Morfología del sistema sensorial en abejas silvestres argentinas. Características del sistema de integración de la información quimiosensorial Galvani, Gerónimo Luis 2013

Tesis Doctoral

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires www.digital.bl.fcen.uba.ar Contacto: [email protected] Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la Biblioteca Central Dr. Luis Federico Leloir. Su utilización debe ser acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente. This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir. It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source. Fuente / source: Biblioteca Digital de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES  Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Morfología del sistema sensorial en abejas silvestres argentinas. Características del sistema de integración de la información quimiosensorial Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área ciencias biológicas

Galvani Gerónimo Luis 

Director de tesis: Beatriz P. Settembrini Consejero de Estudios: Walter Farina Lugar de trabajo: Museo Argentino de Ciencias Naturales “Bernardino Rivadavia” Buenos Aires, 2013

AGRADECIMIENTOS A Vane, mi gran amor y compañera.

A Beatriz, por darme la oportunidad de aprender y guiarme durante estos 5 años.

A Mis Viejos,Gloria y Eduardo, por su cariño y ejemplo.

A Facu, Male y Mari por estar siempre al lado.

A los bajitos Juan, Bruno, León, Cata y Pedro.

A los que vinieron después Seba, Desi, Coco, Irma, Ana y Mauricio.

A los amigos, Ariel, Santiago, Matías, Maxi y Darío, siempre juntos resolviendo las causas inútiles.

A Rocío, Luis, Juanjo, Susana, Mili, Diego, Adriana y Johana por hacer del laburo un buen lugar.

A Arturo por enseñarme sobre el mundo de las abejas.

A los amigos biólogos Juli, Caro, Maria, Pie, Pablo, Vero, Fer y Jime por los buenos momentos.

Al Tío por sus enseñanzas

A Luciana, Mariana y Angela por la ayuda prestada

A CONICET , MACN y la Universidad Austral por permitirme la realización de esta tesis

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RESUMEN Los sensilios son la unidad funcional básica de los receptores en la cutícula de los insectos, actuando principalmente en la mecano y la quimiorecepción. Con el objetivo de comprender la asociación entre el sistema sensorial externo y la variedad de comportamientos que surgieron durante la historia evolutiva de las abejas, se estudió la morfología externa de los sensilios antenales en 34 taxones pertenecientes a la familia Apidae. Se utilizaron técnicas de microscopia óptica y electrónica. Los resultados muestran que las abejas hembras no parásitas tienen mayor abundancia de sensilios gustativos y táctiles que los machos, así como también se observó que en los machos predominan los sensilios olfatorios. Por el contrario, en las especies parásitas no se observó dimorfismo sexual en la composición de tipos y abundancia de sensilios. Se discutieron las principales causas de una posible coevolución de los sensilios entre machos y hembras de abejas solitarias a la luz de estudios previos. Conjuntamente se caracterizó la expresión de la óxido nítrico sintasa (NOS) y la tirosina hidroxilasa (TH, enzima productora de precursores de catecolaminas) en el sistema nervioso central de 4 especies de abejas solitarias. El oxido nítrico (NO) y la TH son moléculas reconocidas en el sistema nervioso de insectos. Varios experimentos sugieren un rol importante de estas moléculas en el procesamiento de la información olfatoria y en la formación de la memoria. Se analizaron cerebros de obreras de Apis mellifera (social, generalista); Melitoma segmentaria y Thygater analis (solitaria, especialista); Leiopodus lacertinus y Doeringiella nobilis (solitaria, parasita). Los resultados sugieren que la NOS y la TH se localizan principalmente en las áreas olfatorias del cerebro de abejas solitarias. Las hembras de abejas especialistas mostraron niveles mayores de actividad de NOS que las abejas parásitas. En conclusión el NO puede estar relacionado con la detección y procesamiento de la información olfatoria durante la búsqueda de recursos para la cría (alimentación, nidificación).

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Morphology of the sensory system of argentinean wild bees. Features of the integration system of the chemosensory information

ABSTRACT Sensilla are the functional basic unit of cuticle receptors in insects, involved mainly in the mechano- and chemo-reception. For a better understanding of the association between the external sensory system and the several types of behaviors that have emerged along the evolutionary history of bees, the external morphology of the antennal sensilla of 34 taxa of the family Apidae were studied. Light and scanning electron microscopy methodologies were used. The results showed that in non-parasitic bees gustative and tactile sensilla were more abundant in female than male bees. Olfactory receptors predominated in the antennal system of males. On the contrary, parasitic species did not show sexual dimorphism. The possible coevolution of sensilla in males and females of solitary bees is discussed in light of previous reports. Additionally, the expression of nitric-oxide synthase (NOS) and tyrosine-hydroxylase (TH) were characterized in central nervous system of four solitary bees. Nitric oxide (NO) and TH are recognized molecules in the insect nervous system. Several experiments in Apis mellifera suggest an important role of these molecules in the processing of olfactory information, as well as, in learning and memory formation. Brains from Apis mellifera workers (social, generalist) and from males and females of Melitoma segmentaria and Thygater analis (solitary, specialist) and from Leiopodus lacertinus and Doeringiella nobilis (solitary, parasitic) were studied. The results suggest that NOS and TH are mainly present in the olfactory areas of the brain of solitary bees. Females of specialist bees showed higher levels of NOS activity than parasitic bees. In conclusion, the NO might be related to the detection and processing of olfactory information during foraging.

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INDICE     RESUMEN ........................................................................................................................3  ABSTRACT ......................................................................................................................4  CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN GENERAL ....................................................................9  1.1 ABEJAS ARGENTINAS ..........................................................................................9  1.2 PARASITISMO Y ESPECIALIZACIÓN EN ABEJAS DE LA FAMILIA APIDAE ......9  1.2.1 Diversidad comportamental en la Familia Apidae.............................................9  1.2.2 Cleptoparasitismo en abejas solitarias ...........................................................10  1.3 LOS SENSILIOS ...................................................................................................10  1.3.1 Sensilios morfología general y clasificación ...................................................10  1.3.2 Sensilios en los Himenópteros: filogenia y comportamiento...........................12  1.4 SISTEMA NERVIOSO CENTRAL Y QUIMIORRECEPCIÓN EN ABEJAS...........13  1.4.1 El sistema nervioso central en insectos..........................................................13  1.4.2 Neuroanatomía y quimiorecepción en abejas.................................................15  1.4.3 Oxido nítrico sintasa en insectos ....................................................................17  1.4.4 Oxido nítrico en abejas ...................................................................................18  1.4.5 La dopamina y los insectos.............................................................................18  1.5 HIPÓTESIS DE TRABAJO....................................................................................19  1.6 OBJETIVOS ..........................................................................................................20  1.6.1 Objetivo general:.............................................................................................20  1.6.2 Objetivos específicos ......................................................................................20  CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS...................................................................22  2.1 MUESTREOS........................................................................................................22  2.1.1 Colectas ..........................................................................................................22  2.1.2 Material de la colección ..................................................................................22  2.2 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS ............................................................22  2.2.1 Metodología para observación con microscopia electrónica de barrido .........22  2.2.2 Procesamiento de muestras histológicas para microscopia óptica ................23  2.2.3 Procesamiento de muestras histológicas para microscopia electrónica de transmisión...............................................................................................................23  2.2.4 Obtención de homogenatos para el análisis de la actividad enzimática de NOS y western blot ..................................................................................................23 

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2.3 TECNICAS MORFOLÓGICAS ..............................................................................24  2.3.1 Observaciónes por Microscopía Electrónica de Barrido (MEB) y de Transmisión (MET) ..................................................................................................24  2.3.2 Cortes histológicos para microscopia óptica...................................................24  2.3.3 Cortes histológicos ultrafinos y semifinos .......................................................24  2.3.4 Inmunocitoquímica..........................................................................................24  2.3.5 Histoquímica ...................................................................................................25  2.3.6 Metodología para detección de sensilios con poros .......................................25  2.4 ANÁLISIS BIOQUÍMICOS .....................................................................................26  2.4.1 Actividad enzimática .......................................................................................26  2.4.2 Western blot....................................................................................................26  2.5 MEDIDAS MORFOMÉTRICAS .............................................................................27  2.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICO .....................................................................................27  2.7 REFERENCIAS NEUROANATÓMICAS ...............................................................27  CAPÍTULO 3: MORFOLOGÍA DEL SISTEMA SENSORIAL DE LAS ANTENAS EN ABEJAS SOLITARIAS DE LA TRIBU EMPHORINI (APIDAE).....................................30  3.1 INTRODUCCIÓN y OBJETIVOS...........................................................................30  3.2 CARACTERIZACIÓN DE LOS TIPOS DE SENSILIOS EN EL FLAGELO ANTENAL ....................................................................................................................30  3.2.1 Localización general de los sensilios en los flagelómeros..............................30  3.2.2 Setas...............................................................................................................31  3.2.3 Sensilios placodeos (sPa)...............................................................................31  3.2.4 Sensilios tricoides tipo A (stA) ........................................................................31  3.2.5 Sensilio tricoides tipo (stB)..............................................................................32  3.2.6 Sensilio tricoides tipo C-D (stC-D) ..................................................................32  3.2.7 Sensilio basicónico (sBa)................................................................................32  3.2.8 Sensilio coelocónico (sCoe) y sensilio ampuláceo (sAmp).............................33  3.2.9 Sensilio coelocapitular (sCap) ........................................................................33  3.3 DISTRIBUCIÓN Y ABUNDANCIA DE SENSILIOS EN LA TRIBU EMPHORINI ..33  3.3.1 Distribución de setas.......................................................................................33  3.3.2 Distribución de los sensilios............................................................................34  3.3.3 Abundancia de sensilios .................................................................................35  3.3 DISCUSIÓN...........................................................................................................35  3.3.1 Abundancia de sensilios .................................................................................35 

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3.3.2 Dimorfismo sexual ..........................................................................................39  3.3.3 Distribución de sensilios .................................................................................41  3.3.4 Variación taxónomica......................................................................................43  3.4 CONCLUSIÓN.......................................................................................................44  3.FIGURAS..................................................................................................................45  3. GRÁFICOS..............................................................................................................56  3. TABLAS...................................................................................................................65  CAPÍTULO 4: SENSILIOS ANTENALES EN ABEJAS PARÁSITAS Y NO PARÁSITAS DE LA FAMILIA APIDAE ...............................................................................................78  4.1 INTRODUCCIÓN y OBJETIVOS...........................................................................78  4.2 SENSILIOS ANTENALES .....................................................................................78  4.2.1 Tipos de sensilios antenales...........................................................................78  4.2.2 Distribución general de los sensilios antenales ..............................................78  4.3 SENSILIOS ANTENALES EN LA ESPECIE Thygater ..........................................79  4.3.1 Morfología general de la antena .....................................................................79  4.3.2 Distribución de setas.......................................................................................79  4.3.3 Abundancia de tipos de sensilios en Thygater analis .....................................79  4.3.4 Distribución de sensilios en el flagelo antenal ................................................80  4.4 SENSILIOS ANTENALES EN 2 ESPECIES CLEPTOPARÁSITAS......................80  4.4.1 Distribución de setas.......................................................................................80  4.4.2 Distribución de sensilios en el flagelo antenal ................................................80  4.4.3 Abundancia de sensilios .................................................................................81  4.5 SENSILIOS ANTENALES EN LA SUBFAMILIA APINAE .....................................81  4.5.1 Abundancia y distribución de sensilios en especies solitarias........................81  4.5.2 Variabilidad de pelos en el flagelo antenal .....................................................81  4.5.3 Longitudes antenales......................................................................................82  4.6 DISCUSIÓN...........................................................................................................82  4.6.1 Pelos antenales en especies no parásitas......................................................82  4.6.2 Sensilios, morfología y cleptoparasitismo.......................................................84  4.6.3 Sistema sensorial y filogenia en los himenópteros .........................................86  4.7 CONCLUSIONES..................................................................................................89  4. FIGURAS.................................................................................................................90  4. GRÁFICOS..............................................................................................................93  4.TABLAS..................................................................................................................102 

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CAPÍTULO 5: SISTEMA NERVIOSO CENTRAL, VÍAS QUIMOSENSORIALES EN ABEJAS SOLITARIAS.................................................................................................112  5.1 OBJETIVOS ........................................................................................................112  5.2 CARACTERIZACIÓN DEL ÓXIDO NÍTRICO EN CEREBRO DE ABEJAS ESPECIALISTAS Y PARÁSITAS ..............................................................................112  5.2.2 Actividad de NOS..........................................................................................112  5.3 VÍAS QUIMIOSENSORIALES EN CEREBROS DE ABEJAS SOLITARIAS: NOS Y TH..............................................................................................................................113  5.3.1 Inmunoreactividad de NOS en cerebros de abejas solitarias .......................113  5.3.2 Histoquímica de NOS en cerebros de abejas solitarias................................113  5.3.3 Inmunoreactividad de células para la enzima tirosina-hidroxilasa................114  5.4 DISCUSIÓN.........................................................................................................114  5.4.1 NOS en cerebros de abejas solitarias ..........................................................114  5.4.2 Principales neuropilos NADPH-diaforasa positivos ......................................115  5.4.3 Somas y fibras NADPH-diaforasa positivos..................................................115  5.4.4 Quimiorrecepción y NO.................................................................................116  5.4.5 Células TH+ y DA en cerebros de abejas solitarias......................................117  5.4.6 Aminas biogénicas en himenópteros ............................................................118  5.4 CONCLUSIONES................................................................................................119  5. FIGURAS...............................................................................................................121  Abreviaturas ..................................................................................................................129  5. GRÁFICOS............................................................................................................130  CONCLUSIONES GENERALES..................................................................................132  BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................133 

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CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN GENERAL 1.1 ABEJAS ARGENTINAS La superfamilia Apoidea incluye a todas las familias de abejas y a las familias de avispas “spheciformes”. A diferencia de las avispas las abejas se caracterizan por proveer a sus crías de una alimentación cuya fuente de proteínas es fundamentalmente, polen. Las abejas se han distribuido por todas las regiones excepto en la Antártida, su riqueza genérica es mayor en la zona Neotropical, pero a nivel de especies la mayor riqueza se localiza en zonas templadas y secas. Son los agentes de polinización más importantes de las plantas con flores y desempeñan un papel de suma importancia en el mantenimiento de las comunidades naturales. Morfológicamente las abejas se diferencian de las avispas por poseer pelos ramificados y el basitarso de las patas posteriores más ensanchado (Michener, 2007). Actualmente se reconocen 7 familias de abejas, Colletidae, Halictidae, Andrenidae, Stenotritidae, Megachilidae, Apidae y Melittidae, abarcando alrededor de 20.000 especies (Michener, 2007). La familia Apidae está representada en la Argentina por sus tres subfamilias y 24 tribus, comprendiendo 427 especies nominales. Es el grupo de abejas más diverso en la Argentina, tanto a nivel de géneros como de especies (Roig Alsina, 2008).

1.2 PARASITISMO Y ESPECIALIZACIÓN EN ABEJAS DE LA FAMILIA APIDAE 1.2.1 Diversidad comportamental en la Familia Apidae A diferencia de la muy estudiada Apis melllifera existe un gran número de especies de abejas que no establecen colonias. La diversidad de adaptaciones al ciclo reproductivo deja afuera innumerables ejemplos, sin embargo aquí se pueden definir algunos de los procesos generales. Una hembra solitaria, luego de aparearse, construye su propio nido donde deposita los huevos y los aprovisiona de alimento. Los estadios larvales suelen ser cortos hasta llegar al estado de pre-pupa donde resiste las estaciones desfavorables. Luego ocurre el estadio pupal, en general, de rápido desarrollo para dar paso a un adulto que emerge del nido en busca de una pareja reproductiva.

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Posteriormente a la cópula, la hembra construye un nido donde acumula el alimento colectado compuesto principalmente por polen a través de un proceso denominado “aprovisionamiento en masa”. Una característica que las diferencia en el proceso de nidificación con las avispas de la familia Sphecidae es que las abejas luego de depositar el huevo, cierran la celda con secreciones glandulares (Roig Alsina, 2008). Algunas especies de abejas, exhiben un alto grado de especificidad en la selección de la planta hospedadora para la colecta de polen u otros recursos. Las abejas que explotan una sola familia de plantas o grupo estrechamente relacionado, se definen como especialistas, mientras que las denominadas generalistas no muestran preferencia estricta en la selección de polen, utilizando una gran diversidad de plantas hospedadoras.

