UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y TECNOLOGÍA QUÍMICA Profesor Patrocinante:

Directores de Memoria:

Lilian Elizabeth Abugoch James

Lilian Elizabeth Abugoch James

Departamento de Ciencia de los Alimentos y

Departamento de Ciencia de los Alimentos y

Tecnología Química, Universidad de Chile

Tecnología Química, Universidad de Chile

Nalda Marcela Romero Palacios Departamento de Ciencia de los Alimentos y Tecnología Química, Universidad de Chile

OBTENCION, CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL Y DETERMINACIÓN DE LAS PROPIEDADES FUNCIONALES DE UN AISLADO PROTEICO DE QUINUA ORGÁNICA (CHENOPODIUM QUINOA)

Memoria para optar al Título Profesional de Ingeniero en Alimentos

MONICA MIREYA RIVERA FIGUEROA

Santiago, Chile 2006

Todo nuestro descontento por aquello de lo que carecemos procede de nuestra falta de gratitud por lo que tenemos. Daniel Defoe

A mi amada familia

II

La fase experimental de esta memoria fue realizada en el Laboratorio de Procesos de Alimentos del Departamento de Ciencia de los Alimentos y Tecnología Química, dependiente de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile. El financiamiento para esta investigación fue otorgado por la Universidad de Chile, a través del concurso interno de tesis del año 2006.

III

AGRADECIMIENTOS

Agradezco de todo corazón a todos quienes me han apoyado durante mi carrera y a quienes han hecho posible la realización de esta memoria: A mi profesora patrocinante y directora de memoria, Lilian Abugoch, por su dedicación, enseñanzas, consejos y su inagotable buena disposición. A la profesora Nalda Romero, por sus enseñanzas, sus correcciones y su valioso aporte a esta tesis. A la profesora María Eugenia Letelier por facilitar la centrífuga sin la cual hubiese sido imposible la obtención del aislado. Por su generosa ayuda y tiempo, gracias. Al profesor Jorge Chavez, por facilitar el secador spray, y a Alejandra Olave, por enseñarme a usarlo. Al profesor Abel Guarda por facilitar el equipo DSC, para la realización de los análisis. A todos los miembros de los laboratorios de: Procesos, Química de Alimentos y Operaciones Unitarias, por su gran disposición y valiosa ayuda. A las profesoras miembros de la comisión evaluadora de mi tesis, Lucía Collados y Paz Robert, por su aporte y sugerencias a mi trabajo. A todos los profesores sin excepción, quienes me entregaron más que conocimientos durante la carrera. A mis compañeros, muchas gracias por su ayuda y compañerismo. A mi muy querido amigo Jorge Silva, por su apoyo, compañía y ayuda durante el desarrollo de esta tesis, mil gracias. A mi familia, en especial a mis padres, Waldo y Mireya, por inculcarme tantos valores (en especial el del estudio), y por su constante apoyo durante toda mi existencia. A mi queridísima tía Iris, quien incluso en la lejanía me dio la fuerza para seguir siempre adelante. A Sosky, Kitty y Nelson, sin cuyo apoyo hubiera sido imposible culminar esta etapa de mi vida. Siempre les estaré en deuda.

IV

INDICE

RESUMEN ............................................................................................................... VII SUMMARY .............................................................................................................. VIII I. INTRODUCCIÓN.....................................................................................................1 1.1

Antecedentes generales ..............................................................................1

1.2

Características de la quinua ........................................................................2

1.2.2

Composición de la semilla de quinua y su valor nutricional.................3

1.2.3

Las Saponinas .....................................................................................5

1.3

Empleos de la quinua ..................................................................................6

1.4

Mercado nacional e internacional ................................................................6

1.5

Los aislados proteicos y sus propiedades ...................................................7

II. HIPÓTESIS .............................................................................................................9 III. OBJETIVOS ........................................................................................................10 3.1

Objetivo general.........................................................................................10

3.2

Objetivos específicos.................................................................................10

IV. MATERIALES Y MÉTODOS................................................................................11 4.1

Materiales ..................................................................................................11

4.1.1

Materia prima .....................................................................................11

4.1.2

Reactivos químicos............................................................................11

4.1.3

Equipos e instrumentos .....................................................................12

4.1.4

Insumos y utensilios...........................................................................14

4.2

Métodos .....................................................................................................15

4.2.1

Obtención de la harina de quinua desgrasada ..................................15

4.2.2

Obtención del aislado proteico de quinua..........................................16

4.2.3

Caracterización química ....................................................................18

4.2.3.1 Composición Proximal……………………….……………………….…. 18 4.2.3.2 Perfil de aminoácidos…………………………………………………… 18 4.2.3.3 Determinación de fitoestrógenos………………………………….…… 19

V

4.2.4

Caracterización estructural de las fracciones proteicas.....................19

4.2.4.1 Perfiles polipeptídicos……………………………………………...…… 19 4.2.4.2 Fluorescencia……………………………………………………………. 20 4.2.4.3 Espectroscopía UV……………………………………………………… 21 4.2.4.4 Calorimetría Diferencial de Barrido………………………………….… 21 4.2.5

Determinación de las propiedades funcionales .................................21

4.2.5.1 Solubilidad…………………………………………………………………21 4.2.5.2 Capacidad de retención de agua………………………………........... 22 4.2.5.3 Capacidad de absorción de agua……………………………………….22 4.2.6

Análisis estadístico ............................................................................23

V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................24 5.1

Caracterización química del aislado proteico de quinua ...........................24

5.1.1

Composición Proximal .......................................................................24

5.1.2

Perfil de aminoácidos.........................................................................25

5.1.3

Contenido de fitoestrógenos ..............................................................27

5.2

Caracterización estructural de las fracciones proteicas ............................28

5.2.1

Perfiles Polipeptídicos del Aislado Proteico de Quinua A9................28

5.2.2

Fluorescencia.....................................................................................31

5.2.3

Espectroscopia de absorción UV.......................................................33

5.2.4

Calorimetría diferencial de Barrido ....................................................35

5.3

Determinación de las propiedades funcionales .........................................37

5.3.1

Solubilidad .........................................................................................37

5.3.2

Capacidad de retención de agua .......................................................39

5.3.3

Capacidad de absorción de agua ......................................................41

VI. CONCLUSIONES ...............................................................................................43 VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................45 ANEXOS ...................................................................................................................53 Anexo 1. Métodos electroforéticos (PAGE)...........................................................54 Anexo 2. Método de Bradford................................................................................58 Anexo 3. Preparación de los buffers .....................................................................60 Anexo 4. Gradientes de concentración para fase móvil de HPLC………..……… 61

VI

RESUMEN El presente estudio tuvo por objetivo la obtención de un aislado proteico de quinua a partir de quinua orgánica proveniente de la VI Región. El aislado se caracterizó desde el punto de vista químico, estructural y funcional. Los resultados se analizaron estadísticamente mediante análisis de varianza y test de Tukey, al 95 % de confianza. El contenido de proteínas totales del aislado fue de 77,2%. El perfil de aminoácidos coincidió con lo descrito en la literatura para la harina de quinua, por lo que la extracción de las proteínas a pH 9 no afectó el balance de aminoácidos, Entre los aminoácidos esenciales, destacan el alto contenido en lisina, metionina y arginina. Los perfiles polipeptídicos en condiciones nativa y desnaturante, sin y con 2-Me, indican que las proteínas del aislado están compuestas principalmente por albúminas del tipo 2S y globulinas 11S. A través de los resultados de espectroscopia UV se verificó la presencia de globulinas. En fluorescencia se observó curvas muy similares para los pHs alcalinos, lo que indicaría que la estructura de la proteína no sufrió modificaciones en tales condiciones. Los resultados de la calorimetría diferencial de barrido, señalan un cierto grado de estructuración de la proteína, presentándose una endoterma de 13,5 mJ y una temperatura de desnaturalización (td) de 98,1ºC, para el aislado suspendido en agua. La endoterma fue mayor para la misma muestra suspendida en buffer de pH 9 (29,1 mJ y td de 100,5ºC), lo que señala que a pH 9 se produce una reestructuración de las proteínas. El estudio de las propiedades funcionales muestran que el aislado de quinua posee un alto nivel de solubilidad, especialmente sobre el pH 5, con una solubilidad de 76,6%, la cual aumentó con el pH hasta alcanzar un máximo de 94,6%, a pH 11. La capacidad de retención de agua (WHC) fue buena, con valores entre 2,5 y 3,0 mL/g aislado proteico, no encontrándose una dependencia del pH. En absorción de agua se obtuvo resultados relativamente elevados, con una capacidad máxima de absorción (WIC) de 1,8 g agua/g aislado, y una velocidad inicial de 1,34 g agua/ g aislado × min. Todas estas características apuntan a que el aislado es apropiado para la elaboración de productos tales como: bebidas, sopas, embutidos, geles, productos de panificación, alimentos deshidratados y, en general, en el desarrollo de productos funcionales altamente proteicos.

VII

SUMMARY OBTAINING, STRUCTURAL CHARACTERIZATION AND DETERMINATION OF THE FUNCTIONAL PROPERTIES OF A PROTEIN ISOLATE OF ORGANIC QUINUA (Chenopodium quinoa) The present study had by objective the obtention of a quinoa protein isolate of organic quinoa, originated at the VI Region. The isolate was characterized from the chemical, structural and functional point of view. The results were statistically analyzed by analysis of variance and test of Tukey, at 95 % of confidence. The total protein content of the isolate was 77.2%. The amino acids composition corresponded to that described in references for the flour of quinoa, reason why the extraction of proteins to pH 9 did not affect the balance of amino acids, between the essential amino acids, emphasize the high content of lisine, metionine and arginine. The polypeptide profiles in conditions native and denaturing, without and with 2-Me, indicate that the proteins of the isolate are compound mainly of albumins of the type 2S and globulins 11S. Through the results of spectroscopy UV the presence of globulins was verified. In fluorescence it was observed very similar curves at alkaline pHs, which would indicate that the structure of the protein did not undergo modifications in such conditions. The results of the differential scanning calorimetry, indicate a certain degree of structuring of protein, appearing one endotherm of 13.5 mJ and one temperature of denaturation (td) of 98,1ºC, for the isolate suspended in water. Endotherm was greater for the same sample suspended in pH 9 buffer (29.1 mJ and td of 100.5ºC), which indicates that at pH 9 a reconstruction of proteins takes place. The study of the functional properties indicates that the isolate one of quinoa has a high level of solubility, especially at pH 5, with a value of 76.6%, which increased with pH until reaching a maximum of 94.6%, at pH 11. The water retention capacity (WHC) was good, with values between 2.5 and 3.0 mL/g isolate protein, not being a dependency of pH. In water absorption one obtained relatively elevated results, with a maximum capacity of absorption (WIC) 1.8 g water/g of isolate, and one initial speed of 1.34 g water/g isolate × min. All these characteristics aims at that the isolate is appropriate for the product elaboration such as: drinks, soups, inlays, gels, baking industry, dehydrated foods, and, in general, in the development of protein high functional products.

VIII

I. INTRODUCCIÓN

1.1

Antecedentes Generales Las proteínas son macromoléculas que contienen carbono, nitrógeno,

oxígeno y, casi todas, azufre. En algunas se ha encontrado fósforo, hierro, zinc y cobre (Robinson, 1991). Son las moléculas más abundantes en el interior de las células y son fundamentales en cuanto a su estructura y función, proporcionando los materiales que constituyen los músculos, huesos, glándulas, órganos internos, sistema nervioso, sangre y otros líquidos del cuerpo, como así también la piel, el cabello y las uñas. Son los instrumentos moleculares mediante los cuales se expresa la información genética; además, desempeñan importantes funciones como la catálisis, la regulación metabólica y los procesos contráctiles (Braverman, 1980; Pennacchiotti, 1998). Además de su función nutricional para cubrir necesidades energéticas y de constitución, las proteínas desempeñan una función esencial en la apetencia del alimento, es decir, en sus características organolépticas (Braverman, 1980; Pennacchiotti, 1998). A partir de esta necesidad, se desarrollaron los procesos necesarios para aislar o extraer las proteínas de sus fuentes orgánicas originales. Se obtienen así los denominados aislados proteicos, que constituyen un purificado proteico a partir del alimento o fuente orgánica inicial. De esta manera, se ha llegado a obtener un macronutriente purificado con papel nutricional en la alimentación propiamente dicha, y con un papel funcional en la elaboración tecnológica e industrial de alimentos (Curare, 2006). Entre los alimentos que entregan proteínas de alta calidad biológica (es decir, aportan los aminoácidos esenciales) se encuentran la leche, la carne, el pescado y el huevo (3,2; 20–23; 15-20 y 13,5%, respectivamente). Sin embargo, los granos de los cereales son una buena fuente de proteína para la mayoría de la población mundial, siendo consumidos en cantidades relativamente grandes en las zonas sub-urbanas (FAO, 1970). En la búsqueda de nuevas fuentes de alimentos que pudieran servir para solucionar en parte el déficit proteico-calórico, en los años ’60 se inició el estudio de un pseudo cereal denominado quinoa, quinua o quingua. La quinua (Chenopodium

1

quinoa willd) es un nutritivo pseudocereal que se ha cultivado en forma tradicional en el área andina desde la época incásica. Fue ampliamente usado en la alimentación de los pueblos antiguos de Sudamérica como uno de los alimentos básicos. Sin embargo, el cultivo de la quinua en el altiplano disminuyó después de la conquista española, cediendo el paso a cereales introducidos como el trigo y la cebada (Wahli, 1990).

