U n i v e r s i d a d d e C o l i m a

Universidad de Colima FACULTAD DE MEDICINA CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS “Efecto de la glibenclamida sobre la fatiga en músculo

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Universidad de Colima FACULTAD DE MEDICINA CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS

“Efecto de la glibenclamida sobre la fatiga en músculo esquelético lento de pollo”

TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE DOCTORA EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS CON ESPECIALIDAD EN FISIOLOGÍA

PRESENTA:

M. en C. MARIA FELIPA ANDRADE URZUA

ASESOR: DRA. XÓCHITL A. R. TRUJILLO TRUJILLO CO-ASESOR: DR. MIGUEL HUERTA VIERA

COLIMA, COLIMA, ABRIL DE 2004.

DEDICATORIA

A mi María Fernanda

AGRADECIMIENTOS

A mis padres, por su amor y por el apoyo incondicional que me han brindado.

A la Dra. Xóchitl Trujillo y al Dr. Miguel Huerta por guiarme y presionarme durante todo este tiempo para poder ver terminado el trabajo que parecía interminable.

A los integrantes del jurado por todas sus sugerencias para enriquecer el presente trabajo.

A EASP por todo su apoyo para la realización de este trabajo.

A Yoyi, Dora, Gab, Adrián, Héctor, Taniushka y al cuatito porque han estado conmigo aún en los momentos más difíciles.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) y al Fondo Juan García Ramos por el apoyo económico para la realización de esta tesis.

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INDICE

RESUMEN....................................................................................................................1 ABSTRACT..................................................................................................................2 INTRODUCCIÓN..........................................................................................................3 a) Inervación de las fibras musculares esqueléticas..............................................4 b) Respuesta mecánica a un estímulo químico.......................................................4 c) Respuesta mecánica a un estímulo eléctrico......................................................5 1) Fibras musculares de sacudida lenta o tipo I...........................................5 2) Fibras musculares de sacudida rápida o tipo IIa......................................6 3) Fibras musculares de sacudida rápida o tipo IIb......................................6 d) Suma de contracciones y contracción tetánica.................................................9 e) La fatiga muscular.................................................................................................9 f) El ATP como un factor limitante de la fuerza muscular.....................................11 g) Canales K ATP..........................................................................................................12 h) Papel del calcio en la fuerza muscular...............................................................13 i) Canal KATP en el músculo esquelético y su papel en la fatiga y justificación de su estudio..................................................................................................................15

HIPÓTESIS.................................................................................................................18

OBJETIVO GENERAL...............................................................................................18

METODOLOGÍA.........................................................................................................19 a) Registro mecánico................................................................................................19 1) Contracturas inducidas por alto potasio.................................................20 2) Caracterización del modelo experimental de fatiga en el músculo lento del pollo …………………………………………………………………………………….20

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3) Contracturas inducidas por cafeína.........................................................22 b) Análisis de datos..................................................................................................22 c) Obtención de vesículas sarcolemales de músculo lento ALD.........................22 d) Cultivo primario de células musculares esqueléticas lentas...........................24 e) Registro de corrientes iónicas............................................................................26 f) Soluciones.............................................................................................................26

RESULTADOS...........................................................................................................28 1. Efectos de la glibenclamida sobre la sacudida en el músculo lento fatigado......................................................................................................................28 2. Efectos de la glibenclamida sobre el tétanos en el músculo fatigado............30 3. Efectos de la glibenclamida sobre las contracturas por cafeína en las fibras musculares lentas.....................................................................................................34 4. Efecto de la glibenclamida durante la inhibición metabólica inducida por cianuro en las fibras musculares lentas.................................................................36 5. Registro de corrientes unitarias en vesículas sarcolemales y en células cultivadas de músculo lento....................................................................................38

DISCUSIÓN................................................................................................................42

CONCLUSIONES.......................................................................................................47

REFERENCIAS..........................................................................................................48

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RESUMEN En la presente tesis se diseñó un modelo de fatiga in vitro para el músculo esquelético lento de pollo. El músculo lento en contraste con el músculo rápido, es resistente a la fatiga. En este tipo de músculo existen pocos estudios en relación con el fenómeno de la fatiga muscular. Por lo cual nos propusimos investigar la posible participación de los canales de potasio sensibles a ATP (K ATP) en el proceso de fatiga muscular. Se ha propuesto que estos canales KATP participan en isquemia en el sistema nervioso y en la fatiga en músculo rápido. Nos enfocamos a estudiar los efectos de la glibenclamida (una sulfonilurea antidiabética que bloquea los canales KATP) sobre la tensión de la sacudida única y el tétanos en músculo esquelético lento anterior latissimus dorsi inducido a fatiga. Los resultados muestran que la glibenclamida incrementa la tensión del músculo fatigado. También, el músculo lento fue expuesto a envenamiento metabólico inducido por cianuro, condición bajo la cual se inhibe la formación de ATP por lo cual disminuye su concentración intracelular y por consiguiente se activa el canal KATP, esto hace que la tensión muscular disminuya. La adición de glibenclamida en esas condiciones inhibió el efecto producido por el cianuro. Se estudió el posible papel del calcio intracelular mediante el efecto de la glibenclamida sobre las contracturas inducidas por cafeína, que se sabe libera calcio del retículo sarcoplásmico; encontrando que la glibenclamida incrementa la tensión de estas contracturas. Por otro lado, con el objeto de determinar la presencia de canales KATP en la membrana de estas células de fibras lentas de pollo se registraron corrientes iónicas en condiciones simétricas de potasio (172 mM) mediante la técnica de fijación de voltaje en áreas pequeñas de membrana (patch clamp), en vesículas de membrana de fibras musculares lentas y en células en cultivo primario procedentes de músculo lento. La presencia de glibenclamida no bloqueó las corrientes unitarias registradas. En conclusión, los resultados obtenidos en esta tesis muestran evidencia indirecta de la participación de canales KATP en el proceso de fatiga, puesto que la glibenclamida incrementó la tensión de la sacudida y el tétanos en el músculo lento fatigado de pollo. Este efecto está mediado por un incremento en la liberación de calcio del retículo sarcoplásmico.