1.2.2 Cleptoparasitismo en abejas solitarias En la historia evolutiva de las abejas han surgido varios tipos de comportamientos en donde una abeja no interviene en la crianza de su progenie y aprovecha los recursos de otra especie u hospedador. El más marcado es el cleptoparasitismo. La abeja hembra cleptoparásita es aquélla que en forma obligada busca nidos de otras abejas no parásitas, depositando sus huevos sobre el alimento almacenado o aprovechando el esfuerzo de otras para que cuiden su descendencia parásita. Las abejas parásitas se caracterizan por presentar modificaciones morfológicas distintivas como: poca pilosidad corporal, estructuras colectoras de polen reducidas o ausentes, pérdida de dientes mandíbulares y un escaso dimorfismo sexual en distintas dimensiones corporales (Wcislo, 1995; Wcislo y Cane, 1996) Varios estudios comportamentales afirman que una abeja hembra no parásita usa señales olfatorias de corto alcance, así como claves visuales de las plantas para colectar alimento para ella y su cría. Por otro lado, una abeja hembra parásita detecta señales que indican la presencia del nido o de la abeja hospedadora. Esto sugiere que los sistemas de localización, hacia la planta u hospedador, han evolucionado de forma diferente en abejas parásitas y no parásitas (Wcislo, 1995).

1.3 LOS SENSILIOS 1.3.1 Sensilios morfología general y clasificación: Los sensilios se definen como la unidad cuticular básica de la mecano y quimiorrecepción de los artrópodos (Chapman, 1998). Se localizan en toda la región corporal de los

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insectos, siendo los más importantes los ubicados en las antenas, el aparato bucal y las patas. Cada sensilio posee una o más neuronas receptoras, conjuntamente con células de sostén, todas incluidas en una estructura cuticular externa.

a)

b)

Figura 1: Componentes de un sensilio. Quimiorreceptor (a) y mecanorreceptor (b). Adaptado de Chapman (1998).

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Existen 3 grandes clases de sensilios, aquellos que carecen de poros en la cutícula, actúan como receptores mecanosensoriales y poseen una inserción en la superficie corporal flexible conectada a terminales nerviosas (cuadro 1). La segunda clase son los sensilios que poseen uno o más poros por donde son capaces de percibir partículas químicas (ver fig. 1). Una tercera clase de sensilios, son los que carecen de poro y sus inserciones

son

inflexibles,

estos

receptores

cumplen

funciones

de

termo

e

higrorrecepción (Altner y col., 1983, cuadro 1).

Figura 2: Nombres de los principales sensilios hallados en las antenas de insectos en base a su morfología externa. Adaptado de Klowden (2007).

1.3.2 Sensilios en los Himenópteros: filogenia y comportamiento En las últimas décadas, el estudio de los sensilios en himenópteros ha despertado el interés como herramienta para profundizar el conocimiento de las relaciones filogenéticas dentro de este grupo (Basibuyuk y Quicke, 1999; Walther 1983). Por otro lado, existen numerosos trabajos que utilizan la identificación de ciertos sensilios y su correlación con distintos tipos de comportamientos. Varios sensilios quimiorreceptores se encuentran involucrados en la detección del huésped por parte de avispas parásitas (Bénédet y col., 2002) o en la detección de compañeras de nido en hormigas (Ozaki y col., 2005). El abordaje de la morfología antenal proporciona no sólo bases para la investigación de los mecanismos de reconocimiento de señales, sino que proporciona caracteres para la separación de especies estrechamente relacionadas (Bleeker y col.; 2004; Shang y col., 2010; van Baaren y col., 1999) o el estudio a nivel de grupos (Hallberg y Hansson, 1999).

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En las abejas existen tres apéndices con sensilios que captan la mayoría de los estímulos del entorno, las antenas, la probóscide y las patas. Las antenas son el órgano con la concentración de sensilios más elevada, siendo el principal sistema de quimio- y mecanorrecepción. La antena consta de tres segmentos un escapo, que corresponde al segmento que se inserta en la cabeza, luego se continúa con el pedicelo y el flagelo. En abejas, escapo y pedicelo son relativamente cortos, mientras que el flagelo es el segmento más largo y posee la mayoría de los sensilios de la antena. Los estudios morfológicos de la estructura externa e interna de los sensilios antenales en Apis mellifera (Ågren 1977; Slifer y Sekhon, 1961; Esslen y Kaissling, 1976) permitieron clasificar los distintos tipos de sensilios, que dieron base a posteriores estudios comparativos en otras especies de abejas (Ågren, 1977, 1978; Ågren y Sevensson, 1982; Gupta 1992; Wcislo, 1995). Los análisis sobre asociaciones entre comportamiento y densidad o distribución de los receptores antenales, fueron realizados en su mayoría sobre las especies sociales (Silva de Moraes y Da Cruz Landim, 1972; Johnson y Horward, 1987; Riveros y Gronenberg, 2010; Spaethe y col., 2007). Por el contrario, los diversos grupos de abejas solitarias han sido escasamente estudiadas con este enfoque (Wcislo 1995).

1.4 SISTEMA NERVIOSO CENTRAL Y QUIMIORRECEPCIÓN EN ABEJAS 1.4.1 El sistema nervioso central en insectos La organización anatómica de sistema nervioso de los insectos está conformada por una cadena de ganglios que conforman el sistema nervioso central (SNC) y una red periférica de fibras nerviosas que se extienden por toda la cavidad corporal, denominada sistema nervioso periférico (SNP). Los ganglios están constituidos por el agrupamiento de los somas neuronales y las terminaciones nerviosas asociadas. Funcionalmente, SNC y SNP intervienen en el control del movimiento, comunicación y percepción. Un tercer sistema llamado sistema nervioso visceral (SNV) inerva y regula procesos fisiológicos internos como la circulación de la hemolinfa, secreción glandular y alimentación (Klowden, 2007). El ganglio principal y más complejo es el cerebro, que está ubicado pre-oralmente en posición dorsal y por encima del esófago. Luego se continúa con una cadena de ganglios pequeños que rodean al esófago dorsalmente y forman parte del SNV, denominado en esta región sistema estomagástrico (Se). A continuación, las conexiones descienden y

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conforman la cadena de ganglios ventrales (CGV). El único ganglio de la CGV ubicado en la cabeza es el ganglio subesofágico (GSe), el resto conforman los ganglios torácicos y abdominales, pertenecientes al SNC del tórax y abdomen. El cerebro y los ganglios comparten la misma histoarquitectura y consisten en somas neuronales rodeando periféricamente a una red de fibras centrales o neuropilo. Asociadas al neuropilo solo se pueden hallar células gliales. (Chapman 1998, Hähnlein y Bicker, 1996). A pesar de la inmensa diversidad

morfológica y comportamental que presentan los

insectos, la anatomía cerebral muestra una organización conservada, con neuropilos homólogos en la mayoría de las especies. El cerebro esta dividido en tres neuroméros mayores: el protocerebro, el deutocerebro y el tritocerebro (Figura 3). El protocerebro (Pc), es la sección más primitiva y desarrollada del cerebro de insectos, posee una estructura principal bilobulada ubicada en la región central denominada lóbulos protocerebrales (Lp). Además en el protocerebro existen 3 neuropilos estructurados bien reconocibles, los lóbulos ópticos (Lo), el complejo central (Cc) y los cuerpos pedunculados. La retina y las extensiones axónicas de los fotorreceptores se continúan en cada Lo ubicados bilateralmente. En posición antero-dorsal se ubica un grupo de células neuroendocrinas cercana a los ocelos llamada pars intercerebralis (Pi). El Cc se ubica en posición medial, conectando neuropilos de distintas regiones (Ver figura 3). El Cc lo componen el puente protocerebral (Pp), una zona de convergencia de varios neuropilos menores, y el cuerpo central (Cu). Diversos estudios en insectos involucran al Cu con el procesado de información visual, locomotora y la memoria de largo término. A cada lado del Pp se encuentran los cuerpos pedunculados o mejor conocidos por sus siglas en inglés como Mushroom bodies (Mb). Las células Kenyon (Kc) son las interneuronas de los Mb. Sus extensiones nerviosas forman tres neuropilos menores, los calices (Ca) el pedúnculo (Pe) y los lóbulos (Lmb). Los somas del Kc se encuentran rodeados por los Ca. Diversas neuronas de proyección tienen sus aferencias en los Mb (Chapman, 1998). El deutocerebro (Do) se divide bilateralmente en 2 neuropilos principales, los lóbulos antenales (La) y los centros mecano-sensoriales y motores, también llamados lóbulos dorsales (Ld). Los La reciben las terminales nerviosas de los sensilios ubicados en el flagelo, estas se conectan a interneuronas y conforman unidades sinápticas de forma esférica llamados glomérulos. Son 3 los tipos neuronales que procesan la información proveniente de la antena, las neuronas locales (Nl), las neuronas de proyección (Np) y las neuronas centrifugas (Nc). Los Ld, ubicados posteriormente a cada lóbulo antenal,

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reciben terminales nerviosas de receptores y motoneuronas del escapo y pedicelo, sin embargo en algunas especies, los axones pertenecientes a sensilios de contacto del flagelo realizan sinapsis en esta zona. La morfología de los neuropilos del Ld son más difíciles de delimitar por su íntima relación con terminales nerviosas del protocerebro y el Gse (Homberg y col., 1989). El tritocerebro es la región más pequeña, consiste en un par de lóbulos ubicado ventralmente al deutocerebro, se continúa con el GSe. Los lóbulos se conectan entre sí por una comisura que trascurre por debajo del esófago; reciben aferencias sensoriales del labro y del Se.

Figura 3: Principales neuropilos de SNC en insectos. Adaptado de Kaas (2007).

1.4.2 Neuroanatomía y quimiorecepción en abejas El modelo más estudiado para comprender las estructuras nerviosas involucradas en la quimiorrecepción de las abejas, es la vía olfatoria que se inicia en las señales captadas por los sensilios antenales de Apis mellifera (Sandoz, 2011). La primera etapa en la detección de una sustancia química, es a través de la interacción entre moléculas odorantes y las dendritas de las neuronas receptoras olfatorias, reconocidas por sus siglas en ingles como ORNs. Las ORNs inervan los sensilios antenales, siendo los sensilios placodeos los más estudiados. A partir de la señal

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registrada en estos receptores se reconstruye la vía desarrollada a continuación. Cuando las ORNs del sensilio se activan por las moléculas-ligando apropiadas, el impulso nervioso se inicia transcurriendo por sus axones. Dichos axones conforman los nervios antenales (Na). En la antena el Na transcurre longitudinalmente en una rama dorsal y otra ventral. El Na en el cerebro se divide en 6 tractos que llevan la información a los centros superiores de integración. El La es el centro primario de integración olfatoria. La información recibida activa neuronas Nl cercanas a los glomérulos. Las Nl hacen sinapsis con otros glomérulos o con neuronas de relevo hacia centros superiores, en general sus acciones son del tipo inhibitoria. Las neuronas de proyección (PNs) son aquellas neuronas de salida de los glomérulos, cuyos axones hacen sinapsis en los centros olfatorios de segundo orden como los Mb y Lh. Se reconocen 5 tractos que agrupan axones de neuronas PN, también reconocidos por sus siglas en ingles ACTs (antenno cerebral tracts). El tracto de salida lateral (l-ACT) y el tracto de salida medial (m-ACT) contienen axones de proyección uniglomerular (uNp). Las fibras alojadas en los glomérulos hacen sinapsis por cualquiera de estas vías pero no por ambas. Los otros tres tractos menores trascurren en dirección medio-lateral (ml-ACT), proyectándose solo a los Lp a través de axones que provienen de neuronas de proyección multiglomerular. Los axones terminales de las PNs hacen sinapsis con las células Kc en los cálices de los Mb. Los Ca reciben las señales olfatorias y visuales, probablemente también del sentido mecano-sensorial y del gusto. Están divididos en tres regiones, el labio, el collar y el anillo basal. El labio y la región media interna del anillo basal, son las regiones que reciben la información olfatoria procesada en los centros primarios (Gronenberg, 2001). Neuronas PNs provenientes del m-ACT inervan la zona olfatoria del anillo basal, mientras que PNs provenientes de l-ACT hacen sinapsis en la región central del anillo basal. La otra gran región inervada por estos dos tractos es el cuerno lateral del protocerebro (Lh) que también se muestra compartimentalizado según el tracto que la inerva. Sin embargo se desconoce la función de Lh. El procesamiento de la señal por centros de segundo orden, está bien representado en los Mb por 3 tipos principales de neuronas; las ya mencionadas Kc o neuronas intrínsecas, las neuronas de retroalimentación (Fn) y las neuronas extrínsecas (Ne). El último tramo de las vías de señales son neuronas de salida de los Mb que se ramifican en distintas regiones del protocerebro, como en el pedúnculo de los mismos Mb, los Lp y Lh donde se conectan con neuronas descendentes (Ver figura 4).

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Estas vías son las menos conocidas en las abejas y representan la instancia final de procesamiento que determina el comportamiento ante una señal dada (Sandoz, 2011). Se puede observar también la configuración de una vía conocida

para la recepción

gustativa (Figura 4). La comprenden las neuronas ventrales impares (VUM), cuyos somas se encuentran en el Gse, y comparten con la vía olfatoria sus aferencias bilaterales en centros como los La, cálices de los Mb y los Lh.

Figura 4: Principales vías nerviosas involucradas en el procesamiento de señales olfatorias. Adaptado de Sandoz (2011).

1.4.3 Oxido nítrico sintasa en insectos El gas oxido nítrico (NO) es una molécula de corta vida reconocida como mensajero intracelular en distintos procesos fisiológicos de los insectos. La producción NO a partir del aminoácido L-arginina es llevada a cabo por una familia de enzimas denominadas sintasas del oxido nítrico, un grupo de hemo-proteínas con actividad oxigenasa y reductasa (Davies, 2000). Las NOS se caracterizan por tener sitios de unión a los cofactores FAD, FMN y NADPH y estar reguladas por el complejo Ca2+-calmodulina. En insectos las NOS se encuentran filogenéticamente cercanas a la isoforma neuronal (NOSn) de los vertebrados (Davies, 2000). Se clonó y secuenció el gen NOS en representantes de distintas familias de insectos. Los estudios sobre Drosophila melanogaster (Regulski y Tully, 1995) Anopheles stephensi (Luckhart y Rosenberg, 1999),

17

Manduca sexta (Nighorn y col., 1998), y Rhodnius prolixus (Yuda y col., 1996) mostraron extensas regiones homólogas, destacándose aquellas que codifican para los sitios de unión de los cofactores y la porción amino-terminal de la secuencia proteica. En los últimos 15 años surgieron diversos trabajos sobre el rol del NO en los insectos; existen evidencias sobre su función como vasodilatador en el huésped durante la succión de sangre por R. prolixus, regulador de la secreción en los túbulos de Malpighi y en el desarrollo de los fotorreceptores en D. melanogaster (Davies y col., 1997; Davies, 2000). Sin embargo, la caracterización de la actividad del NO en el sistema nervioso es sin dudas la más extensa: el aprendizaje y la formación de memoria, el crecimiento de los axones. la locomoción y la olfacción en órtopteros, dípteros, lepidópteros e himenópteros (Davies, 2000).

1.4.4 Oxido nítrico en abejas En 1994 Müller realizó la primera descripción bioquímica sobre la NOS y su localización en el cerebro de Apis mellifera. Se cuantificó la actividad enzimática y se describió su presencia por métodos histoquímicos en el lóbulo antenal y los cuerpos pedunculados. Posteriormente,

nuevos

ensayos

que

combinaron

el

análisis

de

respuesta

comportamental a un estímulo químico sugirieron que el sistema NO/GMPcíclico ubicado en los lóbulos antenales, es un componente de la maquinaria molecular involucrada en los procesos de adaptación e integración de la información quimiosensorial (Müller y Hildebrandt, 1995). Estudios posteriores confirmaron el rol de NO en la formación de memoria de largo plazo (LTM) ante un estímulo quimiotáctil (Müller, 1996; Dacher y Gauthier, 2008).

