de la tercera gráfica de figura 3.2 B). V4a comienza antes que termine V3p , y se propaga caudalmente, siendo más duradero y de mayor amplitud en la región de la cola. Cuando llega a su máxima intensidad, (+0,6) tiene su punto de reversión un poco más atrás que V3acp , en el 85 % de la longitud del pez (ultima gráfica de figura 3.2 B) Por lo tanto, el patrón de corrientes transversales a G. n. sp. omari es un patrón trifásico que comienza localizadamente para luego invadir progresivamente, con el punto de reversión avanzando en el eje longitudinal con el transcurso de la onda. En el pico principal todo el cuerpo del pez está eléctricamente 28

activo, la actividad comienza a cesar desde la región rostral, finalizando con la actividad local de V4p . G. carapo. En el mapa de colores de los campos locales de esta especie (figura 3.3 A) se ve actividad 1.2 ms antes del pico de V3cp , con fuente y sumidero localizados en la región rostral, entre las branquias y el inicio de la aleta anal. Este componente cabeza negativo (no se ve en la DOEht, figura 3.1 C), lento y de baja amplitud, es V1a . Antes de que finalice, comienza una onda caudal lenta o cabeza positiva, que llamamos provisoriamente V1cp , en la región de la cola (-0,8). En la DOEht se observa únicamente la actividad caudal. Estas dos actividades eléctricas tienen una ’región fuente’ central común y sus sumideros en los polos del pez. Los puntos de reversión, que indican la posición del generador están en el 10 % (V1a ) y el 75 % (V1cp ) de la longitud del pez (3.3 B, segundo trazo). En -0,3 ms se invierten las fuentes y sumideros, teniendo ahora también dos regiones activas pero ahora con una ’región-sumidero’ central común y las fuentes en los polos del pez. La actividad es más intensa, y nuevamente lo que se observa en este instante en la DOEht es la actividad generada más caudalmente, cabeza negativa e identificada como V2c . La actividad rostral localizada corresponde a V3a . El punto de reversión de V3a es el mismo que para V1a , mientras que el punto de reversión de V2c está en el 50 % de la longitud del pez, un poco más rostral que el punto de reversión de V1cp , por lo que probablemente no corresponda a la misma fuente (grupo de electrocitos) que se invierte, como ocurre con V1a - V3a . V3a continúa después que V2c termina y comience en su lugar V3cp . En este momento todo el pez participa en la generación de la DOE, actuando la primera mitad del pez como fuente y la segunda como sumidero. El punto de reversión está en 50 % del cuerpo del pez (figura 3.3 B, 0 ms). Luego ocurre V4 (+0,5) de forma similar a G. n. sp. omari, pero de menor duración y por último V5 donde se invierten nuevamente (+1,1) la fuente y el sumidero. G. coropinae: De forma similar a las especies anteriores, el pico de V1a está en -1.3 ms, aunque la secuencia del resto de la onda es mucho más rápida. La duración de este componente (V1a ) es prácticamente la misma que la de todos los otros componentes juntos. Esta onda muestra también, al igual que G. n. sp. omari y G. carapo una fuente y un sumidero muy localizados, pero con el punto de reversión en la zona de la mandíbula, donde se encontró el OE cefálico (ver resultados anatómicos). La siguiente particularidad observada en estos registros es la generación simultánea de V3a y V2cp (figura 3.4 B, -0.2 ms). Al igual que en G. carapo V3a tiene su punto de reversión en el mismo lugar que V1a , y V2cp aproximadamente en el 75 % de la longitud del pez (más atrás que en G. carapo y G. n. sp. omari ). En este instante el pez tiene un gran sumidero central, compartido por 29

Figura 3.2: Patrón de corrientes transcutáneas en G. n. sp. omari. Los campos eléctricos perpendiculares al eje principal del cuerpo del pez fueron registrados sobre una recta a dos cm del pez en el punto más cercano. El mapa de colores indica la localización de las fuentes (amarillorojo) y los sumideros (celesteazul) a lo largo del pez (eje vertical) mientras la DOE progresa en el tiempo (eje horizontal); el verde indica campos despreciables. Los trazos blancos corresponden al campo registrado, y se muestran a modo de referencia. B) Se muestra el patrón de corrientes a los tiempos señalados en A con líneas negras, indicando las fuentes, sumideros y puntos de reversión. G. n. sp. omari muestra cuatro componentes claros: V1a , se invierte alrededor del inicio de la aleta anal; V2 se invierte alrededor de la mitad del pez; V3acp y V4cp se invierten en la región caudal. En esta especie existe una clara correlación entre el orden espacial y el origen espacial de los cuatro componentes. Dado que hay ondas homólogas que se generan en diferentes partes del cuerpo a diferentes tiempos, utilizamos un subíndice numérico que indica el mecanismo de activación y una letra para indicar la posición en el espacio (a: anterior; c:central (central); p: posterior). Con modificaciones de Rodríguez-Cattáneo et al, 2008.

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Figura 3.3: Patrón de corrientes transcutáneas de G. carapo. El campo eléctrico perpendicular al eje principal del pez fue registrado a través de una recta paralela al pez a 2 mm de distancia en el punto más cercano (se utiliza la misma resolución y código de colores que en la figura 3.2). Los tiempos indicados son en relación a V3cp (0 ms). La primer actividad clara ocurre en -1.2 ms, y es una actividad muy localizada, con la fuente ubicada en la cabeza y el sumidero en la región abdominal. Antes de que finalice este componente comienza V1cp (-0.8 ms) en la región caudal, con polaridad opuesta. Este componente se invierte alrededor del 75 % del pez; La actividad se invierte 0.5 ms después, con la coocurrencia de V3a y V2c . En este momento el centro del pez actúa como sumidero y ambos extremos como fuente. El complejo V3cp y V4cp (0 ms y 0.5 ms ) tiene el mismo perfil que en las otras especies. La actividad finaliza con el rebote correspondiente a V5p . (a: anterior; c:central (central); p: posterior) Modificado de Rodríguez-Cattáneo et al, 2008.

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Figura 3.4: Patrón de corrientes transcutáneas de G. coropinae. El campo eléctrico perpendicular al eje principal del pez fue registrado a través de una recta paralela al pez a 2 mm de distancia en el punto más cercano (se utiliza la misma resolución y código de colores que en la figura 3.2). Los tiempos indicados son en relación a V3cp (0 ms). La primer actividad clara ocurre en -1.3 ms, y es una actividad muy localizada, con la fuente y el sumidero ubicados antes de las agallas, ambos en la región cefálica. Después de un período considerable de tiempo, en -0.2 la actividad en este lugar se invierte y al mismo tiempo ocurre V2c , en el 75 % del pez. En este momento el centro del pez actúa como un gran sumidero central y los extremos como fuente. A partir de ese momento la sucesión de ondas acurre de forma muy rápida. En 0 y en 0.2 ms ocurren V3cp y V4cp , con el mismo perfil especial que las especies anteriores, finalizando con la actividad de V5 en la región de la cola (0.4 ms). (a: anterior; c:central (central); p: posterior) Modificado de RodríguezCattánaeo et al, 2008.

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ambos generadores, y las fuentes en los extremos del pez. Luego ocurren V3cp , muy breve, seguida de V4cp y V5cp , todas predominando en amplitud en las regiones caudales. El mapa de colores de los registros de campo de G. n. sp. itapua es muy similar al de G. n. sp. omari , pero con V4 y más profunda y V5 . No obtuvimos registros de G. n. sp. mamacha y G. pantanal

3.3.3.