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ABSTRACT In the present thesis, we designed an in vitro model of fatigue for chicken slow–twitch skeletal muscle. The slow-twitch muscle in contrast to the fast-twitch, is fatigueresistant. In this muscle type there exist a few studies related to the muscle fatigue phenomena. By this, we have proposed to investigate the possible participation of the ATP-sensitive potassium channels (K ATP) in the muscle fatigue process. It has been proposed that these KATP channels participate in ischemia in nervous system and in fatigue in the fast-twitch skeletal muscle. We focus to study the effects of glybenclamide (an antidiabetic sulphonylurea that blocks KATP channels) on twitch and tetanus tension in the anterior latissimus dorsi slow muscle induced to fatigue. The results show that glybenclamide increases tension in the fatigued muscle. Too, the slow muscle was exposed to metabolic venom by cyanide, a condition in which the ATP formation is inhibited and when its intracellular concentration is diminished, consequently, KATP channels are activated which in turn produces a reduction in muscle tension. The addition of glybenclamide in these conditions abolished the effect produced by cyanide. In addition, we studied the possible role of intracellular calcium by the effects of glybenclamide on the contractures evoked by caffeine, which as is known release calcium from sarcoplasmic reticulum; finding that glybenclamide increases tension in these conditions. In the other hand, with the aim to determine the presence of KATP channels in the membrane of these chicken slow fibers we recorded ionic currents in symmetric potassium conditions (172 mM) by the patch clamp technique in membrane vesicles derived from slow muscle fibers and in cells in primary culture proceeding from slow muscle. The presence of glybenclamide did not block the recorded unitary currents. In conclusion, the results obtained in this thesis show an indirect evidence of the participation of KATP channels in the fatigue process, since the glybenclamide increased twitch and tetanus tension in chicken fatigued slow muscle. This effect is mediated by an increase in the calcium release form sarcoplasmic reticulum.

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INTRODUCCIÓN La contracción muscular es un mecanismo que hace posible el movimiento (desplazamiento corporal) y el mantenimiento de la postura. El tejido responsable de esta función es el músculo esquelético. Cada músculo se une al esqueleto a través de los tendones y en conjunto forma la musculatura somática, que es la de mayor proporción en el cuerpo de los animales. Las fibras musculares esqueléticas que integran al músculo son células multinucleadas y para contraerse requieren del ión calcio (Ca2+) y de energía química (ATP), la cual se transforma en energía mecánica a través de la acción de sus elementos contráctiles, los filamentos de actina y de miosina (Fig. 1).

Figura 1. Niveles de organización del músculo esquelético. Los mioblastos dan origen a las fibras musculares. En la parte inferior se observan los filamentos de actina y de miosina (Modificada de Eckert y cols., 1998).

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La contracción muscular, de acuerdo a su curso temporal, puede ser rápida o lenta dependiendo del tipo de fibra muscular involucrada, es decir, en los músculos esqueléticos coexisten dos tipos de fibras: 1) las fibras rápidas (responsables de los movimientos rápidos o fásicos) y, 2) las fibras lentas (responsables de los movimientos lentos, del mantenimiento de la postura y junto con las fibras rápidas de los movimientos finos como los que realizan los músculos extraoculares). Además de las diferencias funcionales, las fibras musculares difieren en su estructura, patrón de inervación y metabolismo.

a) Inervación de las fibras musculares esqueléticas Las

fibras

musculares

rápidas

usualmente

son

monoinervadas

por

motoneuronas con axones motores gruesos y velocidades de conducción de 58-106 m/seg. En contraste, las fibras musculares de sacudida lenta poseen inervaciones múltiples efectuadas por motoneuronas con axones motores delgados, cuya velocidad de conducción se halla en el rango de 50-80 m/seg (valores de velocidad descritos para músculo de mamífero) (Pette y Vrbova, 1985). A su vez, las fibras musculares e l ntas pueden ser de dos tipos: a) fibras tónicas y b) fibras lentas. Es decir, mientras que las fibras lentas y las fibras rápidas generan potenciales de acción, las fibras tónicas carecen del mecanismo que los genera; es decir, no poseen canales de Na + voltaje-dependientes (Kuffler y Vaughan-Williams, 1953 a, b). Sin embargo, cuando estas fibras son denervadas generan potenciales de acción, es decir, expresan canales de Na + dependientes de voltaje y además expresan canales iónicos de K + responsables de la rectificación anómala (Huerta y cols., 2003).

