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ALMACENAMIENTO DE SEMILLAS DE DIFERENTES ESPECIES DE ORQUÍDEAS PARA SU CONSERVACIÓN EN UN BANCO DE GERMOPLASMA I. MADURACIÓN, VIABILIDAD Y LONGEVIDAD DE SEMILLAS C. Ossenbach1, J. Arce1, J. Warner2 1

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Universidad EARTH. Las Mercedes de Guácimo, Limón, Costa Rica Jardín Botánico Lankester, Universidad de Costa Rica. Cartago, Costa Rica Recibido 15 de enero 2003. Aceptado 12 de diciembre 2006.

RESUMEN El almacenamiento de semillas representa un potencial como conservación ex situ de especies de orquídeas neotropicales en peligro de extinción. En este primer estudio, se evaluaron la viabilidad y los embriones de semillas originadas de autogamia, geitonogamia y alogamia. Después, se comparó la longevidad de semillas de cápsulas con cuatro diferentes etapas de desarrollo. El lugar de estudio fue el Jardín Botánico Lankester, CR. Los resultados indicaron que la alogamia produjo una viabilidad mayor en las semillas de la mayoría de las especies. Para efectos de conservación de las especies de orquídeas neotropicales, se sugiere una polinización cruzada. Las semillas de cápsulas más maduras mostraron una mayor longevidad. Por esta razón, se deben cosechar las cápsulas maduras, es decir, frutos que abren naturalmente en la planta. Palabras clave: maduración, orquídeas, polinización, semillas, viabilidad. ABSTRACT The storage of seeds represents a potential as an ex situ conservation system for endangered neotropical orchid species. In this first study, seeds produced from autogamy, geitonogamy and allogamy were evaluated for their viability and embryos. The longevity of seeds from capsules of four different development stages was compared. The study was conducted at the Lankester Botanical Garden, in Costa Rica. The results showed that allogamy produced seeds with a higher viability in most of the species. Therefore, for conservation of neotropical orchid species, cross pollination is recommended. The seeds originating from more mature capsules showed a higher longevity. For this reason, mature capsules should be harvested, that is, fruits which open naturally on the plant. Key words: Maturity, orchids, pollination, seeds, viability. INTRODUCCIÓN Las orquídeas, por su variabilidad genética, tienen una gran importancia ecológica tanto para la flora como para la fauna silvestre. Debido al alto peligro de extinción que presentan, se hace necesaria la evaluación de métodos eficientes de preservación de germoplasma. En la conservación in situ se corre un mayor riesgo de perder esta variabilidad, por lo que la conservación ex situ adopta un papel predominante en estas situaciones (Arditti, 1992).

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Contacto: Jorge Arce ([email protected])