1.4.5 La dopamina y los insectos Las aminas biogénicas, junto con la acetilcolina, los aminoácidos y los péptidos son moléculas neuroactivas que pueden actuar como neuromoduladores, neurotransmisores, neurohormonas de los artrópodos (Chapman, 1998). Dentro de las aminas biogénicas existen moléculas bien caracterizadas en distintos taxones de insectos como la octopamina, la serotonina y la dopamina. La dopamina (DA) deriva del aminoácido tirosina, que a partir de 2 conversiones enzimáticas, por las enzimas tirosina hidroxilasa (TH) y la dihidroxi-L-fenil-alanina (LDOPA) da como producto la DA (Blenau y Baumann, 2001). Diversos estudios sugieren que la dopamina actuaría como neuroregulador en procesos de desarrollo, metamorfosis

18

y comportamiento reproductivo de los insectos (Sasaki y col., 2012). En el sistema nervioso de los insectos se encuentra una alta cantidad de receptores para DA (DAr). Diversos estudios in vivo e in vitro prueban el rol fundamental de la acción de DA en el sistema nervioso central y los procesos de información quimiosensorial (Ellen y Mercer, 2012; Marella y col., 2012). En los adultos de A. mellifera se encontró que los niveles de DA en cerebro varían según el tipo de recurso que colectan para la colonia (Taylor y col., 1992). Por otra parte, en la misma especie se determinó que la DA tiene un efecto modulador sobre la conductancia al K+ en los lóbulos antenales de las larvas (Ellen y Mercer, 2012).

1.5 HIPÓTESIS DE TRABAJO La antena es el principal órgano para la quimiorrecepción en los insectos. Es esperable que los diferentes tipos de comportamiento observados en condiciones naturales se reflejen en modificaciones de la morfología antenal, particularmente en la composición de sus sensilios. El lóbulo antenal de los insectos es la primera región del sistema nervioso central para el procesamiento de la información quimiosensorial. El óxido nítrico (NO) y la dopamina (DA) son neurotransmisores de la vía quimiosensorial de numerosas especies de insectos. Por lo tanto en abejas solitarias especialistas y cleptoparásitas, esperamos observar: 1. Un patrón de organización de sensilios quimiosensoriales específico en un grupo de abejas especialistas. 2. Una reducción de los receptores antenales encargados de la detección de recursos para el sostenimiento de la cría en abejas cleptopárasitas 3. Diferencias en la distribución de mensajeros químicos asociados a las vías quimiosensoriales entre abejas generalistas, especialistas y cleptopárasitas.

19

1.6 OBJETIVOS 1.6.1 Objetivo general: Caracterizar morfológicamente los sensilios del flagelo antenal y conocer la distribución de mensajeros químicos específicos en abejas solitarias de la familia Apidae.

1.6.2 Objetivos específicos 1. Estudiar la morfología del sistema sensorial antenal en una tribu de abejas especialistas 2. Comparar los patrones de sensilios antenales de especies cleptoparásitas y no parásitas dentro de la familia Apidae 3. Identificar las enzimas sintasa de óxido nítrico (NOS) y TH en ganglios cefálicos en abejas parásitas y no parásitas

20

CLASE DE SENSILIO

Propiedades morfológicas

Capacidad sensorial

- Inserción flexible - Una célula sensorial con

- Inserción inflexible

en domo con inserción flexible

chaetica

pelo con inserción flexible

basiconica

bastoniforme

- Higrorecepción

coeloconica

bastoniforme en hoyo

basiconica

pelo uniporo con inserción flexible pelo uniporo con inserción flexible bastoniforme uniporo con inserción flexible domo uniporo con inserción flexible bastoniforme uniporo

- 2 a 9 célula sensoriales

styloconica

cúpula uniporo

- Con pared de poro simple

basiconica

bastoniforme multiporoso bastoniforme multiporoso en hoyo

- Inserción flexible - 2 a 20 célula sensoriales, una dendrita con cuerpo Uniporo de pared gruesa

campaniformia

- Termorecepción

- 3 a 4 célula sensoriales, una dendrita con pliegues

Terminología nueva

-Mecanorepción

cuerpo tubular Poro ausente

Terminología antigua

tubular

chaetica Quimiorecepción gustativa

trichodea

y mecanorecepción (receptor quimico de contacto)

basiconica styloconica

- Inserción inflexible

- 1 a 40 células sensoriales - Dendritas pueden o no

- Quimiorecepción gustativa

- Quimiorecepción olfatoria

estar ramificadas Multiporo de pared fina con inserción inflexible

coeloconica trichodea

pelo multiporoso

placodea

placa multiporosa

basiconica

bastoniforme estriado multiporoso

coeloconica

bastoniforme estriado multiporoso en hoyo

Quimiorecepción olfatoria - Con poros de doble pared

y termorecepción

- 2 a 4 células sensoriales - Dendritas no ramificadas

Quimiorecepción olfatoria, termorecepción e higrorecepción

CUADRO 1: Principales tipos de sensilios comparando la terminología tradicional con la ultraestructura y la función en insectos. Adaptado de Blum (1985).

21

CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS 2.1 MUESTREOS 2.1.1 Colectas Las colectas de abejas se llevaron acabo desde Octubre hasta Marzo con una frecuencia de 2 veces por semana. Las colectas abarcaron el período 2008-2012. Se seleccionaron 2 zonas principales de muestreo, la Reserva Costanera Sur ubicada en la Ciudad Autónoma de Buenos Aires y la Biosfera Laguna Oca ubicada en la ciudad de Formosa. Se utilizaron redes de mano y “pan-traps”. Los insectos colectados fueron ordenados por lugar y fecha para luego ser procesados en el laboratorio.

2.1.2 Material de la colección Para los análisis de morfología antenal también se dispuso de material perteneciente a la colección general de la División de Entomología del Museo Argentino de Ciencias Naturales “Bernardino Rivadavia” (MACN). Dicho material está debidamente identificado con fecha y nombre de la colecta. Las clasificaciones taxonómicas hasta el nivel de especie fueron llevadas a cabo con la asistencia del Dr. A. H. Roig-Alsina y del Lic. L. Compagnucci.

2.2 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS 2.2.1 Metodología para observación con microscopia electrónica de barrido Se utilizó el mismo protocolo para antenas extraídas de material fresco o proveniente de la colección. Se diseccionó la cabeza junto con las antenas, para ser sumergidas en solución fosfosalina (fosfato de sodio, 0,01 M; NaCl, 0,13 M; pH 7.4, PBS). Cada una de las muestras se colocó en tubos individuales de 2 ml. Para eliminar partículas que pudieran enmascarar estructuras se realizaron 10 lavados en PBS + 0,5 % Tritón X-100 (PBST) durante 30 minutos. En algunos casos, particularmente en las piezas pertenecientes a la colección, las muestras se colocaron en un recipiente con agua bidestilada y fueron sonicadas durante 3 minutos (Sabilex, ultrasonic cleaner).

Posteriormente se realizaron 5 lavados en

agua destilada y se deshidrataron en

concentraciones crecientes de alcohol etílico: 20%, 40%, 60% 80% y etanol absoluto, acetona-etanol (1:1) y acetona pura. Finalmente, las antenas se dejaron secar en el interior de una cápsula de Petri y se montaron sobre las platinas de observación previo a su metalización con una aleación oro-paladio por un dispositivo metalizador: Thermo VG Scientific SC7620.

2.2.2 Procesamiento de muestras histológicas para microscopia óptica Todos los animales colectados a campo, se mantuvieron vivos 12 horas en oscuridad a 4ºC, posteriormente se anestesiaron en frío durante 1 minuto en hielo. Las disecciones se efectuaron en un microscopio estereoscópico (Nikon SMZ 660). Los tejidos blandos: cerebros, ganglios subesofágicos y nervios antenales se fijaron en una mezcla de paraformaldehído al 4% (p/v) y acido pícrico al 0,4% (v/v) en tampón fosfato de sodio 0,16M pH 6,9. Se mantuvieron en el fijador durante 24 hs. a 4 ºC. Las muestras postfijadas se lavaron en PBS, luego se colocaron en tubos de 1,5 ml en 20% p/V de sacarosa (Sigma) y 0,26 %

p/V azida sódica (Sigma) en buffer fosfato. Posteriormente fueron

guardadas a 4 ºC hasta su utilización.

2.2.3 Procesamiento de muestras histológicas para microscopia electrónica de transmisión Para el análisis ultraestructural mediante microscopía electrónica de transmisión (MET), las antenas fueron fijadas 24 horas con glutaraldehído 2,5%, CaCl2 1 mM, sacarosa 3,5% p/V en buffer cacodilato 100 mM (pH 7,2) a 4ºC , seguido de una post-fijación en OsO4 1% en buffer cacodilato. Posteriormente se deshidrato en concentraciones crecientes de acetona y oxido de propileno. El material se incluyo en resina Spurr a 60 ºC por 48 horas.

2.2.4 Obtención de homogenatos para el análisis de la actividad enzimática de NOS y western blot Las disecciones de los cerebros junto con los ganglios subesofágicos se realizaron con instrumental previamente esterilizado. Los tejidos se rociaron con solución salina estéril mientras se separaban de la cutícula. Se retiró el tejido traqueal superficial y los lóbulos ópticos, que no formaron parte de los homogenatos. Luego se colocaron en tubos estériles (8 cerebros por tubo) conteniendo 50ul de solución salina con 10% de una

23

mezcla de inhibidores de proteasas (Sigma). Se conservaron a –70º C hasta su utilización (Settembrini y col., 2007). Para el ensayo las muestras se homogenizaron con un microhomogeneizador; luego se centrifugaron a 10.000 rpm, a 4°C durante 10 min (Beckman GS-15R). Para cada muestra se conservó el sobrenadante, mientras que el precipitado se descartó. Alícuotas de 20 µl se conservaron a -30 °C para la determinación posterior de la concentración de proteínas por el método de Bradford (1976).

2.3 TECNICAS MORFOLÓGICAS 2.3.1 Observaciónes por Microscopía Electrónica de Barrido (MEB) y de Transmisión (MET) Para MEB, se utilizó un microscopio electrónico de barrido PHILIPS modelo XL serie 30. Se obtuvieron microfotografías digitales efectuadas por el servicio de microscopía electrónica de barrido del MACN. Para MET se utilizó un Microscopio Electrónico Zeiss modelo EM 10C realizadas por el servicio de microscópia electrónica del instituto LANAISMIE, Facultad de Medicina, UBA.

2.3.2 Cortes histológicos para microscopia óptica Se realizaron cortes histológicos frontales y sagitales de antenas y cerebros con un criostato (Microm, Germany). Se obtuvieron secciones de 14µm, para incubaciones en cámara húmeda que se colocaron en portaobjetos previamente gelatinizados y de 20-50 µm para incubación mediante el método de “free-floating”. En todos los casos, las secciones fueron lavadas en PBS e incubadas durante 1 hora en PBST 0,5 % (v/v).

2.3.3 Cortes histológicos ultrafinos y semifinos Se obtuvieron cortes ultrafinos (0,1 µm) y semi-finos (0,5-1 µm) con un ultramicrotomo Leica (RMC MT XL). Las secciones semifinas fueron teñidas con azul de toluidina al 1%.

2.3.4 Inmunocitoquímica Para localizar células productoras de NO se utilizó el anticuerpo policlonal dirigido contra la porción carboxiterminal de la enzima NOS que se encuentra conservada en la mayoría de las especies; dicho anticuerpo se generó en conejos (Thermo Scientific). La

24

concentración utilizada fue 1:100 (1:500; Settembrini y col., 2007). Con el objetivo de detectar neuronas productoras de NO. Un grupo de muestras se incubaron con anticuerpo dirigido contra la enzima tirosina hidroxilasa (TH) en concentraciones 1:500. A los fines de establecer una relación entre las células inmunorreactivas con los respectivos neuropilos, se utilizo el anticuerpo monoclonal SINORF1 preparado en ratón contra la proteína de fusión GST-synapsin de Drosophila melanogaster (Klagges y col., 1996). Las incubaciones con el anticuerpo primario (anti-uNOS, anti TH), fueron de 24 horas a 4 ºC en caso de las secciones ubicadas en portaobjetos y de 3 días en agitación a 4 ºC para las secciones incubadas mediante “free-floating”. También se realizaron dobles marcajes, utilizando de forma conjunta los anticuerpos SINORF1 y la TH. Para el caso de los dobles marcajes, las secciones se post-incubaron con una mezcla de anticuerpos anti conejo acoplado a iso-tiocianato de fluoresceína (FITC 1:40) para detectar la presencia de TH y anti ratón (1:40 acoplado a B-cloruro de sulfonilo lisamina rodamina (LRSC 1:40) para detectar la presencia de SINORF-1 durante 1 h en oscuridad a Tº ambiente. Para las muestras en flotación libre se incubaron 24hs a 4 ºC y 24 horas en agitación a temperatura ambiente siempre en oscuridad. Todas las secciones fueron montadas en glicerol con 10% 1, 4-Diazobicyclo-2,2,2-octano (DABCO™). Se tomaron fotografías de secciones representativas con un microscopio de epifluoresencia Nikon Eclipse 800.

2.3.5 Histoquímica Con el objetivo de detectar somas y neuropilos con actividad de NOS, se utilizó la técnica de las diaforasas dependiente de NADPH. La técnica se basa en la actividad reductasa de la porción C-terminal de la NOS, la cual no se pierde por efectos de la fijación. El sustrato nitroazul tetrazolio es reducido en presencia de NADPH dando como resultado un precipitado azul (Davies, 2000). Para esto los cortes de cerebros se incubaron en una solución de 0.1 mM de nitroazul tetrazolio (Sigma) en PBS+10% TX (v/v) en oscuridad durante 1 h a 37 ºC, en ausencia y presencia del sustrato ß-NADPH (Sigma) en una concentración 0.1 mM en PBS (Müller, 1996).

2.3.6 Metodología para detección de sensilios con poros Para la observación de sensilios con poros mediante microscopia óptica, se utilizó la técnica de Navasero (1991). Las abejas vivas se anestesiaron en frío y luego se 25

decapitaron. Las cabezas se sumergieron en acetona al 10 % durante diez segundos, luego se las colocó en un tubo conteniendo 5 ml de AgNO3 0,1 M (Biopack) durante 5-10 min. Se realizaron varios lavados en agua destilada de 15 min cada uno. Posteriormente se sumergieron en revelador (Kodack Microdol-X) durante 5-7 minutos. Finalmente las piezas se lavaron en acido acético al 3 % durante 1 minuto, y montaron en glicerol para observación. Los sensilios con poros presentan un precipitado negro.

2.4 ANÁLISIS BIOQUÍMICOS 2.4.1 Actividad enzimática La actividad de la enzima se cuantificó mediante el método de Feelisch y Noack (1987) que evalúa la actividad de la NOS, mediante la oxidación de la oxihemoglobina a metahemoglobina. Se prepararon los siguientes reactivos L-arginina 40 mM, NADPH 5 mM, SOD 80 μM, catalasa 10 μM, DTT 0.5 mM, oxi-Hb 30 μM, hepes 100 mM, en buffer fosfato 50mM. 50μl de cada muestra se incuban con los reactivos en una cubeta de espectofotométro (Beckman). Se registraron las absorbancias a 401 nm con lectura de referencia a 411 nm cada 2,5 segundos, durante 20 segundos. Se extrapolaron los datos de absorbancia (Abs) vs tiempo para obtener el valor de la pendiente de la línea de tendencia lineal (ΔAbs/min). Conjuntamente se tituló la concentración en moles de hemoglobina ([Hb]) a 415 nm y dividido por su coeficiente de extinción molar. La actividad de la enzima fue expresada en nmoles de NO producido por minuto por miligramo de proteína (prot) de la NOS. Estos valores se calcularon utilizando la siguiente ecuación.

nmoles/ (min. mg) = ΔAbs/min x Vf en cubeta (ml) x106 [Hb] x Vm (ml) x prot mg/ml Vf: volumen final de cubeta Vm: volumen de muestra

2.4.2 Western blot De cada uno de los homogenatos de las distintas especies, se sembraron 25ug de proteínas, en geles de SDS-poliacrilamida (8% Laemmli, 1970). Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF. La detección fue realizada utilizando el anticuerpo anti-NOS (1:1000, hecho en conejo, Thermo Scientific). Esta membrana fue luego incubada con anticuerpos secundarios biotinilados dirigidos contra las IgG de 26

conejo, y posteriormente con estreptavidina-peroxidasa. La detección del complejo se realizó por quimioluminiscencia con el kit ECL (Amersham Pharmacia Biotech), con placas fotográficas (Settembrini y col., 2007). Las placas fueron escaneadas y se cotejó el peso molecular de la banda obtenida con el marcador de peso molecular empleado.