b) Respuesta mecánica a un estímulo químico Cuando las fibras musculares son estimuladas con soluciones de alto K+, las fibras rápidas responden con una contractura transitoria; es decir, se relajan espontáneamente. En contraste, tanto las fibras lentas como las tónicas responden con una contractura que se mantiene todo el tiempo en que estén presentes las soluciones de alto K+. Esta respuesta presenta un pico máximo de tensión seguido por un componente sostenido. La conformación de estos componentes está

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relacionada con la presencia del calcio en la solución externa y de la concentración de calcio intracelular en la fibra muscular (Huerta y Stefani, 1981; Huerta y cols., 1986).

c) Respuesta mecánica a un estímulo eléctrico Ante un estímulo eléctrico, las fibras lentas generan una sacudida que tiene un curso temporal de seis a ocho veces mayor que el curso temporal de las fibras rápidas (Page, 1969). En el caso de las fibras tónicas, éstas desarrollan una contracción graduada, en contraste a las fibras rápidas que responden con una sacudida única (Kuffler y Vaughan-Williams, 1953 a, b). A la respuesta mecánica (sacudida única) que las fibras musculares rápidas y lentas desarrollan se le puede medir la amplitud al pico, la velocidad de contracción, la resistencia a la fatiga, etc. Con estas características Burke y cols. (1971) clasificaron a las fibras musculares en los tipos que se describen en la Tabla 1. Tabla 1. Clasificación de las fibras musculares esqueléticas de acuerdo a Burke y cols. (1971).

Tipo I

Tipo IIa

Tipo IIb

Fibras de sacudida lenta

Fibras de sacudida rápida (a)

Fibras de sacudida rápida (b)

Metabolismo oxidativo lento

Metabolismo oxidativo y glicolítico

Metabolismo glicolítico

Fibras rojas

Fibras pálidas

Fibras blancas

1) Fibras musculares de sacudida lenta o tipo I Son fibras cuya velocidad de contracción es lenta; desarrollan poca fuerza y presentan resistencia a la fatiga. Bioquímicamente, son ricas en enzimas oxidativas, pero bajas en enzimas glicolítícas y presentan baja actividad ATPasa. Son llamadas también fibras rojas por su alto contenido de mioglobina y poseen alto número de mitocondrias; son más dependientes del metabolismo aeróbico. Su diámetro es menor en comparación con las fibras rápidas. Presentan escaso desarrollo del

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retículo sarcoplásmico (RS), por lo que son más dependientes del calcio extracelular que los otros tipos de fibras (Page, 1969; Huerta y Stefani, 1981). 2) Fibras musculares de sacudida rápida o tipo IIa Son fibras de velocidad de contracción más rápida que la de las fibras lentas, pero a diferencia de las fibras tipo Ib, éstas presentan una resistencia a la fatiga intermedia, puesto que pueden mantener la fuerza aún después de un gran número de contracciones. Estas fibras tienden a tener una gran actividad glicolítica y oxidativa y además, presentan una gran actividad ATPasa. Son llamadas también fibras pálidas; presentan menor contenido de mioglobina, alto número de mitocondrias y moderada capacidad oxidativa. Son fibras de diámetro intermedio y poseen un buen desarrollo del RS, teniendo hasta tres veces más disponibilidad de Ca2+ que las fibras tipo I.

3) Fibras musculares de sacudida rápida o tipo IIb Este grupo de fibras tiene como caracteristica una velocidad de contracción muy rápida (6 a 8 veces más rápida que las fibras lentas) y desarrollan mayor cantidad de fuerza que las fibras tipo I y tipo IIa. Sin embargo, son incapaces de mantenerla; es decir, se fatigan fácilmente. Tienen alta velocidad de consumo de ATP y presentan baja capacidad oxidativa. Son llamadas también fibras blancas por su bajo contenido de mioglobina. Poseen pocas mitocondrias y son muy dependientes del metabolismo glicolítico. Son fibras de diámetro grande y al igual que las fibras tipo IIa, poseen un buen desarrollo del RS y una gran capacidad de almacenamiento de Ca2+.

En los músculos esqueléticos de los vertebrados generalmente coexisten los dos tipos de fibras y la proporción de un tipo u otro está genéticamente regulada. Una característica importante del músculo esquelético es la capacidad de adaptarse para cambiar las propiedades funcionales, variando las propiedades de las fibras musculares (Punkt, 2002). En los músculos rápidos de los mamíferos, esa mezcla de fibras tipo I y II confiere la velocidad de contracción del músculo completo y la

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contracción es rápida o lenta dependiendo de la mayor proporción del tipo de fibras que el músculo tenga (véase figura 2). Además, la actividad de la fibra muscular depende del tipo de neurona que las inerva; es decir, éstas adquieren las características que les confiere el patrón de disparo de la neurona que las inerva. En el ser humano, la proporción de fibras IIa y IIb varía con la edad y el entrenamiento las hace más resistentes a la fatiga, una actividad que ha sido aprovechada por los atletas.