ISSN: 1659-2751

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Algunas flores son autocompatibles, y el polen producido por las anteras puede germinar en el estigma de la misma flor. Estas flores son denominadas autógamas. Si la autopolinización ocurre cuando el capullo aún no ha abierto, las flores se llaman cleistógamas. Existen profundas implicaciones genéticas que diferencian la alogamia (polinización con polen ajeno a la flor o polinización cruzada) y la autogamia. La autopolinización conlleva a una reducción de la variabilidad genética. La polinización cruzada resulta en un aumento de la variabilidad genética (Arditti, 1992). Hicks (2000) dice que si se desea resaltar alguna particularidad de una orquídea (ej.: flores alba), lo recomendable es realizar una autopolinización. Si se busca mantener el código genético de una colonia en particular, es preferible realizar un cruzamiento entre hermanos (dos plantas que se originaron de la misma planta); y si la meta es conservar la especie, se debe realizar una polinización cruzada. Pocos estudios se han llevado a cabo para valorar la fertilidad en relación con el tipo de polinización. Lock y Profita (1975) demostraron que la polinización cruzada produce un 98 % de fertilidad en Eulophia cristata, mientras que la geitogamia da origen a tan sólo un 83 % de fertilidad en la misma especie. Según Höhne (1995), el grado de maduración apropiado de cápsulas de las orquídeas para su selección es 4/5 partes del tiempo correcto de maduración de las cápsulas. Este tiempo varía según la especie; sin embargo, de forma general se observa un cambio de color de la cápsula de verde a amarillo o café y el tegumento es suave y elástico. Meyers Conservatory (1999), al igual que Seaton (2000), afirman que no vale la pena guardar semilla de cápsulas inmaduras, con excepción de aquellos casos en los que las semillas maduras son difíciles de germinar. Sin embargo, Böhm (1996) asegura que, en especies de más de una cápsula, una manera sabia de averiguar si la semilla dentro de una cápsula cerrada ya está madura, es abriendo una cápsula en la parte superior de la inflorescencia, ya que éstas son las últimas en madurar al ser las últimas en abrir, y por lo tanto, las últimas en ser polinizadas (con algunas excepciones de especies que florecen en la inflorescencia de arriba hasta abajo). Si las semillas son cafés y pueden ser removidas fácilmente de la placenta, están listas para ser cosechadas; si son blancas y no se despegan con facilidad, éstas no son aprovechables; y si son blancas, pero sí se desprenden fácilmente, germinarán, pero deberán sembrarse antes de los 5 días, imposibilitando su conservación (Böhm, 1996). A pesar de las dificultades de almacenar semilla inmadura, tradicionalmente se ha acostumbrado sembrar precisamente, este tipo de semilla, ya que ésta se supone que presenta un porcentaje de germinación mayor y más rápido que las semillas maduras. Posiblemente estas últimas tienen una menor facilidad de imbibirse o de absorber agua. De acuerdo con Böhm (1996), la cosecha para este tipo de semillas se debe realizar a los 2/3 de la maduración de la cápsula, lo cual supone que corresponde a 50 días después de la polinización para la mayoría de las especies con un rizoma. En este primer estudio, los objetivos fueron la evaluación de la viabilidad y los embriones de semillas originadas de autogamia, geitonogamia y alogamia y la comparación de la longevidad de semillas de cápsulas con cuatro diferentes etapas de desarrollo. Las especias de orquídeas estudiadas fueron Asplundia sp., Blettia purpurea (Lam.) D.C., Coeologyne sp., Encyclia ceratistes (Lindl.) Schltr., Encyclia ochracea (Lindl.) W.E. Higging, Epidendrum ciliare L., Epidendrum radicans Lindl., Ionopsis utriulariodes (Sw.) Lindl., Isochilus amparoanus Schltr.,

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Miltoniopsis warscewiczii Rchb. f., Pleurothallis endotrachys Rchb. f., Restrepia trichoglossa, Scaphyglottis lindeniana (A. Rich. & Gal.) L. O. Williams y Sobralia sp. MATERIALES Y MÉTODOS El trabajo en el campo, el cual consistía en la polinización de las orquídeas, la identificación de los frutos y su cosecha, se llevó a cabo en el Jardín Botánico Lankester de la Universidad de Costa Rica, ubicado cerca de la ciudad de Paraíso de Cartago, a una latitud de 9° 50' N, una longitud de 84° 55' O y una altura de 1400 m.s.n.m. Esta zona presenta una precipitación pluvial de 1000 mm a 1300 mm por año y la temperatura promedio es de 18 °C a 24 °C durante el día y 15 °C a 18 °C durante la noche. Las pruebas de germinación se realizaron en el laboratorio de cultivo de tejidos de dicho jardín. Se realizó la polinización de algunas especies para poder determinar el tiempo de maduración de la cápsula. Se evaluó la viabilidad y los embriones de semillas provenientes de flores de polinización cruzada (alogamia) y de flores autopolinizadas con polen de la misma flor (autogamia) y con polen de otra flor de la misma planta (geitonogamia). Las especies estudiadas fueron Blettia purpurea y Scaphyglottis lindeniana, cuyas muestras estaban conformadas por semillas de varias cápsulas (cápsulas mixtas) y Epidendrum ciliare, Miltoniopsis warscewiczii, Pleurothallis endotrachys y Restrepia trichoglossa, de las cuales se valoró la semilla de cada cápsula por separado, evaluando un promedio de dos cápsulas por especie y por tipo de polinización. Se registró el período de maduración de estas especies. También se anotó el tiempo de maduración de las especies Encyclia ochracea y Ionopsis utriulariodes, procedentes de polinización natural. Las cápsulas formadas se observaron cada semana para notar cambios en su color y firmeza. Se cosecharon cápsulas maduras (frutos secos que se abren de manera natural). Las cápsulas se cortaron dentro de un sobre de papel con una tijera desinfectada con yodo. El sobre se identificó con el nombre científico, un número de accesión, el tipo de polinización, el grado de maduración de la cápsula, su color, y la fecha. Finalmente se llevó al laboratorio para recuperar la semilla. Para la comparación entre la longevidad de semillas provenientes de cápsulas maduras e inmaduras, se evaluaron semillas provenientes de cápsulas con cuatro diferentes grados de maduración, clasificadas arbitrariamente (Cuadro 1). Todas las semillas recuperadas para este ensayo se almacenaron a 5 °C en viales de vidrio. La cantidad de semilla que se colocó en cada vial fue el contenido completo de una cápsula y por cada grado de maduración estudiaron cápsulas de dos o tres diferentes plantas por cada especie.