2.5 MEDIDAS MORFOMÉTRICAS La longitud del flagelo (LF) y distancia intertegular (DI) se midieron mediante lupa estereoscópica (Zeiss) provista de un ocular graduado. El cociente entre LF y DI (LF/DI) se calculó para independizarse de las variaciones de tamaño corporal. Se considero la DI como indicador del tamaño corporal en abejas (Cane, 1987) El conteo de sensilios se realizó utilizando las microfotografías obtenidas por MEB de todos los flagelómeros antenales. En el procesamiento de las imágenes se utilizó el programa Corel-Draw versión 12 (Corel® Corporation Inc.). Se definió un área rectangular de muestreo que abarcaba la cara dorsal de cada flagelómero. La base del área coincidió en longitud y orientación con el eje antero-distal del segmento, la altura de dicha área fue definida como la mitad de la longitud del segmento. Para la estimación total del número de sensilios se calculó la superficie del lado dorsal multiplicándola por el valor de la densidad analizada. La superficie de cada flagelómero se obtuvo considerando al flagelómero como un cilindro, excepto el caso del segmento más distal para el cual se utilizó la fórmula de Fonta y Masson (1982).

2.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los datos fueron analizados usando el programa estadístico, GraphPad Prisma software. Las diferencias intra e inter-específicas fueron comparadas utilizando un método no parámetrico

(Kruskall–Wallis,

van

Emden,

2008).

Para

determinar

diferencias

significativas entre machos y hembras se analizaron la densidad de sensilios mediante métodos no paramétricos (Mann–Whitney, van Emden 2008). Los análisis de componentes principales (CPA) se hicieron mediante el programa Statistica 7 statsof 2004.

2.7 REFERENCIAS NEUROANATÓMICAS La disposición hipognata de la cabeza en los himenópteros permite definir al cerebro en tres planos (frontal, sagital y horizontal), donde se pueden reconocer las principales estructuras nerviosas mencionadas en 1.4.1 (ver figura 2.1). Se destaca en el gráfico la 27

presencia de un región del lóbulo protocerebral, denominado cuerno lateral o por sus siglas en ingles (Lh) importante en el procesamiento de la información olfatoria de abejas y hormigas (Abel y col., 2001; Mizunami y col., 2010).

28

Figura 2.1: Esquema de secciones frontales (A), horizontales (B) y sagitales (C) del cerebro de Apis mellifera. En A la línea de puntos separa una sección 160 µm desde la superficie anterior (izquierda), y una sección a 300 µm en el mismo sentido (derecha). La sección izquierda de B corresponde al plano de corte h1 en A, y la sección derecha a h2 respectivamente. En C la sección a la izquierda corresponde al plano de corte s1 en A y la derecha al s2 respectivamente. Cuerpo central (Cc), cálices lateral (Cl) y medial (Cm), células Kenyon (Kc), foramen del esófago (Fe), ganglio subesofágico (Gse), lóbulo antenal (La), lóbulo de los mushroom bodies (Lmb), lóbulo dorsal (Ld), lóbulo protocerebral lateral (Lpl), cuerno lateral (Lh), lamina (Lm), Lobula (Lo), Pd (protocerebro dorsal), Pm (protocerebro medial), medula (Me), Re (retina), S (región de somas celulares). Ejes v (ventral), d(dorsal), a(anterior), p(posterior), interno (Ir), Il (lateral). Adaptado de Kloppenburg (1995).

29

CAPÍTULO 3: MORFOLOGÍA DEL SISTEMA SENSORIAL DE LAS ANTENAS EN ABEJAS SOLITARIAS DE LA TRIBU EMPHORINI (APIDAE) 3.1 INTRODUCCIÓN y OBJETIVOS La tribu Emphorini es un grupo de abejas de la familia Apidae (subfamilia Apinae), exclusivamente americanas, en la cual algunos géneros se distribuyen en todo el continente y otros están restringidos a la región sudamericana. Taxonómicamente, la tribu está dividida en 2 subtribus (Ancyloscelina y Emphorina) que en total abarcan 10 géneros. Los miembros de esta tribu exhiben hábitos especialistas; comúnmente se los asocia a plantas como; convolvuláceas, onagráceas, cactáceas, pontederiáceas y asteráceas. Además, todos los miembros del grupo comparten el hábito de nidificar en el suelo (Michener, 2007; Roig-Alsina, 1998). El objetivo del capítulo es describir la morfología de los tipos de sensilios antenales, su distribución y abundancia en especies representativas de la tribu Emphorini (Apidae), con el fin de obtener nuevas herramientas que puedan contribuir a la taxonomía, filogenia y patrones de comportamiento dentro del grupo.

3.2 CARACTERIZACIÓN DE LOS TIPOS DE SENSILIOS EN EL FLAGELO ANTENAL 3.2.1 Localización general de los sensilios en los flagelómeros Las características generales de una antena se pueden apreciar en la figura 1. El flagelo en posición con su eje longitudinal paralelo al eje mayor de la cabeza, muestra 2 superficies. Ambas superficies son definidas como superficie dorsal y ventral (fig. 3.1a-B). Para una mejor descripción de los pelos antenales (sensilios + setas), la cara dorsal del segmento del flagelo (flagelómero), se la dividió en 2 zonas, una proximal y otra distal siguiendo el eje longitudinal de la antena (fig. 3.1C). Los flagelómeros fueron nombrados desde su segmento proximal (F1) a su segmento más distal (F10) en hembras y F11-F1 en machos. La superficie ventral del F10 (F11 en machos) muestra una zona de la cutícula de aspecto liso y con ausencia total de pelos. En el resto de la región ventral, la superficie del flagelo es del tipo imbricado, en donde únicamente se encuentran setas y 30

sensilios tricoides tipo C-D (fig. 3.2 A-C). La cutícula que reviste la cara dorsal de la antena toma diferentes configuraciones morfológicas según el género; puede ser lisa (fig. 3.2D) caveolada (fig. 3.2E) o estriada (fig. 3.2F). La tabla 3.1 resume los tipos de patrones para cada especie. Los diferentes tipos de sensilios se localizan en la región dorsal de la antena (fig. 3.2). La mayoría de los sensilios se distribuyen en casi toda la superficie dorsal excepto los sensilios en hoyo y los sensilios basicónicos en general restringidos a la zona distal (fig. 3.2D-F).

3.2.2 Setas Las setas son descriptas como pelos no inervados que terminan en una punta aguda. Siempre la base del pelo se inclina sobre la cutícula de inserción (Ci) y la punta se orienta en dirección distal (fig. 3.2C-F). La forma de las setas variaron con su localización en la antena, con forma espiniforme en las regiones laterales y ventrales (fig. 3.2C) o forma de gancho en las zonas distales de 2-11 (figs. 3.2D-F). En los segmentos F1-F2, tomaron forma de hoja o espinas (fig. 3.3D), así como largos pelos en forma de aguja en el F1 (fig. 3.3a-C). En algunas especies las setas espiniformes cortas se distribuyeron a lo largo de la superficie dorsal del flagelo. Todas las setas carecen de poros en su superficie y en razón de esto, mostraron tinción negativa con la marca con AgNO3 (figs. 3.3E, 3.4C, 3.5aB).

3.2.3 Sensilios placodeos (sPa) Los sensilios sPa tienen una forma general de discos planos (pore-plate sensilla) que se localizan sobre toda la superficie dorsal del flagelo, pero muy raramente en el F1 (fig. 3.3A-B). A pesar de estar definido como sensilio multiporoso, no se observaron marcas con AgNO3 (figs. 3.4C, 3.5A-B). Sin embargo los análisis por MET revelaron una cutícula multiporosa (fig. 3.6a)

3.2.4 Sensilios tricoides tipo A (stA) Los stA son los más comunes entre los sensilios tricoides. Tienen entre 12 a 15 µm de longitud. Se los observo proyectándose en dirección distal y curvándose sobre la superficie de la cutícula. La punta es más redondeada que las observadas en las setas (figs. 3.2E, 3.3D, 3.4B). La longitud y grado de curvatura de estos sensilios varia entre los los géneros estudiados (figs. 3.3D-E, 3.4B-C). La cutícula de inserción (Ci), es redondeada, flexible, con un diámetro de 0,5 µm mayor que la base del sensilio (fig. 3.7a). 31

En los preparados analizados por SEM muchas veces, se confunde la Ci con el resto de la cutícula, en otras ocasiones aparece hundida (Fig. 3.4B). Este artificio podría deberse a la estructura débil de la Ci con respecto al resto de la cutícula antenal. El sensilio stA se identificó como un sensilio con poros con reacción positiva al AgNO3, en general sólo se marca la mitad distal del sensilio (figs. 3.3E, 3.4C, 3.5F).

3.2.5 Sensilio tricoides tipo (stB) Es el más delgado y pequeño de los sensilios tricoides, mide de 8 a11 µm de longitud y posee una punta levemente más aguda que los stA. Con excepción del tercio basal, el stB se encuentra totalmente curvado hacia la superficie antenal (figs. 3.2C–F, 3.3D). En ocasiones muestra estrías en la base. La Ci es pequeña, flexible, se limita al ancho de la base y en general es poco evidente. Los sensilos los stB y sPa se observan entremezclados sobre toda la superficie dorsal del flagelo, excepto el F1. Los stB son considerados sensilios sin poros, por esta razón no muestran marca de AgNO3, (fig. 3.3E).

3.2.6 Sensilio tricoides tipo C-D (stC-D) Al menos 2 subtipos de estos sensilios stC-D fueron observados en los preparados. El más frecuente de este tipo, tiene un morfología similar al stA, pero es más largo y menos curvado (15-20 µm de longitud), con la punta extendiéndose hacia arriba y levemente en dirección proximal con respecto a la antena (figs. 3.2C, D–F, 3.3C, 3.6a, C). Este subtipo también puede estar presente en la región ventral, donde adopta mayor longitud. El otro subtipo de stC-D es mucho más recto y corto, muy similar a un sensilio basicónico (figs. 3.2E, 3.3C, 3.4B) pero difiere de este último en que la Ci es más pequeña, con un diámetro menor a 1,5 veces el ancho de la base del sensilio. La punta de stC-D es redondeada o roma sin poro visible. Ambos subtipos de stC-D se localizan en la región dorsal y comparten el mismo patrón de marcas con AgNO3 (figs. 3.4C, 3.5C–E). Además comparten el tipo de cutícula de Ci similar a la descripta para stA. En muchas especies este tipo de sensilio muestra una superficie con estrías profundas (fig 3.2E).

3.2.7 Sensilio basicónico (sBa) Los sensilios sBa son denominados sensilios en forma de estaca o clavija (peg-like sensilla); en abejas sólo se observan en las hembras. Tienen entre 10 a 15 µm de longitud. Es recto y de punta roma (Fig. 3.2C–D, F). El ancho y largo de los sensilios varían con la especie. La cutícula de la Ci es del tipo flexible, bien evidente, de un 32

diámetro de 1,5 veces el ancho del sensilio. La superficie del sensilio no presenta estrías profundas. Forma una o más hileras en la zona distal de cada flagelómero (figs. 3.2a, B y 3.8a, B). Los sensilios sBa presentan un poro apical en la punta del sensilio (fig. 3.7B y C) quedando en evidencia por el depósito de AgNO3 (fig. 3.5E).

3.2.8 Sensilio coelocónico (sCoe) y sensilio ampuláceo (sAmp) Existen 2 tipos de sensilios que se denominan sensilios en hoyo (pit organs), por su localización en una cámara interna que se comunica con la superficie antenal por una pequeña abertura. En algunas ocasiones se los pueden observar protruyendo hacia la superficie. Los sCoe tienen forma similar (fig. 3.9a–C), pero sus cutículas muestran esculturaciones longitudinales y la Ci es inflexible. La aberturas de los sensilios sCoe varían de 2 a 4 µm; aproximadamente el doble de los observados en los sensilios sAmp. Los sensilios sAmp también se asemejan a una clavija o bastón con un engrosamiento en la punta, nunca se observan en la superficie. En secciones transversales del flagelómero, se observa el sensilio dentro de una cámara profunda denominada ampolla (ampulla), que se comunica con la superficie por un canal cuticular (fig. 3.9D).

3.2.9 Sensilio coelocapitular (sCap) Los sensilios sCap tienen forma de domo con un diámetro de 3-5 µm, poseen una protuberancia central con un diámetro de 5 µm. Son más numerosos en el F10, en el resto de los flagelómeros son escasos. (fig. 3.7A). Se los observa frecuentemente formando agrupaciones con sensilios sAmp y sCoe (fig. 3.7A y3.9B). En el flagelómero 1 es uno de los poco sensilios presentes formando parches de 4–6 rodeados por setas.

3.3 DISTRIBUCIÓN Y ABUNDANCIA DE SENSILIOS EN LA TRIBU EMPHORINI 3.3.1 Distribución de setas La presencia de setas en la región dorsal en los F2–F11 varía según el género estudiado. Se encontraron 4 patrones distintos de distribución para cada sexo (fig 3.10, 3.11, tabla 3.3.1-2, grafico 3.3.1). Las hembras con patrones de setas 1 mostraron una distribución regular de setas en todos los flagelómeros, las especies con patrones 2,3 y 4 variaron en la abundancia de setas en el sentido distal-proximal del flagelo (gráfico 3.1a, tabla 3.2a). En los machos las setas son escasas en los flagelómeros distales y dominan en 33

abundancia en los segmentos F1 y F2. En algunas especies también son abundantes en los segmentos F3 o F4 (grafico 3.1b, tabla 3.2b). Los géneros Melitoma, Ptilothrix y Diadasia mostraron un solo tipo de patrón de distribución dentro de cada grupo (tabla 3.1). Por otra parte, las especies correspondientes a los géneros Alepidosceles, Ancyloscelis, Leptometriella y Meliphilopsis mostraron más de un patrón. Sólo una especie del genero Diadasina fue analizada (tabla 3.1).

