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Fundación Produce Sinaloa, A.C.

Tratamiento biológico contra virus de la mancha blanca en camarón Antonio Luna González1

1 Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR), unidad Sinaloa, del Instituto Politécnico Nacional. 2

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Índice INTRODUCCIÓN….........……………………………........7 El camarón estresado es más susceptible a enfermedades virales……….........................................7 Probióticos, una alternativa contra el virus de la mancha blanca……………….........................................8 Justificación del proyecto……………………………….9 Objetivos del proyecto………………………………......9 METODOLOGÍA APLICADA…………………………......9 Liofilización de los microorganismos con potencial probiótico…………….....................................................9 Determinación de la viabilidad y conteo de unidades formadoras de colonia..................................9 Incorporación de la mezcla probiótica al alimento balanceado para experimento en granja.....................9 Análisis del sistema inmune de camarones (ensayo en laboratorio)………..................................................10 Monitoreo del virus de la mancha blanca en camarones experimentales de granja........................10 Evaluación del alimento con mezcla probiótica en camarones cultivados….............................................10 RESULTADOS..............................................................11 CONCLUSIONES…………………………………….......16 BIBLIOGRAFÍA……………………………………….......17

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INTRODUCCIÓN En el presente folleto encontrará información sobre la estimulación del sistema inmune2 de camarones blancos portadores del virus del síndrome de la mancha blanca, con bacterias ácido lácticas3 nativas de Sinaloa adicionadas al alimento de los crustáceos. El estudio se efectuó en una granja comercial del municipio de Guasave. El objeto de la investigación fue observar en campo si los microorganismos inmunoestimulan a los camarones, como sucedió en un experimento en laboratorio, donde los camarones tratados con bacterias ácido lácticas resultaron negativos al virus de la mancha blanca, con mejor supervivencia y su peso no fue afectado. En los estanques de la granja donde se realizó el estudio también se determinó la temperatura, pH, oxígeno disuelto y la salinidad del agua. La información que se presenta en este folleto pertenece a los resultados del proyecto Inmunoestimulación de camarones (Litopenaeus vannamei) infectados con el virus de la mancha blanca en granjas del municipio de Guasave, Sinaloa, apoyado por Fundación Produce Sinaloa, A. C., durante 2008-2009 a través de su Consejo Consultivo zona norte. El camarón estresado es más susceptible a enfermedades virales La salud de las especies acuáticas está influida por interacciones que tienen con el medio ambiente y con patógenos. 2 De inmunidad: estado de resistencia, natural o adquirida, que poseen ciertos individuos o especies frente a determinadas acciones patógenas de microorganismos o sustancias extrañas. 3 Microorganismos que se emplean para prevenir la infección de patógenos. 6

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El cultivo de camarón puede degradar el medio ambiente y causar un significativo estrés en la especie, con lo que se vuelve más susceptible a enfermedades. En los sistemas de producción de camarón, muchos patógenos4 (como bacterias, hongos y virus) coexisten sin causar un impacto negativo en la producción; sin embargo, algunas infecciones inactivas pueden desarrollarse en enfermedades agudas si el camarón está estresado, lo que provoca pérdidas significativas en la industria. Dentro de las enfermedades que afectan al camarón, las virales tienen gran importancia porque pueden provocar mortalidades masivas. El virus de la mancha blanca (WSSV, por sus siglas en inglés) es en la actualidad uno de los patógenos más importantes en el cultivo de camarones peneidos en el estado de Sinaloa, en cuanto a mortalidades se refiere. Una alterativa contra el virus de la mancha blanca en camarón es el uso de bacterias benéficas que inmunoestimulen al crustáceo para que se pueda defender de los patógenos, especialmente cuando las condiciones ambientales le son desfavorables, como los cambios bruscos de temperatura y salinidad del agua.

