Prácticqa1.− Preparación de disoluciones y medios fisiológicos I.− Introducción El objetivo de esta práctica es crear una disolución tampón de unas determinadas características y comprobar su capacidad tamponadora. Un tampón permite que el pH de una disolución se mantenga estable, haciendo que necesarias grandes cantidades de ácidos o bases para modificar el pH. Esto tiene gran utilidad en los seres vivos permitiendo que los procesos metabólicos se puedan realizar sin que den lugar a cambios bruscos de pH que resultaría fatal para el organismo. Bibliografía consultada: Guión de prácticas II.− Parte experimental Para esta práctica hemos usado los siguientes productos e instrumentos: • Preparación del tampón − Comprobación de la capacidad tamponadora KH2PO4 (fosfato monopotásico) Tampón fosfato 0,1 M, pH 7,0 K2HPO4 (fosfato bipotásico) Agua destilada Agua destilada HCl 0,2 N Papel de pesar NaOH 0,2 N Vaso de precipitado Naranja de metilo Barra magnética Fenolftaleina Probeta graduado matraz Soporte con pinzas Pipetas Pasteur Pipetas graduada de vidrio (Trimex VQI) + Pera Ácido clorhídrico y potasa concentrada Bureta recta Espátula Vaso de precipitado Barra magnética Instrumentos: Granatorio (Precisa 310M) pHmetro (Basic20T Crisun) Magnetoagitador (SBS A−06) Procedimiento:

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a) Preparación del tampón: − Pesamos en el granatorio (colocando previamente un papel de pesar y tarando el granatorio una vez colocado el papel) 0,605 g de K2HPO4 y 0,835 g de KH2PO4. − Ponemos en un vaso de precipitado 80 ml de agua destilada y añadimos las cantidades anteriormente pesadas de K2HPO4 y KH2PO4. − Metemos la barra magnética en la mezcla y ponemos el vaso de precipitado encima del magnetoagitador para que se mezcle todo bien − Mientras se mezcla la disolución, calibramos el pHmetro con las dos disoluciones patrón. − Una vez calibrado, usamos el pHmetro en nuestra disolución y anotamos el pH marcado (6,67) − En función del pH obtenido añadimos ácido clorhídrico o potasa concentrada gota a gota y mientras se sigue mezclando con la barra magnética. Vamos añadiendo hasta conseguir el pH pretendido (7,0) − Introducimos la disolución en una probeta graduada y enrasamos con agua destilada hasta 100 ml. b) Comprobación de la capacidad tamponadora: − Añadimos 5 gotas de naranja de metilo a 20 ml de tampón en un vaso de precipitados que colocaremos con la barra magnética en el agitador magnético. − En una bureta colocamos HCl 0,2 N y abrimos para que vaya cayendo gota a gota hasta observar que la disolución cambia de color. En cuanto cambia de color cerramos la llave reguladora y medimos el volumen que hemos usado. − Repetimos el mismo proceso con 5 gotas de naranja de metilo y 20 ml de agua destilada − También repetimos el mismo proceso con NaOH 0,2 N en el agua y el tampón junto con las 5 gotas de naranja de metilo. − Utilizaremos también el procedimiento anterior con 5 gotas de Fenolftaleina en vez de naranja de metilo − Resumiendo, tendremos que hacer 8 veces el mismo proceso: − HCl + Agua destilada + Naranja de metilo − NaOH + Agua destilada + Naranja de metilo − HCl + Tampón + Naranja de metilo − NaOH + Tampón + Naranja de metilo − HCl + Agua + Fenolftaleina − NaOH + Agua destilada + Fenolftaleina − HCl + Tampón + Fenolftaleina − NaOH + Tampón + Fenolftaleina III.− Datos y cálculos Pm K2HPO4 = 174,18 g/mol Pm KH2PO4 = 136,09 g/mol

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pKa = 7,21

!

!