1.2

Características de la Quinua La quinua es una planta anual herbácea que alcanza alturas entre uno y dos

metros (ver Figura 1); y que presenta acumulaciones de pequeñas semillas en panojas, ubicadas en los extremos superiores de las ramificaciones. Las semillas son bastante pequeñas, de alrededor de 1,5 mm de diámetro, aunque es posible encontrar variedades que llegan hasta 4 mm (Junge y Cerda, 1978).

Figura 1: Planta de Quinua (Chenopodium quinoa willd) Desde tiempos ancestrales la quinua se cultiva en la región del altiplano andino de América del Sur. En la actualidad las mayores áreas productivas corresponden a Perú y Bolivia, aunque también se produce en Colombia, Argentina, Chile y Ecuador. Cabe señalar que es un cultivo que se adapta a condiciones muy variables, pudiéndose cultivar hasta los 3.900 metros sobre el nivel del mar (CIED, 2006). Por otra parte, y debido a que posee raíces pivotantes y fasciculadas, se adapta bien al clima frío y a la escasez de humedad, puesto que las raíces pivotantes aprovechan el agua a mayor profundidad y las raíces fasciculadas el agua superficial (Fontúrbel, 2003).

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Es interesante notar que la quinua es una planta de la que se aprovecha todo. Los tallos rojos o amarillos tienen mucha fibra y, como el grano, son buenos para los animales: ganan peso y producen más leche. Las hojas tiernas de la planta permiten preparar sopas y ensaladas y, tras sacar el grano de las panojas, la cascarilla que envuelve a cada quinua se la quema y, con ella, se elabora la “pasa” o lejía, utilizada en la masticación de coca (Azcui, 2005). Por otra parte, la quinua es evolutivamente distinta a aquellos cereales que contienen gluten, fracción tóxica para los celiacos. En la harina de quinua, muy bajas cantidades de proteínas se encuentran como prolaminas (0,8%), mientras que albúminas (31%) y globulinas (37%) son predominantes (Berti y col., 2004).

1.2.2 Composición de la Semilla de Quinua y su Valor Nutricional Tal como se señalara, toda la planta de quinua tiene diferentes usos, sin embargo el producto primario es la semilla (ver Figura 2). Luego que se realizaran análisis bromatológicos de la composición del grano y se divulgara esta información, la quinua ha adquirido importancia internacional por ser uno de los pocos alimentos de origen vegetal que es rico en proteínas y posee todos los aminoácidos esenciales para el ser humano (ver la composición del grano en la tabla 1). También contiene ácidos grasos esenciales como los ácidos grasos insaturados, destacando su alto contenido de ácido linoleico (50,2-56,1%) y oleico (22,0-24,5%), y moderado de linolénico (5,4-7%) (Walhi, 1990; Ruales y Nair, 1992). Asimismo, la quinua posee un alto contenido de vitaminas del complejo B, C y E, además de minerales tales como: hierro, fósforo, potasio y calcio. Este último se encuentra en la misma concentración que en la leche descremada, mientras que el fósforo es cuatro veces más concentrado que el de ésta (Albarrán, 1993).

Figura 2: Semilla de la quinua

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Tabla 1: Composición Proximal de la semilla de quinua Contenido g/100 g de semilla Calorías 331 Humedad 9,8 Proteína 13,0* Lípidos 7,4 ENN 64,1** Fibra cruda 2,7 Cenizas 3,0 * N x 5,7 ** Por diferencia Fuente: Schmidt-Hebbel y col., 1992

El alto valor nutritivo de la semilla de quinua se debe tanto a su composición química, como a la cantidad y calidad de sus proteínas, que fluctúa entre un 12 y 22%.Como se puede apreciar en la tabla 2, los aminoácidos que contiene la quinua son en mayor cantidad, ácido glutámico, ácido aspártico, isoleucina, lisina, fenilalanina, tirosina y valina por unidad de nitrógeno con respecto a otros cereales. Tabla 2: Contenido de aminoácidos en el grano de quinua, el trigo y la leche (% de aminoácidos/100 g de proteínas) Aminoácido Quinua Trigo Leche Histidina * 4,6 1,7 1,7 Isoleucina * 7,0 3,3 4,8 Leucina * 7,3 5,8 7,3 Lisina * 8,4 2,2 5,6 Metionina * 5,5 2,1 2,1 Fenilalanina * 5,3 4,2 3,7 Treonina * 5,7 2,7 3,1 Triptofano * 1,2 1,0 1,0 Valina * 7,6 3,6 4,7 Acido Aspártico 8,6 Acido Glutámico 16,2 Cisteina 7,0 Serina 4,8 Tirosina 6,7 Argina * 7,4 3,6 2,8 Prolina 3,5 Alanina 4,7 3,7 3,3 Glicina 5,2 3,9 2,0 Fuente: IESN-Chile, 2001.

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La lisina que es uno de los aminoácidos más escasos en los alimentos de origen vegetal, se muestra en la quinua en una proporción que al menos duplica la contenida en los otros cereales. Esta ha sido la base para considerar el reemplazo de las harinas de trigo con quinua a fin de ofrecer un alimento popular con un mejor contenido de este importante aminoácido (Tapia y col., 1979). La distribución de las proteínas entre los diversos tejidos que constituyen el grano no es uniforme, las concentraciones mayores se encuentran en las capas más externas del endospermo, en la aleurona y en el germen. Tampoco se distribuyen uniformemente los diferentes tipos de proteínas, las prolaminas y las glutelinas se encuentran localizadas principalmente en el endospermo; las albúminas y globulinas están en las cubiertas exteriores y en el germen (Primo, 1979). Las múltiples características de la quinua hacen de éste un alimento natural que ayuda al desarrollo y crecimiento del organismo, es fácil de digerir, no contiene colesterol y por ende no forma grasas en el organismo, forma una dieta completa y balanceada y se presume que ayuda a prevenir enfermedades como la osteoporosis, el cáncer de mama, las enfermedades al corazón y otras alteraciones femeninas ocasionadas por la falta de estrógenos durante la menopausia (Zamudio, 2003).

1.2.3 Las Saponinas Las pequeñas semillas de quinua están recubiertas de una delgada membrana o pericarpio que contiene hasta un 4% de saponina, sustancia sumamente amarga y que produce abundante espuma al agitar la semilla en agua (Junge y Cerda, 1978). Las saponinas son sustancias orgánicas de origen mixto, ya que provienen tanto de glucósidos triterpenoides (de reacción ligeramente ácida), como de esteroides derivados de perhidro 1,2 ciclopentano fenantreno. En las formas silvestres y las variedades amargas de quinua, el contenido máximo (aproximado) de saponina es de un 2.8% (aunque el rango es variable de acuerdo a la especie y al ecotipo), valor extremadamente alto comparado con las exigencias actuales del mercado, que fijan como valor límite 0,05% (Fontúrbel, 2003).

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Además del fuerte sabor amargo, se ha descubierto que las saponinas son ligeramente tóxicas para los animales y el ser humano, y por ello deben ser eliminadas antes del consumo del grano. En el organismo, las saponinas ocasionan dolor estomacal, nauseas, ligera diarrea y problemas en la digestión, puesto que la fase jabonosa producida al mezclarse con el agua y al ser agitada por los movimientos peristálticos de las vísceras, hace que se rompan las fuerzas de tensión superficial de las fases líquidas que intervienen en el proceso de digestión (Fontúrbel, 2003). La eliminación de esta sustancia jabonosa se puede realizar en forma manual (lavando el grano con agua y frotándolo hasta que no salga espuma) o mecanizado (usando una peladora que pasa el grano por paletas friccionándolo contra una malla trenzada) (Sepúlveda y col., 2004).

1.3

Empleos de la Quinua La quinua se consume como el arroz, en grano; sus hojas tiernas se comen

guisadas como las acelgas y espinacas; su tallo y hojas verdes se aprovechan como ensalada o en sopas. La agroindustria de los países con las mayores producciones de quinua (entre ellos Bolivia y Perú), transforma este grano preferentemente en hojuelas y harina, debido a que la fécula es un excelente alimento panificable. Esta se usa para elaborar panecillos y galletas y para enriquecer harinas de panificación en la elaboración de: galletas, barritas, tartas, batidos, pasteles y espaguetis, entre otros. Por otra parte, los granos de segunda clase como los subproductos de la cosecha pueden ser empleados en la alimentación de monogástricos, aves, cerdos y rumiantes en condiciones especiales (Ccbolgroup, 2006).

1.4

Mercado Nacional e Internacional Bolivia y Perú son los mayores exportadores con cerca de un 88% de la

producción a nivel mundial, le sigue Estados Unidos con un 6%. La producción en Argentina es usualmente para uso doméstico como semilla o harina. Sin embargo y pese a que su origen es sudamericano, la quinua posee un importante potencial

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agronómico, debido a que puede adaptarse para producir altos rendimientos bajo condiciones adversas. Es así como algunos países europeos como España están estudiando su adaptación al clima Mediterraneo y otros como Dinamarca y Finlandia están interesados en su cultivo (Vilches y col., 2003). El consumo en Chile es bajo, comparado con otros alimentos ricos en carbohidratos como: trigo, arroz y maíz. Esto se debe a que no se conocen las ventajas nutritivas de la quinua y a que existe una oferta irregular del producto (Sepúlveda y col., 2004). Sin embargo, existe un mercado creciente del cereal en vías de un amplio mercado exportable. Es así como en julio del 2002, se realizó la primera exportación de quinua a Estados Unidos. Ese mismo año, los productores agrupados en cooperativas ofrecían sus volúmenes productivos del 2003 a supermercadistas de Canadá, Australia, Inglaterra, España, México y Japón; a la vez una cooperativa de la VI Región suscribía acuerdos comerciales y de marketing con la Sociedad Francesa ABCD, con el objetivo de efectuar una serie de acciones y estrategias destinadas a introducir el uso de quinua chilena en el mercado del Viejo Continente (Diario Pyme, 2003).