La DOE registrada en la fóvea electrosensorial

La DOE sirve para dos propósitos: exploración sensorial y comunicación. Para conocer la forma de onda del campo que el pez percibe es necesario registrarlo a nivel de la piel. Dado que la mayor concentración de electrorreceptores se encuentra en la fóvea, la forma de onda de esta región parecería ser la más importante tanto para la electroexploración activa como para la comunicación. Por esta razón destinamos un capítulo aparte para la descripción de la forma de onda foveal. La comparación de registros de campos autogenerados y generados por conespecificos buscando diferencias sistemáticas entre ambos, permite poner a prueba la hipótesis de la correspondencia entre algunos componentes de onda con la función de portadora reaferente y otros con la función de portadora de comunicación. En nuestra condición experimental (figura 3.5), colocamos dos peces paralelos entre sí. Si bien ambos peces son emisores y receptores tanto de su propia onda como de la onda generada por el otro pez, analizamos la DOE generada por uno de ellos. Por lo tanto, como se explica en la figura, uno será el pez receptor (negro) (registramos la DOE generada por el coespecífico) y el otro será emisor y receptor (registramos ambas DOEs, pez gris). Al mismo tiempo registramos la DOEht para utilizarla como referencia. Estudios previos en G. n. sp. omari sobre este tópico (Aguilera et al, 2001), muestran que la cLDOE es muy similar a la DOEht, mientras que la sLDOE tiene variaciones importantes. En el citado trabajo se muestra que la sLEOD es generada en la región rostral del OE. Cuando mediante cirugía le silenciaron la región central y caudal del OE, la cLDOE desaparecía, dado que la descarga del OE rostral es de muy baja amplitud y tiene una actividad muy localizada, mientras, la sLDOE permanecía prácticamente idéntica. Cuando se le extirpó el OE rostral, ocurrió exactamente lo contrario, la sLEOD desapareció, quedando este pez ciego eléctricamente, mientras que era percibido de manera normal por el congénere. En este trabajo no hicimos experimentos con el OE extirpado, pero voy a interpretar los resultados partiendo de las conclusiones del citado trabajo. Los experi-

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Figura 3.5: Registro de la sLDOE y la cLDOE. Consideramos la DOE generada por uno de los dos peces, y registramos de forma simultánea el campo en la fovea del pez emisor (sLDOE, self Local DOE, DOE local propia, pez gris) y en la fóvea del co-específico (cLDOE, co-especific Local DOE, DOE local del campo generado por un co-específico, pez negro) de manera simultánea. También se registró el campo cabeza-cola (DOEht). mentos con cirugía no son estrictamente necesarios una vez que se conoce el patrón espacio temporal de la descarga. Dado que la activación del órgano está secuencialmente organizada y las formas de onda generadas en cada región son diferentes, analizando la temporalidad de la descarga y la forma de onda es eventualmente posible correlacionar los campos foveales del pez emisor y de un conespecifico con las localizaciones de las fuentes que los generan en el OE. En la figura 3.6 se muestran las sLEOD de las cinco especies junto con sus respectivos espectros de potencias. Las DOEs están normalizadas por V3 y los espectros de potencia lo están por el RMS. Todas las especies muestran ciertas características comunes en la forma de onda: A) el pico de V3 de la sLDOE (V3S ) ocurre antes que el pico de V3 de la cLDOE (V3C ); B) La relación V1S /V3S es mayor a V1C /V3C . C) ninguna de las sLDOE presenta V2 ; D) la relación V4S /V3S es menor que V4C /V3C . Todos estos factores sumados a la mayor duración de V3S en relación

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Figura 3.6: DOE local registrada en la fovea del propio pez (sLDOE) y en la de un conespecífico (cLDOE). Los registro fueron realizados con dos pares de electrodos colocados en las foveas del pez emisor y del receptor. A-F) Izquierda: forma de onda de de las diferentes especies (sLDOE en rojo, cLDOE en negro). En todos los casos el pico principal de la sLDOE ocurre antes que el pico principal de la cLDOE. A excepción de G. pantanal todas las especies presentan V1 , la cual no siempre era apreciada en la DOEht. Derecha: espectros de potencias de la sLDOE (rojo) y de la cLDOE. Ancho de barra: 24.14 Hz. La banda de frecuencias con mayor potencia de la cLDOE está sistemáticamente corrida hacia frecuencias mayores que la correspondiente a la sLDOE. Esto refleja la mayor rapidez de los componentes de la cLDOE.

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a V3C se expresan en el espectro de potencias de la sLDOE como un desplazamiento hacia las frecuencias más bajas. Es particularmente llamativo el caso de G. coropinae, que tiene el mayor PPF de la cLDOE y el menor PPF de las sLDOE de todas las especies. Con el registro local en la fovea se confirma la presencia de V1 en todas las especies excepto en G. pantanal. El registro de G. carapo muestra dos picos, uno coincidente con V3 de la cLDOE; es probable que esto se deba a que los electrodos de registro estuvieran un poco corridos de la fóvea.

3.3.4.

La DOEht es insuficiente para caracterizar la forma de onda

Los capítulos anteriores nos permiten inferir que la DOEht resulta de la suma ponderada de componentes individuales originados en distintas regiones de los peces. Un análisis teórico simple indica que el factor de ponderación no es fijo sino que depende al menos de la distancia y la conductividad en el cual se encuentra el animal. Para probar esta hipótesis comparamos los registros cabeza cola obtenidos a distintas distancias y con medios de distintas conductividades. Este estudio no fue exhaustivo, sino que fue realizado a modo exploratorio en tres individuos diferentes (un G. n. sp. omari , un G. carapo y un G. coropinae). Los registros tampoco fueron hechos a suficientes distancias y con las posiciones más adecuadas, hubieran sido preferible una escala logarítmica con mayor número de puntos, que permitiese obtener mayor cantidad de datos en la cercanía del pez. Generalmente se utiliza el cambio de conductividad para estudiar la invasión de V3 hacia las caras rostrales, como complemento de la trampa de aire simple. Este efecto de la conductividad fue mostrado en G. n. sp. omari y B. pinnicaudatus (Caputi et al, 1998) donde se observo que el cociente V4 /V3 depende de la carga externa. Este efecto es prácticamente inexistente en G. coropinae y G. carapo ya que como veremos en el subcapítulo 4, V4 se comporta en estas especies como una FEM lineal. En la figura 3.7 se muestran las DOEsht con los electrodos en los bordes de la pecera (distancias de cada pez) a las tres conductividades diferentes utilizadas. Las ondas se muestran normalizadas por el pico de V3 , por lo que las diferencias en los componentes V1 y V2 son en relación a dicho pico. La amplitud de V3 cae 40 % de 10 a 50µS/cm y un 59 % de 10 a 100 µS/cm en G. n. sp. omari ; en G. carapo 29 % y 55 % respectivamente y en G. coropinae la amplitud es 70 % y 85 % menor. En los recuadros a la izquierda se muestra el inicio de la onda amplificada según se indica. Las formas de 36

Figura 3.7: DOEht registrada a tres conductividades diferentes. Los registros se muestran normalizados por V3 . En el recuadro se muestra amplificado (x4, x3 y x11 en sentido vertical; en sentido horizontal, la barra indica 1 ms en todos los casos)el inicio de la DOE, cuando ocurre la mayor superposición de componentes de polaridad opuesta. A y B) G. n. sp. omari y G. carapo no muestran diferencias significativas en la forma de onda. En el recuadro amplificado se observa que V2 aumenta levemente su amplitud. C) G. coropinae. Esta especie sí muestra cambios sustanciales al inicio de la DOE (recuadro). Superpuesta a la secuencia V1a - V2c se genera V1ct y V3a , de polaridad opuesta. La amplitud relativa de la suma de estos componentes varía en función de la conductividad.