! [K2HPO4] = 0,038 moles/l Pm (K2HPO4) =174,18 g/mol 100 ml ! m= 0,6048g [KH2PO4] = 0,062 moles/l Pm (KH2PO4) =136,09 g/mol 100 ml ! m = 0,8338 g Volúmenes obtenidos en la comprobación de la capacidad tamponadora: • HCl para tampón + naranja de metilo = 7,7 ml • HCl para agua destila + naranja de metilo = 0,2 ml • NaOH para tampón + Fenolftaleina = 4,4 ml • NaOH para agua destilada + Fenolftaleina = 0,1 ml Con los 4 compuestos restantes, HCl + Fenolftaleina y NaOH + naranja de metilo por mucho que añadamos no produce cambio. Los datos parecen correctos ya que se adecuan a lo que suponíamos que iría a pasar según los conocimientos teóricos. En la comprobación de la capacidad tamponadora hemos observado lo siguiente: − HCl + naranja de metilo: El tampón ha necesitado mucho mayor volumen de ácido que con el agua destilada para que la disolución cambiara a color rojo, esto se debe a la capacidad tamponadora del tampón. − HCl + Fenolftaleina: La disolución es incolora, y al pasarla a forma ácida conserva su "incoloridad", por lo que no observaremos cambio en el color de la disolución por mucho HCl que añadamos. − NaOH + naranja de metilo: Pasa lo mismo que en el punto anterior, tanto el tampón como el agua no cambian de color por mucho NaOH que añadamos. Esto se debe a que en su forma básica la muestra ya es amarilla y añadiendo más base, no se modificara el color − NaOH + Fenolftaleina: Ocurre los mismo que en el primer punto, mientras que el tampón ha necesitado una cantidad considerable de NaOH para cambiar a color rosa, el agua solo ha necesitado una gota. Podemos concluir que, tras comprobar la capacidad del tampón, este es efectivo y tampona. Práctica 2.− Diluciones seriadas de muestras y posterior cuantificación I.− Introducción 3

El objetivo de esta práctica es el de mediante diluciones seriadas y análisis de absorbancias, crear una recta de calibrado a partir de la cual, conocer la concentración una muestra problema La disolución seriada en una serie de diluciones que se preparan una a partir de la anterior. Conociendo la absorbancia de de un determinado compuesto podemos saber su concentración ya que existe una relación entre ellos según la Ley de Lambert−Beer: Interpolando el valor de la absorbancia de la muestra problema en la recta de calibrado obtenida a partir de las diluciones seriadas, conoceremos la concentración de la muestra problema Bibliografía consultada: Guión de prácticas II.− Parte experimental Para esta práctica hemos usado los siguientes productos e instrumentos: Azul de Coomassie (0,1 mg/ml) Agua destilada Tubos de ensayo Pipeta graduada de vidrio + pera Gradilla Cubeta espectrofotométrica Instrumentos: Vortex (HeidolpH reax 2000) Espectrofotómetro (Spectro 22, LaboMed, inc.) Procedimiento: − Completar la tabla del guión de prácticas Nº tubo 1 2 3 4 5 6 7 8

Dilución 0 2 5 10 20 50 100 Blanco

Agua (ml) − 3 3,6 3 3 3,6 3 6

Azul (ml) 6 3 2,4 3 3 2,4 3 −

mg/ml 0,1 0,05 0,02 0,01 0,005 0,002 0,001 0

Absorbancia a 580 0,74 / 0,775 0,747 / 0,763 0,542 / 0,644 0,347 / 0,376 0,183 / 0,212 0,109 / 0,102 0,053 / 0,057 0

Absor. Media 0,758 0,755 0,593 0,362 0,198 0,106 0,055 0

De momento, y con los datos iniciales dados, podemos hallar todos los datos menos los de las columnas de absorbancias.