1.5

Los Aislados Proteicos y sus Propiedades Se considera aislado proteico aquel cuyo contenido de proteínas es mayor al

70%. En él las proteínas constituyentes deben ser exactamente las que se encontraban en la fuente orgánica inicial, sin haber sufrido procesos de degradación o hidrólisis no deseables (Curare, 2006). Los aislados proteicos pueden ser utilizados en la elaboración de diferentes productos en la industria alimentaria, tales como productos horneados, en la elaboración de bebidas para deportistas, de embutidos, para la preparación de alimentos para bebés, por mencionar algunos. Las proteínas se usan como aditivos en suplementos nutricionales para mejorar el perfil de aminoácidos e incrementar el contenido de proteínas, pero también para aportar beneficios funcionales como emulsificación, estabilización e incremento de viscosidad, mejoramiento de la apariencia, del gusto, la textura y la absorción de agua o aceite (Giese, 1994). En este sentido, el estudio de las propiedades funcionales es muy importante para determinar los usos que pueden darse a las proteínas y aislados proteicos en

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la industria alimentaria. Básicamente, las propiedades funcionales son aquellas propiedades no nutricionales que son capaces de impartir una característica tecnológica específica deseable a un producto dado (Cheftel y col., 1989). Las propiedades funcionales de las proteínas, pueden clasificarse en tres grupos principales (Cheftel y col. 1989): D Propiedades de hidratación: dependientes de las interacciones proteína-

agua. Incluye propiedades tales como la absorción y retención de agua, hinchado, adhesión, dispersibilidad, solubilidad y viscosidad. D Propiedades texturales: dependientes de las interacciones proteína-proteína,

y que intervienen en fenómenos tales como la precipitación, la gelificación y la formación de estructuras diferentes. D Propiedades superficiales: las cuales están relacionadas con la formación de

emulsiones y espumas. Dentro de las propiedades funcionales que se busca modificar a través de las

proteínas

se

encuentran:

solubilidad,

absorción

de

agua

y

aceite,

comportamiento reológico, capacidad emulsificante y espumante (Giese, 1994). Existen muchos estudios respecto a aislados proteicos, los que van desde el popular aislado de soja, hasta alimentos menos difundidos como la mucuma (Adebowale y Lawal, 2003). En el caso del aislado de soja, se ha estudiado muy ampliamente cómo modificar sus propiedades funcionales (Añón y col., 2001). Situación muy distinta es la del aislado proteico de quinua, en cuyo caso prácticamente no se han reportado publicaciones. De hecho, el estudio de la quinua se ha limitado a la composición y caracterización funcional de la semilla y su harina. En este estudio se obtendrá un aislado proteico a partir de quinua orgánica y se investigará las propiedades de hidratación de las proteínas del aislado, las que dependen de las interacciones proteína-agua. Específicamente se estudiará la solubilidad y la capacidad de retención y absorción de agua. Todo ello con el objetivo de producir conocimiento e información que permitan incorporar estas proteínas, de alto valor nutricional, en alimentos destinados al consumo humano.

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II. HIPÓTESIS La preparación de aislados proteicos con características funcionales conocidas constituye un paso preliminar para la formulación de alimentos tecnológicamente funcionales que los incluya como ingredientes. En el caso de los aislados proteicos en general, y en específico de la quínoa, el conocimiento de dichas características es posible a través del discernimiento de la relación estructura-funcionalidad de las fracciones proteicas, la que se podría determinar por medio del estudio de los cambios estructurales de la proteína, frente a distintas condiciones de procesamiento físicas y/o químicas.

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III. OBJETIVOS 3.1

Objetivo General Obtener un aislado proteico a partir de quinua orgánica y estudiar sus

proteínas desde el punto de vista estructural y funcional, para producir conocimiento que permita incorporar estas proteínas, de alto valor nutricional, en alimentos destinados al consumo humano.

3.2

Objetivos Específicos D Obtener un aislado proteico de quinua orgánica. D Determinar el contenido de proteínas de la harina de quinua, a partir de la

cual se obtendrá el aislado. D Realizar un análisis proximal y determinar el perfil de aminoácidos al aislado

proteico. D Determinar el contenido de Fitoestrógenos en el aislado proteico, mediante

el uso de cromatrografía líquida de alta resolución (HPLC). D Caracterizar los perfiles polipeptídicos de las proteínas del aislado de quinua,

mediante electroforesis (PAGE). D Estudiar los cambios conformacionales de los aislados proteicos a distintos

pHs, mediante el uso de técnicas espectrofotométricas (UV y fluorescencia). D Determinar la estabilidad térmica de las proteínas del aislado proteico,

mediante la técnica de calorimetría diferencial de barrido (DSC). D Determinar

las propiedades funcionales que exhiben las proteínas

integrantes del aislado proteico de quinua, mediante el estudio de tres propiedades de hidratación: solubilidad, capacidad de retención de agua y capacidad de absorción de agua, a distintos pHs. D Analizar las relaciones existentes entre las características estructurales que

exhiben las proteínas y sus propiedades funcionales.

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IV. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1

Materiales

4.1.1 Materia Prima: Quinua orgánica pelada en seco, proveniente de la localidad de La Plaza, comuna de Pichilemu, ubicada en la VI Región de Chile. La semilla fue proporcionada por el agricultor Críspulo Leiva. 4.1.2 Reactivos Químicos D Acetato de sodio (CH3COONa) Panreac, Barcelona, España D Acetonitrilo (CH3CN) Panreac. Barcelona, España D Ácido acético glacial (CH3COOH) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania D Ácido bórico (H3BO3) Panreac, Barcelona, España D Ácido clorhídrico (HCl) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania D Ácido orto-fosfórico (H3PO4) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania D Ácido perclórico (HClO4) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania D Ácido sulfúrico (H2SO4) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania D Acrilamida (C3H5NO) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania D Alcohol etílico (Etanol) (C2H60) p.a. Winkler. México D Alcohol etílico absoluto (Etanol) (C2H60) técnico, Comercial Tecnológica

Ltda. Santiago, Chile D Antrona (C14H10O) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania D Azul brillante de coomasie G-250 (C47H50N3NaO7S2) Baker. USA D Azul de bromofenol (C19H10Br4O5S) Sigma. USA D Bis-acrilamida (C7H10N2O2) Sigma. USA D β -mercapto etanol (C2H6OS) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania D Cloruro de sodio (NaCl) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania D Coomassie blue R (C45H44N3O7S2Na) Sigma. USA D Dietil etoximetilenmalonato. Fluka. Buchs, Suiza D Dodecil sulfato de sodio (SDS) (C12H25NaO4S) p.a. Merck. Darmstadt,

Alemania D Estándar de aminoácidos DL-2-Aminobutyric Acid for synthesis, Merck

Schuchardt, Alemania

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D Estándar de proteínas para electroforesis Bio-Rad Precision Plus ProteinTM

Catalog 161-0373 N. (con pesos moleculares de: 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20, 15 y 10). D Estándar de Seroalbúmina de bovino (BSA). Sigma. USA D Estándar de fitoestróngenos Daizenine Genist. Sigma. USA D Fosfato de potasio dihidrogeno (KH2PO4) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania D Fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4*H2O) p.a. Merck. Darmstadt,

Alemania D Glicerol (C3H8O3) Sigma. USA D Glicina (C2H5NO2) Sigma. USA D Glucosa monohidratada (C6H12O6*H2O) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania D Hidróxido de sodio (NaOH) técnico. W&Z D Hidróxido de sodio (NaOH) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania D Indicador fenolftaleina (C20H14O4) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania D Indicador rojo de metilo (C15H15N3O2) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania D Persulfato de amonio (PSA) ((NH4)2S2O8) Sigma. USA D Sodio fosfato bibásico anhidro (Na2HPO4) p.a. Merck. Darmstadt, Alemania D Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4*5H2O) p.a. Merck. Darmstadt,

Alemania D Sulfato de potasio (K2SO4) p.a. Purom D TEMED (N,N,N`,N`-Tetramethiletilendiamina) Sigma. USA D Tris (C4H11NO3) p.a. J.T.Baker. USA

4.1.3 Equipos e Instrumentos D Agitador eléctrico vortex Thermolyne, tipo 37600 Mixer, modelo Nº M37610-

26, serie Nº 871570819103 D Agitador magnético Magnetic Stirrer HI190M Hanna Instruments Nº S229370 D Agitador Heavy Duty KitchenAid Inc. St Joseph, model K5SS, Michigan USA D Balanza analítica Precisa 125 A Swiss Quality D Balanza granataria AND, modelo EK 120-A D Balanza granataria Precisa 1620 D D Baño de agua Haake Tipo FK Nº 751117, fabricado en Alemania D Batería de tamices

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D Calorímetro diferencial de barrido (DSC) Mettler Toledo 822e D Cámara de refrigeración FríoLux D Campana de extracción D Centrifuga Heraeus Sepatech Suprafuge 22, fabricada en Alemania D Conjunto para electroforesis Bio-Rad con kit para preparación de geles, cuba

de corrida y fuente de poder D Desecador D Destilador Büchi 323 tipo B-323 Nº1258804, fabricado en Suiza D Digestor Büchi 426 tipo B-426RC Nº 1270878, fabricado en Suiza D Espectrofotómetro de fluorescencia Perkin Elmer, modelo LS50B, serie Nº

32938 L225-0105 D Espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 11 Nº BC11 230V,serie NR30031 D Espectrofotómetro UNICAM UV/Vis, tipo UV3-200, Nº UV 3022809, fabricado

en Inglaterra D Estufa Heraeus Instruments D-63450 Hanau, tipo UT 6200, fabricada en

Alemania D Estufa Heraeus, tipo KB 600 D Estufa Heraeus W.C. Heraeus GMBH Hanau, tipo TU 60/60, Nº 2760-02,

fabricada en Alemania D Estufa WTB Binder Tipo 1924090000200 Nº 940107 73532 Tuttlingen,

Alemania D Freezer medical Sanyo, modelo MDF-U332, Nº 606033941, fabricado en

Japón D Mechero D Microcentrifuga HermLe Z160M Hersteller Spintron, fabricada en Alemania D Mini secador Spray Dryer B-191, Büchi, fabricado en Suiza D Molino de impacto Retsh Muhle GmbH West-Germany, type SR-2 Nº73454 D Mufla Wild Barfiel tipo M254 Nº c2441557, fabricada en Inglaterra D pHmetro microprocesador pH 537 WTW, fabricado en Alemania D Placa calefactora Gerhardt Bonn tipo H52 Nº 443792 D Refrigerador Mademsa Evolution 3500 G no frost system D Sistema HPLC Merck Hitachi bomba ternaria L6200 con inyector Rheodyne

7725; loop de 20 µl, Detector espectrofotométrico UV-Visible modelo 484 de

13

longitud de onda variable, Integrador D-2500; Columna Nova Pack RP18 (3,9 x 300 mm, con un tamaño de partícula de 4 µm), acoplado a un computador con el software Clarity versión preliminar 2.4.1.43, con licencia Waters. D Termómetro

4.1.4 Insumos y Utensilios D Agua destilada y bidestilada D Bandejas de acero galvanizado de 30 mallas de 44 cm x 24 cm D Bolsas de papel Kraft D Cápsula de aluminio D Cápsula de porcelana D Cubetas para electroforesis D Cubetas de cuarzo D Cubetas de plástico D Espátulas y microespátulas D Filtro Millipore membrana 6V (Durapore) D Frascos de vidrio D Fuentes plásticas D Gradillas D Guantes D Hielo D Jeringas desechables Dynatech de 5mL D Material de vidrio (buretas, pipetas de aforo, pipetas gravimétricas, matraces

erlenmeyer, matraces aforados, matraz kitasato, balones, vaso con doble camisa, dedales, varillas de agitación, tubos de ensayo con tapa con teflón, varillas de reflujo, etc.) D Micropipetas D Mortero D Nitrógeno D Papel absorbente D Papel Whatman Nº1 D Parafilm D Pinzas

14

D Plumavit D Potes de plástico D Rejilla de asbesto D Soporte para electroforesis D Trípode D Tubos de digestión D Tubos Ependorf D Utensilios de cocina D Vidrios para polimerización y peineta (plástico dentado)

4.2

Métodos

4.2.1 Obtención de la Harina de Quinua Desgrasada Se seleccionaron los granos mediante tamizado, retirándose toda materia extraña. Luego se lavaron con abundante agua corriente y mediante frotación, con el objetivo de eliminar las saponinas. Dicho proceso se llevó a cabo hasta que no se produjo más espuma, lo cual indica que las saponinas fueron efectivamente retiradas. Posteriormente, se llevó los granos a una estufa, a 50º C, hasta alcanzar la humedad de acondicionamiento del grano para la elaboración de la harina (15±1%). Para comprobar que se obtuvo la humedad deseada, se extrajo una muestra de 5 g, a la que se le determinó humedad por el método rápido, el que consiste en someter la muestra a 156º C, durante 15 min (Pearson, 1970). Luego, se molió los granos usándose un molino de martillo-cuchillo (Retsch tipo SR-2), proporcionado por el laboratorio de Operaciones Unitarias de la facultad. Para desgrasar la harina, ésta fue suspendida en hexano en una relación 1:10. La suspensión se mantuvo durante 24 horas, a aproximadamente 4º C, bajo agitación continua. Después, se filtró la harina al vacío con papel Whatman Nº 1 y se secó a temperatura ambiente hasta la completa eliminación del hexano. Finalmente se almacenó en bolsas de papel Kraft, dentro de un desecador.

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4.2.2 Obtención del Aislado Proteico de Quinua Se suspendió la harina desgrasada en agua al 10 % p/v. Luego, para solubilizar las proteínas, se ajustó el pH de la solución a 9,0, con NaOH 2N, manteniéndose a temperatura ambiente y agitación, por 30 minutos. Posteriormente, se centrifugó durante 60 min. a 3.400 rpm a 15 ºC (ver Figura 3).