onda de G. n. sp. omari y G. carapo no muestran cambios sustanciales al modificarse la conductancia, aunque es visible que V1a y V2cp aumentan un poco su amplitud con respecto a V3cp con el aumento de la conductividad. G. coropinae sin embargo muestra modificaciones más complejas. V1a tiene mayor amplitud a 50 y 100µS/cm (al igual que G. n. sp. omari y G. carapo), a continuación ocurre simultáneamente V2cp , V3a y V1cp . A 50 y 100µS/cm este complejo es principalmente negativo, mientras que a 10µS/cm predominan los componentes positivos. Esta dominancia relativa provoca que el pico de V2cp se retrase a medida que disminuye la conductividad. En la figura 3.8 se muestra el cambio de la forma de onda de G. n. sp. omari y G. coropinae con la distancia a conductividad constante (100µS/cm). G. n. sp. omari no muestra diferencias, más que en la amplitud, pero esto no se muestra, ya que los trazos están normalizados. G. coropinae tiene un cambio importante con los electrodos casi tocando al pez, donde V1a se hace muy amplia, dominando completamente el registro durante la coocurrencia con V1cp . Como vimos en los registros locales perpendiculares al pez, a continuación de V1a ocurre V3a , en el mismo lugar (la región cefálica). Este componente (V3a ) domina completamente sobre V2 , al punto que este componente desaparece, observándose una onda única correspondiente a V3acp . Podemos concluir que en la DOEht emitida con el agua a bajas conduc37

Figura 3.8: DOEht registrada a diferentes distancias de los extremos del pez (16, 4 y 1 cm). Se muestra la forma de onda normalizada y en el recuadro el inicio de la DOE amplificado (x3 y x10 en sentido vertical, en sentido horizontal se conserva la escala). La forma de onda de la DOE de G. n. sp. omari permanece incambiada, mientras que G. coropinae varía tanto la amplitud de V1a como de V3a (aumentan a medida que acercamos los electrodos).

tividades prevalecen las ondas generadas en el centro y en la cola del pez. La dominancia de las ondas con dipolos más cortos y localizados rostralmente, prevalecen a mayor conductividad y/o con los electrodos cerca de los extremos del pez. Es de destacar que en este último tipo de registro, el electrodo rostral está a 1-2 cm de la fuente rostral y a 7 o más de las fuentes centrales.

3.4.

Discusión

La DOE de todas las especies estudiadas presenta un patrón espacio temporal que varía en su complejidad según la especie. El registro cabezacola refleja hasta cierto punto la complejidad de la DOE, pero se revela mejor haciendo registros que tomen en cuenta la dimensión espacial, como lo es el registro de campos locales. La descripción de las formas de onda características de cada especie solamente por la DOEht puede ser diferente según el método de registro utilizado. Esto se evidencia en los registros de DOEht con diferentes conductividades y distancias al pez. En todas las especies la DOE comienza con fuentes y sumideros localizados en la region rostral. A medida que transcurre la descarga, la activi38

dad se propaga hacia regiones más caudales y todo el cuerpo se activa con un buen grado de sincronización de modo que las fuentes se distribuyen en extensiones mayores y por lo tanto los dipolos equivalentes pueden ser vistos más eficientemente que los iniciales desde el punto de vista de un conespecífico. Es llamativa en algunas especies la generación simultánea de ondas de polaridad opuesta en regiones distintas del órgano. Este fenómeno es más importante en las especies de descarga más rápida, principalmente en G. coropinae. Esto parece ser ilógico, ya que esto provocaría una disminución del campo neto generado. Este aparente absurdo deja de serlo si comparamos los vectores de campo durante V3a /V2cp (figure 3.9 A) con los generados durante V3cp (figura 3.9 B). Durante V3a /V2cp los vectores de campo correspondientes a V3a registrados cerca del pez son mayores a los correspondientes a V2cp , sin embargo en la DOEht (trazo azul, figura 3.9 C) prevalece V2cp . Esto se debe a que la fuente y el sumidero de V3a se encuentran más cercanos entre sí a los correspondientes a V2cp , por lo que las corrientes de V3a se cierran más cerca del pez, decayendo más con la distancia que las generadas por V2cp . Este efecto es aún mayor durante V3cp , donde la extensión del dipolo equivalente a las fuentes sincronizadas ocupa el 90 % del largo del pez. A partir de modelos computacionales (Caputi, tesis de Doctorado, Caputi y Budelli, 1995) se pudo observar que la forma del cuerpo del pez juega un rol muy importante en este efecto. El pez tiene forma de cono, por lo que cada electrocito está rodeado de diferente cantidad de tejido, es decir resistencia interna. El potencial generado en la región rostral, tiene una caída suave dentro del pez, lo que sumado a la cercanía a la fovea eléctrica, permite que llega a ésta con gran amplitud relativa. Contrariamente, las corrientes generadas en la región de la cola llegan muy atenuadas hacia las regiones rostrales debido a las perdidas a través de la piel. Por esta razón las fuentes rostrales estan principalemente representadas en la sLEOD. Fuera del pez, ocurre lo explicado con la figura 3.9: el potencial generado en las regiones rostrales cae más rápidamente que los caudales, explicando la predominancia del complejo V234cp en la descarga vista por un conespecífico. Como consecuencia de la diferente forma de los campos lejano y cercano, la sLDOE y la cLDOE tienen formas de onda diferente. Esto confirma lo hallado en G. n. sp. omari por Aguilera et al (2001), en el sentido que las dos funciones del campo eléctrico generado tiene un filtro post efector que segrega las corrientes que son utilizadas en electrorrecepción activa y electrocomunicación. Los resultados sobre la forma de onda de la sLDOE y la cLDOE confirman para estas cinco nuevas especies que los canales para las 39

Figura 3.9: Potenciales de campo a dos tiempos diferente de la DOE de G. coropinae. El mapa de vectores fue construido graficando los vectores de los campos perpendicular y parasagital al eje principal del pez. Los registros fueron realizados cada 5 mm e interpolados de forma de tener el doble de vectores en el mapa. A) Mapa de vectores durante la co-ocurrencia de V3a y V2c (línea marcada como ’A’ en C)). Existe un sumidero rodeado de dos fuentes; el sentido de la corriente es remarcado con las flechas sombreadas. B) Mapa de vectores durante la ocurrencia de V3cp (línea marcada como ’B’ en C)). Existe un sumidero y una fuente única, pero la distancia entre sí es considerablemente mayor que en A). C) Forma de onda registrada en los asteriscos mostrados en A) correspondientes a cada color y a la DOEht. Con modificaciones de Castelló et al (2009)

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señales reaferentes y las exaferentes son diferentes. Independientemente de la complejidad de la DOE, las sLDOE muestran un patrón trifásico que corresponde a V1a , V3a y V4a (a excepción de G. pantanal). Sin embargo, en el caso de G. coropinae, si bien la sLDOE es similar a la de las otras especies no se genera por los mismos mecanismos. Puede observarse en el mapa de colores que el punto de reversión de V1a y V3a se localiza a la altura de la mandíbula, mientras que en las otras especies se localiza en la región del abdomen. En el capítulo de anatomía se muestra la reconstrucción 3D de este OE, hecha por L. Iribarne y M.E. Castelló. Dichas reconstruciones indican que hay dos pares de electrocitos con doble inervación, una de ellas rostral, que posiblemente sea la responsable de V1a , así como 7 pares de electrocitos con inervación caudal posiblemente responsables de la generación de V3a , si se mantiene la ley de Pacini para estos electrocitos.

