UNIVERSIDAD DE ORIENTE NÚCLEO DE SUCRE ESCUELA DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOANÁLISIS

CALIDAD ESPERMÁTICA Y SU ASOCIACIÓN CON Enterococcus faecalis, AISLADO DE PACIENTES CON PROBLEMAS DE INFERTILIDAD (Modalidad: Tesis de Grado)

Rosimar Angélica Molina De Gouveia

TRABAJO DE GRADO PRESENTADO COMO REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR AL TÍTULO DE LICENCIADO EN BIOANÁLISIS

Cumaná, 2011

CALIDAD ESPERMÁTICA Y SU ASOCIACIÓN CON Enterococcus faecalis, AISLADO DE PACIENTES CON PROBLEMAS DE INFERTILIDAD

APROBADO POR:

MSc. José G. Betancourt Asesor Académico

Lcda. Patricia Cruces Co-Asesor

MSc. Elvia Michelli Jurado

Dr. Guillermo Rada Jurado

ÍNDICE DEDICATORIA ....................................................................................... iii AGRADECIMIENTOS ............................................................................iv LISTA DE TABLAS................................................................................. v LISTA DE FIGURAS.............................................................................. vii LISTA DE FIGURAS.............................................................................. vii RESUMEN ........................................................................................... viii INTRODUCCIÓN.................................................................................... 1 METODOLOGÍA..................................................................................... 7 Población ............................................................................................ 7 Criterios de exclusión.......................................................................... 7 Muestras ............................................................................................. 7 Examen macroscópico del semen ...................................................... 8 Licuefacción .................................................................................... 8 Aspecto ........................................................................................... 8 Volumen .......................................................................................... 8 Viscosidad ....................................................................................... 8 pH.................................................................................................... 9 Examen microscópico del semen ....................................................... 9 Concentración espermática............................................................. 9 Motilidad espermática ..................................................................... 9 Vitalidad espermática .................................................................... 10 Espermocultivo ................................................................................. 10 Tinción de Gram............................................................................ 10 Siembra y aislamiento para la diferenciación de Enterococcus faecalis................................................................................................... 11 Pruebas bioquímicas diferenciales para Enterococcus faecalis .... 11

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RESULTADOS ..................................................................................... 18 DISCUSIÓN ......................................................................................... 25 CONCLUSIONES................................................................................. 31 RECOMENDACIONES ........................................................................ 32 BIBLIOGRAFÍA .................................................................................... 33 ANEXOS .............................................................................................. 38 Hoja de Metadatos ............................................................................... 43

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DEDICATORIA A DIOS TODOPODEROSO, por ser mi guía espiritual, cubriéndome con su manto divino para encaminarme hacia el logro exitoso de mis metas. Mis padres: Adolfo Molina e Ysidra De Gouveia, hermanas, y toda mi familia, por ser un apoyo incondicional en todo lo que emprendo. Los ADORO. Mi novio Harmer Salazar, por estar conmigo en las buenas y en las malas durante el largo camino hacia esta meta. Te AMO.

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AGRADECIMIENTOS A El Prof. José G. Betancourt, por haberme asesorado y brindado su apoyo en la realización de esta investigación. La Lcda. Patricia Cruces, Lcdo. Antonio Torres y Lcdo. José Estrada, por haberme prestado su colaboración en la investigación. La Lcda. Diorelis González, por su ayuda y asesoramiento en la preparación de los medios de cultivos utilizados. Todas esas personas que, de forma desinteresada, contribuyeron a la realización de esta investigación. Todos ellos, MUCHAS GRACIAS.

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LISTA DE TABLAS Tabla 1. Calidad espermática en pacientes con problemas de infertilidad, provenientes del laboratorio de la Unidad de fertilidad de la Clínica Santa Rosa, Cumaná, estado Sucre. Marzo-julio 2010. ................... 18  Tabla 2. Alteraciones en los parámetros espermáticos, en pacientes provenientes del laboratorio de la Unidad de fertilidad de la Clínica Santa Rosa, Cumaná, estado Sucre. Marzo-julio 2010........................................... 19  Tabla 3. Asociación del volumen espermático con la presencia de E. faecalis, en pacientes provenientes del laboratorio de la Unidad de fertilidad de la Clínica Santa Rosa, Cumaná, estado Sucre. Marzo-julio 2010............ 20  Tabla 4. Asociación de la licuefacción con la presencia de E. faecalis, en pacientes provenientes del laboratorio de la Unidad de fertilidad de la Clínica Santa Rosa, Cumaná, estado Sucre. Marzo-julio 2010. ................... 21  Tabla 5. Asociación de la viscosidad con la presencia de E. faecalis, en pacientes provenientes del laboratorio de la Unidad de fertilidad de la Clínica Santa Rosa, Cumaná, estado Sucre. Marzo-julio 2010. ............................... 21  Tabla 6. Asociación del pH con la presencia de E. faecalis, en pacientes provenientes del laboratorio de la Unidad de fertilidad de la Clínica Santa Rosa, Cumaná, estado Sucre. Marzo-julio 2010........................................... 22  Tabla 7. Asociación de la concentración espermática con la presencia de E. faecalis, en pacientes provenientes del laboratorio de la Unidad de fertilidad de la Clínica Santa Rosa, Cumaná, estado Sucre. Marzo-julio 2010. ...................................................................................................................... 22  Tabla 8. Asociación de la motilidad espermática con la presencia de E. faecalis, en pacientes provenientes del laboratorio de la Unidad de fertilidad de la Clínica Santa Rosa, Cumaná, estado Sucre. Marzo-julio 2010............ 23  Tabla 9. Asociación de la vitalidad espermática con la presencia de E. faecalis, en pacientes provenientes del laboratorio de la Unidad de fertilidad

v

de la Clínica Santa Rosa, Cumaná, estado Sucre. Marzo-julio 2010............ 23 

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LISTA DE FIGURAS Figura 1. Distribución porcentual de E. faecalis aislados en espermocultivos de pacientes provenientes del laboratorio de la Unidad de fertilidad de la Clínica Santa Rosa, Cumaná, estado Sucre. Marzo-julio 2010. ....................... 20  Figura 2. Susceptibilidad antimicrobiana de cepas de E. faecalis, de pacientes provenientes del laboratorio de la Unidad de fertilidad de la Clínica Santa Rosa, a la penicilina (P), ampicilina (AMP), eritromicina (E), tetraciclina (TE), ciprofloxacina (CIP), vancomicina (VA) y teicoplanina (TEC). Cumaná, estado Sucre. Marzo-julio 2010. ....................................................................... 24 

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UNIVERSIDAD DE ORIENTE NÚCLEO DE SUCRE ESCUELA DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOANÁLISIS

CALIDAD ESPERMÁTICA Y SU ASOCIACIÓN CON Enterococcus faecalis, AISLADO DE PACIENTES CON PROBLEMAS DE INFERTILIDAD (Modalidad: Tesis de Grado) Autor: Rosimar A., Molina De G.