Figura 2. Contracción rápida o lenta de diferentes músculos. A, frontalis/orbicularis oculi (15% de fibras lentas); B, Interóseo del primer dedo (57% de fibras lentas); C, sóleo (80% de fibras lentas); D, extensor digitorum brevis (60% de fibras lentas). Nótese que cuanto menor es la proporción de fibras rápidas, la duración de la sacudida se incrementa (Modificado de McArdle y cols., 1996).

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Como ya se mencionó, las fibras lentas generalmente se encuentran entremezcladas con las fibras rápidas en los músculos de los vertebrados; sin embargo, en las aves la parte anterior del músculo latissimus dorsi (ALD) se caracteriza por poseer exclusivamente fibras lentas y la parte posterior de dicho músculo latissimus dorsi (PLD) está constituído sólo de fibras rápidas (Ginsborg, 1960; Ginsborg y Mackay, 1961). Esta disposición y composición del músculo latissimus dorsi posibilita estudiar en detalle características propias de los tipos de fibras musculares de nuestro interés. Además, las contracturas inducidas por K+ en ambos tipos de fibras están bien caracterizadas, ya que las fibras rápidas del PLD al sumerjirse en soluciones con K+ o cafeína, desarrollan una contractura transitoria; es decir, relajan espontáneamente. En contraste, las fibras lentas del ALD desarrollan una contractura sostenida que depende de la entrada de Ca2+ (Page, 1969; Huerta y Stefani, 1981; Trujillo y cols., 2002). Cuando estas fibras musculares son estimuladas repetitivamente presentan una gran resistencia a la fatiga, una característica propia de las fibras musculares lentas tipo I de acuerdo a la clasificación de Burke y cols. (1971) (véase Figura 3).

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Figura 3. En A, se ilustra la respuesta mecánica (sacudida única) de las fibras musculares fatigables. En B, se muestra la respuesta de las fibras musculares resistentes a la fatiga. En C, la respuesta de las fibras musculares no fatigables (Modificado de Burke y cols., 1971).

Grosso modo, como ya se mencionó, la función de las fibras musculares rápidas está relacionada con los movimientos rápidos (atrapamiento, huida), mientras que las fibras lentas están relacionadas más con los movimientos tónicos y posturales, así como con los movimientos finos como los de los músculos extraoculares para el acomodo de la visión.

d) Suma de contracciones y contracción tetánica La estimulación repetitiva de las fibras musculares provoca una activación de los elementos contráctiles que se va adicionando cada vez antes que la relajación ocurra y por consiguiente, se agrega una respuesta a la contracción presente. Como resultado, las contracciones se van sumando y si la estimulación se repite consecutivamente, las respuestas individuales se fusionan en una contracción continua llamada contracción tetánica o tétanos fusionado (Burke y cols., 1971) (véase Figura 4).

Figura 4. Se muestra la sacudida única en músculo rápido de mamífero, la suma de contracciones y el tétanos fusionado o contracción tetánica, resultado del incremento en la frecuencia de estimulación (Modificado de Burke y cols., 1971).

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e) La fatiga muscular La fatiga muscular, se define como la incapacidad de un músculo para mantener la fuerza y/o hacer un trabajo dado (Fitts y Metzger, 1993; Edwards, 1983). Los factores subyacentes a la fatiga varían en intensidad y duración y entre éstos se involucran procesos a nivel del sistema nervioso central (SNC) y procesos de nivel periférico (Davies y cols., 1996), los cuales se resumen en las Figuras 5 y 6.

Fati ga de ori gen central

__________________________________________________________________

Fati ga de ori gen peri féri ca Túbulo-T

sarcolema

Disponibilidad de ATP

2+

Liberación de Ca -RS

Interacción actina-miosina

Figura 5. Ilustra los principales mecanismos involucrados en la fatiga del músculo esquelético de origen central (parte superior delimitada por la línea central) y periférica (parte inferior, delimitada por la línea central) (Modificado de Fitts y Metzger, 1993).

Los mecanismos de origen central se muestran en la Figura 6A e involucran: 1) fallas a nivel supraespinal, 2) inhibición aferente, 3) baja excitabilidad de las motoneuronas, 4) pérdida de la inervación y 5) falla presináptica. En contraste, dentro de los sitios potenciales de la fatiga de origen periférica (Figura 6B) se hallan: 1) falla presináptica, 2) incapacidad del sarcolema para desarrollar un potencial de acción (PA), 3) falla para sostener el potencial de acción, 4) pérdida del acople entre la excitación y la contracción (E-C), 5) disminución del acople E-C, 6) afinidad reducida en la unión del Ca2+ con las proteínas contráctiles, 7) falla en la interacción entre los miofilamentos y en la formación de los puentes cruzados, 8) disociación de puentes cruzados retardada y 9) baja recaptura de Ca2+ sarcoplásmico. 10

por el retículo

A

B

Figura 6. Se indican los principales mecanismos involucrados en la fatiga de origen central (A) y de origen periférico (B). La descripción de cada uno de los mecanismos se encuentra en el texto.