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Capítulo 4 La DOE registrada en el aire 4.1.

Introducción

El sistema electromotor le da al pez la capacidad de emitir corrientes externas. El campo eléctrico asociado a la DOE es el resultado de la actividad del sistema electrogénico sobre la “red eléctrica” en la que está inmerso. Por lo tanto, para caracterizar la salida del sistema electrogénico es necesario hacerlo en función de sus parámetros como fuente eléctrica. Para eso, considerando que el OE es una fuente eléctrica y que sus parámetros son independientes de la carga, Cox y Coates (1938) introdujeron las técnicas de registro en el aire con circuito abierto y cerrado. El registro en circuito abierto consiste en registrar la diferencia de potencial entre dos puntos del pez mantenido fuera del agua. En estos peces es posible registrar prácticamente cualquier segmento del OE, ya que el órgano se encuentra directamente bajo la piel. Con el pez en circuito abierto no circula corriente por fuera del pez, por lo que el voltaje registrado corresponde a la FEM. De todas formas existen corrientes que circulan por dentro del pez (que denominaré corrientes de pérdida), cerrando el circuito por el tejido no electrogénico. Utilizando esta técnica Cox y Coates (1945) encontraron en E. electricus que la FEM por segmento es función lineal del número de electrocitos del segmento. La técnica de registro con circuito cerrado es muy similar pero se conecta una resistencia entre los electrodos de registro, permitiendo la circulación de corrientes por fuera del pez. Esta técnica se basa en el teorema de Thévenin, el cual dice que cualquier circuito compuesto por resistencias y/o FEMs lineales puede ser representado como una única FEM y una resistencia interna en serie. Colocando una resistencia de carga variable en serie (RL) es posible hallar la resistencia equivalente interna y la FEM equivalente global de cada pez aplicando la

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ecuación: ∆V = FEM − Rinp ∗ I donde la FEM es el punto de corte con el eje de las ordenadas, y Rinp (resistencia interna del pez) es el opuesto de la pendiente de la recta. Dado que el OE está distribuido a lo largo del cuerpo del pez y tiene propiedades estructurales y funcionales diferentes, Caputi et al (1989) desarrollan la trampa de aire múltiple en circuito abierto, la cual consiste en el registro simultáneo de diferentes regiones del pez. Esto permitió confirmar que en G. n. sp. omari, B. pinnicaudatus y R. rostratus la FEM regional (al igual que en E. electricus) también depende del número de electrocitos y crece de forma exponencial en sentido rostro caudal. Además, dado que G. n. sp. omari y R. rostratus tienen DOEs más complejas que E. electricus (esta especie tiene forma de onda monofásica) se encontró que los diferentes componentes de onda se originan en diferentes regiones del pez, y que tienen diferentes tiempos de activación (existe una secuencia de activación que progresa rostro-caudalmente (Caputi et al, 1998)). Para la mayoría de los peces eléctricos estudiados hasta el momento (E. electricus: Cox y Coates, 1938; Gnathonemus petersii: Bell et al, 1976; G. n. sp. omari: Caputi et al, 1989) la relación entre ∆V e I para diferentes valores de RL es lineal. Sin embargo, Bell et al (1976), muestran que no todos los componentes de la DOE de G. petersii se comportan de esta manera. Caputi, (1993, Tesis de Doctorado) muestran lo mismo para la V4 de la DOE de B. pinnicaudatus (se le llama N1, pero está activada por el mismo mecanismo que V4 ) y algunos pocos especímenes de G. n. sp. omari. Esta no linealidad se debe a que V4 es activada por las corrientes que circulan durante V3 (I3 ), por lo que al variar la resistencia de carga se varía I3 . Este fenómeno depende de varios factores: la densidad y sensibilidad de los canales iónicos de los electrocitos, tamaño de los electrocitos, la resistencia en serie (distancia), corrientes de fuga y resistencia en paralelo (tejido que rodea el OE), por lo tanto no es correcto decir que la no linealidad de V4 se debe a una menor excitabilidad electrocítica, sino que se debe a una menor excitabilidad del OE y esta depende en mayor o menor medida de estos factores. Partiendo del supuesto de que V4 es intrínsecamente lineal para valores fijos de I3 , durante mi pasantía de grado nos basamos en un paper de Bell y col (1976), y diseñamos y construimos un circuito que nos permitió confirmar la dependencia de la FEM de V4 sobre I3 . En el siguiente capítulo se muestran los resultados de las formas de onda regionales de las especies, y luego se muestran los resultados del análisis de las fuentes con trampa de aire simple, tanto de las lineales (V2 y V3 ) como de las que no los son (V4 y V5 ).

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Figura 4.1: Circuito de trampa simple y trampa con diodos. A) Trampa simple. El pez es mantenido en el aire y es conectado a dos electrodos a los extremos del pez. A medida que variamos RL1 registramos el voltaje en los extremos del pez y la corriente a través de R1. En este caso RL1 afecta tanto a las corrientes durante V3 como durante V4 . B) El tipo de registro es similar, pero medimos solamente el extremo caudal del pez. Los diodos obligan a las corrientes a circular por caminos diferentes, permitiendo, al variar RL1, calcular la FEM de V4 . El proceso es repetido para diferentes valores de RL2, la cual afecta únicamente a V3 .

4.2.

Métodos

Trampa de aire múltiple (sin carga). Con esta técnica se estudia el patrón temporal de las FEMs generado por diferentes regiones del pez (Caputi et al, 1989). Se coloca el pez sobre una serie de electrodos paralelos entre sí y transversales al eje longitudinal del pez. Cada electrodo es la referencia al electrodo anterior y el activo para el que le sigue, el primero y el último (cabeza cola) cierran el anillo y es utilizado como referencia para alinear los registros. Cada par de electrodos está conectado a un amplificador de ganancia adecuada a la amplitud de la FEM generada para maximizar su cuantización; su salida va a un conversor análogo-digital. La frecuencia de muestreo fue de 25 Khz. en cada canal. Los peces fueron analizadas con siete trampas (excepto G. carapo y G. coropinae), por lo que estas no tienen la misma distancia en los diferentes peces, sino que la distancia entre electrodos es proporcional al largo total de cada pez. En el caso de G. carapo y G. coropinae la primer trampa tiene el doble de longitud debido a limitaciones del método (ver discusión de este capítulo). La trampa de aire simple (con carga) consiste en mantener al pez en el aire mientras descarga (figura 4.1 A), una resistencia de carga variable (figura 4.1, RL1) es conectada en paralelo a los extremos del pez y registramos el voltaje del cabeza cola del pez y la corriente a través de una resistencia fija (R1). Dado que en G. n. sp. omari, la FEM de V4 (F EM4 ) depende de I3 con este método no es posible calcularla. Cargando la trampa simple con diodos profundizamos el análisis de los mecanismos de generación de V4 y su dependencia sobre las corrientes generadas por V3 . Parte 44

de este estudio en G. n. sp. omari fue ya realizado durante mi pasantía de licenciatura; aquí se extiende a otras especies. Este circuito (figura 4.1 B) fue diseñado teniendo en cuenta que V3 y V4 tienen polaridad opuesta. El pez es colocado en el aire y conectado a dos resistencias variables en paralelo. En cada una de estas vías paralelas se conecta un diodo. La distinta orientación de los diodos permite controlar independientemente la corriente en cada una de las ramas. Variando selectivamente la resistencia de carga para V3 (RL2) fijamos I3 en un valor determinado, y para dicho valor obtenemos una serie de valores de corriente y voltaje de V4 variando la resistencia de carga de V4 (RL1). Repitiendo el experimento para diferentes valores de RL2 (es decir I3 ) es posible determinar la relación entre la FEM de V4 e I3 . Se utilizó un amplificador diferencial de alta impedancia y los datos fueron adquiridos en una PC a 25 KHz o más y luego analizados utilizando el software Matlab (MathWorks Inc). Dado que G. n. sp. omari y G. n. sp. itapua tienen morfología externa y anatomía del OE muy similares, así como formas de onda idénticas excepto en V4 , estas especies difieren únicamente en la excitabilidad del OE. Me voy a centrar principalmente en estas dos especies, y luego haré un breve resumen de los resultados de las otras.