Figura 3: Solubilización de las proteínas a pH 9 (izquierda) y posterior centrifugación (derecha) Para precipitar las proteínas se ajustó el pH del sobrenadante, llevándolo a pH 5 (cercano al punto isoeléctrico), con HCl 2N. Luego se centrifugó a 3.400 rpm por 60 min, a 4º C. Inmediatamente después, se resuspendió el precipitado para neutralizarlo, usándose para ello NaOH 0,1 N (Martínez, 1997). El secado del aislado se llevó a cabo mediante secado spray (mini secador Büchi, B-191), bajo las siguientes condiciones: Temperatura del aire: 120º C Concentración de la suspensión del aislado: 20% Flujo del aire: 600 Aspiración: 90% Alimentación: 15%

Figura 4: Aislado proteico de quinua obtenido a pH 9

16

Figura 5: Diagrama de la Obtención del Aislado Proteico de Quinua a pH 9

Suspensión de la harina de quinua desgrasada en agua al 10 % p/v

Ajuste a pH 9 con NaOH 2N

Agitación por 30 min a temperatura ambiente

Centrifugación a 3.400 rpm por 1 h a 15º C

Ajuste del pH del sobrenadante a 5,0 con HCl 2N

Centrifugación a 3.400 rpm por 1h a 4º C

Resuspensión del precipitado en agua al 20%

Neutralización con NaOH 0,1N

Secado spray a 120º C

17

4.2.3 Caracterización Química 4.2.3.1 Composición Química: Se realizó análisis proximal, lo que comprendió la determinación del contenido de: a. Proteínas. Se determinó proteínas totales mediante el método de Kjeldahl (Official Method AOAC 920.53, 1995). El método consiste básicamente en la digestión ácida total de las proteínas y conversión cuantitativa del nitrógeno a NH3, el que se valora por retrotitulación. El factor de conversión utilizado tanto para la harina de quinua como para el aislado proteico es 5,77 (Schmidt-Hebbel, 1981). b. Carbohidratos. A través del método colorimétrico de reacción de Antrona, el cual implica digerir 1,0 g de muestra con ácido perclórico. Posteriormente se procede a una serie de diluciones, para finalmente tomar 1 mL de la solución la que se hace reaccionar con 5 mL de Antrona. Los almidones hidrolizados, junto con los azúcares solubles, se determinaron colorimétricamente mediante espectrofotómetría a una longitud de onda de 630 nm, utilizándose patrones de glucosa de 0,05 y 0,1 mg/mL (Osborne y Voogt, 1986). c. Humedad. Se empleó el método gravimétrico propuesto por la AOAC (Official Method 935.29, 1995), lo que implicó colocar la muestra en estufa a 105º C, hasta peso constante. d. Cenizas. Se realizó de acuerdo al método oficial de la AOAC (Official Method 923.03, 1995), el cual consistió en calcinar la muestra a 550º C, determinándose gravimétricamente el contenido de cenizas.

4.2.3.2 Perfil de Aminoácidos: Se hidrolizó las muestras (aproximadamente 2 mg) con ácido clorhídrico 6N, durante 24 horas, a 110ºC. Posteriormente, el ácido se evaporó a sequedad y los aminoácidos se solubilizaron con tampón de borato de sodio 1M (pH 9,0), aforando a 25 mL. Seguidamente, se derivatizó los aminoácidos, para lo cual se colocó 5 mL de la solución anterior en un tubo de ensayo con tapa de teflón más 4 µl de dietiletoximetilenmalonato. La derivatización se llevó a cabo en un baño de agua a 50ºC, durante 50 min, bajo agitación constante.

18

Finalmente, 20 µl de la muestra derivatizada se inyectaron en un cromatógrafo HPLC con detector UV-Visible Merck Hitachi, modelo 484, longitud de onda 280 nm, acoplado a un computador con el software Clarity versión preliminar 2.4.1.43, con licencia Waters. La resolución de los derivados de aminoácidos se logró usando una columna Nova Pack RP18 (3,9 x 300 mm, con un tamaño de partícula de 4 µm) y un sistema de gradiente binario a temperatura ambiente, empleando como fase móvil tampón de acetato de sodio 25mM (pH 6,0) y acetonitrilo, de acuerdo al detalle descrito en el Anexo 4 (Alaiz y col., 1992).

4.2.3.3 Determinación de Fitoestrógenos: El método utilizado consistió en hidrolizar las muestras (1 g) con 24 mL de ácido clorhídrico 1N en baño de agua, a 98ºC, durante 2 horas. Luego se extrajo los fitoestrógenos con 100 mL de acetonitrilo. Enseguida, se diluyó 1 mL del sobrenadante obtenido con 1 mL de agua destilada, dilución que luego de agitada se filtró, utilizándose para ello una jeringa con porta filtro Millipore. La determinación de los Fitoestrógenos se realizó mediante cromatrografía líquida de alta resolución (HPLC Merk Hitachi), utilizando el mismo equipamiento señalado en la sección 4.2.3.2 y un sistema de gradiente binario de metanol y agua como fase móvil, de acuerdo al detalle descrito en el Anexo 4 (Wang y col., 1990).

4.2.4 Caracterización Estructural de las Fracciones Proteicas 4.2.4.1 Perfiles Polipeptídicos: Mediante Electroforesis se analizó y caracterizó los polipéptidos que integran el aislado proteico de quinua. Ello fue realizado de acuerdo al método descrito por LaemmLi U. K. (1970), el cual detalla la técnica PAGE, la que se realiza en función del estado de las proteínas (nativo o desnaturalizado). En la electroforesis nativa (PAGE-nativa), se somete a las proteínas a migración en un campo eléctrico. En esta situación las proteínas migran en función de su carga, su tamaño y forma, mientras que en la electroforesis desnaturalizante (PAGE-SDS), la más común, las proteínas son sometidas a migración en un campo eléctrico en presencia de un detergente aniónico, lo que asegura la completa

19

desnaturalización (pérdida de la estructura tridimensional). En esta situación la migración es proporcional al tamaño molecular de la molécula, pero no a su carga. El aislado proteico de quinua fue sometido a ambos tipos de electroforesis, además de la electroforesis desnaturante con β-mercaptoetanol (2-Me). Para la realización de estas pruebas se elaboró geles de 1 mL de espesor. En el caso de la electroforesis desnaturante, sin y con β-mercapto etanol, se usó gel concentrador al 5% y gel separador al 12%. Se cargó 10 µl de muestra y 7 µl de estándar. Las masas moleculares de los polipéptidos fueron calculadas usando un estándar de proteínas con los siguientes pesos moleculares: 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20, 15 y 10 kDa. En el caso de la electroforesis nativa se usó gel separador al 5%, y no se carga estándar (ver el detalle de estos métodos en el anexo 1).

4.2.4.2 Fluorescencia: Se preparó dispersiones al 1% del aislado proteico en buffer a los siguientes pHs: 3, 5, 7, 9 y 11, en tubos ependorf (ver detalle de los buffer en anexo 3). Posteriormente se sometió los tubos a agitación intensa en vortex, a intervalos de 15 minutos, durante 1 hora, a temperatura ambiente. A continuación, se centrifugó los tubos a 10.000 rpm, durante 30 minutos, a 15° C. Luego, se midió la absorbancia del sobrenadante a 260 y 280 nm, datos que se utilizaron en la siguiente fórmula, para conocer los mg de proteína por mL de solución: Proteína = 1,55 * A280 – 0,76 * A260 [mg/mL] El propósito del paso anterior fue estandarizar la concentración de las dispersiones de los distintos pHs, diluyéndolas, para que todas tuvieran una concentración de 0,02 mg/mL. Una vez estandarizadas las muestras, se midieron en un espectrofotómetro de fluorescencia (Perkin Elmer, modelo LS50B) con una excitación de 270-290 nm, para obtener el espectro de emisión en el rango de 300 a 500 nm, con una velocidad de barrido de 300 nm/min (Permyakov, 1993; Mathews y col., 2002; Abugoch, 2006).

20

4.2.4.2 Espectroscopia UV: Se preparó diluciones del aislado al 1% en buffers de pHs: 3, 5, 7, 9 y 11 (ver detalle de los buffers en anexo 3). Posteriormente se agitó las muestras vigorosamente en vortex cada 15 min, hasta completar 1 hora. Concluida la etapa anterior, se centrifugó las muestras por 30min a 10.000 rpm. Para realizar la medición se diluyó 5 veces el sobrenadante obtenido de la centrifugación (Mathews y col., 2002; Abugoch, 2006). Finalmente, se midió la absorción de las muestras en el espectrofotómetro UNICAM UV/Vis, efectuándose un barrido de longitudes de onda, que cubrió desde los 250 hasta los 450 nm.

4.2.4.4 Calorimetría Diferencial de Barrido: Se efectuó una caracterización térmica de las proteínas, para lo cual se preparó dispersiones al 20% con buffer de pH 9 y agua. Se colocó entre15 y 20 mg de dicha mezcla en una cápsula, previamente pesada y tarada la cual se selló y llevó al equipo de calorimetría diferencial de barrido (Mettler Toledo 822e). Se trabajó desde los 10 a los 120º C, con un régimen de calentamiento de 10º C por min. Como referencia se utilizó aislado proteico de quinua con la proteína previamente desnaturalizada.

4.2.5 Determinación de las Propiedades Funcionales 4.2.5.1 Solubilidad: Se preparó dispersiones proteicas al 1% p/v en buffers que cubrieron desde el pH 3 al pH 11 (detalle de las fórmulas de los buffers en el anexo 3). Las muestras se sometieron cada 15 minutos a agitación intensa y breve en vortex a temperatura ambiente, durante 1 hora. En seguida, se centrifugaron los tubos a 10.000 rpm, durante 30 minutos, a 15° C (Scilingo, 2000). La proteína que quedó en el sobrenadante se cuantificó a través del método descrito por Bradford, M. M. (1976) (ver detalles de este método en el anexo 2).

21

4.2.5.1 Capacidad de Retención de Agua (WHC): En tubos ependorf, previamente pesados, se elaboró dispersiones proteicas al 1% p/v en agua y en buffers de pH: 3, 5, 6, 7 y 9. A continuación, los tubos se sometieron a agitación intensa en vortex, a intervalos de 15 minutos, durante 1 hora, a temperatura ambiente. Posteriormente, se centrifugaron los tubos a 10.000 rpm, durante 30 minutos, a 15°C. Luego se determinó la masa de precipitado obtenido, para lo cual antes se dejó invertidos los tubos durante 10 min sobre papel absorbente. Paralelamente, se cuantificó la cantidad de proteína solubilizada en el sobrenadante después de la centrifugación, lo que se efectuó utilizándose el método de Bradford M. M. A (1976) (ver detalles de este método en el anexo 2). La capacidad de retención de agua, se obtuvo a través de la siguiente fórmula: WHC = m2 – (m1 – m3) [mL agua / g muestra] m1 * d Donde: m1: masa de muestra pesada en gramos m2: masa del precipitado obtenido en gramos m3: masa de la proteína soluble en gramos d: densidad del agua a 25° C

4.2.5.3 Capacidad de Absorción de Agua (WIC): La WIC es la cantidad máxima de agua que un gramo de aislado es capaz de absorber espontáneamente, a una temperatura definida. Para determinarla se utilizó un equipo similar al diseñado por Baumann (1967), el que consiste en un embudo buchner conectado, a través de una manguera flexible, a una pipeta de 1 mL graduada (ver Figura 6). Una vez instalado el equipo, se llenó con agua, evitando la incorporación de burbujas. Luego se colocó el papel filtro dentro del embudo, dejándolo que embebiera agua durante aproximadamente 5 min. Posteriormente, se eliminó el exceso de agua sobre el papel filtro, con el objetivo de enrasar a cero la columna de agua en la pipeta. Se verificó que la nivelación del equipo no variara durante un lapso de 10 min, tras lo cual se esparció rápidamente 60 mg del aislado sobre el papel filtro húmedo, para formar una monocapa uniforme. Al mismo tiempo, se

22

disparó un cronómetro para realizar mediciones a través del tiempo, registrándose el retroceso de la columna de agua en la pipeta, hasta que no hubo más variación (Añón y col., 2000).