Con respecto a la actividad metabólica a nivel periférico, también se ha atribuido como posible causa de fatiga la acumulación de difosfato de adenosina (ADP, por sus siglas en inglés) y fosfato inorgánico (Pi), así como la falta de trifosfato de adenosina (ATP, por sus siglas en inglés) y de fosfato de creatina (PCr) (Enoka y Stuart, 1992). Estudios recientes del grupo de Westerblad (Westerblad y Allen, 2002) sugieren que de estos componentes, el Pi tiene un efecto más importante como causa de fatiga, puesto que un incremento de este metabolito produce una reducción de la fuerza y además ocurren fallas en los mecanismos de liberación y recaptura de Ca2+ por el RS (Fitts y Metzger, 1993).

f) El ATP como un factor limitante de la fuerza muscular Como ya se mencionó, la falta de ATP se ha relacionado con la fatiga muscular. La concentración intracelular de ATP durante una actividad muscular intensa no cae más allá del 70% de los niveles preexistentes; sin embargo, se ha

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especulado que el ATP intracelular está restringido a la mitocondria, es decir, está “secuestrado” y que aunque haya suficiente en el medio intracelular éste no se encuentra en el sitio donde es requerido, como sería en el caso de los miofilamentos. Además, también se sabe que durante el ejercicio exhaustivo, durante una estimulación constante y durante la fatiga, lo que se reduce es la velocidad de hidrólisis del ATP.

g) Canales K ATP Los canales KATP fueron descritos por primera vez en el sarcolema de músculo cardiaco (Noma, 1983) y se caracterizan por presentar una inhibición o bloqueo cuando la concentración de ATP intracelular se incrementa a niveles milimolares. Posteriormente, su actividad fue reportada en otros tejidos como páncreas (Cook y Hales, 1984; Ashcroft y cols., 1984; Rorsman y Trube, 1985), músculo esquelético rápido de anfibio (Spruce y cols., 1987), de mamífero (Burton y cols., 1988) y de aves (Thomas y Hume, 1993; Fosset y cols., 1995); en músculo liso (Standen y cols., 1984), en células hipofisiarias (Bernardi y cols., 1993) y en neuronas del sistema nervioso central (Ashford y cols., 1988). Su actividad ha sido relacionada con el acople del estado metabólico de la célula con la actividad eléctrica, atribuyéndoseles un importante papel como sensores de los niveles de ATP y ADP intracelular (Inagaki y Seino, 1998) y como resultado se activan cuando las células se hallan metabólicamente comprometidas, como en el caso de la diabetes, la isquemia (falta de oxígeno) y la fatiga (disminución de la fuerza muscular) (Yokoshiki y cols., 1997).

Un canal KATP es una proteína transmembranal formada por dos subunidades, un canal rectificador entrante (Kir 6.x) y un receptor a sulfonilureas (SUR) en una estequiometría 4:4 (Babenko y cols., 1998) (Fig. 7). Estos canales son activados por fármacos que abren canales de K+ (como el cromakalim, pinacidil, BRL 38227, etc., Weik y Neumcke, 1990) y su apertura es inhibida por sulfonilureas hipoglucemiantes como la glibenclamida y por el ATP (Hussain y cols., 1994; Quayle y cols., 1997). El canal responde también a nucleótidos de adenina como son el NADP (fosfato de

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dinucleótido de nicotinamida y adenina) y NADPH (forma reducida de NADP) (Nichols y Lederer, 1991) y a cambios de pH (Davies y cols., 1992; Honore y Lazdunski, 1995).

Fig. 7. Ensamble de las subunidades SUR y KIR para formar el canal KATP. Arriba: modelo de 17 dominios transmembrana propuesto por Tusnady, Bakos, Varadi y Sarkadi (1997). N y C indican los grupos amino y carboxilo terminal. Abajo: ilustración esquemática del canal KATP. Los árboles indican los sitios de glicosilación (modificado de Aguilar-Bryan y Bryan, 1999).

Se ha sugerido que estos canales actúan como sensor metabólico que acopla la excitabilidad de la membrana con la función muscular protegiendo al músculo de la falta de ATP, y por consecuencia evitando un daño irreversible (Davies y cols., 1991; Baukrowits y Flaker, 2000).

h) Papel del calcio en la fuerza muscular

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La velocidad con que se desarrolla la tensión al pico está relacionada con la velocidad con que interactúan los miofilamentos y también con la cantidad de Ca2+ intracelular liberado por el RS. La disminución de la fuerza está relacionada con una reducción en la liberación de Ca2+ por el RS o con una menor entrada de Ca2+ del medio extracelular. Se conoce que las fibras musculares rápidas poseen un RS más desarrollado y, por lo tanto, poseen una mayor cantidad de bombas Ca2+-ATPasa que las fibras musculares lentas. Así, la velocidad de contracción se relaciona con la velocidad con que las bombas recapturan el Ca2+. Sin embargo, la bomba de Ca2+ del RS es la mayor consumidora de ATP durante el reposo y durante la actividad de las células musculares, por ejemplo, en una contracción isométrica el consumo de ATP por estas proteínas representa aproximadamente el 30% del total.