4.3.

Resultados

4.3.1.

Análisis de la DOE en Trampa de aire Múltiple

Los resultados de las DOEs son presentados de dos formas, en el dominio del tiempo y en el dominio de las frecuencias. La primera forma de presentación nos permite identificar qué componentes de los observados en la DOEht se generan en cada región, así como cuantificar las amplitudes regionales de los diferentes componentes y la secuencia de activación de los componentes homólogos y los no homólogos. La aplicación de la transformada rápida de Fourier a las formas de onda regionales, muestra espectros unimodales, por lo tanto, esta aproximación permite una estimación rápida y global del pico y la banda de frecuencias, permitiendo comparar las diferencias en los espectros de potencia entre regiones y entre especies. G. n. sp. omari (figura 4.2 A) presenta tres perfiles básicos diferentes en la forma de onda de las FEMs regionales: anterior (trampa 1), central (trampas 2 a 5) y posterior (trampa 7). Las características que tomamos en cuenta para hacer esta división son los componentes de onda. La forma de onda de la región anterior comienza con una onda lenta cabeza nega45

tiva (V1a ). En esta región no se genera V2 , por lo que después de V1 ocurre V3a -V4a . La región central comienza su actividad con V2c , y continúa con V3c−4c . Por último, en la cola se observa únicamente V3p -V4p . Por lo tanto, de acuerdo con resultados previos, las FEMs responsables de las cuatro ondas descritas por Trujill0-Cenóz et al (1984), tienen sitios diferentes de generación. V1 se genera únicamente en la región rostral del OE, V2 en la región central, mientras que V3 y V4 en todo el OE. La amplitud de V2 (figura 4.2 C) crece rostro-caudalmente hasta la trampa 5, disminuyendo su amplitud en la sexta porción del pez y no es generada en la cola. Por otro lado, la amplitud de V3 y V4 (figura 4.2 D-E) crece de forma exponencial en sentido caudal. Se ha demostrado en investigaciones anteriores (Cox y Coates, 1945, Caputi et al, 1989, Pereira et al, 2007) que este crecimiento exponencial de la amplitud de V3 por región es función lineal del número de electrocitos de dicha región. En este estudio lo confirmamos para las especies acá estudiadas, los resultados anatómicos se muestran en la próxima sección. Los componentes de onda no fueron sincrónicamente activados, sino que sigue un orden de activación que progresa rostro-caudalmente. En la figura 4.17 (página 68) se muestra el tiempo de ocurrencia del pico de cada V3 regional con respecto al pico de V3 en el registro cabeza-cola (la suma de las FEMs regionales). Puede verse que existe una diferencia de tiempo importante entre la región abdominal y la central, siendo en las tres trampas centrales donde se observa la mayor coordinación. El retraso entre la región central y la caudal aumenta nuevamente. Dado que V3a es el segundo componente de la región rostral y V2cp es el primer componente en la región central y caudal, estos componentes de polaridad opuesta se superponen parcialmente, como puede verse en la región sombreada, confirmando lo observado en los registros de campos locales. En la figura 4.2 B se muestran los espectros de potencias de cada descarga regional de G. n. sp. omari. Los espectros se normalizaron el valor RMS para facilitar la comparación entre trampas y especies. La forma del espectro de potencias es asimétrica con respecto a la banda de frecuencia con mayor potencia (PPF, peak power frequency, ancho del bin, 24,41 Hz). Ésta presenta su valor máximo en las regiones centrales (media=1223.1 Hz; SD=105.1Hz), disminuyendo hacia la cola (media=407.1 Hz; SD=117.9 Hz) y hacia la región rostral (media=488.3Hz; SD=69.3Hz). G. n. sp. itapua (figura 4.3) muestra los mismos tres patrones básicos que G. n. sp. omari, pero con una V4 más amplia en todas las regiones, además, presenta V5 en las regiones caudales. La amplitud relativa de V2 (figura 4.3 C) tiene el mismo perfil que en G. n. sp. omari, llegando a su máxima amplitud en la trampa 5 y disminuyendo en la 6. Al igual que en G. n. sp. omari esta onda no se genera ni en la región abdominal ni en la cola. Las 46

Figura 4.2: Patrón espacio-temporal de la DOE en la trampa de aire múltiple: G. n. sp. omari. A) La caída de voltaje de las diferentes regiones del cuerpo fue registrada en simultáneo mientras el pez se mantenía en al aire. Cada porción corresponde a un séptimo del pez, como se indica en el esquema a la izquierda. Los registros están alineados temporalmente por V3 del registro cabeza-cola. B) Espectro de potencias de los registros mostrados en A); ancho del bin 24.14 Hz. La línea punteada roja indica la banda de mayor potencia (PPF) de la región más rostral. Puede observarse que la región más caudal tiene un PPF menor, probablemente debido al comportamiento no lineal de V4 . C-E) Amplitud de los diferentes componentes de la DOE en función del sitio de origen (1 a 7, según esquema en A)). C) V2 . D) V3 . D) V4 .

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Figura 4.3: Patrón espacio-temporal de la DOE en la trampa de aire múltiple: G. n. sp. itapua. A) Voltaje de las diferentes regiones del cuerpo del pez mantenido en el aire. Cada porción corresponde a un séptimo del pez, como se indica en el esquema a la izquierda. Los registros están alineados temporalmente por V3 del registro cabeza-cola. B) Espectro de potencias de las formas de onda mostradas en A). En este caso, el menor PPF es en la trampa más rostral. C-E) Amplitud de los diferentes componentes de la DOE en función del sitio de origen (1 a 7, según esquema en A). C) V2 . D) V3 . D) V4 . N=12