Figura 6: Esquema del equipo de absorción de agua Los datos obtenidos se graficaron colocando el tiempo en minutos en el eje de las abscisas y los mL de agua absorbidos por gramo de aislado en el eje de las ordenadas. A partir de él se obtuvo la WIC, el tiempo de equilibrio (te) y la velocidad inicial de absorción de agua (vi) (Abugoch, 2006). 4.2.6 Análisis Estadístico Se evaluó estadísticamente los resultados obtenidos usando la media aritmética y la desviación estándar. Asimismo, se efectuó análisis de varianza, con un nivel de confianza del 95%, para determinar si existen diferencias significativas entre los distintos pHs estudiados. Este último análisis se llevó a cabo empleándose el programa StatGraphics Plus 4.0.

23

V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1

Caracterización Química del Aislado Proteico de Quinua

5.1.1 Composición Proximal A partir de harina de quinua desgrasada con 12,7 ± 0,4 % de proteína, se obtuvo un aislado proteico con un contenido de proteína en base húmeda del 72,5 ± 0,14 %. En la tabla 3 se observa la composición proximal del aislado. Tabla 3: Composición proximal del aislado proteico de quinua A9 Componente % Proteínas* 77,2 ± 0,15 Humedad 6,1 Hidratos de carbono* 18,8 ± 0,52 Cenizas* 3,0 *En base seca El aislado fue tamizado con el objetivo de determinar el tamaño de partícula, estableciéndose que un 2,73% del aislado se encontró entre 0,25 y 0,5 mm, un 76,6% entre 0,125 y 0,250 mm y un 20,67% presentó un tamaño de partícula inferior a 0,125mm. La actividad de agua (aw), determinada en un equipo Novasina, fue de 0,326, medida a 25º C. El aislado de quinua fue obtenido solubilizando las proteínas a pH 9, por lo que en adelante se denominará A9. De esta manera se diferenciará de otro aislado, obtenido en condiciones similares, pero a pH 11 (Silva, 2006) el que se designará como A11. El rendimiento de A9 fue similar al de A11, esto es próximo al 5 %, aunque el contenido de proteínas para A11 fue mayor, siendo de un 83,5 %, en base seca. El contenido de proteínas también fue inferior que el obtenido en aislados de amaranto (otro pseudocereal), en cuyo caso se han reportado contenidos proteicos del 90% (Martínez y Añón, 1996) y del 84,4%, en condiciones de extracción muy similares a las de la quinua (Abugoch, 2006).

24

5.1.2 Perfil de Aminoácidos La composición en aminoácidos es de particular interés para el nutricionista, puesto que el valor nutritivo de una proteína depende primariamente de su patrón o perfil de aminoácidos (Braverman, 1980). La quinua es reconocida por su alto valor nutritivo, destacándose especialmente su balance aminoacídico. En efecto, la quinua contiene 16 aminoácidos, 10 de los cuales son esenciales: histidina, fenilalanina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, treonina, triptófano, valina y arginina, debiendo ser aportados por la dieta. El contenido de lisina es importante en la harina de quinua, el que duplica el de otros cereales (aminoácido principal en legumbres), siendo también uno de los aminoácidos más escasos en los alimentos de origen vegetal. La quinua también es rica en metionina (aminoácido principal en cereales), fuente principal de azufre y necesaria para el metabolismo de la insulina. Asimismo, es alta en arginina y ácido glutámico y tiene niveles adecuados de histidina, isoleusina, valina y treonina (Chauhan, 1992; Drzewiecki y col., 2003; Valenzuela, 1997). En la tabla 4 se muestra el contenido de algunos aminoácidos presentes en el aislado proteico de quinua A9. Tabla 4: Contenido de aminoácidos en aislado proteico de quinua A9 Aminoácido g/100 g muestra en base húmeda Acido Aspártico 6,16 ± 0,08 Acido Glutámico 12,67 ± 0,51 Serina 3,98 ± 0,05 Histidina 1,98 ± 0,03 Glicina 4,10 ± 0,11 Treonina 3,34 ± 0,09 Arginina 7,59 ± 0,25 Alanina 2,91 ± 0,07 Prolina 0,004 ± 0,002 Tirosina 2,71 ± 0,05 Valina 3,86 ± 0,08 Metionina 1,68 ± 0,02 Cistina 0,45 ± 0,13 Isoleucina 3,30 ± 0,07 Leucina 5,61 ± 0,13 Fenilalanina 3,43 ± 0,06 Lisina 4,01 ± 0,05 Total 67,80 ± 0,25

25

Los valores de aminoácidos para la harina de quinua reportados en la literatura difieren de acuerdo a la variedad de quinua estudiada y la cantidad total de proteína calculada (Tapia y col., 1979). En la Figura 7 se muestra el contenido promedio de aminoácidos, en g/100 g de proteína, para tres ecotipos de harinas quinua de la VI Región (Villarroel, 2005; Gajardo, 2005) y los valores para los aislados de quinua A9 y A11 (Silva, 2006).

20,00

Contenido (g/100 g proteina)

18,00

A9

16,00

harinas VI Región

14,00

A11

12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00

Ac .

A Ac spá . G rtic o lu tá m ic o Se r H ina ist id in a G li c in tre a on in Ar a gi ni n Al a an in a Ti ro sin a Va li m et na io ni na ci st i Is ol na eu ci n Le a u Fe ci na ni la la ni na Li si na

0,00

Figura 7: Contenido de aminoácidos en los aislados A9 y A11 y dos harinas de quinua de la VI Región, expresados en g/100 g de proteína. Se evidencia una leve disminución en el contenido de algunos aminoácidos del aislado A9 en comparación con los valores promedio para las harinas de quinua orgánica provenientes de la VI Región. Esto puede atribuirse a la pérdida de algunas proteínas durante el proceso de elaboración del aislado, ya sea durante la solubilización a pH 9, o en la precipitación de las mismas a pH 5. No obstante lo anterior, se puede afirmar que el perfil aminoacídico del aislado A9 es muy similar al de las harinas de quinua, por lo que el aislado mantendría las propiedades nutritivas de la quinua. En la tabla 5 se presenta el contenido de los aminoácidos esenciales y el patrón de referencia propuesto por la

26

FAO/OMS, los que corresponden a los requerimientos para niños preescolares entre 2 y 5 años (FAO, 1970). Tabla 5: Contenido de aminoácidos esenciales en el aislado de quinua A9 y patrón de referencia FAO (mg/g proteína) Aminoácidos Aislado de quinua A9 Patrón FAO/OMS Histidina 19,8 19 Isoleucina 33 28 Leucina 56,1 66 Lisina 40,1 58 Metionina + Cisteina 21,3 25 Fenilalanina + Tirosina 61,4 63 Treonina 33,4 34 Triptófano * 11 Valina 38,6 35 * No determinado Se observa en la tabla 5 que algunos valores de contenidos de aminoácidos para el aislado de quinua se encuentran por debajo del patrón de referencia, especialmente la leucina y la lisina, mientras que para los otros aminoácidos los valores son muy cercanos o los superan. Por lo tanto, si bien la proteína no es completa para el grupo de niños de 2 y 5 años, grupo que posee la mayor demanda de requerimientos de aminoácidos, sí lo sería para los adultos los cuales poseen requerimientos bastante inferiores a los de los preescolares.

5.1.3 Contenido de Fitoestrógenos La determinación de fitoestrógenos en el aislado proteico de quinua mostró su ausencia. Sin embargo tampoco se hallaron estas sustancias en la harina a partir de la cual se elaboró el aislado. Cabe señalar que en los tres ecotipos de quinua utilizados anteriormente, también procedentes de la VI Región, se encontró fitoestrogenos del grupo isoflavonas, específicamente Genisteina y Daidzeina (Araneda, 2004), por lo tanto, en estudios posteriores deberá determinarse si estos compuestos quedan en el aislado o se pierden en el proceso de extracción de la proteínas. Son conocidas las propiedades benéficas para la salud de los fitoestrógenos, los que se han asociado principalmente a una menor incidencia de ciertas

27

patologías,

como

la

enfermedad

cardiovascular

y

algunos

cánceres

hormonodependientes, sin embargo también se ha planteado que su consumo puede producir efectos adversos como interferencia en los procesos reproductivos (Wang y col., 1990), por lo que la posibilidad de obtener aislados proteicos de quinua sin fitoestrógenos no es del todo desfavorable.

5.2

Caracterización Estructural de las Fracciones Proteicas

5.2.1 Perfiles Polipeptídicos del Aislado Proteico de Quinua A9 5.2.1.1 Electroforesis Nativa (PAGE-Nativa) En la electroforesis nativa las proteínas migran en función de su carga, de su tamaño y de su forma. Además se mantienen en ciertos casos las interacciones entre subunidades y entre proteínas, separándose los complejos (UB, 2006). En la Figura 8 se presenta el gel del aislado proteico de quinua (A9) obtenido en condiciones nativas. En él se visualizan principalmente 3 bandas, dos de ellas (a y b), con menor nivel de migración, debieran tratarse de proteínas de mayor tamaño o menor carga negativa, mientras que la tercera banda (c) correspondería a moléculas más pequeñas o con mayor carga negativa, lo cual les permitió mayor movilidad en el gel.

Figura 8: PAGE-Nativa de los aislados proteicos de quinua A9 y A11

28

Por otra parte, debido a que la primera banda (a) es de mayor intensidad que las restantes, se prevé una mayor concentración de este tipo de proteínas. De acuerdo a lo señalado por Martínez y Añón (1996), para aislados de amaranto extraídos en condiciones similares, dichas proteínas con baja movilidad (tanto a, como b), podrían corresponder al tipo albúminas y globulinas, las cuales están presentes en la quinua. En condiciones nativas las proteínas de quinua están compuestas principalmente por dos tipos de polipéptidos, albúminas del tipo 2S y globulinas 11S, ambas estabilizadas por puentes disulfuro, con masas moleculares de 3 - 4 kDa y 7 - 9 kDa (Brinegar y Goundan, 1993; Brinegar y col., 1996). Estos resultados son prácticamente los mismos que los obtenidos por el aislado proteico A11 (Silva, 2006), esto es: el mismo número de bandas, con un nivel de movilidad muy similar (ver Figura 8). Por otra parte, en pruebas de electroforesis nativa realizada a muestras de harina de quinua, también de la VI Región (Gajardo, 2005), se obtuvo sólo 1 banda y con un alto grado de movilidad (mayor a “c”, en la Figura 8). En este sentido, podría conjeturarse que en el proceso de obtención del aislado proteico de quinua hubo agregación proteica, dando como resultado proteínas de mayor tamaño y por ende con menor movilidad.

5.2.1.2 Electroforesis Desnaturante (PAGE-SDS) En la electroforesis en gel con detergente SDS, la cadena polipeptídica se despliega y se rodea de moléculas de SDS, cargándose negativamente. Dicha carga es proporcional a su longitud, y por lo tanto a su peso molecular, de modo que las moléculas migran con movilidades relativas de acuerdo a su peso molecular (Mathews y col., 2002). En la Figura 9, se muestra el gel realizado para el aislado proteico de quinua (A9) en condiciones desnaturantes. En el primer carril, de izquierda a derecha, se observa el estándar de peso molecular; en el siguiente (a) el perfil proteico sin la presencia de β-mercaptoetanol (2-Me); mientras que en la última línea (b) se visualiza el perfil polipeptídico en presencia del agente reductor de enlaces disulfuro. Este procedimiento se efectúa

para distinguir entre las subunidades que se

mantienen juntas mediante puentes –S-S- y las que se mantienen unidas sólo mediante fuerzas no covalentes.

29

Figura 9: PAGE-SDS del aislado A9 (a) sin 2-Me y (b) con 2- Me En lo que respecta a los perfiles sin 2-Me, son 11 las bandas más intensas, y por lo tanto las proteínas presentes en el aislado corresponden en su mayoría a dichos pesos moleculares. Las masas moleculares de dichas bandas son: 111,9; 74,9; 52,5; 32,4; 26,7; 19,8; 19,0; 14,8; 14,3; una banda con peso molecular mayor a 250 kDa y una aglomeración entre 13,1 y 10,9 kDa. Las globulinas tipo 11S se caracterizan por tener dos grupos heterogéneos de polipéptidos a 30 - 40 kDa (subunidades ácidas) y a 20 - 25 kDa (subunidades básicas), las cuales son ligadas por puentes de disulfuro (Brinegar y Goundan, 1993). Por lo tanto, las bandas de A9 sin 2-Me (ver carril a en la Figura 9), con pesos moleculares de 32,4; 30,3; 22,8 y 20,7 kDa, y que en presencia de 2-Me desaparecen (ver carril b), corresponderían a dichas globulinas. En lo referente a la electroforesis con 2-Me, se aprecian menos bandas y de menores pesos moleculares que sin 2-Me. Con ello se evidencia que las bandas con masas superiores a 15 kDa están unidas por puentes disulfuro. Los enlaces de dichas proteínas (los que ayudan a estabilizar la estructura terciaria y cuaternaria de la proteína intra e intermolecular), en presencia del agente reductor se rompieron para convertirse en proteínas de menor peso molecular (ver Figura 9, carril b), específicamente de: 14,8; 12,5; 11,5 y 10,2 kDa.