3.3.2 Distribución de los sensilios La distribución de los sensilios sPa y stB es uniforme sobre la superficie dorsal de los F3F10 (F11 en machos), en cambio la presencia de sensilios stA mostró una distribución restringida relacionada con la presencia de setas (fig. 3.11). En las abejas hembras que presentan los patrones de setas 1, 2 y 3 (fig. 3.10) no se observaron sensilios stA en el límite de la zona distal de cada flagelómero, que denominaremos patrón A (fig. 3.11, tabla 3.1). Los machos con patrones de setas 1 y 2 (fig. 3.11) también mostraron una distribución segregada de los sensilios stA (fig. 3.11). En F1 solo se observaron sensilios stC-D y sAmp, con la excepción de los machos de la especie Ancyloscelis apiformis que presentaron sensilios sPa en F1 (fig. 3.3 A-B, grafico 3.3b). En las hembras, los sensilios sBa aparecen junto con algunos sensilios stC-D, formando una franja en la zona distal entre los F4–10 (fig. 3.2D-F). Los sensilios sAmp, sCoe y sCap pueden aparecer dispersos formando un anillo transversal al flagelómero o en grupos en F2–F10 (fig. 3.8a y C, fig. 3.11). Observamos en los flagelómeros distales de las abejas hembras diferencias significativas en la distribución de las densidades de los sensilios stC-D, stB y sBa (tabla 3.10). Se observa una mayor concentración de estos sensilios en los segmentos distales (fig. 3.8AB, gráficos 3.3a-5a). El segmento F10 duplica en número a los segmentos restantes, además de una creciente abundancia de estos sensilios en sentido disto-proximal de la antena (tablas 3.3.4a-8a). En cambio, en los machos sólo se observó una cantidad significativamente superior de los sensilios stC-D en Melitoma segmentaria y Diadasina distincta (tablas 3.6b, gráficos 3.4b). También, se encontraron valores elevados de densidad stC-D tanto en los segmentos distales como proximales de los machos de D. distincta y A. apiformis. (tabla 3.6). Sin embargo, teniendo en cuenta los valores totales de stC-D, sólo se observaron una mayor cantidad de sensilios en F10 de D. distincta (tabla 3.7)

34

3.3.3 Abundancia de sensilios Para evaluar la cantidad de sensilios y setas en las distintas especies, comparamos la densidad media de los sensilios stA, stB y sPa stC-D y sBa. Además, se calcularon el número total de los sensilios stC-D, sBa, sCoe, sAmp y sCap presentes en el área dorsal (tablas 3.3.7-10). Encontramos una relación entre las especies con distintos patrones de setas y la abundancia de sensilios stA y stB en ambos sexos (Kruskal–Wallis; p < 0,05). Sólo se observó una diferencia en la densidad de sPa en los machos (tabla 3.3a-b). En el análisis entre especies representantes de cada patrón, se observó en las hembras de Ptilothrix relata una densidad significativamente menor de sensilios stA y stB, que en las hembras de Ancyloscelis apiformis (Dunn’s test; p < 0,01; tabla 3.1). Los machos de A. apiformis mostraron una densidad significativamente mayor de sPa y stB (Kruskal-Wallis; p < 0,05) que los machos de las otras especies (tablas 3.3b y 3.5b). En todos los taxones analizados, los patrones de densidad de setas 1 y 2 están asociados con una abundancia significativamente menor de stA con respecto a los que poseen patrones de tipo 3 y 4 (tabla 3.11). En las 4 especies analizadas estadísticamente la densidad media de stB, y stC-D correspondiente a los 7 segmentos distales fue mayor en las hembras (Mann–Whitney; p < 0,05) este fenómeno también se observa como tendencia en las demás especies estudiadas de la tribu (tablas 3.1 y 3.9) con la excepción de Meliphilopsis ochrandra. Por otra parte, la densidad de stA fue más alta en los machos (Mann–Whitney, p < 0,05, tabla 1). La densidad de sPa tiende a ser mayor en los machos, con algunas excepciones mencionadas en la tabla (3.1). Sin embargo, los machos tienen un flagelómero más que las hembras, por lo tanto mayor cantidad de sensilios sPa totales (tabla 3.9). En el gráfico 3.8a se pueden observar las diferencias entre machos y hembras en cuanto a las proporciones de sensilios y setas localizadas en la región dorsal del flagelo. El gráfico 3.8b indica una mayor proporción de sensilios multiporosos en los machos y sus hembras co-específicas, e inversamente, las hembras superan ampliamente el número de sensilios uniporosos y sin poros.

3.3 DISCUSIÓN 3.3.1 Abundancia de sensilios La nomenclatura para identificar los sensilios basada en sus características generales, presenta algunos problemas al momento de hacer análisis comparativos con otros 35

taxones revisados. La terminología adoptada por Ågren (1977) es utilizada en la mayoría de los trabajos. Los análisis morfológicos combinando técnicas de microscopía electrónica y marcaje de sensilios por AgNO3 permitieron una determinación precisa de los tipos de sensilios, y es coincidente con las categorías establecidas por Ågren (1977). Los sensilios stA son los más abundantes en la tribu Emphorini, seguida por los sensilios sPa, stB y stC-D. Resultados similares se publicaron en otros grupos de abejas solitarias pertenecientes a las familias Andrenidae, Colletidae y Halictidae (Ågren, 1977, 1978; Ågren y Sevensson, 1982). En ápidos corbiculados, el sensilio más abundante varió según la especie estudiada; en algunos tales como Apini y Bombini el sensilio más común fue stA con rangos de valores entre 9.000 y 13.000 por mm2 (Gupta, 1992; Ågren y Hallberg, 1996). Sin embargo, en el recuento de los sensilios tricoides en Apis florea (Gupta, 1992) no se discriminaron los subtipos, por lo tanto el valor real de la abundancia de sensilios stA es probablemente menor al citado aquí. Por otra parte, en machos y hembras de Apis mellifera, se encontró que el sensilio sPa es el más abundante (Silva De Moraes y Da Cruz Landim, 1972; Esslen y Kaissling, 1976). También, en estudios realizados en antenas de meliponinos pertenecientes a los géneros Melipona, Trigona y Lestrimelita se observó que en número, todos los sensilios tricoides son menos abundantes que los sPa (Jonson y Horward, 1987; Silva de Moraes y Da Cruz Landim, 1972). La diferencia en la abundancia de sensilios stA entre Emphorini y Apis mellifera es más notable en los machos. Los machos de Emphorini mostraron una densidad de sensilios stA de un rango entre 4000–11,000 por mm2 (un equivalente a 2.000 por antena, ver tabla 3.1); en cambio en los zánganos de Apis mellifera el número total de sensilios stA no supera los 370 por antena (Esslen y Kaissling, 1976). Los sensilios sPa son los más frecuentemente estudiados, probablemente por su fácil identificación. La abundancia de sPa en hembras de los géneros Sphecodes, Apis, Bombus, Trigona y Nannotrigona, está en el mismo rango con respecto a los valores expresados en nuestros resultados entre los 2000–4000 sensilios por mm2 o 700–2000 de sensilios totales por antena (Esslen y Kaissling, 1976; Ågren y Sevensson, 1982; Fonta y Masson, 1982; Gupta, 1992; Stort y Moraes-Alves, 1999; Spaethe y col., 2007; Shang y col., 2010). Estudios realizados en el género Bombus (Fonta y Masson, 1982; Ågren y Hallberg, 1996) mostraron valores similares (3000–4800 por mm2) que los machos de Emphorini, con la excepción de Meliphilopsis melanandra y Leptometriella monteana, que mostraron mas de 5000 sensilios por mm2. 36

En síntesis, la información sobre la abundancia y predominio de los 2 principales sensilios (stA y sPa) sugiere un patrón similar entre las especies solitarias. En cambio, en las especies sociales los análisis muestran una mayor variabilidad. Este hecho, tal vez, no se deba a una causa biológica, sino más bien, a la mayor disponibilidad de estudios sobre abundancia de sensilios en apidos sociales. Además dichos análisis fueron realizados con distintos criterios de conteo y clasificación. Sin embargo, independientemente de cuál es el más abundante, los sensilios stA y sPa comparten la naturaleza de ser de tipo olfatorio (ver 3.3.2). Esto sugiere una especialización de la antena a la quimiorrecepción de sustancias volátiles. La detección de señales visuales y olfatorias ha sido ampliamente estudiada en abejas sociales (Chittka y Raine, 2006). Existen también estudios en abejas solitarias, que afirman el uso de señales olfatorias para detectar la planta huésped (Dötterl y col., 2005; Dötterl y Schäffler, 2007; Howell y Alarcón, 2007). Análisis de electrofisiología sobre antena de Apis mellifera demostraron la sensilibilidad de los sensilios sPa a la exposición de distintos odorantes (Getz y Akers, 1993). En este sentido, los sensilios sPa pueden jugar un rol importante en la detección de químicos en las plantas. Sin embargo no observamos una correlación directa entre la abundancia de sensilios sPa y la preferencia floral en abejas Emphorini, resultados similares fueron publicados sobre abejas de la familia Halictidae (Wcislo, 1995). Los datos publicados sobre abundancia de los sensilos stB para Apis mellifera y varias especies de Bombus ronda los valores de 600-1300 por antena (Esslen y Kaissling, 1976; Shang y col., 2010) y 300–1200 por mm2 (Ågren y Hallberg, 1996). Nuestros resultados muestran un valor total de sensilios stB entre los 400 y 1100 por antena (700–1200 por mm2). Debe remarcarse que son pocas las especies de la tribu Emphorini que tienen los valores más altos del rango, como es el caso de Ancyloscelis apiformis. En el caso de los sensilios stC-D, los valores totales están entre los 180–300 sensilios por antena para las hembras, 160 sensilios o menos para los machos. Estos resultados coinciden con los publicados previamente para ambos sexos en los géneros Apis y Sphecodes (Ågren y Sevensson, 1982; Esslen y Kaissling, 1976). La presencia exclusiva de sensilios sBa en las hembras fue descripta en miembros de varias familias de abejas como Apidae, Halictidae, Adrenidae y Colletidae (Esslen y Kaissling, 1976; Ågren, 1977,1978; Ågren y Sevensson, 1982; Wcislo, 1995). La abundancia de sBa en Apis se encuentra entre los 90-120 sensilios por antena (Esslen y Kaissling, 1976; Gupta, 1992). En los Emphorini el rango de abundancia observado entre sus especies es muy amplio (36–180 sensilios por antena). 37

La identificación de sensilios stC-D y sBa presenta dificultades a la hora de utilizar solo análisis por SEM. En estudios realizados en especímenes de ambos sexos correspondientes a los géneros Bombus y Trigona se ha reportado un número de sensilios sBa superior a los 1.500 por antena (Johnson y Horward, 1987; Shang y col., 2010). Estos resultados pueden deberse a que en algunos sensilios tricoides, la variabilidad en la longitud y grado de curvatura, (Ågren, 1977) resulte en que sean considerados como sensilios basicónicos. Es posible que algunos valores de sBa expuestos en la bibliografía resulten de una identificación errónea y por lo tanto estén sobrestimados. Existen discrepancias en cuanto a la naturaleza sensorial de los sensilios sBa. Algunos estudios recientes consideran al sensilio sBa como sensilio olfatorio (Brockmann y col., 2003; Frasnelli y col., 2010; Groh y col., 2002). Sin embargo estudios ultraestructurales realizados en antenas de Apis mellifera permitieron reconocer al sensilio sBa como un receptor gustativo bajo el nombre de sensilios quético tipo II (Whitehead y Larsen, 1976). Los sensilios considerados como sBa descriptos en las abejas Emphorini fueron analizados teniendo en cuenta características distintivas de los sBa como la marcación del poro central con AgNO3, comparaciones con cortes semifinos, las medidas relativas de la zona de inserción y su exclusiva ubicación en la zona distal del flagelómero. Este criterio nos permitió un diagnóstico preciso de dicho quimiorreceptor de poro único. Nuestros resultados están de acuerdo con trabajos previos sobre la morfología con diversas técnicas histológicas (Slifer y Sekhon, 1961; Dietz y Humphreys, 1971; Esslen y Kaissling, 1976; Ågren, 1977). Por lo tanto la morfología de los sensilios sBa, con un solo poro apical, en las especies analizadas en el presente trabajo, nos permite asignar un rol definitivamente gustativo para los sensilios sBa. Estudios morfológicos y fisiológicos en obreras de A. mellifera definen a los sensilios stCD como receptores gustativos. Los términos sensilio stC-D y quético son usados como sinónimos de un receptor gustativo aquí definidos como stC-D. La abundancia de los sensilios sCoe, sAmp y sCap estudiados en obreras de A. mellifera y A. florea (Dietz y Humphreys, 1971; Esslen y Kaissling, 1976; Gupta, 1992) resultó más elevada que los encontrados en hembras de Emphorini. Los estudios realizados en los sensilios de hembras de Nannotrigona testaceicornis (Meliponini) arrojaron valores ligeramente menores (Stort y Moraes-Alves, 1999). En zánganos de A. mellifera, se registraron diferentes cantidades de sCap por antena (Esslen y Kaissling, 1976; Stort y Moraes-Alves, 1999). De todas maneras ambos valores sobre los 3 tipos de sensilios fueron más altos que los hallados en machos de Emphorini. 38

Como se comentó en la introducción y se profundizó en esta sección, la nomenclatura para identificar los sensilios basada sólo en sus características externas conduce a determinaciones poco precisas o ambigüedades a la hora de clasificarlos. Es por eso que un extenso análisis comparativo, agrupando todas las especies estudiadas aquí, sumado a la bilbiografia existente en otros taxones permitió robustecer el sistema de clasificación propuesto por Ågren (1977).

3.3.2 Dimorfismo sexual En Apis mellifera las diferencias en el número de sensilios entre sexos es bien marcada. Los zánganos tienen una cantidad mucho más elevada de sensilios sPa que las obreras (Brockmann y Brückner, 2001), pero valores muy bajos de sensilios stA y stB (Esslen y Kaissling, 1976). Los machos de género Trigona también tienen una cantidad superior sPa que las obreras (Johnson y Horward, 1987). En los estudios realizados en especies solitarias de Andrenidae, Colletidae y Halictidae, los machos superan en cantidad de sensilios sPa y stA a sus hembras coespecíficas, contrariamente, los sensilios stB son más abundantes en las hembras. (Ågren, 1977,1978; Ågren y Sevensson, 1982). Lo observado en las abejas Emphorini coincide con los patrones registrados en abejas solitarias. En otros apoideos, solo existen dos descripciones sobre dimorfismo sexual en sensilios stC-D, en una sobre el género Sphecodes los machos duplican el valor de stC-D de las hembras, y en Apis mellifera donde los sensilios stC-D de las obreras son más abundantes que en los zánganos (Esslen y Kaissling, 1976). Nuestros estudios en los Emphorini también muestran más sensilios stC-D en hembras. La modalidad sensorial de estos sensilios esta mayormente estudiada para A. mellifera. Como ya lo mencionamos, los sPa son considerados receptores olfatorios, los sensilios stC-D y sBa son receptores gustativos (Groh y col., 2002; Haupt, 2007), los sensilios stB son receptores táctiles (Martin y Lindauer, 1966; Haupt, 2007), y los sensilios sCap son higrorreceptores (Yokohari y col., 1982). Estudios ultraestructurales realizados en sensilios stA sugieren un rol olfatorio (Slifer y Sekhon, 1961; Ågren y Hallberg, 1996). Los sensilios sAmp y sCoe en hormigas son considerados como higro y termorreceptores respectivamente (Ruchty y col., 2009; Nakanishi y col., 2009). En base a estos antecedentes, consideramos que en las abejas machos de Emphorini más del 60% de los pelos de la antena corresponderían a receptores olfatorios, en contraste con el 30–55% en las hembras. Por el contrario, el resto de los sensilios que incluye a los receptores de 39

contacto y a otros sensores que no son olfatorios. Las hembras poseen alrededor del 15 % del total de este tipo de sensilios contra sólo el 5 % estimado en los machos (grafico 3.8). Existen pocos estudios en abejas que describan el dimorfismo sexual de sensilios antenales utilizando métodos cuantitativos (Esslen y Kaissling, 1976; Johnson y Horward, 1987; Wcislo, 1995). El hecho de encontrar diferencias entre machos y hembras en la composición de sensilios permite analizar la conformación del sistema sensorial a partir del rol reproductivo de cada sexo. Las abejas hembras no-parásitas poseen 2 actividades principales, la colecta de polen y la construcción del nido (Wcislo y Cane, 1996). En obreras de Apis mellifera, existe una relación entre el reconocimiento de la flor, así como, la construcción del nido en la que interviene el contacto antenal (Martin y Lindauer, 1966; Kevan y Lane, 1985). En este sentido, en hormigas, hay identificados quimiorreceptores de contacto que están involucrados en la detección del alimento y el reconocimiento de la cría (Walther, 1985; Sheridan y col., 1996; Ozaki y col., 2005; Nakanishi y col., 2009). Igualmente el reconocimiento del sustrato en los procesos de nidificación, requiere muchas veces un contacto con los extremos de la antena, donde efectivamente las hembras mostraron una concentración más alta de sensilios por contacto. El hecho de observar sensilios basicónicos sólo en las abejas hembras, sugiere una relación directa entre este sensilio y la detección de señales que involucren las tareas del cuidado de la cría. La ausencia de de los sensilios basicónicos en abejas se discute en el capítulo 4. La morfología de la antena también puede explicarse desde el punto de vista del apareamiento. Los machos invierten más energía en aparearse que las hembras, en cambio éstas se dedican al cuidado de la progenie. Es por eso que existe una asimetría en el esfuerzo por encontrar a la pareja, y esto tal vez impacte en la comunicación química requerida para la cópula (Ayasse y col., 2001). Los himenópteros producen una variedad de feromonas involucradas en la atracción sexual. Dentro del género Apis, estudios morfológicos, neurofisiológicos y etológicos sugieren que la presencia de feromonas sexuales son el principal factor que configura en gran medida el sistema quimiosensorial del zángano (Brockmann y Brückner, 2001; Sandoz y col., 2007). Más aun, se ha propuesto que los sensilios sPa detectan la feromona real dado que los zánganos poseen un número muy alto de este tipo de sensilios. Compuestos glandulares excretados por las hembras de abejas solitarias también son determinantes del patrón de comportamiento de sus machos coespecíficos (Bergström y Tengö, 1978). El dimorfismo observado en la tribu Emphorini también se relaciona con una mayor abundancia de sensilios sPa en los machos, aunque 40