RESUMEN Se evaluó la calidad espermática y su asociación con Enterococcus faecalis, aislado de pacientes con problemas de infertilidad. La población estuvo conformada por 83 pacientes de sexo masculino que acudieron al laboratorio de la Unidad de Fertilidad de la Clínica Santa Rosa de la ciudad de Cumaná, durante los meses marzo-julio 2010, a quienes se les realizaron: espermatogramas, según las normas de la OMS, aislamiento e identificación de E. faecalis utilizando métodos convencionales para la determinación de género, grupo y especie, susceptibilidad antimicrobiana de E. faecalis a penicilina, ampicilina, teicoplanina, eritromicina, ciprofloxacina, tetraciclina y vancomicina. Del total de muestras, 67,47% presentó motilidad espermática anormal, encontrándose también porcentajes de anormalidad de 55,42% para los parámetros: licuefacción, viscosidad y concentración espermática, 36,14% para la vitalidad espermática, 37,35% para el volumen y un 7,23% para el pH. De los espermocultivos evaluados, 13,25% presentaron E. faecalis. No se encontró asociación estadísticamente significativa entre la presencia de E. faecalis y el volumen, licuefacción, viscosidad, pH, concentración espermática, motilidad espermática y vitalidad espermática. En cuanto a la evaluación de la susceptibilidad antimicrobiana de E. faecalis aislado de las muestras en estudio, se encontró una resistencia del 100,00% a la penicilina, seguida de la eritromicina (72,73%) y la tetraciclina (63,64%); y una sensibilidad del 100,00% a la vancomicina y teicoplanina.

viii

INTRODUCCIÓN El aparato reproductor masculino está constituido por órganos internos, representados por los testículos, vías espermáticas y vesícula seminal; órganos externos como: el pene y escroto y órganos anexos: glándulas bulbouretrales y próstata. Estos tejidos accesorios producen sustancias de gran importancia biológica, ya que protegen al tracto urinario de agresiones patológicas que invaden la uretra, mediante la secreción de metales como el zinc,

proteasas

como

lisozimas

e

inmunoglobulinas

secretoras.

El

mecanismo de lavado de la uretra por estas secreciones establece un medio hostil a los agentes invasores (Sanz et al., 1999). La espermatogénesis es el proceso mediante el cual se forman los espermatozoides en el hombre, éste se inicia a partir de las células ubicadas en la membrana basal de los túbulos seminíferos y consta de tres fases o etapas: a) divisiones mitóticas de la espermatogonia para generar espermatocitos destinados a convertirse en espermatozoos maduros; b) divisiones meióticas de los espermatocitos, para reducir el número de cromosomas y producir espermátides haploides, y c) espermiogénesis, en la cual las espermátides se transforman en espermatozoos maduros, mediante la pérdida de citoplasma y desarrollo de flagelos (Simón, 2003). La formación del líquido seminal ocurre mediante la mezcla rápida e individual de cuatro fracciones diferentes. Una primera fracción denominada pre-eyaculatoria, de consistencia mucosa, libre de espermatozoides, que proviene de las glándulas bulbouretrales y uretrales, la segunda fracción, consiste en una secreción prostática libre de espermatozoides, con una elevada concentración de ácido cítrico y fosfatasa ácida. La tercera fracción contiene elementos líquidos gelatinosos, rico en espermatozoides y originada

1

en el epidídimo, conducto deferente y ampolla deferente. La última fracción es la más abundante y constituye del 50,00 al 80,00% del eyaculado, es procedente de las vesículas seminales, tiene pH alcalino y es rica en fructosa (Silva et al., 2001). El

propósito

fundamental

del

análisis

básico

de

semen

(espermatograma) radica en evaluar los parámetros descriptivos clásicos de un eyaculado producido por masturbación. Las características a analizar son: aspecto, licuefacción, viscosidad, pH, volumen, concentración espermática, motilidad y vitalidad espermática (Remohi et al., 2003), todo esto con el fin de determinar

la

calidad

espermática,

e

investigar

si

los

parámetros

espermáticos del individuo, están o no dentro de los valores de referencia (OMS, 1999). La infertilidad es la incapacidad de una pareja de lograr un embarazo, después de 12 meses de mantener relaciones sexuales sin utilizar ningún método anticonceptivo; su incidencia varía notablemente en diferentes países e incluso en diferentes zonas de un mismo país (Poirot y Cherruau, 2005). La infertilidad no es únicamente un problema de origen femenino sino de pareja; se ha reportado que el 50,00% de las parejas presentan factor de infertilidad atribuible a ambos (Barten, 1998). Hasta hace poco tiempo, no se tomaba conciencia de la importancia del factor masculino en la infertilidad de la pareja. Estudios epidemiológicos determinan que el varón es responsable de la infertilidad, en forma exclusiva o compartida (Hull, 1985; Vanrell et al., 2000; Barja y Berrios, 2003). Las causas que originan infertilidad masculina pueden ser congénitas (criptorquidia,

hipospadias),

infecciosas 2

(parotiditis

pospuberal,

enfermedades de transmisión sexual), urológicas (prostatitis, litiasis), traumáticas, consecuencia de cirugía inguinoescrotal; también pueden estar asociadas a enfermedades pulmonares crónicas, genéticas, tumorales, disfunciones sexuales (eréctiles, eyaculatorias), por lesiones neurológicas y por factores ambientales y tóxicos. Aunque en la mayoría de los casos se deben a varicocele, infección de las glándulas sexuales accesorias, falla testicular u obstrucción. Por otro lado, el alcohol produce alteración de la función exocrina y endocrina que conlleva a atrofia testicular, con azoospermia, impotencia y feminización; mientras que, el cigarro, además de causar atrofia del testículo, produce detención de la espermatogénesis y alteración de la morfología espermática (Teppa y Palacios, 2004). Como se mencionó anteriormente, una causa frecuente de infertilidad masculina es el daño producido por infecciones bacterianas. La uretra anterior masculina está colonizada por agentes bacterianos que forman parte de la flora normal, como Staphylococcus epidermidis, difteroides y algunas especies de Streptococcus. Sin embargo, una cantidad de infecciones del tracto genital causadas por Enterococcus faecalis, y otros agentes, pueden tener consecuencias a corto y mediano plazo, provocando infertilidad masculina (Askienazy, 2005). El género Enterococcus tiene características morfológicas tales como: cocos Gram positivos, aislados en pares o en cadenas (cortas y largas), y que

eventualmente

pueden

tener

una

morfología

cocobacilar.