Por otro lado, se ha sugerido que la disminución de la fuerza durante la fatiga se debe al menos en parte, a una falla en el mecanismo de acople entre la excitación y la contracción, lo que conduce a una reducción de la concentración de Ca2+ en el mioplasma disponible para la contracción (Westerblad y Allen, 1991). La prolongación en el curso temporal de la relajación observada durante el ejercicio extremo está muy relacionada con una disminución en la velocidad de recaptura del Ca2+ por el RS. Así, algunas drogas como la cafeína incrementan la fuerza en el músculo fatigado al incrementar la liberación de Ca2+ por el RS (Eberstein y Sandow, 1961; Delay y cols., 1986; Germinario y cols., 2004) (véase Figura 8) y además la cafeina induce contracturas sostenidas en fibras lentas de pollo (Huerta y Stefani, 1981) y tónicas de rana (Muñiz y cols., 1992).

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Figura 8. Ilustra el incremento en la fuerza de las sacudidas en un músculo fatigado cuando se adiciona cafeína a la solución que baña a las fibras musculares. Nótese el desarrollo de una contractura sostenida inducido por la cafeína (modificada de Eberstein y Sandow, 1961).

i) El Canal KATP en el músculo esquelético, su papel en la fatiga y justificación de su estudio A pesar que desde 1985 Spruce y cols. reportaron que los canales KATP están presentes en la membrana del músculo esquelético, su función todavía es desconocida.

Los trabajos donde se han empleado fármacos que abren éstos canales de potasio muestran evidencia de la participación de los canales KATP en la disminución de la fuerza característica de la fatiga muscular (Weselcouch y cols., 1993; Light y French, 1994; Wickenden y cols., 1996; Matar y cols., 2000 y Matar y cols., 2001). Sin embargo, los resultados obtenidos al emplear bloqueadores de estos canales, específicamente la glibenclamida, está todavía en discusión. Algunos autores han reportado que la glibenclamida no tiene efecto sobre la fatiga (Van Lunteren y cols., 1998; Gong y cols., 2000; Light y cols. 1994; Matar y cols., 2000). Otros autores han reportado que la glibenclamida acelera el proceso de fatiga (Comtois y cols., 1994) y algunos otros han reportado que este bloqueador de canales KATP incrementa la fuerza tetánica y los niveles de calcio intracelular en fibras rápidas de mamífero (Duty y Allen, 1995).

En este trabajo, mediante el registro de corrientes unitarias en vesículas de membrana procedentes de fibras musculares lentas (que describiremos más adelante), tratamos de demostrar la presencia de estos canales y darle una posible explicación funcional a la participación de los canales KATP en el proceso de fatiga muscular.

En el sarcolema de las fibras musculares lentas los canales iónicos están poco estudiados y, por consiguiente, sus funciones son escasamente conocidas (Stefani y

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Chiarandini, 1982; Huerta y cols., 2003). Una posible razón de la escasez de estudios electrofisiológicos en fibras musculares lentas es la enorme dificultad técnica que representa estudiarlas (fibras de diámetro pequeño, alto contenido de tejido conectivo [Nakamura y cols., 2003], etc.) y uno de los problemas asociados al registro de las corrientes iónicas en células musculares intactas es la dificultad para fijar el voltaje con la técnica de fijación de voltaje con tres microelectrodos en el extremo de la fibra (Huerta y col.s, 2003). En este trabajo, se utilizó el modelo de vesículas de membrana (sarcolema) donde se aplicó la técnica electrofisiológica de fijación de voltaje en microáreas de membrana (patch clamp) a fin de eliminar los problemas técnicos previamente descritos. Inicialmente, el estudio en este tipo de vesículas con la técnica de patch-clamp fue hecho en músculo rápido de rana (Standen y cols., 1984), en músculo lento de pollo (Trujillo y cols., 1992) y aunque la procedencia exacta de estas vesículas a la fecha no ha sido bien establecida, el trabajo realizado por Camacho y cols. (1999) usando fluorescencia emitida con el reactivo

de

fluorescencia

tubular

(RH-795)

sugiere

que

el

túbulo-T

está

contribuyendo en su formación. Adicionalmente, estas vesículas carecen de componentes del citoesqueleto, de organelos intracelulares y la membrana pierde las invaginaciones características de la membrana de las fibras musculares intactas (Camacho y cols., 1996; Camacho y cols., 1999), lo que facilita estudiarlas mediante la técnica de patch-clamp.

Para explorar la posible relación entre el canal KATP y la fatiga muscular en este trabajo utilizamos la glibenclamida, puesto que se sabe que bloquea selectivamente al canal KATP en músculo esquelético de perro, rana y cobayo (Van Lunteren y cols., 1998). Esta droga ha sido usada en diversos estudios que exploran la relación entre la fatiga muscular y los canales KATP en músculo esquelético (Comtois y cols., 1994; Gutierrez y cols., 1995; Light y cols., 1994; Wickenden y cols., 1996; Van Lunteren y cols., 1998), lo que facilita la comparación de nuestros resultados con los obtenidos por esos autores. Adicionalmente exploramos la acción de la cafeína para estudiar la regulación del calcio intracelular en fibras musculares

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lentas, como ha sido reportado en fibras rápidas de rana (Delay y cols., 1986) y en fibras musculares esqueléticas de ratón (Germinario y cols., 2004).