30

De acuerdo a un estudio de las proteínas 2S en quinua (Brinegar y col., 1996), estos polipéptidos tienen masas moleculares entre 8 y 9 kDa bajo condiciones reductoras. La banda con masa molecular de 10,2 kDa, en el carril b (ver Figura 9), podría corresponder a este tipo de polipéptido, teniendo en realidad masas moleculares un poco inferiores a las entregada por la ecuación del estándar de proteínas.

5.2.2 Fluorescencia El comportamiento de los residuos triptofano, tirosina y fenilalanina puede dar información útil para caracterizar y detectar modificaciones en proteínas. El triptofano cuando es excitado a 295 nm genera fluorescencia que es muy sensible a los cambios en el entorno vecino a él (Royer, 1995). Sin embargo, la intensidad de dicho espectro es mayor que la de fenilalanina y tirosina, los que resultan apagados, de modo que el triptofano se constituye como el fluorófobo dominante. De hecho, la fluorescencia del triptofano persiste aunque el aminoácido forme parte de la estructura proteica (Cheftel y col., 1989). En la Figura 10 se presenta el espectro de emisión del aislado proteico de quinua (A9), a distintos pH, con una misma fuerza iónica, igual a 0,5. Se graficó el promedio de cada ensayo y su duplicado.

Intensidad de fluorescencia

200

160

pH 3 pH 5

120

pH 7 pH 9 pH 11

80 40 0 305

330

355

380

405

430

455

480

505

Longitud de onda (nm)

Figura 10: Espectros de fluorescencia de A9 en función del pH, a una fuerza iónica constante igual a 0,5

31

Se aprecia en la figura anterior una clara similitud entre las curvas a pH alcalinos, lo que indicaría que la estructura de las proteínas del aislado A9 en dichas condiciones no se vería modificada, especialmente entre los pH 7 y 11, en los cuales las curvas son casi coincidentes. Respecto a la intensidad de fluorescencia (ver Figura 11) se observa que éstas son mayores a pHs alcalinos, con la excepción del pH 11, donde la intensidad máxima es prácticamente la misma que a pH 7. Se advierte, además, que la disminución de la intensidad de la fluorescencia a pHs ácidos (pH 3 y 5) es mayor al incremento de la misma experimentada a pHs alcalinos. Resultados similares se registraron en pruebas de fluorescencia a un aislado proteico de quinua obtenido a pH 11 (A11) (Silva, 2006) y a aislados proteicos de amaranto obtenidos a pHs 9, 11 y 9-11. Dichas variaciones se pueden atribuir a cambios en el entorno del triptofano inducidos en una misma proteína por efecto del pH o a la presencia de distintas especies con diferente contenido de triptofano los que tendrían entornos

Intensidad de Fluorescencia

moleculares diferentes (Abugoch, 2006).

250,0

d

200,0

c

c

150,0 100,0 50,0

b a

0,0 3

5

7

9

11

pH

Figura 11: Intensidad de fluorescencia del aislado de quinua (A9) a distintos pHs y a una fuerza iónica constante igual a 0,5 En cuanto a los valores de longitud de onda máxima (λmáx, ver tabla 6) no se observa una tendencia de corrimiento entre los mismos. De hecho, en lo que respecta a los pHs 5 al 11 no existen diferencias significativas entre los valores

32

obtenidos. Sólo el espectro correspondiente al pH 3 se aleja de los restantes, con un valor mayor. Tabla 6: Longitud de onda máxima obtenida para el aislado A9 a distintos pHs e igual fuerza iónica (0,5) pH Longitud de onda máxima (nm) 3 366,8 ± 0,4a 5 335,5 ± 0,7b 7 334,3 ± 1,1b 9 335,8 ± 1,1b 11 335,3 ± 1,8b Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas, con un nivel de confianza del 95% El estudio de los espectros de fluorescencia que se obtiene de los aislados solubles a distintos pHs será la resultante de la composición de las proteínas en cada condición y de la influencia de cada pH sobre su conformación (Abugoch, 2006). En este sentido, si se compara los resultados anteriores con los del aislado de quinua A11 se aprecia que para ambos la forma de los espectros es similar, lo que podría sugerir que la composición de ambos aislados es también parecida. Sin embargo, las intensidades de los espectros de A9 son mayores que los de A11, lo que indicaría que la composición proteica del aislado A9 posee mayor concentración de fluorófobos que A11.

5.2.3 Espectroscopia de Absorción UV Los usos más comunes en bioquímica de las técnicas espectroscópicas son los de la espectroscopía ultravioleta.

En dicha región, las proteínas absorben

intensamente. Las absorciones proteicas más fuertes se encuentran en dos márgenes de longitud de onda dentro de las regiones ultravioleta, en la proximidad de 280 y 200 nm. En el margen de 270-290 nm, vemos la absorción por las cadenas laterales aromáticas de fenilalanina, tirosina y triptófano (Mathews y col., 2002). En este estudio se determinó el espectro de absorción entre 250 y 450 nm a los sobrenadantes obtenidos de la solubilización del aislado A9 a distintos pHs. En la Figura 12 se haya el promedio de las absorbancias registradas para cada ensayo y su duplicado a los distintos pHs estudiados.

33

Absorbancia

2,0

1,5

pH 3 pH 5 pH 7

1,0

pH 9 pH 11

0,5

0,0 240

280

320

360

400

440

Longitud de onda (nm)

Figura 12: Espectros de absorción del aislado proteico de quinua (A9), a distintos pHs y una misma fuerza iónica (0,5) Tal como se aprecia en la figura anterior, las curvas de los distintos pHs poseen formas levemente distintas, asemejándose entre sí las correspondientes a los pHs más ácidos (pHs 3 y 5) y las de los pHs alcalinos (pHs 9 y11), mientras que la del pH 7 difiere de todas ellas. En cuanto a los pHs, se puede ver en el mismo gráfico que a pHs alcalinos las curvas se hayan más elevadas que a pHs ácidos, de modo que prácticamente en todo el rango de longitud de onda analizado, a mayor pH aumenta la absorbancia, con la sola excepción del pH 7, cuyo espectro supera a los de los pHs alcalinos. Los picks encontrados podrían ser de globulinas, proteínas presentes en la quinua (Tapia y col., 1979), y cuya absorción se encuentra en el rango de los 260 a 282 nm, de acuerdo a estudios realizados en guisantes (Chavan y col., 2001). En pruebas efectuadas a aislados proteicos de amaranto se visualiza el mismo tipo de curvas, pero con una absorbancia mayor (Avanza y Añón, 2005). El motivo de esto último radica en que el amaranto posee un mayor contenido de proteínas que la quinua (14-19%), y mayor aún si se trata de un aislado de proteínas, lo que implica que la solución proteica va a absorber más energía, por lo cual la absorbancia es mayor (Mathews y col., 2002).

34

5.2.4 Calorimetría Diferencial de Barrido La calorimetría diferencial de barrido (DSC) mide la capacidad calorífica relativa de un sistema determinado cuando sufre una transición inducida por un cambio térmico, como por ejemplo la desnaturalizacion de una proteína. Para ello, se someten dos celdas, una con la muestra y otra con la referencia, a un programa de calentamiento a una velocidad de flujo de calor controlado. Cuando se produce una transición inducida por la temperatura, la muestra absorbe parte del calor que se le está suministrando a la celda. Como resultado, la célula de la muestra tendría una temperatura algo inferior a la de la celda de referencia, pero el sistema de control del equipo suministra una potencia calorífica adicional para que ambas celdas mantengan la misma temperatura. Esta potencia en exceso es proporcional a la diferencia de capacidades caloríficas entre las dos celdas y sus contenidos (Beldarraín, 2001). En la Figura 13 se muestra el termograma del aislado de quinua A9 obtenido por DSC. ^exo

A9 en agua 1

05.10.2006 11:37:35

mW

-8.0 A9 en agu a, 05.1 0.2006 11:08: 49 A9 en agu a, 16.4 600 mg -8.5

-9.0

-9.5 Integral -13.50 mJ Peak 98.12 °C Left Limit 84.80 °C Right Limit 103.44 °C Heating Rate 10.00 °Cmin^-1

-10.0

-10.5

-11.0

-11.5 55.0

60.0

65.0

7 0.0

75.0

80.0

85 .0

90.0

95.0

100.0

105.0

110 .0

°C

4.5

5 .0

5.5

6.0

6 .5

7.0

7.5

8.0

8 .5

9.0

9.5

10.0

min

Universidad de Santiago de Chile: Lab. Prop. Fisicas

METTLER TOLEDO STA Re System

Figura 13: Termograma (DSC) de A9 en una suspensión al 20% en agua En el termograma se aprecia una endoterma que denota un cierto grado de estructura de las proteínas del aislado suspendidas al 20 % en agua y una temperatura de desnaturalización (Td) de la muestra de 98,1 ± 0,1 ºC. En un ensayo, bajo las mismas condiciones, el aislado proteico de quinua obtenido a pH 11 (A11) tuvo una endoterma muy pequeña, de 1,35 mJ (Silva, 2006), en comparación con la

35

del aislado A9, cuya endoterma fue de 13,5 mJ, lo que evidencia el efecto de la obtención de aislados a un pH tan alcalino sobre la estructura de las proteínas, al mismo tiempo que corrobora el hecho de que las globulinas presentes en la quinua (Abugoch, 2006; Martínez y Añón, 1996), al ser extraídas a pH 9, mantienen un mayor grado de estructura. Para el aislado de quinua suspendido al 20% en buffer de pH 9, en tanto, la transición térmica es mayor en comparación a la estudiada en medio acuoso, con una temperatura de desnaturalización (Td) igual a 100,5 ± 5,6 ºC y una endoterma de mayor área, en la zona que va desde los 87,2 a 112,9 ºC, y equivalente a 29,1 mJ (ver Figura 14). Se pudo observar que el aislado de quinua suspendido a pH 9 aumenta el grado de estructura de sus proteínas. Situación similar ocurre con el aislado A11, el que aunque de todos modos se presenta prácticamente desnaturalizado, suspendido en pH 9 muestra una endoterma con un área mayor que en agua (Silva, 2006). ^exo

A9 pH 9 2

05.10.2006 12:45:24

mW

A9 pH 9 2, 05.10 .2006 1 2:44:07 A9 pH 9 2, 17.03 00 mg

-0.6

-0.8 I ntegral -2 9.11 mJ P eak 104.44 °C L eft Lim it 87.16 ° C R ight Li mit 112.89 °C H eating Rate 10.00 ° Cmin^-1

-1.0

-1.2

-1.4

-1.6

-1.8 65.0

70.0

75.0

80.0

85.0

90.0

95 .0

100.0

10 5.0

110.0

°C

5.5

6. 0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

9 .5

10.0

min

Universidad de Santiago de Chile: Lab. Prop. Fisicas

METTLER TOLEDO STA Re System

Figura 14: Termograma (DSC) de A9 suspendido al 20% en buffer a pH 9 En el análisis calorimétrico realizado a un aislado proteico de amaranto obtenido a pH 9, y suspendido a distintos pHs, se obtuvo resultados similares a los de A9, con condiciones de mayor termoestabilidad que para el aislado de amaranto obtenido a pH 11 (Abugoch, 2006). En dicho caso, la temperatura de desnaturalización de las proteínas del amaranto fue un poco mayor a pH 7 que la de

36

A9, de alrededor de 103 ºC, mientras que a pH 9 la temperatura fue de 100 ºC, valor casi idéntico que el del aislado de quinua A9. 5.3