la diferencia es menor a la mencionada para Apis. Esta discrepancia puede deberse a que el comportamiento reproductivo entre machos y hembras en abejas solitarias es diverso (Michener, 2007). Los machos no buscan a las hembras al azar, concentran sus actividades en lugares donde las hembras receptivas frecuentan; como las flores y áreas de nidificación (Alcock y col., 1978). Se han estudiado machos de los géneros Diadasia, Diadasina y Melitoma, buscando a las hembras en áreas de nidificación (Linsley y col., 1952, 1980; Martins y Antonini, 1994). Por otra parte, machos de Ptilothrix sumichrasti fueron observados esperando aparearse en las flores huéspedes de las hembras (Oliveira y Schlindwein, 2010). De todas maneras, la elección del lugar de apareamiento puede ser muy plástico en la tribu Emphorini incluso dentro de una misma especie. Formas de machos de gran tamaño de la especie Philothrix fructifera defienden agresivamente la flores donde se encuentra la hembra, en cambio una variedad de machos mas pequeños y menos agresivos, evita estas zonas de competencia y prefieren sobrevolar lugares entre el sitio de nidificación y los parches de flores huéspedes (Oliveira y Schlindwein, 2010). En algún punto, machos y hembras de especies oligoléticas comparten un sistema antenal adaptado al reconocimiento de señales provenientes del recurso floral y de áreas de nidificación (Alcock y col., 1978; Sugiura y col., 2007). Es por eso que en algunas especies de la tribu Emphorini, los sensilios placodeos pueden estar cumpliendo algunas funciones similares en ambos sexos y esto se traduce en una baja diferencia en la abundancia.

3.3.3 Distribución de sensilios Observamos que los sensilios stC-D, sAmp, sCoe y sBa se encuentran en la antena en forma de grupos, contrariamente a los sensilios sPa y stA que se distribuyen en toda la región dorsal. Estos resultados son similares a estudios previos en otras abejas (Ågren, 1977, 1978; Esslen y Kaissling, 1976; Galvani y col., 2008). Por otro lado, en machos del género Sphecodes (Halictidae), sPa y stA se localizan agregados en parches (Ågren y Sevensson, 1982). Hallamos que él número de sensilios of stB, stC-D y sBa a lo largo del flagelo aumenta en la sección distal en las antenas de las hembras de Emphorini, fenómeno observado en obreras de Apis y en otras hembras de abejas solitarias (Esslen y Kaissling, 1976; Ågren, 1977,1978; Wcislo, 1995). Las setas dominan en abundancia en los segmentos proximales de la antena (Esslen y Kaissling, 1976; Ågren, 1977, 1978; Ågren y Sevensson, 1982; Wcislo, 1995; Galvani y col., 2008). Además hay una relación

41

negativa entre la abundancia de stA y la presencia de setas en la zona distal de cada flagelómero. Como se comentó anteriormente, el grupo de los Emphorini lo componen abejas especialistas en la selección de plantas (hospedadoras) de las cuales colectan polen y néctar. El proceso de especialización en la cual una abeja selecciona una dada planta y la expresión de una morfología antenal es aun difícil de dilucidar. En los Emphorini faltan estudios sobre muchas especies del grupo y las plantas huespedes. Además, los pocos genéros de la tribu analizados hasta ahora, frecuentemente comparten las mismas familias de plantas. Por lo tanto, resulta difícil encontrar adaptaciones morfológicas que expliquen la selección de un grupo de plantas en particular (Sipes y Tepedino, 2005). Sin embargo, en el contexto de nuevas evidencias sobre el origen de la especialización en las abejas, surgen otros factores fisiológicos que pudieran estar influenciando dicho proceso. La elección de una planta puede no solo estar restringida a los límites de discriminación del sistema sensorial del polinizador, si no también, al tipo de alimento que la planta ofrece (Sedivy y col., 2008). Una hipotésis sobre el surgimiento de nuevas configuraciones del sistema antenal pueden tener como raiz modificaciones durante el crecimiento larval. Experimentos en ortópteros, a partir de individuos criados con dietas diferentes, hallaron cambios en la composición de sensilios en sus diferentes etapas del desarrollo (Rogers y Simpson, 1997). El alimento principal de las larvas en las abejas, es el polen y en menor medida néctar y aceites florales. El contenido proteico parece no ser la única característica que determinaría la ingesta adecuada de polen (Roulston y Cane, 2000). Compuestos secundarios y ausencia de enzimas específicas para la digestión del grano son factores que pueden actuar durante el consumo del alimento por la crías. Experimentos en abejas oligolécticas mostraron restricciones fisiológicas en el desarrollo larval cuando el polen consumido es de origen diferente al de la planta hospedadora (Praz y col., 2008; Sedivy y col., 2011). Esto sugiere que la aparición de hábitos especialistas en ancestros de las abejas Emphorini y los consecuentes cambios en la selección de plantas hospedadoras (y el tipo de dieta de la larva), pudo haber afectado de algún modo, la morfogénesis de los sensilios en estas abejas. La baja abundancia de sensilios stA en algunos de los géneros estudiados, podría deberse a procesos evolutivos guiados por los efectos mencionados. Sin embargo, no existen estudios sobre dieta y desarrollo del sistema antenal en himenópteros. Para lograr una idea acabada del rol específico de los sensilios y setas en relación a la detección de recursos y preferencias florales, se necesita la incorporación de más grupos 42

de abejas solitarias que posean distintos grados de asociación con las plantas que utilizan.

3.3.4 Variación taxónomica La distribución de setas muestra por lo menos 4 patrones distintos en las especies analizadas (fig. 10). El patrón referido como 1 no se encontró citado en otros estudios en abejas pero si hay descripciones similares para avispas de la familia Cabronidae (Ågren, 1989). Es interesante que el patrón 1 estuvo presente en todas las especies del genero Ptilothrix (tabla 3.1). Los otros 3 patrones ya fueron citados en otras especies (Esslen y Kaissling, 1976; Ågren, 1977, 1978; Fonta y Masson, 1982; Stort and Moraes- Alves, 1999; Galvani y col., 2008). Las especies del género Melitoma y Diadasia mostraron los patrones 2 y 3 respectivamente en todas las especies analizadas. Sin embargo, en el resto de los géneros no mostraron un patrón en común, existieron variaciones ya sea entre especies o entre sexos de la misma especie (tabla3. 1). El patrón 4 no es común en las hembras de Emphorini analizadas, sólo estuvo presente en ambos sexos de Ancyloscelis apiformis, pero compartió las mismas características que la especie Chalepogenus caeruleus perteneciente a la tribu Tapinotaspidini (capitulo 4). Cabe destacar que el patrón 4 muestra baja densidad de setas y alta densidad de todos los tipos de sensilios. En general, las hembras de Emphorini compartieron una distribución de los sensilios stA acá expresada como patrón A, definida por la ausencia de los sensilios stA en el margen distal de flagelómero en machos y hembras, como el caso de los generos Ptilothrix y Melitoma (tabla 3.1). En cambio, los machos de Diadasia, Leptometriella y Diadasina mostraron el patrón B en donde se observan sensilios stA incluso en los límites del flagelómero (figs. 3.7C y 3.10). El resto de los géneros mostraron uno u otro patrón dependiendo de la especie revisada (tabla 3.1). Otra organización interesante es la distribución de los órganos en hoyo. Pueden encontrarse agregados en un solo parche (Fig. 3.10, G), o estar dispersos en la superficie ya sea en sentido transversal o longitudinal (Fig. 3.10, S1 y S2). Los géneros Ptilothrix, Diadasia, Alepidoceles y Melitoma comparten el mismo patrón (tabla 3.1), los demás géneros presentan variaciones entre las especies (tabla 1). Las configuraciones de la cutícula no presentan dimorfismo sexual con la excepción de Meliphilopsis ochrandra. Los géneros Ptilothrix,

Melitoma

y

Diadasia

se

caracterizaron

por

presentar

características

morfológicas conservadas entre las especies de los géneros. Por otra parte el género Ancyloscelis fue particularmente variable, mostrando la mayor diversidad entre sus 43

miembros. El potencial uso de estos patrones morfológicos con fines de estudios filogenéticos demandara futuros análisis.

3.4 CONCLUSIÓN Este es el primer estudio de sensilios antenales a nivel de una tribu incluyendo un gran número de especies. El análisis comparado con otras especies estudiadas permitió corroborar y reforzar el sistema actual de clasificación de sensilios antenales. La distribución y abundancia de los sensilios indica un patrón generalizado entre los apoideos. La principal relación entre la composición de receptores antenales y comportamiento esta dada por el dimorfismo sexual entre las especies de abejas, sugiriendo que las hembras poseen un sistema de detección adaptado a tareas específicas de las mismas. Parte de la configuración de la morfología sensorial de los Emphorini parece estar guiada por factores que involucran al proceso de encuentro de pareja, particularmente diverso entre las abejas de esta tribu. Se discute también influencias en el desarrollo de los sensilios durante los procesos evolutivos hacia el hábito oligoléctico del grupo. Por otra parte, los patrones de las setas parecen influir en la abundancia de algunos sensilios, además de variar entre las especies de la mayoría de los géneros.

44

3.FIGURAS

Figura 3.1: Microfotografías de MEB de Ptilothrix tricolor. (A) Cabeza de la hembra; las flechas blancas indican el limite anterior y posterior del flagelo antenal (B) Vista lateral externa de la antena derecha de un macho; las cabezas de flechas indican el lado ventral (blancas) y dorsal (negras) del flagelo. El primer y último flagelómero está rotulado como F1 y F11 respectivamente. (C) Vista dorsales de los F8 y F9 de la antena en (B). La línea

de puntos sobre F8 marca la división entre las zonas distal (dz) y

proximal (pz) del flagelómero; ojo (ey); flagelómero (f); mandíbula (m); pedicelo (flecha negra); proboscis, (p); escapo (s). Barra: (A)= 1000 µm, (B)= 250µm, (C)= 50 µm.

45

Figura 3.2: Microfotografías de MEB sobre los flagelómeros distales de hembras. A: cara dorsal, en la zona distal hembra de Alepidosceles imitatrix, cabezas del flechas blancas marcan la posición de sensilios basiconicos. Se observa una área ventral de superficie lisa con escasos pelos (cabeza de flecha negra). B: Vista del lado lateral de flagelómero F8 y F9 de Diadasina distincta. Se observa el lado dorsal (cabezas de flecha blanca) y lado ventral revestido de setas y largas sensilios tricoides (flechas negras). C: Lado dorsal del F10 de Melitoma ameghinoi. Se observan diferentes tipos de sensilios y el lado dorsal con la superficie imbrincada y carente de receptores. D: A. imitatrix. Zona distal del F9. E: F10 dorsal de Meliphilopsis ochrandra, con aumento

en

la zona medial del flageómero. F: M.

ameghinoi hembra. Zona distal del F9 . Barra: (A-B)= 50 µm, (C-F) 10 µm.

46

Figura 3.3: Microfotografías de MEB (A-D) y de campo claro (E), correspondientes a las superficies dorsales de los flagelómeros proximales. (A) Ptilothrix relata hembra f1 y f2 (antena izquierda). (B) Diadasina distincta hembra f1-f4 (antena izquierda). (C) imagen aumentado del recuadro en A, mostrando un area de setas espiniformes y sensilios stC-D. (D) Área marcada en B, se observan setas de forma foliadas, sensilios sPa, stA y stB. (E) Un sitio similar mostrada en la fotografía de D, donde se observa sensilios porosos marcados con nitrato de plata. Recuadro: se observa cerca de la superficie apical de 2 sensilios stA marca con nitrato de plata y junto un sensilio stB sin marca. Sensilios tricoide tipo A (stA); sensilios tricoides tipo B (stB); sensilios placodeos (sPa) Escala: (A-B)= 100 µm, (CD)= 20 µm, y (E)= 5 µm.

47

Figura 3.4: Microfotografías de MEB (A, B) y de campo claro (C) de la antena de Melitoma segmentaria macho (antena izquierda). (A) Lado dorsal de los F5 y F6. (B) Aumento del área marcada en A. (C) Una región similar a B mostrando la marca positiva al nitrato de plata en los sensilios tricoide tipo A (stA) y una marca inespecífica sobre algunas setas; cabezas de flecha blanca marcan un sensilio tricoide tipo C-D. Sensilio tricoide tipo B (stB); sensilio placodeo (sPa); sensilio coelocónico (coe); seta (S). Escala: (A)=100 µm, (B-C) 10 µm.

48

Figura 3.5: Microfografías de campo claro de abejas Emphorini. (A) Ptilothrix relata macho. Corte sagital del flagelómero 4 (antena izquierda). (B) Imagen aumentada de A marca negativa en setas. (C) La misma sección en otro plano focal. (D) Imagen aumentada de C se observa marca positiva para un sensilio tricoideo tipo C-D. (E-D).Imagen en una zona del F10 de una hembra de Melitoma segmentaria hembra. (E). Marca con nitrato de plata positiva para un sensilio basiconico y tricoideo tipo C-D. (F) Sensilio tricoideo tipo A (antena izquierda). Ba, sensilio basicónico; seta (S); sensilio tricoideo A (stA); sensilio tricoideo B (stB); sensilio tricodeo C-D (stC-D); seta (S). Escala: (A and C)=50 µm, (B, D, F)=10 µm, (E)=5 µm.

49

Figura 3.6: Microfografíasde MET. Corte sagital del flagelómero 8 de Ptilothrix relata macho (A) Imagen de un sensilios placodeo, se observa en el recuadro los poros en el límite de la cutícula y la superficie externa de la antena. (B) Sección tangencial de un sensilio tricoide. Célula tormógena (Tc), prolongaciones de la célula Tc (flecha), terminales tubulares correspondientes a dendritas (cabeza de flecha y recuadro de B). Barra= 2 µm

50

Figura 3.7: Microfotografías de MEB de la antena derecha de Melitoma segmentaria macho (A), hembra (B) y Ptilothrix tricolor hembra (C). (A) Zona proximal del F10 observándose diferentes tipos de sensilios. (B) Zona distal de F10 observándose sensilio tricoideo tipo C-D (stC-D) y sensilio basicónico (Ba). Note que el poro solo es evidente en Ba. (C) Sensilio basicónico observándose la amplia superficie de inserción. Sensilio coelocapitular (cap); sensilio placodeo (Pa); sensilio tricoideo A (stA); sensilio tricoideo B (stB); cutícula de inserción (Ci). Escala: (A)=10 µm, (B-C)=5 µm.

51

Figura 3.8: Microfotografías de MEB de la antena izquierda de Ptilothrix relata, hembra (A, B) y Diadasina distincta, macho (C,D). (A) Superficie dorsal de F8, F9 y F10, flechas negras indican grupos de órganos en hoyos (B) Aumento del recuadro indicado en A, se puede observar setas (cabezas de flechas negras) entre los diferentes tipos de sensilios. (C) Superficie dorsal de F6, flechas negras indican los sensilios en hoyo en forma dispersa. (D) Aumento del recuadro sobre la zona distal de C, los sensilios stA predominan y hay ausencia de setas. Cabezas de flecha blanca son stC-D, sensilio tricoideo A (stA); sensilio tricoideo B (stB); sensilio placodeo (sPa); sensilio ampullaceo (amp); sensilio coelocapitular (cap); sensilio coeloconico (coe); seta (S). Escala: (A and C)= 100 µm, (B and D)= 20 µm.