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Cuadro 1. Grado de maduración de las cápsulas, clasificadas arbitrariamente. Índice de cosecha Grado de maduración 100 %

Maduras, cápsulas abiertas

90 %

En 9/10 de su maduración y presentaban un tegumento suave, cambio de color y se abrían cuando se les aplicaba una gran presión con los dedos de las manos

75 %

En ¾ de su maduración y presentaban un tegumento que empezaba a ceder, colores generalmente más claros, según la especie, pero no abrían ni con una gran presión

50 %

En ½ de su maduración y habían alcanzado el tamaño y grosor de una cápsula madura, sin embargo, su tegumento seguía duro

Las especies evaluadas fueron Asplundia sp., B. purpurea, Coeologyne sp., Encyclia ceratistes, Epidendrum radicans, Isochilus amparoanus y Sobralia sp. Se realizaron pruebas de viabilidad en la fecha de entrada de las muestras al laboratorio, y luego de una, ocho y 16 o 20 semanas después. RESULTADOS Y DISCUSIÓN El éxito de la polinización se muestra el hecho que la flor se marchita y en una semana se puede observar el crecimiento del ovario (Arditti, 1992). El porcentaje de éxito alcanzado con las especies polinizadas fue de un 100 %. Para las especies B. purpurea y S. lindeniana, no hubo una gran diferencia en viabilidad entre la polinización cruzada y la autogamia (Figura 1). Según Arditti (1992), B. purpurea es una especie que puede presentar tanto polinización cruzada como autopolinización, debido a sus características evolutivas.

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No viables Viables

Embriones (%)

100

80

60

40

B. p

0

ur p M . w E. ure a ci a P. rsce liar en w e R. do iczi tri trac i S. cho hys lin glo de ss ni a na na B. pu M E rpur . w . ea a cil P. rsce iare en wi do cz tra ii ch ys B. pu M E rpur . w . ea ar cili sc ar ew e ic zi i

20

Alogamia

Autogamia

Geitonogamia

Figura 1. Porcentaje de embriones viables y no viables en relación con especie y con el tipo de polinización efectuado. En las especies E. ciliare, M. warscewiczii y P. endotrachys, se detectó una tendencia a presentar una mayor viabilidad en la polinización cruzada y menor en la autogamia y geitonogamia (Figura 1). Tomando en cuenta las relaciones genéticas, la autogamia y la geitonogamia se consideran en la mayoría de los casos como equivalentes, ya que el donador de polen y el receptor son genéticamente idénticos (Arditti, 1992). Por otro lado, obtuvo en M. warscewiczii una viabilidad mayor con la polinización cruzada, aunque la anatomía de la flor favorece la autogamia al no presentar ningún obstáculo físico entre la antera y el estigma (Arditti, 1992). La especie Restrepia trichoglossa no se pudo comparar con otro tipo de polinización (Figura 1). Sin embargo, ha mostrado tener una gran dificultad de desarrollar semillas con embriones, incluso realizando polinización cruzada. Este caso se puede deber a que R. trichoglossa se considera una orquídea miniatura muy difícil de polinizar (Hicks, 2000). Ninguna de las especies evaluadas está incluida en la lista de Arditti (1992) de especies que presentan apomixis, por lo cual no se toma este factor como otra posible variable. Estos datos deben ser reforzados con más estudios para evaluar su reincidencia. Existe poca investigación en esta área y los resultados que se pudieran obtener beneficiarían mucho a los productores de semillas. Se logró recopilar la información del tiempo de maduración de cápsulas de 11 especies (Cuadro 2). También se identificó el color de la cápsula que se observó en su estado maduro. Se observó que dentro de una misma especie se halla un rango muy amplio de maduración de las cápsulas. No se pudo afirmar que existe la misma variabilidad para todas las especies, debido a que no se evaluaron cantidades iguales de cápsulas en cada una de ellas. Por ejemplo, para