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amplitudes V3 y V4 (figura 4.3 D-E) también siguen el mismo perfil de crecimiento exponencial visto en G. n. sp. omari, aunque la relación V4 /V3 es diferente (figura 4.16 F, página 66). En esta especie la relación es constante, con pendiente uno. La sincronización de V3 es también similar a G. n. sp. omari , con el mayor retraso entre la región abdominal y la central y la mayor sincronización en las trampas centrales (figura 4.17). Los espectros de potencia de esta especie, al igual que el espectro de la DOEht, están corridos hacia frecuencias mayores (figura 4.2 B), aunque en la región central fue un poco menor (media=1031.5 Hz; SD=114.1Hz), y en la región caudal mayor a G. n. sp. omari(media=571.7 Hz; SD=127.3 Hz). En la región central el PPF fue muy similar (media=541.2 Hz; SD=49.7 Hz). En ningún caso la potencia de una banda de frecuencias llega al 3 % de la potencia total. G. n. sp. mamacha. La región abdominal conserva los componentes de forma de onda descritos para las especies anteriores (V1 -V3 -V4 , figura 4.4 A). La región central es similar excepto por el componente positivo al inicio de la onda, que se corresponde con la actividad registrada en la DOEht (V1cp ). A pesar de la distancia al núcleo de relevo, este componente se activa junto con V1a . Como veremos, ocurre de forma similar en G. carapo y en G. coropinae. El sincronismo de V3 es similar al descrito para G. n. sp. omari y G. n. sp. itapua 4.17. Recuérdese que estos peces miden entre 30 y 40 cm (media=34.3 cm; SD=3.4 cm), el doble que G. n. sp. omari y G. n. sp. itapua, por lo que la distancia entre las regiones equivalentes es mayor. Es necesario hacer estudios más detallados para determinar si esta mayor sincronización se debe a efectos de escala (el diámetro de los axones aumenta, aumentando la velocidad, pero las EMN disminuyen su excitabilidad) o si esta especie desarrolló mecanismos extra para aumentar el sincronismo. V2 , V3 y V4 mantienen el mismo perfil de crecimiento de las amplitudes (figura 4.4 C-F). Las FEMs regionales de G. carapo reflejan el aumento en la velocidad de las ondas observada en los registros en el agua (figura 4.5 A). El PPF de las diferentes regiones es considerablemente mayor que en las especies anteriores, llegando a 1878 Hz en la región central (figura 4.5 B). Las amplitudes regionales de V2 mantienen el perfil básico visto en las especies anteriores, al igual que las amplitudes de V3 y V4 . Esta especie también presenta un componente positivo alrededor del 75 % de la longitud del pez. En la figura 4.5 puede verse las amplitudes de las diferentes ondas en las diferentes trampas. V2 crece desde la trampa 2 hasta la trampa 5, disminuyendo su amplitud nuevamente en la 6. V3 y V4 por otro lado crecen de forma exponencial hacia las regiones caudales. El patrón de activación de V3 es similar a las especies anteriores. Es de destacar que esta especie muestra actividad simultánea de generadores opuestos, sobre todo al 49

Figura 4.4: Patrón espacio-temporal de la DOE en la trampa de aire múltiple: G. n. sp. mamacha. A)Voltaje de las diferentes regiones del cuerpo fue registrada en simultáneo mientras el pez se mantenía en al aire. Los registros están alineados temporalmente por V3 del registro cabeza-cola. B) Espectro de potencias de los registros en A) normalizados por el RMS. La barra vertical corresponde al 1 % de la potencia total normalizada. Ancho del bin: 24.14 Hz. El menor PPF regional ocurre en la región más rostral, y el mayor en la región más central. C-F) Amplitud de los diferentes componentes de la DOE en función del sitio de origen (1 a 7, según esquema en A). C) V2 . D) V3 . E) V4 . F) V5 . N=8

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Figura 4.5: Patrón espacio-temporal de la DOE en la trampa de aire múltiple: G. carapo. A) Voltajes de las diferentes regiones del cuerpo registrados en simultáneo mientras el pez se mantenía en al aire. Cada porción corresponde a un octavo del pez, excepto la primer región que ocupa dos octavos, como se indica en el esquema a la izquierda. Los registros están alineados temporalmente por V3 del registro cabeza-cola. B) Espectro de potencias de las formas de onda mostradas en A). Los espectros están normalizados por el valor RMS, la barra vertical corresponde al 1 % de la potencia total normalizada. Nótese que en esta especie el eje de las abscisas llega hasta 5kHZ. C-F) Amplitud de los diferentes componentes de la DOE en función del sitio de origen (1 a 8, según esquema en A)). C) V2 . D) V3 . E) V4 . F) V5 . N=5

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inicio de la onda. V1a y V1cp se activan casi sincrónicamente, seguidas cada una de V3a y V2c . Estos dos pares de onda tienen polaridad opuesta, generando corrientes en sentido opuesto. G. coropinae (figura 4.6) presenta una V1 de inusual duración y de baja amplitud relativa. La V3 de esta región es también considerablemente lenta, mientras que en las regiones más caudales las ondas son de muy corta duración. En el espectro de potencias se observa que la región abdominal tiene dos picos, uno de 0.4 KHz (menor que el de G. n. sp. omari) y otro en 1.1 Khz (menor que el pico de la región equivalente de G. carapo), mientras que las otras regiones tienen su espectros de potencias muy corridos hacia frecuencias altas (PPF región central =2.7 KHz). La amplitud de los picos por región tiene el mismo perfil que las especies estudiadas anteriormente. Esta especie también presenta V1cp , aunque de menor amplitud relativa que en G. carapo y G. n. sp. mamacha. Al igual que en todas las especies, V3 muestra su máximo retraso en la transición entre la región rostral y la central y la mayor sincronicidad en las trampas centrales. La superposición de ondas con polaridad opuesta es aún mas marcada que en G. carapo. En el registro cabeza cola no se observa V2 , ya que este componente se encuentra superpuesto con V3a y V1cp , teniendo estos últimos mayor FEM. Puede observarse en las trampas finales que cuando V3 llega a su máximo, en la trampa anterior ya finalizó o incluso comenzó V4 . G. pantanal. Confirmamos la ausencia de V1a (figura 4.7 A). Los demás componentes no muestran diferencias con el resto de las especies. V2 comienza en la segunda trampa, y crece hasta la sexta, no ocurriendo en la punta de la cola (figura 4.7 C); V3 y V4 (figura 4.7 D y E) crecen exponencialmente en sentido rostro-caudal. Los espectros de potencia de esta especie son los que presentan menor PPF, cercano a cero en la primer y segunda trampa debido a monofasidad de la descarga local. Para comprobar que los componentes considerados como homólogos lo son realmente, registramos dos especimenes de G. n. sp. omari y dos de G. n. sp. itapua antes y después de administrarle curare (figura 4.8). Puede observarse el efecto del curare es el mismo en ambas especies. El efecto sobre los componentes observados en la región abdominal (figura 4.8 A, V1 y V3 ) es diferente. V3 , que es la expresión de un conjunto de potenciales de acción permanece con una actividad débil, que corresponde a los potenciales sinápticos de las caras caudales. V1 también se ve afectado, pero en menor grado, ya que V1 es generado por potenciales sinápticos, por lo que su amplitud se ve menos afectada. En la región central (figura 4.8 B) existen tres componentes con diferentes orígenes: V2 y V3 tienen origen neural y V4 es generada por mecanismos periféricos. Esto fue confirmado para G. n. sp. itapua, ya que la V4 desaparece completamente cuando dis52

Figura 4.6: Patrón espacio-temporal de la DOE en la trampa de aire múltiple:G.coropinae. A) Voltajes de las diferentes regiones del cuerpo registrados en simultáneo mientras el pez se mantenía en al aire. Cada porción corresponde a un séptimo del pez, excepto la primer región que ocupa dos séptimos, como se indica en el esquema a la izquierda. Los registros están alineados temporalmente por V3 del registro cabeza-cola. B) Espectro de potencias de las formas de onda mostradas en A). Los espectros están normalizados por el valor RMS, la barra vertical corresponde al 1 % de la potencia total normalizada. En esta especie el eje de las abscisas llega hasta 6kHZ. C-F) Amplitud de los diferentes componentes de la DOE en función del sitio de origen (1 a 6, según esquema en A)). C) V2 . D) V3 . E) V4 . F) V5 . N=9

