Universidad Autónoma de Ciudad Juárez Instituto de Ciencias Biomédicas Departamento de Ciencias Básica

Uso de ciclodextrinas como antioxidantes

Ciudad Juárez

Ciclodextrinas Oligosacáridos cíclicos naturales constituidos por 6, 7 u 8 unidades de glucopiranosa unidas por enlaces glucosídicos α(1,4) H OH

H

HO H

O

H OH

H

H

H

O

HO O

H

H

H

O

O

O HO

OH

H

OH

H

O

H

H

OH

H

OH

4,7 - 5,3 Å

H

H O

OH

H

H

H

O

O

H

OH

6,0 - 6,5 Å

H

H H

HO

7,5 -8,3 Å

HO

OH

H O OH

O

H

H

H

H

H O

OH

OH

H

O H

H

O HO

O H

H

H

OH

H

H

H

HO

O

OH

HO

H HO

HO O

H

H

H

O H

OH

H

H

OH

H

H O HO

O

H

HO

O

H

H

H

HO

O

H

H

O HO H

OH

H H

O

H

OH

HO

O

H

HO

HO H

OH

OH

H

H

H HO H

H

H

HO

H

H

O

O

H

H OH

H OH

HO O H

H

H

H H

HO

HO

O H H

O

H

H OH

H

H

O H H

HO H

H

H

HO H

β

H

HO OH O

O

O OH

H

HO H

α

H

HO

H

OH O

HO

OH O

H

H

H

H

OH

H

H

O

HO H

OH

H

OH

O

O

OH

HO

H

O

HO

H

γ

O

H

H OH

Obtención de Ciclodextrinas Almidón

Ciclodextrina Glucosil Transferasa

Ciclodextrinas

E.C. 2.4.1.19

Reacción intramolecular

Propiedades fisicoquímicas de las Ciclodextrinas

Cinturón de hidroxilos secundarios Cinturón de oxígenos glucosídicos

H(3) H(3) H(5) H(6

H(5) H(6)

H(3) H(5)

Cinturón de hidroxilos primarios

Complejos de inclusión Supermolécula formada por una molécula huésped (sustrato) que es incluída o encapsulada en el interior de una molécula hospedadora (receptor)

• Equilibrio Químico • Constante de equilibrio

Complejos de inclusión La formación de agregados supramoleculares está regida por un Proceso de Reconocimiento Molecular a) Compatibilidad geométrica: Tamaño Forma b) Compatibilidad en la polaridad. A mayor polaridad del huésped, menor capacidad de formar complejos

Complejos de inclusión (a)

(b)

(c)

ª Tipos: Completo

Axial (d)

Parcial

(e)

De estequiometría superior

Estequiometría y Fortaleza.

Complejos de inclusión ªModificación de las propiedades fisicoquímicas de la molécula huésped Solubilidad: Aumento o disminución Biodisponibilidad Estabilidad: Térmica Oxidación Degradación fotoinducida

Otros procesos: Enmascarar sabor Reducir volatilidad

Usos de las ciclodextrinas en alimentos: Normativa ● β y γ ciclodextrinas son “generalmente reconocidas como seguras” (GRAS de Generally Recognized As Safe) por la FDA. ● El reconocimiento GRAS fue otorgado en el año 2000 para la γ-CD y 2001 para la β-CD, aunque esta última ha sido utilizada desde 1996. ● La Organización Mundial de la Salud aprobó el uso de la βCD como aditivo alimentario desde 1993. ● Para estas aprobaciones tuvieron que realizarse estudios de: toxicidad aguda y crónica, teratogenicidad y embriotoxicidad, estimaciones de la máxima dosis consumible (912 mg/día.Kg), etc.

Usos de las ciclodextrinas en alimentos Tipo de alimento y uso

Máximo permitido

β-CD Cereales, chicles, dulces

2%

Gelatinas y pudines, café y té de sabores, productos de queso, polvo para bebidas

1%

Sopas deshidratadas

0.2%

γ-CD Bebidas e polvo, sopas instantáneas, polvo para salsas, 1% café y té instantáneos, especias, botanas, chicles y dulces Leche de soya (modificación del sabor)

2%

Vehículo de vitaminas y ácidos grasos como suplemento 80-90%

Ejemplos de aplicaciones • Protección frente a la degradación • Eliminación productos indeseables (olores, sabores) • Control de la maduración de frutas (Metileno)