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B. purpurea se evaluaron más de 15 cápsulas, mientras que para Gongora quinquenervis sólo se tomó en cuenta un fruto. El número de ejemplares de las demás especies oscila entre tres y siete cápsulas. Cuadro 2. Tiempo de maduración de cápsulas de orquídeas y color de la cápsula madura. Tiempo de maduración de Especie Color de cápsula madura la cápsula Asplundia sp.

11-12 semanas

verde claro con líneas longitudinales cafés

Blettia purpurea

6-12 semanas

verde oscuro

Encyclia ochracea

8-11 semanas

verde claro a amarillo

Epidendrum ciliare

22-26 semanas

anaranjado

Gongora quinquenervis

12 semanas

morado claro

Ionopsis utriulariodes

7-10 semanas

amarillo

Miltoniopsis warscewiczii

16-20 semanas

verde claro

Pleurothallis endotrachys

11-12 semanas

verde claro a amarillo

Restrepia trichoglossa

6-11 semanas

verde claro a amarillo

Scaphyglottis lindeniana

7-8 semanas

verde claro a amarillo

Sobralia sp.

12-14 semanas

verde claro

Böhm (1996) afirmó que la mayoría de las especies con un rizoma deben ser cosechadas aproximadamente a los 50 días después de su polinización para su siembra. Refiriéndose al hecho que muchas especies presentan una variabilidad de tiempo muy amplia para su desarrollo (especialmente B. purpurea), se hizo muy difícil recomendar un tiempo de cosecha predeterminado, como lo hace Böhm (1996). Esto posibilitaría que se obtengan semillas en etapas de desarrollo muy distintas. Por esto, los índices de cosecha se tomaron de carácter arbitrario y sería más aconsejable determinar, mediante la observación, el punto adecuado de cosecha. Es así como las tablas de referencia sobre tiempos de maduración y color de las cápsulas maduras juegan un papel primordial para cualquier persona que necesite realizar la cosecha de una especie que desconoce. En la mayoría de las especies, mientras las semillas maduran, las células de los suspensores y la testa (cobertura de la semilla) mueren (Arditti, 1992). Debido a esto, ya que el contenido de agua de las semillas maduras es menor, se espera que éstas posean una mayor capacidad para soportar un periodo de almacenamiento más prolongado. A pesar de ello, los resultados en el Cuadro 3 no representan con exactitud esta hipótesis.

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Cuadro 3. Viabilidad de semillas provenientes de cápsulas con distintos índices de cosecha. % viabilidad de semillas (por semanas) 0

1

8

16 †

Pérdida de viabilidad por IC (%)

100 %

50

35

30

15

70.0

75 %

40

40

40

25

37.5

100 %

72

72

70

32

55.6

90 %

82

78

70

70

14.6

75 %

83

79

62

56

32.5

50 %

93

88

67

55

40.9

100 %

55

0

100.0

90 %

31

0

100.0

100 %

90

89

82

75

16.7

90 %

88

85

80

70

20.4

75 %

88

87

73

70

20.4

100 %

10

5

0-5

0

100.0

50 %

58

0

100 %

85

85

85

80

5.9

90 %

85

85

85

75

11.8

95

95

90

75

21.1

Índice de cosecha (IC) Asplundia sp.

Blettia purpurea

Coelogyne sp.

Encyclia ceratistes

Epidendrum radicans 100.0

Isochilus amparoanus

Sobralia sp. 100 %

90 % 95 92 75 75 † Veinte (20) semanas para las cápsulas de Encyclia ceratistes e Isochilus amparoanus.

21.1

En la especie E. ceratistes sí se apreció un porcentaje de pérdida de viabilidad menor en las semillas provenientes de cápsulas maduras, es decir, con un índice de cosecha del 100 % (Cuadro 3). Sin embargo, las diferencias no fueron considerables, menos entre los índices del 90 % y del 75 % (Ossenbach, 2001). También se percibe una menor pérdida para las cápsulas maduras de I. amparoanus, siendo ésta del 5.9 % en comparación con un 11.8 % de cápsulas con un 90 % de maduración.