Son

anaerobios facultativos y tienen un rango óptimo de crecimiento entre 30 y 35ºC. Todas las especies crecen en caldos con 6,50% de NaCl e hidrolizan la esculina en presencia de sales biliares (Facklam y Sahm, 1995). Como causa de patología, los enterococos han sido implicados en una 3

gran variedad de cuadros clínicos, pero también están relacionados con infecciones nosocomiales, principalmente aquellas provenientes del tracto urinario. Otros tipos de infecciones en las cuales los enterococos tienen importancia, son las infecciones intra abdominales, pélvicas, bacteremias y septicemias (Moellering, 1992). Entre el 5,00 y 20,00% de los casos de endocarditis bacteriana, se ha aislado a E. faecalis como agente causal (Megram, 1992). Las infecciones bacterianas producidas por E. faecalis en el tracto genital masculino, afectan sitios anatómicos relacionados con el aparato reproductor

(testículo,

epidídimo,

glándulas

accesorias

y

conductos

eyaculadores), conduciendo al deterioro de los diferentes estadíos de la espermatogénesis, la cual afecta la producción y la calidad del semen (Terríquez y González, 2003). Las infecciones de las glándulas accesorias masculinas tienen un efecto negativo sobre la capacidad reproductiva, debido a que la función del espermatozoide es afectada, especialmente en su motilidad y la capacidad de experimentar la reacción de acrosoma. En una investigación realizada en Chile, en la cual se evaluó el efecto de bacterias sobre la reacción del acrosoma en espermatozoides humanos, se comprobó que la incubación con E. faecalis, produjo una significativa reducción de la reacción del acrosoma de los espermatozoides (Schulz et al., 2001). En el Centro de Fertilidad de Maryland (USA), se realizó una investigación para examinar el efecto de espermocultivos positivos con colonias bacterianas en los procesos de fertilización in vitro, donde se encontró que el gran porcentaje de espermocultivos reveló la presencia de Enterococcus, aunque la presencia o no de esta bacteria no afectó 4

significativamente la tasa de embarazos (Shalika et al., 1996). Sin embargo, un estudio realizado por Terríquez y González (2003), donde se correlacionó el número de microorganismos en espermocultivos con alteraciones en los índices del análisis seminal, reveló que la presencia de especies bacterianas reactivas al oxígeno, como E. faecalis, afecta la motilidad y bloquean los mecanismos de penetración y fecundación espermática, manifestándose como infertilidad masculina. Es importante señalar que en un trabajo realizado en Chile, donde se evaluó la apoptosis en espermatozoides humanos, inducida por bacterias patógenas, se demostró que E. faecalis produjo un aumento significativo en el nivel de apoptosis tardía de los espermatozoides (Villegas et al., 2001). Los enterococos se caracterizan por presentar resistencia intrínseca de bajo nivel a un gran número de antibióticos (β-lactámicos, lincosaminas, aminoglucósidos y trimetoprim-sulfametoxazol) y por su capacidad para adquirir nuevas resistencias (Koneman et al., 2008). La resistencia adquirida a los β-lactámicos en los enterococos, suele ser causada por la modificación de las proteínas fijadoras de penicilina (especialmente la PBP-5) y por la producción de β-lactamasas (McDonald et al., 1997; Sánchez-Molina et al., 2004).

La

combinación

de

un

agente

inhibidor

de

la

membrana

citoplasmática, como β-lactámicos y glicopéptidos, con un aminoglucósido, constituye una antibioticoterapia exitosa para las infecciones enterocócicas severas, debido a su efecto sinergista bactericida (Gray y Pedler, 1992; Koneman et al., 2008). La función del espermatozoide puede ser afectada, específicamente, por procesos inflamatorios asociados a la infección de las glándulas accesorias masculinas. Estas infecciones frecuentemente son causadas por 5

E. faecalis, siendo una posible causa de infertilidad en el hombre. En Venezuela, la información disponible sobre estas infecciones es limitada, razón por la cual surgió la necesidad de realizar el presente trabajo de investigación, cuyo objetivo general fue evaluar la calidad espermática y su asociación con E. faecalis, aislado de pacientes con problemas de infertilidad, con el fin de determinar su papel como agente causal de infertilidad masculina.

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METODOLOGÍA Población La población estuvo conformada por 83 pacientes de sexo masculino que acudieron al laboratorio de la Unidad de Fertilidad de la Clínica Santa Rosa de la ciudad de Cumaná, durante los meses marzo-julio 2010. A cada paciente se le indicó, mediante un instructivo, las normas para la toma de muestra de semen, y se le entregó un recolector estéril de boca ancha para la misma. Se les aplicó una encuesta que sirvió para el conocimiento de antecedentes clínicos y factores de riesgos a infecciones bacterianas (anexo 1). Se les informó sobre los alcances y objetivos de la investigación, así como las ventajas y desventajas de su participación y se solicitó su consentimiento escrito (De Abajo, 2001) (anexo 2).

Criterios de exclusión Para esta investigación se excluyeron aquellos pacientes con problemas de varicocele, alcoholismo, tabaquismo y con tratamiento antimicrobiano.

Muestras Las muestras de líquido seminal fueron obtenidas por masturbación en un recolector de orina estéril, con una abstinencia sexual de 3 a 5 días, dichas muestras se trasladaron inmediatamente al laboratorio de la Unidad de Fertilidad de la Clínica Santa Rosa de la ciudad de Cumaná para su procesamiento, en un tiempo no mayor de treinta (30) minutos (OMS, 1999). Espermatograma

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Examen macroscópico del semen Se evaluaron los siguientes parámetros, siguiendo los criterios de la OMS (1999): Licuefacción Se determinó en un período de 20 a 30 minutos a temperatura ambiente, evidenciándose éste por la desintegración de coágulos de fibrina presentes en el semen por acción enzimática de las aminopeptidasas y pepsinas. Aspecto El semen normalmente es un líquido homogéneo opalescente de color blanquecino amarillento. Este parámetro se evaluó mediante la observación del color y la presencia de cuerpos mucosos o gelatinosos. Volumen El volumen del eyaculado se determinó a través de un aspirado con una pipeta graduada. Se consideró normal los que presentaban entre 2,00 a 4,00 ml. Viscosidad Se evaluó introduciendo un aplicador de madera en la muestra, observando la longitud del filamento que se formó al retirarlo. Se consideró una viscosidad normal cuando el filamento no midió más de 2 cm.