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Figura 4.7: Patrón espacio-temporal de la DOE en la trampa de aire múltiple: G. pantanal. A) Voltajes de las diferentes regiones del cuerpo registrados en simultáneo mientras el pez se mantenía en al aire. Cada porción corresponde a un séptimo del pez. Los registros están alineados temporalmente por V3 del registro cabeza-cola. B) Espectro de potencias de las formas de onda mostradas en A). Los espectros están normalizados por el valor RMS, la barra vertical corresponde al 1 % de la potencia total normalizada. C-E) Amplitud de los diferentes componentes de la DOE en función del sitio de origen (1 a 7, según esquema en A)). C) V2 . D) V3 . E) V4 . N=1

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Figura 4.8: Efecto del curare sobre la DOE registrada en el aire. A) La forma de onda de la región anterior compuesta por V1 y V3 con el pez intacto (arriba) en ambas especies. La actividad remanente luego de la curarización parcial (abajo) muestra que el efecto es diferente para V1 y V3 y que es igual en ambas especies. B) La región central muestra tres componentes en el pez intacto (arriba): V2 -V3 y V4 . El curare suprime V4 en las dos especies y disminuye la amplitud de V2 y V3 , perdurando un remanente de la actividad sináptica de V2 y V3 . C) La cola muestra dos componentes en el pez intacto (arriba): V3 y V4 . La curarización, al igual que en la región central, suprime completamente a V4 , observándose únicamente un componente positivo correspondiente la actividad sináptica de las caras caudales. Trazos azules: G. n. sp. omari, trazos rojos: G. n. sp. Itapua. minuye V3 . V2 y V3 mantienen una actividad remanente correspondiente a los potenciales sinápticos. En la región caudal, puede observarse que G. n. sp. itapua tiene tres componentes (V3 , V4 y V5 ). V5 es el primer componente en desaparecer a medida que hace efecto el curare, confirmando su origen periférico. V4 y V3 en esta región responden de la misma manera que en la región central (figura 4.8 C).

4.3.2.

Trampa de aire simple y con diodos

Trampa simple El registro de la DOE de G. n. sp. omari en el aire es cualitativamente similar a la registrada en el agua, con sus tres picos característicos (figura 4.9). En el el aire, conectada a una resistencia de carga la DOE varía su forma cuando variamos esta resistencia; en la figura 4.9A se muestran esas diferencias: en azul se muestra el registro en corto circuito y en rojo con 55

una resistencia de casi 2MΩ (las pendientes de las rectas que pasan por el origen en la figura 4.9 B indican la resistencia de carga en cada caso). V2 y V3 son activadas sinápticamente, por lo que, como esperábamos, la relación entre corriente y voltaje de estos dos componentes es lineal (figura 4.9 B, círculos blancos y figura 4.9 C respectivamente). V3 presenta una FEM media de 2,8 (SD=0,7), mientras que V2 fue diez veces menor (media=0,21; SD=0,04); la resistencia interna fue similar en ambos picos (35,3kΩ y 32, 3kΩ; SD=7,7kΩ y 10, 7kΩ respectivamente). V4 se apartó de la linealidad para valores de corriente bajos en la mayoría de los peces. Según la ecuación 1 esto indica que la F EM4 y/o la Rinp4 de G. n. sp. omari están variando a medida que cambiamos la RC. Por estudios hechos anteriormente (Rodríguez-Cattáneo, tesis de grado, 2007) sabemos que lo que varía en G. n. sp. omari es la F EM4 y lo confirmamos en este estudio. Esta F EM4 puede disminuir por dos motivos, por un lado, el número de electrocitos excitados disminuye (aunque podría explicarse si cada electrocito genera una V4 más débil). Por otro lado, comparando las formas de onda de este componente a diferentes resistencias de carga (figura 4.9 A), puede observarse que al aumentar la resistencia de carga, V4 no sólo disminuye la amplitud, sino que se hace más duradera. Esto sugiere que la población de electrocitos se desincroniza. Para determinar si en realidad no ocurría solamente el fenómeno de desincronización, medimos el valor RMS de V4 de las DOEs normalizadas por V3 y encontramos que el RMS disminuye al aumentar la resistencia, a pesar de que aumenta la duración de la DOE, por lo que si bien se desincronizan, también disminuye la corriente total generada y probablemente el número de electrocitos activos. Otro punto a resaltar es la aparición de ondas extra numerarias en G. n. sp. omari (figura 4.9 A) a valores de corriente bajos. Estas ondas extranumerarias fueron más frecuentes a finales de octubre y aún más en diciembre. En ocasiones se produjeron oscilaciones que duraban hasta la siguiente descarga. Son de alta frecuencia y se parecen a un chirp, con la diferencia que son generadas por mecanismos periféricos y ocurren en la punta de la cola, mientras que los chirps son controlados por el núcleo electromotor bulbar. La aparición de ondas extranumerarias implica una disminución en la excitabilidad electrocítica. La forma de onda de G. n. sp. itapua sin embargo, no es mayormente afectada (figura 4.9 D). Al comparar las DOEs a diferentes resistencias de carga puede verse que hay un pequeño cambio en V4 , pero menor al visto en G. n. sp. omari. Esto se refleja en la relación de corriente y voltaje, ya que tanto V2 y V3 como V4 tienen una relación lineal (figura 4.9 E), siendo la F EM4 (media=2,8; SD=0,26, n=8) mayor que la F EM3 (media=2,4; SD=0,34; n=8) y la Rinp menor durante V4 que durante V3 (58, 2kΩ 56

Figura 4.9: Registro en trampa simple de G. n. sp. omari y G. n. sp. itapua: A y D) Forma de onda normalizada por V3 registrada en el aire a dos resistencias de carga diferente (el valor de la resistencia es la pendiente de la recta en B y E). En rojo es con alta resistencia de carga y en negro con baja resistencia de carga. G. n. sp. omari cambia drásticamente la amplitud y duración de V4 , mientras que G. n. sp. itapua ve afectada solamente la amplitud. B, C), E), y F) Curva I-V de los diferentes picos que componen la DOE. B y E) V3 y V4 . C y F) V2 . El punto de corte en las ordenadas indica la FEM del componente, mientras que el opuesto de la pendiente es la resistencia interna del cuerpo del pez.

y 44, 2kΩ). V5 si muestra un comportamiento no lineal (no mostrado, las curvas son similares a la mostrada más adelante para G. n. sp. mamacha). Según los resultados anatómicos y la correlación encontrada entre V3 y V4 con la técnica de trampa múltiple (figura 4.16 B) en esta especie, V4 se debería a un mecanismo de invasión, sin embargo eso no es tan evidente en estos experimentos. Estos registros fueron hechos en el pez entero, para explorar mejor las diferencias en la generación de V4 entre estas dos especies realizamos los experimentos con diodos, con los electrodos colocados en la punta de la cola, donde se manifiesta mejor la dependencia de V4 sobre I3 (ver Trampa simple con diodos). G. n. sp. mamacha y G. carapo: V2 , V3 y V4 responden de manera lineal (G. n. sp. mamacha: figura 4.10 B-C; G. carapo: figura 4.11 B-C). La F EM3 media fue =1.63 y 1,15 y la F EM4 fue 1,87 y 1,30, respectivamente (n=2 (G. 57

Figura 4.10: Registro en trampa simple de G. n. sp. mamacha: A) Forma de onda normalizada por V3 registrada en el aire a dos resistencias de carga diferente (el valor de la resistencia es la pendiente de la recta en B). B), C) y D) Curva I-V de los diferentes picos que componen la DOE. B) V3 y V4 . C) V2 . D) V5 . Los componentes generados periféricamente (V4 y V5 ) se apartan de la linealidad.