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Por otro lado, Asplundia sp. perdió un mayor porcentaje de viabilidad con un índice de cosecha del 100 % que con uno de 75 %. En el caso de B. purpurea, se presentó un 50 % de pérdida de viabilidad nuevamente para un 100 % de madurez. Sin embargo, las repeticiones señalaron que una muestra perdió por completo la viabilidad, mientras que la otra muestra permaneció íntegra. Esto demuestra que en algún momento existió una manipulación inadecuada de la semilla, lo cual produjo la pérdida de su viabilidad. Sin tomar en cuenta este dato, los demás resultados son bastante congruentes, presentando una pérdida de viabilidad menor en semillas provenientes de cápsulas más maduras y una pérdida mayor en cápsulas más jóvenes (Cuadro 3). Las demás especies, Coelogyne sp., E. radicans y Sobralia sp., no revelaron diferencia alguna entre los índices de cosecha. Esto se pudo deber, por un lado, a que en Coelogyne sp. y E. radicans el período de vida de la semilla fue tan corto que no permitió detectar las diferencias. Por otro lado, la muestra madura de E. radicans duró mayor tiempo en perder por completo su viabilidad, a pesar de iniciar con una viabilidad considerablemente baja del 10 %, en comparación con un 58 % de las muestras con un índice del 50 %. En general, se percibió una tendencia hacia una mayor longevidad en semillas provenientes de cápsulas más maduras. Las diferencias, por su parte, no fueron siempre muy notables, especialmente entre los índices de cosecha del 100 % y del 90 %. Esto indicó que en casos en que no es posible la cosecha de la cápsula madura, se puede realizar una excepción y cosechar cápsulas inmaduras, preferiblemente en un estado avanzado. Es relevante recordar que aún se desconoce el comportamiento de la semilla después de las 16 o 20 semanas del estudio. CONCLUSIONES Las semillas formadas a partir de la alogamia mostraron una mayor viabilidad al compararlas con aquéllas formadas en la autogamia y la geotonogamia. Para efectos de conservación de las especies de orquídeas neotropicales, se sugiere una polinización cruzada. Sin embargo, es necesario realizar estudios más detallados en relación con el tipo de polinización de las especies en peligro de extinción. La longevidad de las semillas provenientes de cápsulas maduras fue mayor que la de aquellas provenientes de cápsulas inmaduras. Por esta razón, se recomienda cosechar cápsulas maduras, es decir, frutos que abren naturalmente en la planta, para obtener una mayor longevidad de las semillas. Cuando no es posible recolectar frutos maduros, se pueden hacer excepciones. Sin embargo, se deben preferir las cápsulas más maduras. LITERATURA CITADA Arditti, J. 1992. Fundamentals of Orchid Biology. John Wiley & Sons, Inc. US. 691 p. Böhm, J. 1996. Terrestrial orchid seed handling: How to collect, store and send terrestrial orchid seed and pollen and how to send in vitro cultures by post (en línea). Consultado el 25 de febrero del 2001. Disponible en http://www.med-rz.unisb.de/med_fak/physiol2/disa/seed/stor.htm Hicks, A. 2000. Asymbiotic technique of orchid seed germination. Huber, R. (Ed.) Orchid Seed Bank Project (OSP). US. 135 p. Höhne, C. 1995. Producción de orquídeas por medio de semilleros estériles. Manual de Ornamentales Tropicales. Cortés, HN. p. 55-65.

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Lock J.M.; Profita, J.C. 1975. Pollination of Eulophia cristata (Sw.) Steud. (Orchidaceae) in Southern Ghana. Acta Botanica Neerlandica 24:135-138. Meyers Conservatory. 1999. Capsule drying and seed preparation (en línea). Consultado el 16 de marzo del 2001. Disponible en http://www.troymeyers.com Ossenbach, C. 2001. Almacenamiento de semillas de diferentes especies de orquídeas para su conservación en un banco de germoplasma. Proyecto de Graduación, Licenciado Ingeniero Agrónomo. Universidad EARTH. Guácimo, CR. 82 p. Seaton, P. 2000. Growing orchids from seed. Part 1: Seed storage. Orchid Review 108: 55-110.