52

Figura 3.9: Microfotografías de campo claro (A, C-D) y de MEB (B) F9 de Ptilothrix relata hembra (A) Sección transversal de F9. (B) Zona distal en una zona similar a donde efectuaron los cortes, sensilio tricoideo A (cabeza de flecha negra) y a sensillio tricodeo C-D (cabeza de flecha blanca). (C) Magnificación del recuadro mostrado en (A) Se observa el sensilio coeloconico y a sensilio placodeo con la correspondiente celula receptora (rc). (D) Se observa la estructura de sensilio ampulaceo (flecha negra). Cuticular antenal (ac); nervio antenal (ne), sensilio ampullaceo (amp); sensilio coecapitular (cap); sensilio coeloconico (coe); sensilio placodeo (Pa); célula receptora (rc); seta (S); sensilio tricoideo A (stA); sensilio tricoideo C-D (stC-D). Escala: (A)= 50 µm, (B-D)= 10 µm.

53

Figura 3.10: Esquema de la superficie dorsal de las antenas izquierdas de los flagelos de Emphorini hembras (los 4 dibujos superiores) y machos (los 4 dibujos inferiores). Los diferentes patrones de setas están rotulados por número. Las variaciones interespécficas en la longitud del F1 no se muestran.

54

Figura 3.11: Esquema de los de los distintos patrones de distribuciones de sensilios en la superficie dorsal del flagelómero 8. La línea punteada marca el área de dispersión para los sensilios stA, junto con la dispersión de los sensilios stC-D y sBa conforman los patrones A y B. Los patrones G, S1 y S2 indican los tipos de dispersiones de sensilios coeloconicos y ampuláceos. Zona proximal (pz), zona distal (dz)

55

3. GRÁFICOS 3.1a

3.1b

Gráfico 3.1: La densidad media de setas por flagelómero en hembras (a) y machos (b). Desde los flagelómeros F10 (11 en machos) a F1 en sentido distal a proximal. Cada especie representa un patrón de distribución, P. relata (1), M. segmentaria (2), D. distincta (3), A. apiformis (4). Valores con + corresponden a la desviación media estándar del número de abejas (n=5).

56

3.2a

3.2b

Gráfico 3.2: La densidad media de sPa por flagelómero en hembras (a) y machos (b). Desde los flagelómeros F10 (11 en machos) a F1 en sentido distal a proximal. Valores con + corresponde a la desviaciónes media estándar del número de abejas (n=5).

57

3.3a

3.3b

Gráfico 3.3: La densidad media de stA por flagelómero en hembras (a) y machos (b). Desde los flagelómeros F10 (11 en machos) a F1 en sentido distal a proximal. Valores con + corresponden a la desviación media estándar del número de abejas (n=5).

58

3.4a

3.4b

Gráfico 3.4: La densidad media de stB por flagelómero en hembras (a) y machos (b). Desde los flagelómeros F10 (11 en machos) a F1 en sentido distal a proximal. Valores con + corresponden a la desviación media estándar del número de abejas (n=5).

59

3.5a

3.5b

Gráfico 3.5: La densidad media de stC-D por flagelómero en hembras (a) y machos (b). Desde los flagelómeros F10 (11 en machos) a F1 en sentido distal a proximal. Valores con + corresponden a la desviación media estándar del número de abejas (n=5).

60

3.6a

3.6b

Gráfico 3.6: Sensilios totales de stC-D por flagelómero en hembras (a) y machos (b). Desde los flagelómeros F10 (11 en machos) a F1 en sentido distal a proximal. Valores con + corresponden a la desviación media estándar del número de abejas (n=5).

61

3.7a

3.7b

Gráfico 3.7: La densidad media (a) y sensilios totales (b) de sBa por flagelómero en hembras. Desde los flagelómeros F10 a F1 en sentido distal a proximal. Valores con + corresponden a la desviación media estándar del número de abejas (n=5).

62

100,0 8,8 90,0 25,2

26,7

24,7

6,0

10,3

3,6

7,8 17,2

4,8

1,2

0,8

38,0

80,0 46,1

13,0

70,0 14,1

2,1

1,5

3,2

2,8

60,0

50,0

4,5

3,6 60,7

3,8 71,9

8,0 2,8

40,0

30,0

1,7

2,5

3,4

42,1 29,5

45,8

31,3

42,4

20,9

sCoe sAmp setas Co stB sBa stC‐D stA spA

20,0 25,7 10,0

18,2

21,9

25,1

22,2 15,3

14,0

D. distincta ♀

D. distincta ♂

17,2

0,0

P. relata ♀

P. relata ♂

M. segmentaria ♀

M. segmentaria ♂

A. apiformis ♀

A. apiformis ♂

Gráfico 3.8a: Indica en porcentaje de sensilios y setas sobre el total de pelos estimados en la superficie dorsal de la antena.

63

100,0 7,8

8,8 17,2

90,0 25,2

26,7

24,7

4,0 1,2

38,0

80,0 46,1

14,3

70,0

11,5

6,9 15,4

60,0

setas

5,7

1,7 6,5

4,9

sensilios sin poros

6,5

1,8 50,0

5,4 0,9

9,2 85,8

6,4

85,9

sensilios uniporosos

40,0

sensilios multiporosos

64,3 30,0

20,0

63,0 57,6

55,2

53,2

P. relata ♂

M. segmentaria ♀

39,1

10,0

0,0

P. relata ♀

M. segmentaria ♂

D. distincta ♀

D. distincta ♂

A. apiformis ♀

A. apiformis ♂

Gráfico 3.8b: Indica el porcentaje de sensilios sobre el total de pelos estimados en la superficie dosal de la antenna, agrupados según la naturaleza del receptor.

64

3. TABLAS Tabla 3.1

Tabla 3.1: Densidad media de sensilios calculados en los 7 segmentos distales. Valores con +/- corresponden a la desviación media estándar del número de abejas (n=3). Para 4 especies Ptilothrix relata, Melitoma segmentaria, Diadasina distincta y Ancylocelis apiformis correspoden n=5. Fueron incluidos los patrones de distribución de setas, stA, órganos en hoyos. También figuran patrones de la cutícula dorsal. ca, caveolada; so, lisa; st, estriada.

65

Tabla 3.2a

F10 F9 F8 F7 F6 F5 F4 F3 F2 F1

Ptilothrix relata

Melitoma segmentaria

Diadasina distincta

Ancylocelis apiformis

4.934,3 ± 561,7

829,7 ±133,2

1.933,4 ± 476,3

2.784,5 ± 568,8

5.672,7 ± 252,3

1.125 ± 99

1.790,7 ± 86,1

146,2

5.329,1 ± 181,2

1.369 ± 105

1.619,4 ± 400,2

0

5.344,1 ± 124,2

1.870,9 ± 230,9

1.383,7 ± 166,2

0

5.153,1 ± 219,7

1.811,948

1.448,6 ± 369,3

0

5.143,1 ± 345,6

2.800,7 ± 224,5

1.419,4 ± 153,7

45,4

5.178,6 ± 280,8

5.292,6 ± 329,8

1.331,1 ± 234,1

185,9

6.631,2 ± 121,9

4.425,4 ± 291,4

1.421,4 ± 234,1

4.450,1 + 686,4

5.321,7 ± 459,5

3.410,7 ± 350,1

11.034,1 ± 392,6

12.801 ± 2476

3.691,7 ± 836,2

1.315,2 ± 464,5

6.213,7 ± 515,6

8.268,1 ± 751,7

Ptilothrix relata

Melitoma segmentaria

Diadasina distincta

Ancylocelis apiformis

3.619,48 ± 298,4

659,7 ± 108,6

0

0

4.056,8 ± 499,5

1.714,9 ± 102,9

0

0

4.051,1 ± 456,3

2.287,8 ± 314,2

0

0

4.392,1 ± 371,1

1.902,7 ± 133

0

0

3.965,2 ± 374,4

2.055,1 ± 316,3

0

0

4.324,5 + 327,5

2.308,7 ± 348,2

0

0

4.600,7 ± 324

3.141,8 ± 754,4

0

0

4.680,1 ± 602,1

5.384,9 ± 381,9

0

0

5.122,6 ± 167,1

5.353,2 ± 367,1

479

122,1

5.486,1 ± 196,9

3.755 ± 216,7

2543,9 ± 341,1

2.250 ± 850,3

2.565,4 ± 379,2

3.664,5 ± 1167,3

8.619,6 ± 733,6

10.159,7 ± 1453,7

Tabla 3.2b

F11 F10 F9 F8 F7 F6 F5 F4 F3 F2 F1

Tabla 3.2: Densidades de setas por mm2 expresado por flagelómero en hembras (a) y machos (b). Desde los flagelomeros F10 (11 en machos) a F1 en sentido distal a proximal. Valores con +/- corresponden a la desviación media estándar del número de abejas (n=5).

66

Tabla 3.3a

F10 F9 F8 F7 F6 F5 F4 F3

Ptilothrix relata

Melitoma segmentaria

Diadasina distincta

Ancylocelis apiformis

2.653,1 ± 301,3

3.554,2 ± 293,9

3.069 ± 203,7

2.797,9 ± 287,9

2.894,5 ± 241,9

3.101,1 ± 133,7

3.136,3 ± 240,4

3.707,2 ± 334,6

2.963,4 ± 130,8

3.279,6 ± 185,3

3.252,2 ± 86,4

3.456,4 ± 136,3

2.825,4 ± 180

2.992,3 ± 196,0

2.887,5 ± 296

3.607 ± 503,5

2.681,2 ± 286,8

2.749,9 ± 141,8

3.285 ± 249,8

2.917,1 ± 418,7

2.467,7 ± 293,2

2.541,3 ± 197,8

2.530,2 ± 211,4

2.710,8 ± 277,8

2.364,4 ± 204,9

2.009,3 ± 308,6

2.686,6 ± 216,2

2.864,7 ± 150,6

1.396,7 ± 217

0

1.626,5 ± 184,6

3.184,9 ± 239,1

0

0

0

1.982,6 ± 149,6

0

0

0

0

Ptilothrix relata

Melitoma segmentaria

Diadasina distincta

Ancylocelis apiformis

4.062,9 ± 244,8

3.793,2 ± 406,8

2.235,2 ± 149,1

5.029,9 ± 291,9

3.776,9 ± 267,3

3.699 ± 241,6

2.965 ± 205

4.565,3 ± 145,4

3.466,7 ± 239

3.340,8 ± 291,4

2.832,9 ± 60,9

4.431,6 ± 553

3.633,8 ± 331

3.218,9 ± 196,4

2.653 ± 161,8

4.810,2 ± 365,9

3.567,9 ± 180,5

3.263,4 ± 191,3

2.490,3 ± 164

4.888,6 ± 568,3

3.493,1 ± 152,3

3.063,5 ± 265,4

2.511,3 ± 75,1

4.444,1 ± 372,3

2.911,8 ± 185,2

2.589,8 ± 293,3

2.132,9 ± 307,6

4.248,5 ± 565,9

3.125,2 ± 158,5

2.031,8 ± 350,3

2.107,7 ± 173,7

4.240,3 ± 94,8

2.532,5 ± 181,1

282,3 ± 182,5

1.954,3 ± 243,8

3.921,4 ± 283

145 ± 96,3

0

1.034,8 ± 329,7

3.533,6 ± 268,8

0

0

0

1.334,8

F2 F1

Tabla 3.3b

F11 F10 F9 F8 F7 F6 F5 F4 F3 F2 F1

Tabla 3.3: Densidades de sPa por mm2 expresado por flagelómero en hembras (a) y machos (b). Desde los flagelómeros F10 (11 en machos) a F1 en sentido distal a proximal. Valores con +/- corresponden a la desviación media estándar del número de abejas (n=5).

67

Tabla 3.4a

F10 F9 F8 F7 F6 F5 F4 F3 F2

Ptilothrix relata

Melitoma segmentaria

Diadasina distincta

Ancylocelis apiformis

3.406,6 ± 195,3

4.653,3 ± 464,2

6.888,5 ± 797,4

7.740,9 ± 633,4

3.837,1 ± 209,7

5.812,9 ± 164,1

7.982,1 ± 318,9

9.746,8 ± 379,2

3.637,1 ± 244

5.707,6 ± 376,3

9.267,9 ± 466,2

9.924 ± 208,1

3.453,8 ± 239,7

5.019,4 ± 109,9

8.001,8 ± 675,5

9.426 ± 201,1

3.415,7 ± 161,6

3.830,6 ± 538,1

7.824 ± 801,8

9.670,5 ± 846,9

2.565,2 ± 246,9

2.769 ± 384,4

7.961,4 ± 749,6

9.329,9 ± 215,3

2.517,5 ± 391,4

658,9 ± 204,4

8.312,8 ± 827

9.726,2 ± 478,5

257,3 ± 116,2

0

7.008,4 ± 924,7

6.920,7 ± 1166,5

21,6 ± 21,6

0

0

271,4 ± 209,2

0

0

0

0

F1

Tabla 3.4b

F11 F10 F9 F8 F7 F6 F5 F4 F3 F2 F1

Ptilothrix relata

Melitoma segmentaria

Diadasina distincta

Ancylocelis apiformis

6.934,4 ± 651,7

8.508,4 ± 349,4

12.507,1 ± 367,5

11.654,7 ± 782,2

5.230,8 ± 324,8

7.215,8 ± 395,9

12.942,2 ± 737,3

11.845,2 ± 994,5

5.013,4 ± 328,9

7.045 ± 411,2

12.933,1 ± 374,4

11.310 ± 520,7

4.330,3 ± 196,8

6.747,4 ± 492,5

11.513,5 ± 969,8

12.783,8 ± 692,1

4.344,7 ± 84,7

6.217,8 ± 314,2

11.888 ± 603,4

11.001 ± 155

3.650,4 ± 207,4

5.527,3 ± 307,9

11.351,5 ± 661,6

10.983,4 ± 223,1

2.901,6 ± 304,8

4.675,5 ± 549,1

11.928,3 ± 513,1

10.046,6 ± 157,3

1.780,1 ± 647,3

1.127,6 ± 469,1

12.116,3 ± 690,1

10.670,4 ± 521,3

491,6 ± 263,2

0

11.836,7 + 1052,8

10.042,6 ± 285,7

21,6

0

8.555,7 ± 908,7

7.962,8 ± 1201,3

0

0

0

0

Tabla 3.4: Densidades de stA por mm2 expresado por flagelómero en hembras (a) y machos (b). Desde los flagelómeros F10 (11 en machos) a F1 en sentido distal a proximal. Valores con +/- corresponden a la desviación media estándar del número de abejas (n=5).