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− Todos los tubos se rellenaran por duplicado con la ayuda de una pipeta graduada de vidrio. Todas deben tener un total de 6 ml, siguiendo los datos obtenidos en la tabla. El hecho de que hagamos todos los tubos por duplicado (excepto el de agua sola) es para contrarrestar un posible error en la realización del experimento; teniendo dos resultados, si uno de ellos nos da exageradamente lejano de lo que nos venia dando hasta el momento, podemos descartar ese resultado como erróneo − Una vez mezclados en el tubo, los terminaremos de mezclar en el vortex. − A continuación tenemos que calibrar el espectrofotómetro, esto lo hacemos metiendo la cubeta vacía, y el resultado que nos de, lo calibramos como 0. − Una vez calibrado, empezamos a medir las absorbancias de todas nuestras preparaciones y la de la muestra problema, y anotamos los resultados. Una vez tenemos los datos, hacemos la media y en función de esta podemos ya construir la recta de calibrado en función de la cual vamos a hallar la concentración de la muestra problema, extrapolando su absorbancia en la recta de calibrado Absorbancia muestra problema: 0,748 y a partir de este valor interpolaríamos y obtendríamos su concentración en proteína. III.− Datos y cálculos Para completar las columnas seguiremos los siguientes métodos: − Columna de concentraciones mg/ml: Dividiremos la concentración inicial entre los valores de la columna dilución − Columna de azul (mg): Usaremos la formula M·V = M·Vfinal 0,1·V = 0,05·6 ! V azul = 3 0,05·V = 0,02·6 ! V azul = 2,4 0,02·V = 0,01·6 ! V azul = 3 0,01·V = 0,005·6 ! V azul = 3 0,005·V = 0,002·6 ! V azul = 2,4 0,002·V = 0,001·6 ! V azul = 3 − Columna de agua: Restamos el Vfinal − los resultados de la columna Azul − Columna absorbancia media: Hacemos la media aritmética de los valores obtenidos en el espectrofotómetro. El resultado de absorbancia de la muestra problema nos ha dado un valor que si lo interpolamos a la grafica, nos da en la zona curva, con lo que no seria muy fiable hacer la medida. Para obtener un resultado con menos error, deberíamos diluir la muestra problema para conseguir situarla en la zona recta y luego en función de cuantas veces la hallamos diluido, multiplicar para obtener el resultado real de la concentración den proteína la disolución, así habríamos alcanzado el objetivo propuesto.

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Práctica 4.− Liofilización y Diálisis Liofilización I.− Introducción El objetivo concreto de esta práctica es el de obtener leche en polvo a partir de de leche en estado líquido. Utilizaremos un liofilizador que nos permite pasar una muestra congelada a estado sólido sin que pase antes por estado líquido. Bibliografía consulta: Guión de prácticas II.− Parte experimental Para esta práctica hemos usado los siguientes productos e instrumentos: Solución proteica (40 mg/ml) (leche) Tubos de ensayos especiales para liofilización Nitrógeno líquido Micropipeta Parafilm Aguja Vaso de liofilización Instrumentos: Liofilizador (Teslar Lioalfa − 6) Procedimiento: − Tomamos con una micropipeta los volúmenes de leche indicados en el guión y los introducimos en los tubos de ensayo especiales para liofilizar. − Tapamos los tubos con Parafilm y perforamos el mismo con una aguja una par de veces. − Metemos el tubo en nitrógeno líquido para congelarlo − Una vez congelados, colocamos los tubos en el vaso liofilizador y lo dejamos el tiempo necesario. III.− Datos y cálculos Concentración de la solución proteica 40 mg/ml • Para 30 mg ! Tubo 1 40 mg ! 1 ml 30 mg ! x ml 6