Figura 4.11: Registro en trampa simple de G. carapo: A) Forma de onda normalizada por V3 registrada en el aire a dos resistencias de carga diferente. B), C) y D) Curva I-V de los diferentes picos que componen la DOE. B) V3 y V4 . C) V2 . D) V5 . Los componentes generados periféricamente (V4 y V5 ) se apartan de la linealidad.

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n. sp. mamacha) y n=5 (G. carapo)). A pesar de que V4 responde de manera lineal, en ambas especies la forma del componente V4 cambia con la carga (figuras 4.10 A y 4.11 A). Al igual que en G. n. sp. itapua, V4 disminuye su amplitud pero no su duración. Las Rinp fueron diferentes en ambas especies debido a la gran diferencia de tamaños (menor en G. n. sp. mamacha). En ambas especies las Rinp durante V2 y V3 fue similar y durante V4 bajó considerablemente. V5 no es lineal en ninguna de las dos especies (figuras 4.10 D y 4.11 D), aunque no muestra una influencia tan marcada como en G. coropinae (figura 4.12 D). G. coropinae. La forma de onda de G. coropinae registrada en el aire (figura 4.12) es considerablemente diferente a la registrada en el agua con electrodos lejanos, seguramente debido al mismo efecto descrito al registrar la DOEht a diferentes distancias. El principal cambio se ve al inicio de la descarga, donde V3a cubre casi completamente a V2cp . La actividad de este componente se visualiza porque V3a y V3cp no forman una única onda como sucede en la DOEht cercana. Estudiamos la FEM de este componente en el pico de sus sumas y lo llamamos V3a -V2c , porque si bien la FEM del componente positivo es mayor, no debemos olvidar que es la suma de los dos. Este componente, al igual que V3cp y V4cp se comportan de manera lineal (F EM2 =0.025V, SD=2.1x10-4V). La excepción es V5 , la cual se ve claramente no lineal, apoyando la hipótesis de que es generada por mecanismos periféricos. La F EM4 es mayor a la F EM3 (media=0.14V, SD=7x10-4V y 0.22V, SD=1x10-3V respectivamente) en todos los casos, y la resistencia interna es mayor para V3a -V2cp que para V3cp y V4cp (Rinp2 = 91,4kΩ, σ = 14,2kΩ; Rinp2 = 75,9kΩ, σ = 8,8kΩ, Rinp2 = 76,2kΩ, σ = 7,1KkΩ). En esta especie no realizamos los experimentos con diodos, pero dada la respuesta de V4 en la trampa simple es probable que su FEM no cambie con la carga. La forma de onda de V4 también cambia, pero considerablemente menos que en las especies anteriores. Trampa simple con diodos Con esta técnica dejamos fija la corriente que circula durante V3 , variando la resistencia que carga V4 . De esta manera si I3 es fija, entonces la F EM4 también, por lo que la relación I4 /V4 se volverá lineal. Tomamos solamente los dos cm. finales del pez ya que es donde reside la mayor FEM de ambas ondas y donde el pez tiene menos tejido (más resistencia de carga), por lo que se notarán mejor los efectos de la carga externa. En la figura 4.13 A-B se muestra las curvas I/V para cuatro valores diferentes de I3 (es decir cuatro F EM4 diferentes) para G. n. sp. omari y G. n. 59

Figura 4.12: Registro en trampa simple de G. coropinae: A) Forma de onda normalizada por V3 registrada en el aire a dos resistencias de carga diferente. B, C) y D Curva I-V de los diferentes picos que componen la DOE. B) V3 y V4 . C) V2 . D) V5 . V5 es el único componente que se aparta de la linealidad, y de forma más marcada que en las especies anteriores.

sp. itapua, respectivamente. Como puede apreciarse claramente, la F EM4 cambia de manera importante con I3 en G. n. sp. omari. La figura muestra también que la Rinp se mantiene constante (las rectas son paralelas), por lo que el único factor que influye en la no linealidad de V4 es I3 . Como era de esperarse, en G. n. sp. itapua el cambio en la F EM4 es imperceptible, ya que las rectas están superpuestas (misma F EM4 y Rinp4 para todos los valores de I3 ). Esto indica que las corrientes externas al pez no ejercen mayor influencia sobre la F EM4 en esta especie. Esto puede apreciarse en la figura 4.13 C, donde se muestra la relación entre las F EM4 halladas y las I3 correspondientes para ambas especies para más valores de I3 . La F EM4 de G. n. sp. itapua se muestra constante en el rango explorado, mientras que G. n. sp. omari crece hasta casi el doble. Si bien en el ejemplo mostrado en la figura el rango de I3 explorado para G. n. sp. omari es mayor, el mayor crecimiento de esta especie se da en el rango explorado para G. n. sp. itapua, la cual se muestra constante. En la figura 4.14 se muestran los valores normalizados para varios peces de ambas especies. La normalización es debido a que existen diferencias de F EM4 y de I3 entre los diferentes peces. También pueden variar en un mismo pez de un experimento a otro debido a variaciones en la posición de los electrodos. El valor mínimo de F EM4 normalizado es un indicador de cuánto afecta la I3 que circula externamente en la F EM4 má60

Figura 4.13: Trampa de aire con diodos. Registros realizados con el pez en el aire variando la resistencia de V4 , mientras que I3 se mantiene constante. A) Relación I4 -V4 para diferentes valores de I3 en G. n. sp. omari. V4 se vuelve lineal si I3 es fija. La FEM varía con el valor de I3 . B) Mismo experimento realizado en G. n. sp. itapua. En esta especie V4 era lineal en la trampa de aire simple (figura 4.9) y lo es también con esta metodología. Además, la F EM4 se mantiene constante para los diferentes valores de I3 . C) Se muestra la F EM4 como función de I3 . En G. n. sp. omari la F EM4 crece claramente, mientras que G. n. sp. itapua se mantiene constante. 61

Figura 4.14: Relación F EM4 Vs I3 para la población de G. n. sp. omari y G. n. sp. itapua. Los símbolos negros corresponden a G. n. sp. omari y los blancos a G. n. sp. itapua; a su vez cada símbolo indica un pez diferente. Los valores de I3 y F EM4 de cada pez fueron normalizados por el máximo. G. n. sp. omari muestra gran variabilidad en la dependencia de F EM4 sobre I3 , mientras que en G. n. sp. itapua la F EM4 se mantiene casi constante para diferentes valores de I3 en toda la población. G. n. sp. omari N=10; G. n. sp. itapua: N=6.

xima del pez en esa región determinada, independientemente de cual sea el valor absoluto en cada caso. A este valor le llamamos índice de autoexcitabilidad, que nos indica cual es la F EM4 debida a las corrientes internas. G. n. sp. itapua mostró un índice de auto excitabilidad promedio de 0.95, (SD=0.03, N=10), mientras que una población de G. n. sp. omari capturada en la misma estación fue de 0.7 (SD=0.29) Esta diferencia puede verse en la figura 4.13, donde se observa que la autoexcitabilidad de G. n. sp. omari es mucho más variable que G. n. sp. itapua, cuya población se encuentra concentrada al tope de la gráfica, con un solo individuo por debajo 0,9. Dado que la amplitud de V4 ha sido relacionada con el comportamiento reproductivo en diferentes especies de Gymnotus spp, repetimos los experimentos en poblaciones de G. n. sp. omari capturadas en diferentes épocas del año. La población de invierno fue capturada en otoño y mantenida en cautiverio hasta agosto, cuando se realizaron los experimentos. Los resultados fueron muy similares y los test estadísticos dieron negativos para diferencias significativas en el índice de autoexcitabilidad entre las diferentes poblaciones (Kruskal-Wallis: H0, p