C8H17

Complejo con β-CD insoluble HO

Colesterol

Productos lácteos libres de colesterol

Ejemplos de aplicaciones Complejación de Vainillina Prolongar sensación de frescura y liberación controlada del aroma en: • Shampoo • Enjuague de boca • Chicles

Ejemplos de aplicaciones Complejación de ácidos orgánicos usualmente líquidos para formar granulados:

Producción de bebidas en polvo ricas en proteína de soya y de un color rojo brillante

Ejemplos de aplicaciones Complejación de β caroteno: H3C CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3 CH3

Producción de sustitutos de grasas (no digeribles) , enriquecidos en vitaminas liposolubles

Ejemplos de aplicaciones Complejación de aceite de ajo: Capacidad antifúngica

Capacidad antioxidante complejos β-CD:polifenoles efecto in vitro • ¿El complejo ciclodextrina: polifenol tiene mayor capacidad antioxidante que el compuesto libre? • ¿El complejo ciclodextrina: polifenol se degrada menos que el antioxidante libre? • Formulación alimenticios

de

suplementos

Antioxidantes Naturales y Capacidad Antioxidante {

Los compuestos fenólicos “neutralizan” el exceso de radicales libres que pueden desarrollar enfermedades crónicas de tipo degenerativo tales como el cáncer y cardiovasculares.

Antioxidantes Naturales y Capacidad Antioxidante {

Estos radicales libres pueden dañar el ADN y ser

potencialmente cancerígenos

Antioxidantes Naturales y Capacidad Antioxidante {

{

Otro efecto protector de estos antioxidantes es a nivel cardiovascular. La LDL-colesterol al ser oxidada por radicales libres es reconocida por los macrófagos muy rápidamente.

Antioxidantes Naturales y Capacidad Antioxidante {

Esta respuesta tan agresiva puede crear daños en el endotelio vascular, solución de continuidad en vasos y finalmente trombos.

Antioxidantes Naturales y Capacidad Antioxidante {

Un buen aporte de frutas a la dieta puede tener excelentes efectos en nuestra salud

Es importante mantener la capacidad antioxidante de los alimentos

Determinación de la Capacidad Antioxidante Dos métodos principales: - Transferencia de átomos de hidrógeno (HAT)

X· + AH → XH + A· Método ORAC

60

.

ROO + proteína → oxidación

. . ROO + AH → ROOH + A . . ROO + A → ROOA Reacción Rápida

Fluorescencia (ua)

50

40

30

20

10

0 0

Independiente del disolvente

20

40

60

tiempo (min)

80

100

Determinación de la Capacidad Antioxidante Dos métodos principales: - Transferencia individual de electrón (SET)

M(III) + AH → M(II) + AH+ Método FRAP

Fe(TPTZ)2(III) + AntiOH → Fe(TPTZ)2(II) + AntiOH+· Ambos mecanismos (HAT y SET) ocurren paralelamente Capacidad Reductora Reacción Lenta Dependiente del disolvente y pH Sensible a la presencia de vit. C

Determinación de la Capacidad Antioxidante 1.2 1

Qc Rt

0.6

CA CDQC

0.4

CDRt

1.8

CDCA

1.6 1.4

0.2

1.2

Abs

Abs 595

0.8

0

0

500

1000

1500

Tiempo / s

2000

1 0.8

y = 0.0005x + 0.1594 2 R = 0.9988

0.6 0.4 0.2 0 0

500

1000

1500

Fe

Cuantificar la concentración de Fe2+ reducido

2+

2000

/ mM

2500

3000

3500

Capacidad antioxidante complejos β-CD:polifenoles efecto in vitro ¿Forman las ciclodextrinas complejos de inclusión con los polifenoles? •

• ¿Los complejos modifican la capacidad antioxidante de los polifenoles?

Formación de los complejos de inclusión β-CD:polifenoles Espectro de fluorescencia

20

u. a. f.

15

Quercetina

10 5 0 450

500

550 l / nm

Formación de los complejos de inclusión β-CD:polifenoles Análisis no lineal: ajuste por mínimos cuadrados 22

0 .4 5 0 .4 0 0 .3 5

λ

0 .2 5 0 .1 5

18

0 .1 0 0 .0 5 0

1000

2000

3000

1/[β-CD]

16 14 12 10 8 6 4 0.000

0.002

0.004

0.006

[β-CD] / nm

K1

0 .3 0 0 .2 0

Fluorescence Intensity / a.u.