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pH Para la determinación del pH, se extendió con uniformidad una gota de semen sobre papel indicador (cintas de pH a intervalos de 6,50 a 9,20) y a los 30 segundos se comparó con la escala de calibración para determinar su valor. Se consideró un pH normal entre 7,50 a 8,00.

Examen microscópico del semen Según los criterios de la OMS (1999), se evaluaron los siguientes parámetros: Concentración espermática Se evaluó haciendo una dilución del semen en una proporción 1:20, con una solución inmovilizadora (1 000 ml de agua destilada, 50 g de NaHCO3, 10 ml de solución de formaldehído al 35,00% y 0,25 g de azul tripano). La dilución se mezcló enérgicamente y se colocaron 10 μl en una cámara de Neubauer, donde, una vez sedimentadas las células, se realizó el recuento de espermatozoides en el microscopio óptico, con el objetivo de 40X, contando sólo los espermatozoides que se encontraban en el interior del cuadrado, así como aquellos que limitaban los bordes superior e izquierdo. Luego, se multiplicó el número obtenido por el factor 106, como resultado se obtuvo el número de espermatozoides por mililitro de muestra. Se consideró una concentración espermática normal de 20x106 espermatozoides/ml o más. Motilidad espermática La motilidad de los espermatozoides de la muestra de semen se realizó en un directo, contando solamente los espermatozoides libres y no los que

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estuvieran agregados entre sí o a otras células. Para tal fin, se llevo a cabo el recuento de espermatozoides móviles e inmóviles en varios campos seleccionados al azar y con objetivo de 40X. En función a la motilidad que presentaron, se clasificaron según las siguientes categorías: categoría a, si el movimiento espermático es progresivo rápido y lineal; categoría b, si el movimiento espermático es progresivo lento o perezoso y con frecuencia no lineal; categoría c, si el movimiento es no progresivo (in situ); y categoría d, cuando los espermatozoides se encuentran inmóviles. Se consideró normal 50,00% o más con progresión (entre a y b). Vitalidad espermática La vitalidad espermática se determinó mediante la mezcla del semen con una solución de eosina en proporciones iguales, de esta mezcla se agregó una gota en un portaobjeto y se cubrió con una laminilla para su observación al microscopio óptico, con objetivo de 40X. Luego, se contaron los espermatozoides vivos (no teñidos) y los muertos (teñidos), expresados en porcentajes, considerándose normal 75,00% o más de espermatozoides vivos.

Espermocultivo Tinción de Gram

Las muestras de semen fueron procesadas inmediatamente después de la toma, se realizaron extendidos, los cuales se dejaron secar a temperatura ambiente, luego se fijaron mediante calor y se colorearon mediante la técnica de coloración de Gram (Hucker y Conn, 1923). Esto permitió observar la

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presencia de células bacterianas, su morfología y afinidad. Siembra y aislamiento para la diferenciación de Enterococcus faecalis

Se realizó la siembra de las muestras de semen, mediante la técnica de estriado en 4 cuadrantes en agar sangre y chocolate; luego se incubaron a 37ºC, en microaerofilia, por 48 horas. Transcurrido este tiempo, se realizó la observación macroscópica a las colonias y el tipo de hemólisis formada. Las colonias típicas (redondas, lisas, blanquecinas, de consistencia blanda y α, β o γ-hemolíticas) se evaluaron mediante la técnica de Gram, para apreciar las características microscópicas de las células bacterianas (cocos Gram positivos, dispuestos en cadenas cortas o largas, en pares o aislados) (Koneman et al., 2008). Pruebas bioquímicas diferenciales para Enterococcus faecalis

Diagnóstico de género Para el diagnóstico de género se utilizaron las siguientes pruebas bioquímicas según, Facklam y Collins (1989); Ruoff (2002) y Herve y Porte (2007):

Prueba de la catalasa Se basa en la capacidad de los microorganismos de producir la enzima catalasa, mediante la descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. Ésta se realizó transfiriendo con un palillo de madera parte del

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centro de una colonia sospechosa a la superficie de un portaobjetos de vidrio, el cual disponía de una gota de peróxido de hidrógeno al 3,00%; la aparición rápida y sostenida de burbujas o efervescencia constituyó una reacción positiva. Prueba de tolerancia de crecimiento en 6,50% de cloruro de sodio (NaCl) Esta prueba permitió comprobar la capacidad que tienen los microorganismos de crecer en presencia de cloruro de sodio al 6,50%. Se colocaron de dos a tres colonias sospechosas en el caldo con NaCl al 6,50%, luego se incubó a 37ºC por 24 horas, en condiciones de aerobiosis. Una prueba positiva se manifestó por la presencia de desarrollo bacteriano evidente en el medio, con cambio de color del indicador púrpura de bromocresol. Prueba de hidrólisis de bilis y esculina Esta prueba se basa en la capacidad que tienen ciertas bacterias de hidrolizar el glucósido esculina a esculetina y glucosa en presencia de bilis. Con un asa bacteriológica se tomaron de dos a tres colonias sospechosas, y se sembraron mediante estría en el pico de flauta del medio bilis esculina; luego se incubó a 37ºC por 24 horas, en condiciones de aerobiosis. El ennegrecimiento difuso de más de la mitad del pico de flauta indicó hidrólisis de la esculina. Prueba de pirrolidonil beta naftilamida (PYR) Esta prueba determinó la producción de la enzima pirrolidonil arilamidasa, a través de la hidrólisis del pirrolidonil beta naftilamida (PYR). 12

Este diagnóstico se realizó, utilizando un disco impregnado con el sustrato (PYR), al cual se le agregaron de dos a tres colonias sospechosas, se dejó actuar por dos minutos y luego se le añadió una gota del reactivo revelador (p- dimetilaminocinamaldehido); la formación de un color de rosado a rojo indicó positividad de la prueba. Prueba de leucino aminopeptidasa (LAP) Esta

prueba

determinó

la

presencia

de

la

enzima

leucino

aminopeptidasa (LAP) mediante la hidrólisis del sustrato leucina-βnaftilamida. Este diagnóstico se realizó, utilizando un disco impregnado con el sustrato (leucina- β-naftilamida), al cual se le agregaron de dos a tres colonias sospechosas, se dejó actuar por dos minutos y luego se le añadió una gota del reactivo revelador (p-dimetilaminocinamaldehido); la formación de un color de rosado a rojo indicó positividad de la prueba. Crecimiento a 45ºC Esta prueba se basa en la capacidad que tiene el género Enterococcus de crecer a altas temperaturas. Se realizó mediante la inoculación de dos a tres colonias sospechosas en caldo infusión cerebro corazón, luego se incubó a 45ºC por 7 días, en condiciones de aerobiosis. El desarrollo bacteriano en el medio indicó la positividad de la prueba. Diagnóstico de grupo Para el diagnóstico de grupo se emplearon las siguientes pruebas bioquímicas, descritas por Facklam y Collins (1989); Ruoff (2002) y Herve y Porte (2007), las cuales son: 13