Tubo 1 = 0,75 ml = 750 l • Para 10 mg ! Tubo 2 40 mg ! 1 ml 10 mg ! x ml Tubo 2 = 0,25 ml = 250 l Al sacar los tubos al día siguiente observamos que no nos ha dado el mismo resultado el mismo resultado. En el que se congelo correctamente, observamos un polvillo blanco en el fondo. En el otro que no se congelo correctamente, observamos una capa de polvos adherida a la pared y unas fibrillas en la zona central del tubo. Diálisis I.− Introducción El objetivo de esta práctica es el de separar los componentes de una disolución (proteínas) de diferente tamaño mediante un proceso de diálisis. La diálisis es un proceso que permite separar moléculas según su tamaño, haciéndolas pasar a trabes de una membrana porosa. Si tenemos la muestra en una bolsa de diálisis, al introducirla en un medio líquido, por osmosis ciertas moléculas son capaces de atravesar la bolsa y salir de ella, entrando en la bolsa moléculas de agua. Bibliografía consultada: Guión de prácticas II.− Parte experimental Para esta práctica hemos usado los siguientes productos e instrumentos: Disolución acuosa de azul de dextrano y ferricianuro potásico (3 mg/ml) Bolsas de diálisis (Medicell International) Vaso de precipitados de 5 litros Barra magnética Goma elástica Agua destilada Pipeta graduada de vidrio (Trimex VQI) + Pera Pipeta Pasteur Cinta adhesiva Instrumentos: Agitador magnético (SBS A − 06)

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Procedimiento: − Echar agua destilada en un vaso de precipitados grande e introducir la bolsa de diálisis para que se vaya abriendo. − Una vez abierta hacer un nudo en uno de los extremos de la bolsa − Pipetear 2 ml de la mezcla en un tubo de ensayo, y a continuación introducirlos en la bolsa mediante una pipeta Pasteur por el extremo abierto − Cerrar el extremo abierto de la bolsa haciendo un nudo, y atándolo con la goma elástica; y con la precaución de que quede un poco de aire dentro de la bolsa para que esta flote, y que haya espacio para que pueda entrar el agua. − Introducir la bolsa atada con la goma en el vaso de precipitados con agua y sujetar la goma al borde del vaso de precipitados con cinta adhesiva − Introducir la barra magnética y colocar el vaso en el agitador magnético − Cambiar el agua del vaso varias veces y dejarlo hasta el día siguiente. III.− Datos y cálculos Observamos que nuestra muestra, inicialmente, es de un color verde azulado. Tras un cierto tiempo de estar la bolsa dentro del agua se observa que al agua se torna de un color amarillento, y al día siguiente el contenido de la bolsa es de color azul. Viendo este cambio de color nos indica que los componentes de la mezcla inicial se has separado ya que el azul de dextrano es azul y el ferricianuro potásico es amarillo. Práctica 5.− Precipitación de proteínas I.− Introducción El objetivo de esta práctica es observar la precipitación de proteínas mediante el método de la centrifugación y la precipitación por salado. La centrifugación es un proceso que nos permite precipitar sustancias dependiendo del campo centrífugo aplicado y del coeficiente de sedimentación de dichas moléculas El sulfato amónico ayuda a formar agregados de proteínas que posteriormente precipitaran. Bibliografía consultada: Guión de prácticas II.− Parte experimental Para esta práctica hemos usado los siguientes productos e instrumentos: Hemoglobina (sigma) disuelta en agua a 2 mg/ml Sulfato amónico (NH4)2 SO4 Espátula

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Papel de pesar Agua destilada Barra magnética Vaso de precipitados Tubo de centrifuga Pipeta Pasteur Pipeta graduada de vidrio (Trimex VQI) + pera Barreño con hielo Instrumentos: Granatorio (Precisa 310M) Magnetoagitador (SBS A−06) Centrífuga (P. Selecta) Procedimiento: − Pipetear con una pipeta de vidrio 5 ml de la disolución de hemoglobina en un vaso de precipitado y colocarlo en un barreño con hielo − Pesar 0,57 g de sulfato amónico en el granatorio, previa taración (con un papel de aluminio) − Introducir la barra magnética en el vaso de precipitados y colocar el barreño encima del agitador magnético − Añadir poco a poco con la espátula el sulfato amónico en el vaso con la hemoglobina − Cuando este todo bien disuelto, pipetas con una pipeta Pasteur en un tubo de centrífuga − Tarar en el granatorio un vaso de precipitados y pesar el tubo de centrifuga con la disolución − Colocar un tubo de centrifuga en el granatorio e ir introduciendo agua hasta que peso lo mismo que el que contiene la disolución − Introducir los dos tubos enfrentados en la centrífuga y centrifugar durante 10 min. a 5000 rpm. − Al terminar el centrifugado, recoger el sobrenadante y medir su volumen. − Calcular la cantidad de sal que hay que añadir para obtener el 85 % de saturación pedido en el guión. − Repetir el mismo proceso antes descrito: mezclarlo bien, pesarlo, coger otro tubo con el mismo peso y centrifugar. III.− Datos y cálculos Porcentaje de saturación obtenido con los 0,57 g de sal: 9