Determinación de las Propiedades Funcionales

5.3.1 Solubilidad El uso exitoso de fuentes de proteínas vegetales en la formulación de alimentos depende de las propiedades funcionales de la materia prima. En ese sentido, la baja solubilidad de un aislado proteico evidentemente limita su uso en algunos tipos de productos en la industria alimentaria, pero en otros podría favorecerlos. Sin embargo, esta propiedad puede ser modificada por la influencia de varios factores, como el pH, la concentración de sal, la constante dieléctrica del solvente y la temperatura (Bora y Riveiro, 2004). En la Figura 15 se muestra la curva de tendencia de solubilidad del aislado A9 a distintos pHs, y con una fuerza iónica constante de 0,5. En él se evidencia una notoria diferencia de solubilidad entre los pHs más ácidos (pHs 3 y 4), con niveles muy bajos de solubilidad, y los restantes, con valores superiores al 75%. Así, la mínima solubilidad se encuentra a pH 3, siendo de 7,6%. Le sigue muy de cerca el pH 4, con 11,3 %. El resto de los pHs, presentan solubilidades que van desde 76,6% a pH 5, llegando a un máximo de 94,6% a pH 11. 100 90

% Solubilidad

80

b

b

5

6

cd

de

7

8

cd

bc

e

9

10

11

70 60 50 40 30 20

a

10

a

0 2

3

4

12

pH

Figura 15: Solubilidad del aislado proteico de quinua A9 a distintos pHs a una fuerza iónica constante de 0,5. Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas, con un nivel de confianza del 95%

37

Las variaciones de la solubilidad con el pH, está relacionada con la modificación de la carga neta de las proteínas y por lo tanto con su balance electrostático; en la zona cercana a su pI la carga neta de las proteínas tiende a 0 y la variación de la solubilidad es mínima debido al aumento de la atracción entre las moléculas. Del lado alcalino al pI las proteínas tendrán una carga neta negativa y probablemente mayor que la carga neta positiva que presenta en medio ácido, de este modo las fuerzas repulsivas a pHs alcalinos y ácidos extremos serán más importantes que las fuerzas de atracción aumentando la solubilidad (Abugoch, 2006). En un estudio anterior en que se investigó la solubilidad de la harina de quinua en función del pH, la curva obtenida describe una “U” con un mínimo de solubilidad, de aproximadamente el 15%, a pH 6, y un máximo cercano al 50%, a pH 10, aunque a pHs ácidos también se obtuvo solubilidades medianamente altas, de hecho, a pH 2 la solubilidad fue cercana al 40% (Ogungbenle, 2003). Ello implica que el pI de las proteínas de la harina de quinua es el pH 6, superior al pI obtenido para el aislado A9, el que se encontraría próximo al pH 3. Por lo tanto, la aplicabilidad del aislado A9 no es la misma que para las proteínas de su harina, puesto que mientras estas últimas serían apropiadas para bebidas con alta acidez, el aislado sería más ventajoso en formulaciones de bebidas con pHs iguales o superiores a 5. Siguiendo con lo anterior, debe colocarse atención en el hecho de que las solubilidades para el aislado A9, en la región que va desde el pH 5 al 7 (pHs normales en alimentos) son muy superiores a las solubilidades obtenidas por las proteínas de la harina de quinua, pues los resultados para el aislado prácticamente quintuplican los de la harina. Estos resultados estarían demostrando que se puede mejorar esta propiedad de la quinua, preparando un aislado proteico. Asimismo, las solubilidades obtenidas son muy superiores a las exhibidas por el aislado de quinua A11. En dicho caso la máxima solubilidad también se produjo en la zona alcalina, sin embargo ésta fue de sólo un 41,4%, a pH 11 (Silva, 2006). El motivo de dichas disconformidades podría atribuirse a diferencias estructurales entre las proteínas de los aislados en cuestión. Por otra parte, los resultados son concordantes con los presentados por aislados proteicos de amaranto, en cuanto al aumento de la solubilidad a pHs

38

alcalinos, con la diferencia de que en dicho caso los aislados obtenidos a distintos pHs (9, 11 y 9-11) exhibieron solubilidades inferiores entre los pHs 5 a 8. En efecto, a pH 5 los aislados tuvieron entre un 20 y 30% de solubilidad, mientras que para los pHs 6 a 8 dicha solubilidad se encontró entre un 30 y un 60% (Abugoch, 2006). Esta diferencia con el amaranto (considerado pseudocereal, al igual que la quinua), en la zona de pHs ácidos, estaría señalando diferencias en los pI de sus respectivas proteínas que los componen como aislados. La misma tendencia en su solubilidad la han presentado proteínas de otros alimentos. Es el caso del aislado proteico del trigo sarraceno (Tomotake y col., 2002), el que aumenta su solubilidad a pHs alcalinos, alcanzando un máximo de 55%, a pH 10; del aislado proteico de mucuna (Adebowale y Lawal, 2003), con un máximo de solubilidad del 96%, a pH 12; y del aislado proteico de salvado de arroz (Wang y col., 1999), el que presentó una solubilidad máxima de 82%, a pH 10. Cabe señalar que estos aislados preseen un punto isoeléctrico cercano al pH 4, un poco superior al del aislado A9 (próximo al pH 3).

5.3.2 Capacidad de Retención de Agua La capacidad de retención de agua de las proteínas, WHC, es un índice importante en la evaluación del comportamiento de las mismas como ingredientes en productos de panadería, carnes embutidas, salchichas y geles alimentarios. Esta propiedad afecta no sólo las condiciones del procesamiento, sino también la calidad final de los productos (Abugoch, 2006). En la Figura 16 se muestran los resultados de la capacidad de retención de agua para el aislado A9, en agua (control) y en buffers de distintos pHs. En la gráfica se aprecia que no existen diferencias estadísticamente significativas (p>0,05) entre los diversos pHs, de modo que los valores encontrados van de un mínimo de 2,5 mL/g aislado proteico, a pH 5, hasta un valor máximo de 3,0 mL agua/g aislado, a pH 3.

39

WHC (ml/g)

4,0

3,0

a a

a

a

a

5

6

7

a

2,0

1,0 0,0 control

3

9

pH

Figura 16: WHC del aislado proteico de quinua A9 a distintos pHs a una fuerza iónica constante de 0,5. Letras iguales indican que no existen diferencias estadísticamente significativas, a un nivel de confianza del 95% Estos resultados de WHC para A9 son inferiores a los correspondientes al aislado de quinua A11 (Silva, 2006), los que tampoco presentaron diferencias estadísticamente significativas entre los distintos pHs, con valores entre 3,1 y 4,0 mL de agua/g de aislado. En su conjunto, los datos confirmarían lo señalado por Petruccelli y Añón (1994), quienes encontraron una relación inversa entre WHC y solubilidad, de modo que los aislados que presentan alta WHC poseerían mínima solubilidad. Dicha situación también se dio con los aislados de amaranto obtenidos a distintos pHs. La explicación a las diferencias de WHC entre los aislados, podría atribuirse al mayor nivel de desnaturalización de las proteínas (Abugoch, 2006) del aislado A11, lo que fue comprobado mediante calorimetría diferencial de barrido. Además, debe considerarse el hecho obvio de que un aislado más soluble posee una menor fracción insoluble capaz de retener agua. En todo caso, los resultados de A9 son superiores a los obtenidos para el aislado de amaranto obtenido a pHs 9 y 11 (de aproximadamente 1,9 mL de agua/g de aislado) y cercanos al aislado de amaranto obtenido a pH 9-11 (con un WHC de 2,9 mL de agua/g de aislado).

40

5.3.3 Capacidad de Absorción de Agua La capacidad para absorber agua es considerada una propiedad funcional de las proteínas, fundamental en alimentos viscosos tales como sopas, salsas, masas y alimentos horneados, productos donde se requiere una buena interacción proteínaagua (Granito y col., 2004). En la Figura 17 se observa la curva de absorción de agua en función del tiempo para el aislado A9. A partir de dicha gráfica se obtuvo la capacidad de absorción de agua (WIC), la que no es más que el volumen máximo de agua absorbido por gramo de aislado. La WIC para A9 fue de 1,8 ± 0,3 g agua/g aislado. El tiempo para alcanzar la WIC o el equilibrio -esto es, donde el aislado es incapaz de seguir captando agua espontáneamente- se denomina tiempo de estabilización (te). El te para A9 fue de 3,9 min. Un tercer parámetro cinético es la velocidad inicial (vi) con que el aislado absorbe agua. Dicho valor se obtiene calculando la pendiente del gráfico, en los primeros instantes en que aumenta el volumen de agua. Para A9 la vi fue de 1,34 g agua/ g aislado × min.

Figura 17: Agua absorbida por el aislado A9 en función del tiempo

En pruebas de WIC a aislados proteicos de amaranto los resultados mostraron que cuánto más desnaturalizadas se encontraban las proteínas, mayor

41

era la capacidad de imbibición de agua. Es así como la WIC registrada para el aislado de amaranto obtenido a pH 9 fue de 1,7 mL de agua/g aislado, valor muy cercano al del aislado de quinua A9, e inferior a los aislados de amaranto extraídos a pHs 11 y 9-11, que fueron de 2,5 mL de agua/g aislado en ambos casos (Abugoch, 2006). Este efecto estaría dado por el incremento de la accesibilidad a las proteínas y en consecuencia a los aminoácidos polares, los cuales tienen una gran afinidad por el agua, produciéndose un incremento en la capacidad para absorber agua (Granito y col., 2004). La WIC expuesta por el aislado de quinua A11, el que presentó una mayor desnaturalización en su estructura que el aislado A9, fue mayor a la de A9, alcanzando los 2,8 mL de agua/g aislado (Silva, 2006) lo que ratificaría lo expuesto en el párrafo anterior. La velocidad de absorción de agua para el aislado A9 fue bastante mayor que para el amaranto al mismo pH, el que alcanzó sólo 0,5 mL agua/g aislado × min. También sobrepasó al aislado de amaranto a pH 9-11 (0,4 mL agua/g aislado × min), acercándose al aislado de amaranto de pH 9-11, el que tuvo una vi de 1,1 mL agua/g aislado × min. Fue inferior sí al aislado de quinua A11, el que alcanzó una vi de 3,5 mL agua/g aislado × min. En lo relativo a los tiempos de estabilización, el tiempo determinado para A9 fue mucho mayor que para los aislados de amaranto extraídos a pHs 9 y 11 (0,9 y 0,6 respectivamente), pero inferior al aislado de amaranto obtenido a pH 9-11, que fue de 5 min. El tiempo requerido para alcanzar el equilibrio por A11, por su parte, fue de apenas 0,8 min.

42

VI. CONCLUSIONES

D

A partir del proceso de extracción de las proteínas de la harina de quinua a pH 9, se obtuvo un aislado proteico con un contenido de proteínas del 77,2% y un perfil de aminoácidos balanceado, muy similar al de la harina de quinua, lo cual podría motivar su empleo como ingrediente en la formulación de alimentos destinados al consumo humano y, en especial, de alimentos funcionales altamente proteicos.

D

Los estudios de los perfiles polipeptídicos, a través de la técnica PAGE, en condiciones nativas y desnaturantes, reveló la presencia de proteínas del tipo albúminas 2S y globulinas 11S, las cuales están presentes en la quinua.

D

A través de los estudios espectroscópicos de fluorescencia y UV se evidenció el efecto del pH sobre la estructura de las proteínas del aislado, constatándose un efecto mayor a pHs alcalinos que los cambios sufridos a pHs ácidos, con diferencias leves entre pHs correspondientes a un mismo grupo (ácidos o alcalinos).

D

El aislado presentó una solubilidad bastante alta, la que aumentó con el incremento del pH, registrándose valores bastante mayores que para la harina de quinua y semejantes o superiores a los reportados en la literatura para otros aislados proteicos. Esta mayor solubilidad del aislado respecto a su harina, estaría dada por la desnaturalización de las proteínas durante el proceso de obtención del aislado. La alta solubilidad del aislado lo hace propicio para su utilización en la formulación de sopas y bebidas, enriquecidas en proteínas.

D

No se encontró una correlación entre la capacidad de retención de agua (WHC) y el pH, y por tanto, con el grado de desnaturalización de las proteínas. De todos modos, los valores obtenidos son apropiados para la elaboración de productos de panadería, embutidos y geles alimentarios, entre otros.

43

D

El nivel de capacidad de absorción de agua (WIC) del aislado es apropiado para el desarrollo de productos deshidratados y alimentos viscosos en general.