Fermentación de manitol y sorbitol Se basa en la capacidad que tienen los microorganismos de utilizar los alcoholes polihídricos manitol y sorbitol, con la consiguiente acidificación del medio. Se colocaron de dos a tres colonias sospechosas en el caldo con manitol o sorbitol, luego se incubó a 37ºC por 24 horas, en condiciones de aerobiosis. Una prueba positiva se manifestó por la presencia de desarrollo bacteriano evidente en el medio, con cambio de color del indicador rojo fenol. Fermentación de sorbosa Se basa en la capacidad que tienen los microorganismos de utilizar el monosacárido L-sorbosa, con la consiguiente acidificación del medio. Se colocaron de dos a tres colonias sospechosas en el caldo con sorbosa, luego se incubó a 37ºC por 24 horas, en condiciones de aerobiosis. Una prueba positiva se manifestó por la presencia de desarrollo bacteriano evidente en el medio, con cambio de color del indicador púrpura de bromocresol. Descarboxilación de arginina Esta prueba se basa en la capacidad de los microorganismos de convertir la arginina, en dos etapas: una primera etapa, donde se forma la citrulina por una reacción de dihidrolasa, esta citrulina, a su vez, se convierte en ornitina, y una segunda etapa que se caracteriza por la formación de putrescina, producto de la descarboxilación de la ornitina. Para ello, se colocaron de dos a tres colonias sospechosas en el caldo con arginina, luego se incubó a 37ºC por 24 horas, en condiciones de aerobiosis. Una prueba positiva se manifestó por la presencia de desarrollo bacteriano evidente en el medio, sin cambio de color del indicador púrpura de bromocresol. 14

Diagnóstico de especie Para el diagnóstico de especie se utilizaron las siguientes pruebas bioquímicas, descritas por Facklam y Collins (1989); Ruoff (2002) y Herve y Porte (2007). Dichas pruebas fueron las siguientes: Fermentación de arabinosa Esta prueba se basa en la capacidad que tienen los microorganismos de utilizar el monosacárido D-arabinosa, con la consiguiente acidificación del medio. Se colocaron de dos a tres colonias sospechosas en el caldo con arabinosa, luego se incubó a 37ºC por 24 horas, en condiciones de aerobiosis. Una prueba positiva se manifestó por la presencia de desarrollo bacteriano evidente en el medio, con cambio de color del indicador púrpura de bromocresol. Prueba de motilidad Se basa en la capacidad que tienen los microorganismos de desplazarse a través del medio por la presencia de flagelos. Para esta prueba, se tomaron de dos a tres colonias sospechosas con una aguja bacteriológica y se sembraron por punción en el medio motilidad, luego se incubó a 37ºC por 24 horas, en condiciones de aerobiosis. La presencia de turbidez en el medio indicó la positividad de la prueba. Antibiograma La determinación de los patrones de susceptibilidad se llevó a cabo por medio de difusión con discos, en agar Mueller Hinton (Bauer et al., 1966). 15

Para ello, se preparó un inóculo de E. faecalis en solución salina fisiológica estéril a partir de un crecimiento de 24 horas, sembrado en agar sangre, ajustando dicho inóculo al patrón 0,5 en la escala de Mac Farland. Una vez obtenida la turbidez correspondiente, se procedió a impregnar un hisopo estéril en la suspensión, se eliminó el exceso de muestra y luego, se sembró la superficie entera del agar, por estrías, en tres direcciones diferentes, rotando la placa en ángulo de 60º. Posteriormente, se colocaron los discos de antibióticos: penicilina (10 u), ampicilina (10 µg), teicoplanina (30 µg), eritromicina (15 µg), ciprofloxacina (5 µg) y tetraciclina (30 µg). Luego, se incubó a 37ºC por 24 horas, una vez transcurrido el tiempo, se realizó la medición de los halos de inhibición de acuerdo a lo recomendado por el Instituto de Estándares de Clínica y Laboratorio, del inglés: Clinical and Laboratory Standards Institute. La susceptibilidad a la vancomicina, se determinó por concentración mínima inhibitoria (CMI), a través del método de dilución en agar, el cual consistió en sembrar el inóculo de E. faecalis estudiado, en placas de agar Mueller Hinton, cada una de las cuales contenía una concentración diferente de vancomicina (0,5 - 64 µg/mL); luego se incubó a 37ºC por 24 horas. Después de este tiempo, se realizó la interpretación de los resultados, donde la CMI fue la menor concentración de antimicrobiano que inhibió completamente

el

crecimiento

bacteriano

(CLSI,

2009).

Para

los

antimicrobianos ciprofloxacina y eritromicina, aquellos halos que quedaron en la categoria de intermedio se tomaron como resistentes, ya que no se realizó CMI para ellos. Control de calidad Para el control de calidad de las pruebas de susceptibilidad 16

antimicrobiana se utilizó la cepa de E. faecalis ATCC 29212 (CLSI, 2009). Análisis estadístico Los resultados obtenidos se presentaron a través de estadística descriptiva (tablas y/o figuras). Además, se aplicó la prueba de Chi-cuadrado (χ2) con un nivel de confiabilidad de 95% (Sokal y Rohlf, 1981), ésto con la finalidad de asociar la calidad espermática (licuefacción, aspecto, volumen, viscosidad, pH, concentración espermática, motilidad espermática y vitalidad espermática) con la presencia de E. faecalis en las muestras analizadas.

17

RESULTADOS En todos los pacientes estudiados se encontró algún parámetro espermático alterado, donde de un total de 83 pacientes analizados, 56 de ellos (67,47%) mostraron motilidad espermática anormal, observándose también un porcentaje de anormalidad de manera considerable en los siguientes parámetros espermáticos: licuefacción (55,42%), viscosidad (55,42%), concentración espermática (55,42%), volumen espermático (37,35%) y vitalidad espermática (36,14%) (tabla 1). Tabla 1. Calidad espermática en pacientes con problemas de infertilidad, provenientes del laboratorio de la Unidad de fertilidad de la Clínica Santa Rosa, Cumaná, estado Sucre. Marzo-julio 2010. Variables Normal % Anormal % Volumen espermático

52

62,65

31

37,35

Licuefacción

37

44,58

46

55,42

Viscosidad

37

44,58

46

55,42

pH

77

92,77

6

7,23

Concentración espermática

37

44,58

46

55,42

Motilidad espermática

27

32,53

56

67,47

Vitalidad espermática

53

63,86

30

36,14

%= porcentaje

En la tabla 2, se observa el porcentaje de alteraciones en algunos de los parámetros espermáticos de los pacientes estudiados, donde la astenozoospermia y la oligozoospermia presentan porcentajes elevados,

18

67,47% y 48,19%, respectivamente. Además, se visualiza la presencia de hipospermia en 12 pacientes, representando el 14,46%, y azoospermia en 6 pacientes, lo que representó el 7,23%. Tabla 2. Alteraciones en los parámetros espermáticos, en pacientes provenientes del laboratorio de la Unidad de fertilidad de la Clínica Santa Rosa, Cumaná, estado Sucre. Marzo-julio 2010. Parámetros espermáticos Valores anormales Nº de pacientes % anormales Oligozoospermia Menos de 20 millones de 40 48,19 espermatozoides. Azoospermia

Sin espermatozoides.