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La finalidad de este proyecto es probar estas cepas en granjas comerciales para determinar si los resultados obtenidos en laboratorio se repiten en las condiciones reales de cultivo. Justificación del proyecto El presente trabajo de investigación tiene como fin el mejoramiento del cultivo de camarón blanco en Sinaloa. Como se mencionó anteriormente, el problema de las enfermedades virales en los cultivos, especialmente la mancha blanca, provoca pérdidas que pueden motivar desde la disminución de la superficie cultivada hasta el cierre de granjas: según autoridades de Guasave, en el municipio existen 3 mil hectáreas de estanquería de camarón abandonadas, de las que se desconoce cuántas fueron cerradas por motivos de infecciónes virales. En el aspecto social, el cultivo de camarón representa una alternativa de empleo a pescadores ribereños sinaloenses que han resultado golpeados por la baja en la pesca del crustáceo. Objetivos del proyecto 1. Estimular el sistema inmune de camarones portadores del virus del síndrome de la mancha blanca con bacterias ácido lácticas adicionadas al alimento de los crustáceos. 2. Mejorar la producción de granjas camaroneras de Guasave con problemas de virus de mancha blanca.

Probióticos5, una alternativa contra el virus de la mancha blanca En acuicultura, el término probiótico se define como un suplemento microbiano formado por un cultivo simple o mixto de microorganismos seleccionados que son adicionados en los sistemas de producción, con el propósito de reducir o eliminar la incidencia de comunidades microbianas dañinas. En los camarones peneidos se han probado probióticos en cultivos larvarios, juveniles y adultos: los resultados han sido un mejor crecimiento, supervivencia y capacidad inmune. Sin embargo, los probióticos comerciales que se utilizan actualmente en Sinaloa son caros y poco efectivos porque fueron aislados y probados en otros países, con condiciones ambientales diferentes a las nuestras. Para garantizar la eficacia de probióticos en el estado es necesario aislar microorganismos de la región. En el Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR), unidad Sinaloa, se aislaron y probaron (en el alimento) cinco cepas6 de bacterias ácido lácticas (LTA2, LTA6, LTA8, LTA10 y LT6) en camarones blancos (Litopenaeus vannamei) cultivados en laboratorio e infectados con el virus de la mancha blanca. Las bacterias inmunoestimularon a los camarones, el resultado fue cero camarones positivos al virus de la mancha blanca, mejor supervivencia y su peso no fue afectado.

METODOLOGÍA APLICADA Liofilización7 de los microorganismos con potencial probiótico. Las bacterias ácido lácticas (mezcla probiótica) se cultivaron en el medio Man, Rogosa & Sharp con los nutrientes sacarosa (como fuente de carbono), proteínas y minerales para su buen crecimiento, posteriormente se secaron en frío para obtener un polvo con bacterias vivas. Determinación de la viabilidad y conteo de unidades formadoras de colonia. Para conocer si las bacterias liofilizadas se mantenían vivas, inmediatamente después de la liofilización, y cada 15 días (por al menos tres meses), se determinó la viabilidad de los microorganismos. Incorporación de la mezcla probiótica al alimento balanceado para experimento en granja. La preparación del alimento (Purina) con bacterias liofilizadas consistió en agregar 2 millones de células bacterianas (400 mil de cada una de las cinco cepas) por gramo de alimento. El alimento con bacterias activas liofilizadas se preparó cada día en campo, al momento de la alimentación; se efectuó una suspensión bacteriana en “Dry Oil” (‘producto que sirve como ligante y atractante

4 Microorganismos causantes de enfermedades. 5 Microorganismos con efecto benéfico para la salud porque regulan la flora intestinal y potencian el sistema inmunológico. 6 Grupo de organismos dentro de una especie o variedad.

7 Operación que permite conservar, en este caso en bacterias todas sus propiedades mediante congelación. A través de la congelación los microorganismos pierden humedad y se transforman en polvos ultraligeros.