0,57 g ! 5 ml x g ! 1000 ml x = 114 g/l ! S2 = 20,099 % Sobrenadante obtenido tras la primera centrifugación: 4,3 ml Cantidad de sal para un porcentaje de saturación del 85 % ! g = 464, 32 g/l 464,32 g ! 1 litro x g ! 4,3 ml x = 1,997 g En los resultados podemos observar que dependiendo del porcentaje de saturación que se quiera obtener la cantidad de sal que hay que añadir varía; a mayor porcentaje, más sal. A medida que vamos centrifugando la muestra va perdiendo color que se queda en las proteínas. La muestra inicial tiene un tono ocre, tras la primera centrifugación tiene un color rojo oscuro; tras la segunda centrifugación el sobrenadante tiene un color rojo mucho más suave Gracias a la precipitación por salado y a la centrifugación hemos conseguido precipitar las proteínas de la muestra biológica dada. Actividades complementarias 1.− Usaría como compuestos de la disolución el NaHCO3 y el Na2CO3 ya que son los que tienen el pKa más cercano al pH que nos pide el ejercicio. Para hallar las masas de cada compuesto usaría el siguiente sistema de ecuaciones: !!! [AH] = 0,282 moles/l Pm (NaHCO3) =83,99 g/mol 250 ml ! m = 5,921 g [A−] = 0,017 moles/l Pm (Na2CO3) =105,99 g/mol 250 ml ! m = 0,450 g Meteríamos estas cantidades en 220 ml de disolvente aprox., e iríamos añadiendo ácido o base en función del pH que nos resultara de la mezcla inicial, y cuando tuviéramos el pH que buscábamos (9,0) añadiríamos el disolvente necesario para llegar a los 250 ml. 2.− Elegiría la opción a. Ácido acético y acetato sódico, ya que son los que tienen el pKa más cercano al pH que nos piden. Para hallar la proporción usaría la siguiente formula:

!

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g/l ! g para 10 ml de disolución = 4,3 g 9.− Separaría el Citocromo C de las otras dos proteínas mediante diálisis. Y la Albúmina de la Hemoglobina mediante precipitación por sales y centrifugación. Las concentraría mediante liofilización, ya que al quitar el disolvente quedarían totalmente concentradas. El volumen de tampón fosfato que debería añadir para tenerlas a una concentración de 12 mg/ml es: − Para Albúmina − Para Hemoglobina − Para Citocromo C La concentración (12 mg/ml) en moles es la siguiente 12 mg = 0,012g − Para Albúmina: 0,012/68,5 = 1,75·10−4 moles/ml *1000 ml/l = 0,175 moles/l − Para Hemoglobina: 0,012/64,5 = 1,86·10−4 moles/ml *1000 ml/l = 0,186 moles/l − Para Citocromo C: 0,012/12,5 = 9,6·10−4 moles/ml *1000 ml/l = 0,96 moles/l La técnica que utilizaría para eliminar las sales de sulfato amónico que precipitan junto con las proteínas sería, echar suficiente sales para que precipitaran todos los compuestos, centrifugar y quitar el sobrenadante, donde están las sales. 1

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