6

7,23

Astenozoospermia

Menos del 50% espermatozoides móviles.

de

56

67,47

Hipospermia

Volumen espermático por debajo de 2 ml.

12

14,46

%= porcentaje

En la figura 1, se muestra la distribución porcentual de E. faecalis aislados en los espermocultivos analizados, donde el 13,25% (11/83) corresponde a los cultivos positivos para E. faecalis y el 86,75% (72/83) a los cultivos negativos.

19

13,25%

E. faecalis Cultivos negativos 86,75%

Figura 1. Distribución porcentual de E. faecalis aislados en espermocultivos de pacientes provenientes del laboratorio de la Unidad de fertilidad de la Clínica Santa Rosa, Cumaná, estado Sucre. Marzo-julio 2010. Es importante destacar que de los once (11) pacientes con cultivos positivos para E. faecalis, ocho (8) presentaron dos o más parámetros espermáticos alterados. En la tabla 3, se observa la asociación del volumen espermático con la presencia de E. faecalis en los pacientes evaluados, donde no se encontró una asociación estadísticamente significativa (χ2=0,17; p>0,05) entre las variables estudiadas. Tabla 3. Asociación del volumen espermático con la presencia de E. faecalis, en pacientes provenientes del laboratorio de la Unidad de fertilidad de la Clínica Santa Rosa, Cumaná, estado Sucre. Marzo-julio 2010. Volumen Cultivo % Cultivo % Total Total espermático positivo negativo (%) Normal 8 9,64 44 53,01 52 62,65 Anormal

3

Total

11

3,61

28

33,74

31

37,35

13,25

72

86,75

83

100,00

2

ns= no significativo, (p>0,05) χ = 0,17 ns, corrección de Yates, %= porcentaje

20

En la tabla 4, se evidencia que no hubo asociación estadísticamente significativa (χ2=1,08; p>0,05) entre la licuefacción y la presencia de E. faecalis en los pacientes estudiados. Tabla 4. Asociación de la licuefacción con la presencia de E. faecalis, en pacientes provenientes del laboratorio de la Unidad de fertilidad de la Clínica Santa Rosa, Cumaná, estado Sucre. Marzo-julio 2010. Licuefacción Cultivo % Cultivo % Total Total positivo negativo (%) Normal 7 8,43 30 36,15 37 44,58 Anormal

4

4,82

42

50,60

46

55,42

Total

11

13,25

72

86,75

83

100,00

ns= no significativo, (p>0,05) χ2= 1,08 ns, corrección de Yates, %= porcentaje

Al asociar la viscosidad con la presencia de E. faecalis en los pacientes analizados, no se encontró una asociación estadísticamente significativa (χ2=1,08; p>0,05) entre las variables estudiadas (tabla 5). Tabla 5. Asociación de la viscosidad con la presencia de E. faecalis, en pacientes provenientes del laboratorio de la Unidad de fertilidad de la Clínica Santa Rosa, Cumaná, estado Sucre. Marzo-julio 2010. Viscosidad Cultivo % Cultivo % Total Total positivo negativo (%) Normal 7 8,43 30 36,15 37 44,58 Anormal

4

4,82

42

50,60

46

55,42

Total

11

13,25

72

86,75

83

100,00

ns= no significativo, (p>0,05) χ2= 1,08 ns, corrección de Yates, %= porcentaje

En la tabla 6, se muestra la asociación del pH con la presencia de E. faecalis en los pacientes evaluados, observándose que no hubo asociación

21

estadísticamente significativa (χ2=0,14; p>0,05) entre dichas variables. Tabla 6. Asociación del pH con la presencia de E. faecalis, en pacientes provenientes del laboratorio de la Unidad de fertilidad de la Clínica Santa Rosa, Cumaná, estado Sucre. Marzo-julio 2010. pH Cultivo % Cultivo % Total Total positivo negativo (%) Normal 10 12,04 67 80,73 77 92,77 Anormal

1

1,21

5

6,02

6

7,23

Total

11

13,25

72

86,75

83

100,00

ns= no significativo, (p>0,05) χ2= 0,14 ns, corrección de Yates, %= porcentaje

En la tabla 7, se observa la asociación de la concentración espermática con la presencia de E. faecalis en los pacientes estudiados, evidenciándose, según la prueba de Chi-cuadrado (χ2), que no hubo una diferencia estadísticamente significativa (χ2=2,86; p>0,05) para asociar las variables. Tabla 7. Asociación de la concentración espermática con la presencia de E. faecalis, en pacientes provenientes del laboratorio de la Unidad de fertilidad de la Clínica Santa Rosa, Cumaná, estado Sucre. Marzo-julio 2010. Concentración Cultivo % Cultivo % Total Total espermática positivo negativo (%) Normal 8 9,64 29 34,94 37 44,58 Anormal

3

3,61

43

51,81

46

55,42

Total

11

13,25

72

86,75

83

100,00

ns= no significativo, (p>0,05) χ2= 2,86 ns, corrección de Yates, %= porcentaje

En la tabla 8, se presenta la asociación de la motilidad espermática con la presencia de E. faecalis en los pacientes analizados, donde se observó que no hubo asociación estadísticamente significativa (χ2=0,003; p>0,05) entre estas variables.