Con el fin de correlacionar los registros electrofisiológicos obtenidos en vesículas de membrana y controlar de alguna manera la influencia de componentes celulares (citoesqueleto, metabolitos, etc.) sobre los canales iónicos de interés se estableció y estandarizó un cultivo primario de células musculares lentas del músculo ALD de pollo recién nacido de la variedad arbor acres.

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HIPÓTESIS La glibenclamida al bloquear los canales KATP modifica el acople excitacióncontracción en las fibras musculares lentas, aumentando la liberación de calcio del retículo sarcoplásmico durante la fatiga, lo que mejora la tensión postfatiga.

OBJETIVO GENERAL Determinar el efecto de la glibenclamida sobre la fatiga en músculo esquelético lento de pollo, para lo cual nos propusimos los siguientes objetivos particulares:

1) Inducir la fatiga en el músculo lento mediante estimulación repetitiva en fascículos de fibras lentas de pollo, es decir, diseñar un modelo de fatiga in vitro. 2) Explorar el efecto de la glibenclamida sobre la sacudida post-fatiga y sobre la contracción tetánica post-fatiga. 3) Inducir indirectamente la apertura de canales (K ATP) mediante la inhibición metabólica (disminución de la concentración intracelular de ATP) y explorar en estas condiciones el efecto de la gibenclamida. 4) Explorar si el efecto de la glibenclamida está relacionado con la liberación de calcio del retículo sarcoplásmico, mediante el estudio de contracturas por cafeína en presencia de glibenclamida. 5) Investigar si el efecto de la glibenclamida está relacionado con el bloqueo de canales de potasio dependientes de ATP (K ATP), mediante el registro de corrientes unitarias para detectar la presencia de estos canales en estas fibras musculares lentas.

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METODOLOGÍA La presente tesis fue hecha en fascículos obtenidos del músculo lento anterior latissimus dorsi (ALD) de pollo de la variedad arbor acres. Los pollos fueron adquiridos de una proveedora comercial de nuestra ciudad en lotes según nuestras necesidades experimentales. Los procedimientos en el manejo de los animales y su mantenimiento en el bioterio se llevaron de acuerdo a la guía y norma para el cuidado de animales de experimentación del Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas de la Universidad de Colima.

Para obtener los músculos lentos (ALD), los pollos fueron sacrificados usando el procedimiento descrito por Huerta y Stefani (1981) y Trujillo y cols. (2002). Este consistió brevemente en sacrificar a los pollos por decapitación para posteriormente disecar el músculo ALD, el cual fue colocado en una caja de Petri revestida con fondo de resina transparente (Sylgard). El músculo fue fijado mediante alfileres entomológicos al fondo de la cámara e inmerso en solución Ginsborg (véase soluciones). Bajo el microscopio estereoscópico se retiró el exceso de tejido conectivo y se procedió a obtener fascículos delgados (de 1-1.5 mm de grosor), para con ellos llevar a cabo el registro mecánico, o bien el músculo completo era expuesto a una solución con alto potasio y carente de calcio (ver soluciones) para la obtención de vesículas sarcolemales.

a) Registro mecánico Se registraron las siguientes respuestas mecánicas: sacudida única, tétanos no fusionado (5 Hz) y tétanos completo (50 Hz), contracturas inducidas por alto K+ (80 mM) y por cafeína (8 mM) en fascículos de músculo lento. Para el registro de cada una de las respuestas mecánicas, el fascículo fue colocado en una cámara experimental de lucita transparente, con dos placas deslizables para ajustar el ancho del canal. El fascículo fue fijado del extremo proximal al fondo de la cámara mediante alfileres entomológicos y fue atado del extremo distal, con parte del hueso húmero, al ganchito del transductor mecanoeléctrico Grass FT03. El transductor estaba conectado a un amplificador Cyberamp 320 (Axon Instruments, Co.), el cual a su vez 19

estaba conectado a una interfase analógico-digital DMA TL-1 (Axon Instruments, Co.), que estaba conectada a una computadora Acer pentium I que nos permitió adquirir (con el programa Axotape, Axon Instruments, USA) y almacenar los datos para su posterior análisis (ver más adelante). Antes de proceder con el registro de tensión isométrica, el fascículo fue estirado hasta 1.3 veces su longitud de reposo y equilibrado en solución Ginsborg normal (ver soluciones). Los cambios de soluciones se hicieron a través de una llave de tres vías conectada a la cámara con salida directa hacia el fascículo. Para el registro de las sacudidas y de los tétanos se aplicaron protocolos diferentes de estimulación a través de electrodos de platinoiridio colocados paralelamente al músculo dentro de la cámara experimental. Durante todos los experimentos, los fascículos fueron bañados por la solución Ginsborg con manitol (ver soluciones). En las contracturas inducidas por cafeína los fascículos se incubaron en presencia de glibenclamida por un periodo de 4 minutos previo a la contractura en presencia de este fármaco para permitir la difusión de la droga y su interacción con la membrana de las células musculares (Ligth y cols., 1994). Todos los experimentos fueron realizados a temperatura ambiente (22-25 °C).