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para agregar bacterias o antibióticos al alimento‘). La mezcla se colocó en una lona de plástico (en el suelo), se agregaron las bacterias por aspersión y se agitó para homogeneizar. El alimento se secó al sol por 15 minutos, sin dejar de revolver para que el secado fuera homogéneo. También se utilizaron bacterias muertas por calor (a 70 OC) bajo las mismas concentraciones y condiciones mencionadas en el párrafo anterior, para agregarlas al alimento. Análisis del sistema inmune de camarones (ensayo en laboratorio). Este experimento duró seis días; se realizó en tinas con 80 litros de agua de mar filtrada. En cada tina se colocaron 10 camarones de 6 a 8 gramos cada uno. Se utilizaron tres tratamientos por triplicado: 1) camarones alimentados con Camaronina más Dry Oil; 2) Camaronina más Dry Oil más mezcla probiótica liofilizada (bacterias vivas); y 3) Camaronina más Dry Oil más mezcla probiótica secada a 70 OC (bacterias muertas). Monitoreo del virus de la mancha blanca en camarones experimentales de granja. Para seleccionar la granja de trabajo se analizaron 40 organismos en cuatro estanques (ver Cuadro 3) mediante la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa8 (PCR, por sus siglas en inglés), que consiste en la amplificación de un segmento específico del genoma del virus de la mancha blanca. Evaluación del alimento con mezcla probiótica en camarones cultivados. El experimento duró aproximadamente 30 días; se realizó en los cuatro estanques evaluados. Antes de empezar el estudio se efectuó un monitoreo del virus de la mancha blanca en camarones, con el objeto de observar si los crustáceos estaban infectados. También se pesaron 30 camarones de cada estanque por muestreo, capturados al azar (a partir del inicio del experimento) en diferentes zonas de los estanques. En los estanques 12 y 13 se probó el alimento con la mezcla probiótica, mientras que en el 14 y 15 se empleó el alimento sin la mezcla probiótica. Durante la investigación se respetó el manejo tradicional de la granja y la manera de alimentación de los crustáceos. En los estanques también se determinó la temperatura, pH, oxígeno disuelto y la salinidad del agua al inicio del experimento y cada 10 días.

8 La polimerasa es una enzima que participa en el proceso de duplicación del material genético, y que en la técnica de PCR se le emplea para aumentar el número de copias del virus que se estudia y así facilitar su detección. 10

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Figura 1. Liofilización de bacterias ácido lácticas.

RESULTADOS Liofilización de las cepas de bacterias ácido lácticas para la prueba de viabilidad. La liofilización de las cepas de bacterias ácido lácticas (ver Figura 1) fue un éxito porque después de 22 días de haber sido liofilizadas se tenía un número aceptable de células viables (vivas): por ejemplo, en la cepa LTA2, a temperatura ambiente, en el día uno se contaba con aproximadamente 13 mil millones de células viables, mientras que en el día 22 se poseían aproximadamente 5 mil millones de células viables; esto significa que el productor puede tener células viables en número suficiente para añadir al alimento (ver Cuadros 1 y 2).

Cuadro 1. Liofilización de bacterias ácido lácticas en el día 1. Cepa

Unidades formadoras de colonia por gramo en temperatura ambiente

LTA2

13 mil millones

LTA6

17 mil millones

LTA8

37 mil millones

LTA10

2 mil millones

LT6

Mil millones 11

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inmunoestimulaban a los camarones tratados, de la misma forma que lo hacen las bacterias vivas (liofilizadas). En el ensayo también se incluyó un tratamiento con bacterias vivas para comparar los resultados de Control I (Camaronina más Dry Oil).

Figura 2. Sembrado de cepas liofilizadas después de las diluciones seriadas decimales.

Células por mililitro (X 100,000)

300

b

b

250 200 a

150 100 50 0 I

Cuadro 2. Prueba de viabilidad después del liofilizado en el día 22.

II

III

Tratamientos

Cepa

Unidades formadoras de colonia por gramo en temperatura ambiente

Unidades formadoras de colonia por gramo en temperatura ambiente

LTA2

5 x 109

5 mil millones

I (Camaronina® más Dry Oil); II (Camaronina® más Dry Oil más bacterias ácido lácticas vivas); III (Camaronina® más Dry Oil más bacterias ácido lácticas muertas). Superíndices distintos indican diferencias significativas (P