22

Tabla 8. Asociación de la motilidad espermática con la presencia de E. faecalis, en pacientes provenientes del laboratorio de la Unidad de fertilidad de la Clínica Santa Rosa, Cumaná, estado Sucre. Marzo-julio 2010. Motilidad Cultivo % Cultivo % Total Total espermática positivo negativo (%) Normal 4 4,82 23 27,71 27 32,53 Anormal

7

8,43

49

59,04

56

67,47

Total

11

13,25

72

86,75

83

100,00

ns= no significativo, (p>0,05) χ2= 0,003 ns, corrección de Yates, %= porcentaje

Al asociar la vitalidad espermática con la presencia de E. faecalis en los pacientes evaluados, se observó que no hubo diferencia estadísticamente significativa (χ2=0,10; p>0,05) para la asociación de dichas variables (tabla 9). Tabla 9. Asociación de la vitalidad espermática con la presencia de E. faecalis, en pacientes provenientes del laboratorio de la Unidad de fertilidad de la Clínica Santa Rosa, Cumaná, estado Sucre. Marzo-julio 2010. Vitalidad Cultivo % Cultivo % Total Total espermática positivo negativo (%) Normal 8 9,64 45 54,22 53 63,86 Anormal

3

3,61

27

32,53

30

36,14

Total

11

13,25

72

86,75

83

100,00

ns= no significativo, (p>0,05) χ2= 0,10 ns, corrección de Yates, %= porcentaje

En la figura 2, se muestra la susceptibilidad antimicrobiana de E. faecalis, observándose que la mayor resistencia encontrada correspondió a la penicilina con un 100,00%, mientras que, en el caso de la vancomicina y teicoplanina, los aislados fueron 100,00% sensibles.

23

Figura 2. Susceptibilidad antimicrobiana de cepas de E. faecalis, de pacientes provenientes del laboratorio de la Unidad de fertilidad de la Clínica Santa Rosa, a la penicilina (P), ampicilina (AMP), eritromicina (E), tetraciclina (TE), ciprofloxacina (CIP), vancomicina (VA) y teicoplanina (TEC). Cumaná, estado Sucre. Marzo-julio 2010

24

DISCUSIÓN El estudio de la calidad espermática es el examen de laboratorio más importante en la fertilidad masculina, y es una de las prácticas que se efectúan en los servicios de atención a parejas infértiles. Algunos estudios epidemiológicos publicados indican que en las últimas décadas, la calidad espermática se está deteriorando en diferentes países del mundo (Vanrell et al., 2000; Barja y Berrios, 2003). En esta investigación se determinó que el 67,47% de los pacientes con problemas de infertilidad presentaron motilidad espermática anormal, así como alteración en otros parámetros como licuefacción (55,42%), viscosidad (55,42%) y concentración espermática (55,42%), lo que indica que dicha población podría estar siendo afectada por alguna causa, que pudieran ser: factores ambientales, drogas e infecciones. La OMS considera que existe infertilidad masculina cuando hay alteración del espermatograma, fundamentalmente, en la calidad espermática, definida por la concentración de espermatozoides, la motilidad espermática, la vitalidad espermática y morfología espermática, asociada a alteraciones propias del semen (OMS, 1999). Muchas veces, los resultados satisfactorios de estos parámetros seminales convencionales no se corresponden con los resultados que desde el punto de vista de fertilidad tienen estos individuos, por lo que clínicamente no son siempre suficientes para demostrar la función espermática y fertilidad masculina. El hecho de no encontrar alteraciones en los parámetros espermáticos, no indica que la capacidad funcional de los espermatozoides no se encuentra comprometida, ya que tanto las bacterias, como sus productos

metabólicos,

podrían

ocasionar

cambios

bioquímicos

y

moleculares en la membrana espermática, que afectan la reacción acrosómica y su capacidad de fusión con el ovocito, así como daños en el

25

ADN espermático (Hungerhuber et al., 2004). En el espermatograma se pueden hallar algunas alteraciones en los parámetros espermáticos tanto macroscópicos como microscópicos que pueden afectar la calidad espermática, entre los que se encuentran: la astenozoospermia y oligozoospermia. En esta investigación, se encontraron porcentajes de astenozoospermia y oligozoospermia de 67,47% y 48,19 %, respectivamente, lo que indica que los individuos estudiados tienen un alto porcentaje de estas anomalías. Estos resultados son similares a los propuestos por Alvizuri (1999), quien determinó que la alteración seminal más frecuente fue la astenozoospermia con un 64,10%, en un estudio realizado en 404 varones del servicio de Andrología (Hospital Militar Central) en Perú. En otro estudio realizado en ese mismo país, entre los años de 1990 a 1992, específicamente, en 242 varones del servicio de andrología (Hospital Cayetano Heredia), se encontró que la anomalía más frecuente en espermatogramas de varones era la astenozoospermia, con un 33,00%, consecuencia probable de un proceso inflamatorio en el tracto reproductivo (Torres y Gonzáles, 1995). En otra investigación realizada en el año 2002, se encontró que de 878 espermatogramas estudiados la alteración con más frecuencia fue la astenozoospermia con un 39,10%, seguido de la oligozoospermia, con un 14,00% (Barja y Berrios, 2003). La astenozoospermia es la disminución de la motilidad de los espermatozoides en el hombre; esta anormalidad es importante ya que si los espermatozoides no se mueven, no se pueden desplazar desde la vagina hasta las trompas, que es donde se encuentran con el óvulo, contribuyendo así a la infertilidad en el hombre. Por el contrario, la oligozoospermia, se refiere a la baja cantidad de espermatozoides (menos de 20 millones) en el semen eyaculado; tal disminución puede ser debida a un déficit en su 26

producción o a una obstrucción parcial de la vía seminal, siendo la primera la más frecuente. Esta baja calidad del esperma, puede implicar un problema de fertilidad (Poirot y Cherruau, 2005). Las infecciones seminales en el hombre con frecuencia son de poca sintomatología, por lo que permanecen largo tiempo sin ser identificadas y generan secuelas que pueden conducir a la infertilidad. En los cultivos bacterianos de los pacientes con problemas de infertilidad estudiados se encontró un porcentaje de cultivos con E. faecalis del 13,25%, esto demuestra que dichos pacientes se encuentran expuestos a infecciones bacterianas. Estos resultados coinciden con los reportados en un estudio realizado por Mendoza et al. (2004), quienes encontraron una frecuencia de E. faecalis del 13,04%. En el Centro de Fertilidad de Maryland (USA), se realizó una investigación para examinar el efecto de espermocultivos positivos con colonias bacterianas en los procesos de fertilización in vitro, y se encontró que la gran mayoría de espermocultivos, reveló la presencia de Enterococcus con un 73,00% (Shalika et al., 1996). Sin embargo, Terríquez y González (2003) encontraron la presencia de distintas bacterias, siendo la más frecuente E. faecalis, con un 40,10%. Las infecciones del tracto reproductivo se han convertido en un serio problema de salud a nivel mundial, afectando tanto a hombres como a mujeres, las cuales, pueden tener diversas consecuencias, entre ellas, la infertilidad. Sólo en la última década se ha empezado a dar importancia a las infecciones como causa de infertilidad en las parejas (Hungerhuber et al., 2004). Una causa frecuente de infertilidad masculina es la infección bacteriana producida por E. faecalis en el tracto genital, que inhibe muchas veces la 27