D

A partir de los resultados de solubilidad se puede presumir una alta capacidad espumante en el aislado, debido a que ambas propiedades serían directamente proporcionales. Dicha capacidad se evidenció a través del manejo del aislado, pero deberá ser evaluada en estudios posteriores. Asimismo, se vislumbra la necesidad de estudiar otras propiedades funcionales, como las propiedades texturales, y de investigaciones centradas en el aspecto tecnológico de la obtención de aislados proteicos de quinua a nivel industrial, que permitan la obtención del aislado con mayores niveles de rendimiento.

44

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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52

ANEXOS

53

ANEXO 1 Métodos Electroforéticos para la Caracterización de los Perfiles Polipeptídicos

Reactivos: D Tampón de carga (pH 8,3): disolver 3,0 g de Tris, 14,4 g de glicina y 1,0 g de

SDS en un litro de agua destilada. En la preparación del buffer nativo no incorporado SDS. D Buffer del gel de concentración (pH 6,8): disolver 6,0 g de Tris y 0,4 g de

SDS en 40 mL de agua destilada. Ajustar el pH con HCl 4 N, y completar el volumen a 100 mL. En la preparación del buffer nativo no incorporar SDS. D Buffer del gel de separación (pH 8,8): disolver 18,2 g Tris y 0,4 g de SDS en

40 mL de agua destilada. Ajustar con HCl 4 N, y completar el volumen a 100 mL. En la preparación del buffer nativo no incorporar SDS. D Solución de persulfato de amonio: disolver 200 mg de persulfato de amonio

en 2 mL de agua destilada, eliminar el gas de la solución y congelar en pequeñas alícuotas. Esta solución permanece estable por aproximadamente cuatro años. D Solución colorante: disolver 1,25 g de Coomassie Blue R en 227 mL de

metanol y 46 mL de ácido acético glacial. Completar con agua destilada a 500 mL. D Solución decolorante: mezclar 70 mL de ácido acético glacial, 300 mL de

etanol y completar el volumen a 1 litro con agua destilada. D Solución acrilamida / Bis-acrilamida: disolver 30 g de acrilamida y 0,8 g de

bis-acrilamida en 100 mL de agua destilada. Almacenar en frasco oscuro a 4 ºC. D Buffer de muestra desnaturante con β-mercapto: mezclar 2,5 mL buffer de

gel de concentración (pH 6,8), 1,2 g de SDS, 4 mL de glicerol, 2 mL de βmercapto y punta de espátula de azul de bromofenol. Completar a 10 mL. D Buffer de muestra desnaturante: mezclar 2,5 mL buffer de gel de

concentración (pH 6,8), 1 g de SDS, 0,4 g de sacarosa y punta de espátula de azul de bromofenol. Completar a 10 mL.

54

D Buffer de muestra nativa: mezclar 4 mL buffer de gel de concentración (pH

6,8) (nativo), 4 mL de glicerol y punta de espátula de azul de bromofenol. Completar a 10 mL. D TEMED D Agua destilada D Butanol D Estándar de peso molecular D Alcohol

Procedimientos: Preparación de las Muestras para Electroforesis (PAGE) D Pesar 20 mg de muestra en un tubo ependorf D Agregar 200 ul de solución nativa, desnaturante o desnaturante con β-

mercapto, según corresponda. D Agitar breve e intensamente en vortex a intervalos de 5 minutos, durante 15

minutos. D Centrifugar a temperatura ambiente por 15 minutos, a 10.000 rpm. D Recolectar el sobrenadante en otro tubo ependorf. Almacenar los tubos en

congelador hasta llevar a cabo la electroforesis. D Cuando se desee ocupar las muestras, calentarlas durante 1 minuto en agua

hirviendo (esto se hace sólo con las muestra desnaturantes), insertando los tubos en plumavit para que floten. Procedimiento para Electroforesis Nativa (PAGE-nativa) D Los geles se preparan entre dos placas de vidrio perfectamente limpias. Para

ello, las placas deben lavarse con detergente, enjuagarse con abundante agua destilada y por último ponerles alcohol y secarlos con toalla nova. D Colocar los vidrios en el soporte del equipo Bio-Rad, procurando que queden

derechos y fijos al soporte. D Preparar gel al 5 %, mezclando: 2.653 µl de agua destilada, 1.750 µl de

acrilamida/bisacrilamida (A/BA), 1.820 µl de buffer a pH 8,8, 70 µl de PSA al 10% y 7 µl de TEMED, con agitación.

55

D Colocar la mezcla en seguida entre los vidrios, con la ayuda de una

micropipeta (hasta que rebalse). D Usando guantes colocar el peine, procurando que no queden burbujas. D Esperar hasta que gelifique por completo. D Retirar los vidrios del soporte y colocarlos en la cubeta de corrida del equipo

Bio-Rad, con el peine hacia adentro. D Retirar el peine y cargar cuidadosamente las muestras con la ayuda de una

micropipeta. D Llenar la cubeta con el tampón de carga (pH 8,3). D Tapar la cuba de corrida y conectarla a la fuente de poder. Programarla a

200 voltios por aproximadamente 40 minutos, o hasta que la muestra haya alcanzado el borde inferior del gel. D Apagar el equipo y remover los vidrios de la cuba de corrida. D Retirar el gel cuidadosamente con la ayuda de una espátula o con las

manos, usando guantes, y colocarlo estirado en un recipiente que contenga solución colorante, idealmente de un día para otro. D Retirar la solución colorante y adicionar solución decolorante. Cambiar la

solución a medida que se va tornando azulada. Esta solución puede ser reaprovechada adicionándole carbón activado y filtrándola. Procedimiento para Electroforesis Desnaturante (PAGE-SDS) D Los geles se preparan entre dos placas de vidrio perfectamente limpias. D Colocar los vidrios en el soporte del equipo Bio-Rad, procurando que queden

derechos y fijos al soporte. D Preparar el gel separador al 12 %, mezclando: 1.091 µl de agua destilada,

2.004 µl de A/BA, 1.300 µl de buffer a pH 8,8, 50 µl de SDS al 10%, 50 µl de PSA al 10% y 5 µl de TEMED, con agitación. D Colocar en seguida 3,5 mL del gel separador entre los vidrios, con la ayuda

de una micropipeta. Cubrir la superficie con agua saturada con butanol, la que debe ser adicionada lentamente. D Esperar a que la solución gelifique por completo, lo cual se evidencia por la

formación de una línea divisoria nítida entre el gel y el agua con butanol.

56

D Sacar los vidrios del soporte y retirar la capa de agua saturada con butanol,

lavando con abundante agua destilada. D Secar entre los vidrios con papel absorbente. D Preparar gel de concentración al 5 %, mezclando: 1.050 µl de agua

destilada, 250 µl de A/BA, 190 µl de buffer a pH 6,8, 15 µl de SDS al 10%, 15 µl de PSA al 10% y 1,5 µl de TEMED, con agitación. D Colocar en seguida 1,5 mL (o hasta que rebalse) gel concentrador entre los

vidrios (sobre el gel separador), con la ayuda de una micropipeta. D Usando guantes colocar el peine, procurando que no queden burbujas. D Esperar a que el gel concentrador gelifique por completo. D Retirar los vidrios del soporte y colocarlos en la cubeta de corrida del equipo

Bio-Rad, con el peine hacia adentro. Continuar el procedimiento de igual forma que para electroforesis nativa.

57

ANEXO 2 Método de Bradford Reactivos: D Solución estándar de proteína (BSA): Pesar en balanza analítica 10 mg

exactos de albúmina de bovino, completar con 990 µl de agua destilada y disolver completamente. Luego, colocar 100 µl de esta solución y colocarla en un tubo ependorf. Diluir agregando 900 µl de agua destilada. Agitar en vortex, etiquetar y congelar hasta el momento de su utilización. D Reativo de Bradford: disolver 100 mg de azul brillante de coomasie G-250 en

50 mL de etanol al 95 %. Agregar 100 mL de ácido fosforico al 85% (p/v), diluir a un volumen final de 1 l. Agitar al menos 2 horas tapado y cubierto de la luz. Filtrar con papel Whatman Nº1, usando plegado múltiple. Almacenar en frasco ámbar protegido de la luz. D Agua destilada o buffer del pH que corresponda

Procedimiento: Curva de Calibración D Comprobar la concentración del estándar de proteína (BSA), leyendo a 280

nm, y usando como blanco agua destilada. El valor obtenido se divide por 0,63 y este resultado da la concentración exacta del estándar, en mg/mL. D En cada tubo agregar las cantidades de estándar de albúmina y agua

destilada de acuerdo a la tabla que se presenta a continuación. Dejar reposar por 5 minutos y agregar el reactivo de Bradford. Luego, agitar en vortex y esperar 10 minutos antes de leer las muestras en el espectrofotómetro. La lectura debe realizarse a 595 nm. Tubo Estádar BSA (µl) Agua destilada o buffer (µl) Reactivo de Bradford (µl) 1 0 50 1500 2 10 40 1500 3 20 30 1500 4 30 20 1500 5 40 10 1500 6 50 0 1500

58

D Dibujar la curva de calibración, con la cantidad de BSA en el eje de las

abscisas y la absorbancia, en el eje de las ordenadas. Preparación de las Muestras D Estimar el porcentaje de proteínas aproximado que se espera en el

sobrenadante de la muestra, para caer en el rango de la curva del estándar (entre 1 y 40 µl de proteína). D Tomar entre muestra y solvente 50 µl, agregando en tubos ependorf el

solvente que corresponda según el análisis a efectuar (agua destilada o buffer al pH que corresponda). D Agitar y dejar reposar 5 min. D Agregar 1.500 ul de reactivo de Bradford y dejar reposar durante 10 min. D Leer las muestras en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 595

nm, usando para ello cubetas plásticas. D Para conocer la cantidad de proteína en la muestra interpolar en la curva de

calibración, la que debe realizarse en paralelo con la medición de la muestra.

59

ANEXO 3 Preparación de los Buffers

Buffer pH 3,0: 4,2028 g de ácido cítrico monohidratado más 0,4 g de hidróxido de sodio y 2,34g de cloruro de sodio, disueltos en 40 mL de agua destilada. Ajustar el pH y aforar a 100 mL. Buffer pH 4,0: 4,2028 g de ácido cítrico monohidratado más 0,92 g de hidróxido de sodio y 1,4 g de cloruro de sodio, disueltos en 40 mL de agua destilada. Ajustar el pH y aforar a 100 mL. Buffer pH 5,0: 4,2028 g de ácido cítrico monohidratado más 1,3 g de hidróxido de sodio y 0,29 g de cloruro de sodio, disueltos en 40 mL de agua destilada. Ajustar el pH y aforar a 100 mL. Buffer pH 6,0: 50 mL de fosfato dihidrógeno de potasio 0,1M más 5,6 mL de hidróxido de sodio 0,1 M y 1,3 g de cloruro de sodio. Buffer pH 7,0: 50 mL de fosfato dihidrógeno de potasio 0,1 M más 29,1 mL de hidróxido de sodio 0,1 M y 1,85 g de cloruro de sodio. Buffer pH 8,0: 50 mL de fosfato dihidrógeno de potasio 0,1 M más 46,7 mL de hidróxido de sodio 0,1 M y 1,88 g de cloruro de sodio. Buffer pH 9,0: 50 mL de bórax 0,025 M más 4,6 mL de ácido clorhídrico 0,1 M y 2,26 g de cloruro de sodio. Buffer pH 10,0: 50 mL de bicarbonato de sodio 0,05 M más 10,7 mL de hidróxido de sodio 0,1 M y 1,57 mL de cloruro de sodio. Buffer pH 11,0: 50 mL de bicarbonato de sodio 0,05 M más 22,7 mL de hidróxido de sodio 0,1 M y 1,85 g de cloruro de sodio. Se adicionó cloruro de sodio a los buffer para que todos tuvieran una fuerza iónica idéntica, de 0,5.

60

Anexo 4 Gradientes de Concentración de Fase Móvil para HPLC

Perfil de Aminoácidos: Tiempo % Acetato de Sodio % Acetonitrilo (min) (pH 6) 0,0 92 8 3,0 88 12 6,0 86 14 22 79 21 30 69 31 40 92 8 Con un flujo de 0,9 mL/min

Determinación de Fitoestrógenos: Tiempo % Agua % Metanol (min) 0,0 60 40 20 25 75 21 60 40 35 60 40 Con un flujo de 0,7 mL/min

61