68

Tabla 3.5a

F10 F9 F8 F7 F6 F5 F4 F3 F2

Ptilothrix relata

Melitoma segmentaria

Diadasina distincta

Ancylocelis apiformis

2.292,8 ± 77,9

2.371 ± 135,7

2.946,2 ± 366,6

4.313,9± 300,8

1.101,4 ± 92,8

1.645 ± 97,7

1.942,4 ± 140,1

2.536,3 ± 114,6

1.014,6 ± 63,6

1.368,6± 90,6

2.038,1 ± 298

2.215,3 ± 150,9

926,6 ± 36,2

1.518,7 ± 92,8

1.525,9 ± 206,2

1.878,5 ± 31,8

906,5 ± 56,8

1.474,7 ± 94,8

1.718,2 ± 220,9

2.166,8 ± 303

877 ± 83,8

1.698 ± 99,4

1.272,3 ± 62,4

1.751,3 ± 153,1

879,1 ± 142,2

1.542,6 ± 113,3

1.370,6 ± 146,8

1.510,9 ± 170,8

794,6 ± 109,6

1.912 ± 578,5

1.157,7 ± 175,3

1.940,8 ± 290,2

261,5 ± 34,9

308,9 ± 107,3

1.023,5 ± 197,7

1.123,4 ± 233,7

0

0

0

0

F1

Tabla 3.5b

F11 F10 F9 F8 F7 F6 F5 F4 F3 F2 F1

Ptilothrix relata

Melitoma segmentaria

Diadasina distincta

Ancylocelis apiformis

1.102,1 ± 38,2

797,6 ± 29,2

770,3 ± 88

1.293,8 ± 93,6

567,4 ± 105

770,8 ± 103,9

565 ± 67,4

1.125 ± 75,6

557,9 ± 80,3

763,9 ± 127,1

569,6 ± 69,3

949,4 ± 110

518,8 ± 72,9

633,8 ± 107,9

612,6 ± 97,3

843,4 + 124,7

431,6 ± 80

717,9 ± 50,2

563,8 ± 39,9

836,6 + 25,4

529,8 ± 57

745 ± 94,2

608,7 ± 73,1

587,8 ± 51,2

445,5 ± 36,9

903,8 ± 116,5

616,7 ± 95,2

745,1 ± 55

359,9 ± 8,4

893,6 ± 87

520,2 ± 82,2

858,5 ± 109,3

526,2 ± 78,3

585,7 ± 95,7

514,5 ± 64,2

564,3 ± 49,7

270,2 ± 26,6

94,4 ± 35

692,5 ± 59,6

701 ± 219,4

0

0

41,3

0

Tabla 3.5: Densidades de stB por mm2 expresado por flagelómero en hembras (a) y machos (b). Desde los flagelómeros F10 (11 en machos) a F1 en sentido distal a proximal. Valores con +/- corresponden a la desviación media estándar del número de abejas (n=5).

69

Tabla 3.6a

F10 F9 F8 F7 F6 F5 F4 F3 F2 F1

Ptilothrix relata

Melitoma segmentaria

Diadasina distincta

Ancylocelis apiformis

2.155,3 ± 251,4

1.378,2 ± 92,7

2.036,0 ± 354,8

2.560,5 ± 540,5

850,6 ± 61,9

931 ± 64,6

1.453,9 ± 367,4

729,6 ± 149,9

845,2 ± 73

855,9 ± 89,6

1.042,3 ± 134,8

987,1 ± 78,6

735,1 ± 99,1

924,6 ± 29,7

1.110,1 ± 148,1

783,4 ± 137,5

846,5 ± 47,5

826,1 ± 149

902 ± 148,2

735,7 ± 24,6

755,4 ± 63,1

554,2 ± 116,3

789,2 ± 148,2

861 ± 67,9

600,9 ± 55,6

447,4 ± 117,8

666,5 ± 138,2

600 ± 175,5

765,4 ± 72,7

460,1 ± 125,7

677,8 ± 178,1

812,3 ± 47

385,9 ± 129,2

328,1 ± 77,5

636,2 ± 182,6

759,1 ± 117,8

199,2 ± 16,7

101,2 ± 28,7

287,1 ± 139

328,5 ± 94,1

Ptilothrix relata

Melitoma segmentaria

Diadasina distincta

Ancylocelis apiformis

505,4 ± 94,8

444,3 ± 27,1

758,5 ± 90,2

691,2 ± 148,9

442,9 ± 35,4

357,6 ± 23

321 ± 53,2

298,8 ± 87,5

365,6 ± 57,2

206,6 ± 48,8

295 ± 58,5

181,7 ± 30

358 ± 61,4

267,3 ± 13,4

252,5 ± 29,4

238,4 ± 30,7

386,5 ± 50,9

251,3 ± 21,3

312 ± 52,7

222,3 ± 47,3

405,5 ± 67,3

208,9 ± 58,6

208,4 ± 38,5

206,1 ± 46,2

271,7 ± 69,5

331,9 ± 48

224,8 ± 40,3

139,9 ± 8,2

338,4 ± 47,8

325,5 ± 30,4

268,6 ± 58,9

193,2 ± 34,2

303,1 ± 69,5

256,5 ± 73,5

225,7 ± 48,6

175,9 ± 35,1

329,9 ± 71,9

178,8 ± 39,5

234,3 ± 54,4

309,1 ± 97

151,5 ± 46,7

138,7 ± 35,7

446,3 ± 174,5

870,2 ± 129,3

Tabla 3.6b

F11 F10 F9 F8 F7 F6 F5 F4 F3 F2 F1

Tabla 3.6: Densidades de stC-D por mm2 expresado por flagelómero en hembras (a) y machos (b). Desde los flagelómeros F10 (11 en machos) a F1 en sentido distal a proximal. Valores con +/corresponden a la desviación media estándar del número de abejas (n=5).

70

Tabla 3.7a

F10 F9 F8 F7 F6 F5 F4 F3 F2 F1

Ptilothrix relata

Melitoma segmentaria

Diadasina distincta

Ancylocelis apiformis

63 ± 4,7

54,5 ± 4,2

67,7 ± 5,8

60,6 ± 9,7

32,5 ± 4,1

34 ± 3,6

33 ± 2,8

21,6 ± 2

31,2 ± 4,4

27,7 ± 5,2

30 ± 1

20 ± 2

24,2 ± 2,8

24,5 ± 2,1

30,5 ± 1,8

14 ± 3,7

27 ± 1,8

22,2 ± 2,2

27,5 ± 0,6

13,6 ± 2,3

27 ± 3

19 ± 1,1

22,7 ± 2

12,3 ± 2,9

23,5 ± 0,9

15,5 ± 2,2

20,7 ± 2

9,6 ± 3,3

18 ± 5,3

10 ± 1,4

19,2 ± 2,4

12 ± 1

14,7 ± 1

6,2 ± 1

18 ± 2,2

10,3 ± 1,2

12,7 ± 1,3

10 ± 1,4

9,2 ± 1,3

6,6 ± 0,6

Tabla 3.7b Ptilothrix relata

Melitoma segmentaria

Diadasina distincta

Ancylocelis apiformis

F11

23,7 ± 4,8 

18,2 ± 2,1 

23,5 ± 2,2 

10,3 ± 4,6 

F10

18,7 ± 2,8 

11,2 ± 1,2 

12,2 ± 3 

7,6 ± 1,3 

F9

17 ± 2,3 

9,7 ± 1,3 

10 ± 1,7 

9,3 ± 0,8 

F8

18,2 ± 0,2 

7,5 ± 1,1 

8 ± 1,2 

7,3 ± 1,20 

F7

16,5 ± 1,4 

8 ± 0,4 

9,2 ± 1,6 

8 ± 1 

F6

13,2 ± 2,6 

9 ± 0,8 

7,7 ± 1 

6,3 ± 1,2 

F5

12 ± 2 

9,7 ± 1,4 

8,2 ± 1 

4,3 ± 0,8 

F4

13,7 ± 2,5 

8,7 ± 0,2 

9 ± 1,8 

5 ± 1 

F3

10,5 ± 3,2 

8 ± 1,2 

9,2 ± 1,8 

5 ± 1 

F2

9 ± 1,4 

7,2 ± 0,4 

8,2 ± 1 

5,3 ± 2 

F1

9,7 ± 2,2 

5,7 ± 1,1 

10,2 ± 1,8 

8 ± 2,3 

Tabla 3.7: Números totales de stC-D expresado por flagelómero en hembras (a) y machos (b). Desde los

T

flagelómeros F10 (11 en machos) a F1 en sentido distal a proximal. Valores con +/- corresponden a la desviación media estándar del número de abejas (n=5).

71

Tabla 3.8a

F10 F9 F8 F7 F6 F5 F4 F3

Ptilothrix relata

Melitoma segmentaria

Diadasina distincta

Ancylocelis apiformis

615,9 ± 32,3

924,2 ± 22,1

1.003,8 ± 131,1

1.285,5 ± 119,9

372,3 ± 47,9

472,7 ± 43,7

736,1 ± 32,3

1.053,2 ± 79,7

396,8 ± 101,8

408,3 ± 20,7

538,2 ± 59,7

695,3 ± 51

340,4 ± 71,1

290,1 ± 28,2

624,9 ± 32,7

734,3 ± 117,3

283,6 ± 29,8

274 ± 35,8

527,9 ± 49,4

372,8 ± 27,2

327,7 ± 36,6

145,1 ±1 9,9

470,4 ± 19,5

364 ±53,8

301,6 ± 40,4

0

518,1 ± 107,7

184,3 ± 50,2

198,3 ± 26,1

0

532,1 ± 107,3

74,5

0

0

35,3

0

0

0

0

0

F2 F1

Tabla 3.8b

F10 F9 F8 F7 F6 F5 F4 F3 F2 F1

Ptilothrix relata

Melitoma segmentaria

Diadasina distincta

Ancylocelis apiformis

30,2 ± 1,7

42,5 ± 2,9

45,2 ± 3,7

32,3 ± 1,2

18,5 ± 1,1

16,5 ± 3,9

24,5 ± 1,9

18 ± 1,1

20,5 ± 3,6

22 ± 4,1

26 ± 3,1

16,6 ± 2,3

14,2 ± 0,8

11,2 ± 0,2

19,2 ± 1,6

8 ± 0,5

12,7 ± 1

9,2 ± 0,2

15,2 ± 1,2

8 ± 0,5

10 ± 1

5,5 ± 0,9

11 ± 1,

8+3

10,2 ± 0,4

1,2 ± 0,7

10,5 ± 1,4

6±3

6,2 ± 0,4

0

8,2 ± 1,7

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Tabla 3.8: Distribuciónes por mm2 (a) y números totales (b) de sBa expresado por flagelómero en hembras. Desde los flagelómeros F10 a F1 en sentido distal a proximal. Valores con +/- corresponden a la desviación media estándar del número de abejas (n=5).

72

Tabla 3.9 Especies

Ptilothrix Relata

Melitoma Segmentaria

Genero

♀ ♂

♀ ♂

Diadasina distincta

♀ ♂

Ancyloscelis apiformis

♀ ♂

TEs stA

TEs stB

TEs sPa

Total stC-d

Total sBa

Total sCoe

Total sAmp

Total sCap

TOTAL

1.696 ± 194 2.879 ± 245

647 ± 25 439 ± 107

1.481 ± 262 2.511 ± 239

274 ± 38 162 ± 21

122 ± 9,2 nr

56,5 ± 19,8 25 ± 8,5

79,3 ± 9,3 2,3 ± 11,3

19,8 ± 4,9 12,5 ± 5,3

4.378 6.052,3

1.838 ± 87 2.891 ± 335

828 ± 27 408 ± 75

1.286 ± 130 3.281 ± 171

223 ± 19 103 ± 9.7

108 ± 7,8 nr

32,2 ± 1,7 44,2 ± 5,2

62,7 ± 8,7 48 ± 19,5

11,5 ± 3 16 ± 7,5

4.391 5.033,3

3.251 ± 430 7.202 ± 568

789 ± 50 363 ± 31

1.174 ± 74 1.398 ± 79

278 ± 17 115 ± 21

160 ± 16,3 nr

30,8 ± 6,3 27,5 ± .3

91 ± 5,5 29,8 ± 12,1

6,5 ± 2,3 6±4

5.782,4 9.143,1

730 ± 34 457 ± 35

967 ± 135 2.397 ± 180

181 ± 8,7 76,7 ± 11,6

97 ± 7,5 nr

28,8 ± 1,1 11,7 ± 5,6

57,3 ± .2,4 47,7 ± 10,4

20,3 ± 3,8 10 ± 2,7

4.665,7 8.793,8

2.582 ± 138 5.792 ± 78

 

73

Continuación de Tabla 3.9

Especies

Género

TEs stA

TEs Pla

total stC-d

total Ba

total Co

total Amp

total Coel

TOTAL

♀ ♂

2.342 4453

733,5 475,8

1277 1300

182 34

146 Nr

18,0 47,0

32 43

10 10

4.741,4 6.363,8

Ancylocelis bonariensis

♀ ♂

2.540 5.099

818,9 461,7

1456 2059

173 76

64 nr

109 24

78 86

9 12

5249,0 7818,7

Diadasia ochracea

♀ ♂

2.754 -

582,9 401,1

1278 1751

195

119 nr

20 12

62 0.0

2 0

2.259,1 2.164,1

Diadasia baeri

♀ ♂

5.003 ± 280 9.643 ± 71

434,6 ± 46 295, ± 91

2047 ± 60,7 3349 ± 106

243 ± 2 148 ± 14

130,5 ± 7,5 nr

53 ± 5 40 ± 1

117 ± 9 110 ± 35

30 ± 1 10,5 ± 2,5

8.059,5 13.597,2

Diadasia hirta

♀ ♂

2.510 7.121

313,4 228,5

1693 2169

133 123

53 Nr

29 42

94 84

32 10

4.858,3 9.778,8

Meliphilopsis melandra

♀ ♂

3.074 3.718

1100 586,7

2121 3929

201 80

76 nr

56 4

53 36

3 3

6.685,2 8.357,6

Meliphilopsis ochrandra

♀ ♂

1.157 2.549

571,8 553,6

917,8 1144

262 40

120 Nr

37 24

84 40

26 4

3.176,3 4.355,8

Leptometriella monteana

♀ ♂

1.358 3.091

300,4 297,6

1494 2754

211 84

36 nr

31 32

29 58

24 5

3.484,5 6.322.5

Alepidoceles imitatrix

TEs stB

74

Continuación de Tabla 3.9

Especie

Género

TEs stA

TEs stB

TEs Pla

total stC-d

total Ba

total Co

total Amp

total Coel

TOTAL

Ptilothrix tricolor

♀ ♂

2.178 ± 159 3.577 ± 208

672 ± 10 372 ± 5

1.762 ± 48 2.945 ± 9

261 ± 22 158 ± 4

102 ± 7 nr

37 ± 3 40,5 ± 2,5

70,5 ± 3,5 68,5 ± 11,5

18,5 ± 4,5 23,0 ± 4,0

5.102,1 7.184,8

Ptilothrix albidohirta

♀

2.603 3.746

772 540

2.275 2.334

317 ± 123 174

123 nr

36 24

90,0 9,0

25,0 4,0

6.242,9 6.832,3

Alepidoceles filitarsis

♀ ♂

672 1.727

524 ± 451

877 1.525

334 114

131 nr

23 50

72,0 53,0

1,0 18,0

2.635,3 3.939,8

Leptometriella separata

♀ ♂

947 ± 55 1.778 ± 71

264 ± 5 239 ± 17

1.109 ± 150 1.649 ± 45

181 ± 30 56

56,5 ± 9,5 nr

22,5 ± 3,5 37,5 ± 0,5

60,5 ± 8,5 67 ± 5

28 ± 11 19,5 ± 9,5

2.6710 3.848,0

Melitoma ameghinoi

♀

1422

673

1555

189

91

50

95

23

4099,3

Melitoma nudipes

♀ ♂

2190 2158

492 326

1377 1539

193 110

87 Nr

29 40

80 78

19 15

4469,2 4268,0

Ancylocelis romeroi

♀ ♂

3356 3947

775 670

1136 1569

165 119

75 nr

40 58

89 90

22 26

5660,3 6480,5

Tabla 3.9: Valores totales de los sensilios estimados por densidad (TEs) o calculados en forma directa (total). Valores con +/- corresponden a la desviación media estándar.

75

Tabla 3.10

sPa stA stB stC-D sBa

sPa stA stB stC-D sBa

Ptilothrix relata

Melitoma segmentaria

Diadasina distincta

Ancylocelis apiformis

1,04 3,41 12,28* 11,84* 14,53*

6,75 11,99* 12,35* 9,28 16,07*

1,65 6,02 10,68* 10,2* 13,71*

4,4 6,83 10,1* 17,94* 12,63*

Ptilothrix relata

Melitoma segmentaria

Diadasina distincta

Ancylocelis apiformis

3,45 11,94* 11,01 3,23 ------

3,47 11,13 2,07 15,3* ------

8,92 2,98 3,83 10,4* -----

1,83 4,2 8,55 8,23 -----

Tabla 3.10: Análisis de la varianza de la densidad entre los tipos de sensilios, presentes en los 5 segmentos distales del flagelo en hembras (a) y en machos (b). Los valores corresponden a los estadísticos de Kruskall –Wallis. El asterisco indica valores significativos p