1) Contracturas inducidas por alto potasio: Al inicio y al final de cada experimento se registró una contractura inducida por 80 mM de K+ durante 5 minutos a fin de conocer el estado del fascículo ya que este tipo de contractura está bien caracterizado en este músculo (Huerta y cols., 1986).

2) Caracterización del modelo experimental de fatiga en el músculo lento del pollo: Protocolos de estimulación: Las fibras musculares esqueléticas pueden responder a la estimulación eléctrica repetitiva con dos tipos de respuestas mecánicas dependiendo de la frecuencia de estimulación: 1) la sacudida única y 2) la contracción tetánica (ver introducción). Se han empleado diversos protocolos de estimulación eléctrica para provocar fatiga muscular, registrando como respuesta mecánica la sacudida única con pulsos de 0.2 ms de duración a frecuencias de 2, 3.2, 4, 5.2 y 7.6 Hz (Giannesini y cols., 2001) o registrando las contracciones tetánicas aplicando trenes de 200 ms de duración a una frecuencia de 140 Hz, con

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pulsos de 0.5 ms de duración (Light y cols., 1994) o mediante trenes de 350 ms de duración a una frecuencia de 100 Hz y pulsos de 0.5 ms de duración (Westerblad y Allen, 1991; Duty y Allen, 1995; Matar y cols., 2000). Cuando aplicamos estos protocolos de estimulación ya establecidos para inducir fatiga en el músculo ALD de pollo, no observamos ninguna respuesta mecánica, por lo que procedimos a aplicar diferentes frecuencias de estimulación y a variar la duración de los pulsos hasta establecer nuestros propios protocolos de estimulación eléctrica para estudiar tanto la sacudida única como la contracción tetánica e inducir la fatiga en estas condiciones.

Fatiga (sacudidas únicas): Para el registro de las sacudidas únicas aplicamos estimulación eléctrica repetitiva a una frecuencia de 0.2 Hz con pulsos de 300 ms de duración. Se continuó el registro hasta observar la disminución de las respuestas en aproximadamente 70% con respecto al valor inicial registrado para la sacudida única. Una vez inducida la fatiga, se aplicó la droga de prueba (glibenclamida) realizando observaciones durante 5 min a fin de determinar su efecto.

Fatiga (tétanos): Se aplicó una estimulación eléctrica repetitiva (trenes de 5 s, pulsos de 10 ms de duración; frecuencia de 5 o 50 Hz). Se registró la respuesta hasta observar la disminución del 70 u 80% con respecto al valor al inicio de la estimulación. Una vez presentada la fatiga, se aplicó la droga de prueba (glibenclamida 150 µM) realizando observaciones durante 5 min a fin de determinar su efecto.

Sacudidas únicas en presencia de cianuro (CN): Se aplicó estimulación eléctrica repetitiva con pulsos de 300 ms de duración a una frecuencia de 0.2 Hz durante 10 min y se adicionó 10 mM de CN continuando con el registro durante 5 min; posteriormente se lavó el CN con la solución normal permitiendo que la tensión se recuperara hasta valores similares a los registrados al inicio del experimento. A continuación se agregó CN (10 mM) en presencia de glibenclamida (150 µM) realizando la observación durante 5 min, posteriores a los cuales se lavaron el CN y

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la glibenclamida con la solución normal continuando el registro por un periodo de 10 min.

3) Contracturas inducidas por cafeína Para determinar si la acción de la glibenclamida está relacionada con un incremento en la liberación de Ca2+ por el RS (Delay y cols., 1986), se realizó una serie experimental mediante contracturas inducidas por 8 mM de cafeína. Para cada experimento se indujeron tres contracturas por cafeína con una duración de 5 min con periodos de 20 minutos entre contracturas. Se incubó el fascículo en presencia de glibenclamida durante 4 min previos a la contractura inducida en presencia de este fármaco (Light y cols., 1994).

b) Análisis de los datos Se midió la tensión al pico y la tensión total (área bajo la curva) de la sacudida única, además se midió la tensión máxima en el tétanos y la tensión total del tétanos, (área bajo la curva). Asimismo, la tensión máxima y la tensión total de las contracturas por K+ o cafeína. La tensión al pico fue medida como la diferencia entre la tensión basal y la tensión máxima (al pico) desarrollada por el fascículo antes, durante la aplicación de la droga y de forma posterior al lavado de las sustancias de prueba. El análisis fue realizado con una computadora Pentium III (Compaq deskpro), utilizando la subrutina Clampfit del programa pClamp (versión 8.0) y las gráficas fueron elaboradas con el programa Sigmaplot (versión 8.0). Las mediciones obtenidas de las sacudidas únicas y tétanos de prueba fueron normalizadas con respecto a las sacudidas y tétanos control. Los resultados se expresan como el promedio ± el error estándar de las observaciones realizadas. Se aplicó la prueba estadística “t” de Student para comparar los promedios empleando una P

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