Datos iniciales: Valores de ajuste lineal: K1

1/ΔF

F H + F C1 K1 [CD]0 F = 1 + K1 [CD]0 λ

λ

20

0.008

0.010

4000

Formación de los complejos de inclusión β-CD:polifenoles Guest

K1/ M-1 (linear fit)

K1/ M-1 (non-linear fit)

CA

420 ± 50a

465 ± 26

Rt

250 ± 48

224 ± 14

Qc

1284 ± 106

1138 ± 52

Capacidad antioxidante complejos β-CD:polifenoles efecto in vitro 1.2 1

Abs 595

0.8

Qc Rt

0.6

CA CDQC CDRt

0.4

CDCA

0.2 0

0

500

1000

Tiempo / s

1500

2000

Transformar a concentración de Fe2+ con la curva de calibración

Capacidad antioxidante complejos β-CD:polifenoles efecto in vitro 1800 1600 1400

Fe 2+

1200

Valores FRAP 4 min

1000 800

*

600 400 200 0 Qc

Qc/CD

Rt

Rt/CD

CA

CA/CD

Tratamiento

Fe2+ 4 min

Valores FRAP 4 min y 30 min

Fe2+ 30 min

Qc

1424 ± 73

2073 ± 130

Rt

660 ± 58

1454 ± 73

CA

569 ± 23

1063 ± 65

Qc:CD

1515 ± 107

2225 ± 227

Rt:CD

770 ± 23

1608 ± 70 *

CA:CD

673 ± 11 *

1215 ± 27 *

Capacidad antioxidante in vivo de complejos de ciclodextrina 4 grupos: a) control (agua) b) β-CD ( 6 mM) c) Ácido Caféico (6 mM) d) Mezcla (6 mM CD + 6 mM AC) Duración del experimento: 28 días

Extracción de sangre (2 mL), centrifugar para separar el plasma y medir capacidad antioxidante por la técnica FRAP

Capacidad antioxidante in vivo de complejos de ciclodextrina 700.0

Capacidad antioxidante:

600.0 [Fe 2+] / mM

500.0

Diferencia significativa entre tratamiento con ciclodextrina

400.0 300.0 200.0 100.0 0.0 CD

Caf

com

agua

90.0 80.0

Colesterol: mg Colesterol

No se presentaron diferencias entre tratamientos

70.0 60.0 50.0 40.0 30.0 20.0 10.0 0.0 CD

Caf

com

agua

Efecto de la ciclodextrina en la inhibición de la actividad de la PPO Enzima responsable del pardeamiento de frutas

OH

R

R

R

O2

O2

Actividad cresolasa

Actividad catecolasa

OH OH

Forma de acción de la PPO O O

Sustrato

Efecto de la β-ciclodextrina sobre la actividad de la PPO

+

Ciclodextrina

K11

Complejo

PPO o-Quinonas Aminoácidos Pardeamiento

Efecto de la ciclodextrina en la inhibición de la actividad de la PPO Efecto de la β-CD, 4HR y Mezcla sobre la oxidación del AC por PPO de Manzana Todos los tratamientos produjeron una inhibición de la actividad de la PPO, siendo esta mayor para el caso de la mezcla.

control 4-HR / 0.5 mM β-CD / 5.0 mM Mezcla (CD+ 4-HR)

0.0025

1

0.0015

/UV

abs o

Vo / Uabss-1

0.0020

0.0010

§ § 0.0005

*

* *

0.0000 0

2

4

6

[AC] / mM

8

10

Efecto de la ciclodextrina en la inhibición de la actividad de la PPO Parámetros cinéticos de la PPO de manzana Red Delicious en presencia de los inhibidores.

Control

4-HR Competitivo

ΜJ*

β-CD

Mixto

Mixto

Vmax1

2.9

2.8

2.2

2.5

K´M1

3.39

9.86

4.20

8.35

Vmax2

3.0

2.8

2.9

2.1

K´M2

3.68

10.84

6.62

6.4

0.26

8.38

3.42

Ki 1Ajuste

no-lineal a la ecuación de Michaelis-Menten; 2ajuste lineal a la ecuación Lineweaver-Burk.

Efecto de la ciclodextrina en la capacidad antioxidante de manzana fresca cortada Manzana cortada lavada y tratada con CD, extracto de la piel, extracto mas CD y agua Tomar muestras liofilizar y determinar capacidad antioxidante

Efecto de la ciclodextrina en la capacidad antioxidante de manzana fresca cortada Capacidad antioxidante de manzana fresca cortada

2500

Control Agua

2+

[Fe ] / mM

3000

CD

2000

1500 0

3

5 Días

7

¡Gracias!