movilidad del espermatozoide, así como también puede causar daño en los túbulos seminíferos, originando deterioro en la calidad del semen. La presencia de E. faecalis en los pacientes estudiados, pudo haber comprometido la calidad del líquido seminal, ya que, se encontraron valores alterados en la motilidad espermática, viscosidad y licuefacción. En el presente estudio no se encontraron diferencias significativas cuando se asoció la presencia de E. faecalis con los parámetros espermáticos,

licuefacción,

viscosidad,

concentración

espermática

y

motilidad espermática (tablas 4, 5, 7 y 8). De la misma manera, no se encontró una asociación estadísticamente significativa entre el volumen espermático, pH y vitalidad espermática con la presencia de E. faecalis (tablas 3, 6 y 9). A pesar de que no se encontraron asociación significativa entre los parámetros espermáticos estudiados con la presencia de E. faecalis, se observaron porcentajes considerablemente elevados en muchos de estos parámetros. Al respecto, Villegas et al. (2001), demostraron que la incubación de espermatozoides con E. faecalis produjo un aumento significativo en el nivel de apoptosis tardía de los espermatozoides. De igual manera, en una investigación realizada por Schulz et al. (2001), se comprobó que la incubación de espermatozoides con E. faecalis originó una significativa reducción de la reacción de acrosoma de los espermatozoides, lo que indica que en los pacientes con infecciones de las glándulas accesorias masculinas, no sólo se ve afectada la motilidad espermática y el aumento de espermatozoides apoptóticos. Es importante también destacar que, en un trabajo realizado por Terríquez y González (2003), encontraron que la presencia de especies bacterianas reactivas al oxígeno, como E. faecalis, afecta la motilidad y bloquean los mecanismos de penetración y fecundación espermática, 28

manifestándose como infertilidad masculina. La presencia de agentes bacterianos que infectan la próstata, pueden dar lugar a procesos inflamatorios que obstruyen la vía seminal a cualquier nivel, perjudicando la concentración de espermatozoides en el líquido seminal, además, al estar afectada la próstata se genera un aumento de la viscosidad y la no licuefacción del semen. De igual forma, estas bacterias pueden adherirse a los espermatozoides, afectando la movilidad o la capacidad fecundante. Los microorganismos pueden favorecer la producción de anticuerpos antiespermáticos con toda una serie de efectos perjudiciales. Las infecciones del semen aún siendo asintomáticas, son capaces de inducir alteraciones en la viscosidad y la licuefacción del líquido seminal, produciendo inmovilización secundaria del espermatozoide (Weidner y Ludwig, 2003). Al evaluar la susceptibilidad de E. faecalis, se obtuvo una resistencia a la penicilina del 100,00%, seguida por la eritromicina (81,82%), tetraciclina (63,64%), ciprofloxacina (54,55%) y ampicilina (45,45%). Resultados que difieren de la investigación de Sánchez-Molina et al. (2004), donde E. faecalis fue sensible a penicilina (98,00%) y resistente a la eritromicina (53,00%). Es importante destacar que los enterococos se caracterizan por presentar resistencia intrínseca de bajo nivel a un gran número de antibióticos y por su capacidad de adquirir nuevas resistencias (Koneman et al., 2008). La resistencia de ciertas cepas de E. faecalis a la penicilina se debe a la producción de β-lactamasas, así como también a la modificación de las proteínas fijadoras de penicilina; por otra parte, la resistencia de E. faecalis a la eritromicina se debe a la producción de eritromicina esterasas, a través de estos mecanismos el E. faecalis es capaz de evitar ser inhibido por la penicilina y la eritromicina (McDonald et al., 1997; Sánchez-Molina et al., 29

2004). En este estudio, E. faecalis mostró una sensibilidad del 100,00% a vancomicina

y

teicoplanina;

seguidos

por

la

ampicilina

(54,55%),

ciprofloxacina (45,45%), tetraciclina (36,36%) y eritromicina (18,18%). En un estudio realizado por Causse et al. (2006), encontraron resultados muy similares a la presente investigación, con un 100,00% de sensibilidad del E. faecalis frente a la vancomicina y teicoplanina. Sin embargo, los resultados obtenidos en este estudio difieren de lo reportado por Aznar et al. (2004), quienes hallaron E. faecalis resistentes a vancomicina y teicoplanina (100,00%). Tanto la vancomicina como la teicoplanina presentan una gran afinidad por ciertos precursores de la pared celular elaborados por E. faecalis, específicamente los que terminan en la secuencia de aminoácidos D-Alanil-D-Alanina; que una vez que se unen a ellos bloquea la síntesis de la pared celular y por tanto, la multiplicación de E. faecalis (McDonald et al., 1997; Sánchez-Molina et al., 2004). Debido a la importancia que desde el punto de vista de diagnóstico y pronóstico tienen las infecciones en el líquido seminal de hombres infértiles y que todavía se subestiman, es necesario el monitoreo continuo en cuanto a la detección de E. faecalis y su rol en la infertilidad; así como, la determinación de sus patrones de susceptibilidad, los cuales permitan orientar el tratamiento antimicrobiano adecuado.

30

CONCLUSIONES La motilidad espermática, la licuefacción, viscosidad y la concentración espermática en la población estudiada, presentaron altos porcentajes de anormalidad, de igual manera el volumen, el pH y la vitalidad espermática presentaron anormalidad pero en menor proporción. La frecuencia de aislamientos de E. faecalis fue de 13,25% en los pacientes con problemas de infertilidad estudiados. La presencia o no de E. faecalis en pacientes con problemas de infertilidad, no se asoció con los parámetros espermáticos como: volumen espermático, licuefacción, viscosidad, pH, concentración espermática, motilidad espermática y vitalidad espermática. E. faecalis presentó un elevado porcentaje de resistencia a penicilina, eritromicina y tetraciclina. Hubo una sensibilidad del 100,00% del E. faecalis frente a los agentes antimicrobianos vancomicina y teicoplanina.

31

RECOMENDACIONES Aumentar la muestra en estudios posteriores, de manera que permitan estudiar de forma más exhaustiva la presencia de E. faecalis en pacientes con problemas de infertilidad. Promover el estudio bacteriológico del líquido seminal en pacientes infértiles con el fin de controlar y evitar posible infertilidad masculina. Realizar programas continuos de educación, orientados a un ejercicio responsable de la sexualidad. Realizar estudios más precisos y especializados donde se tome en cuenta los cambios bioquímicos y moleculares que pueda ocasionar el E. faecalis a los espermatozoides.

32

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Teppa, A. y Palacios, A. 2004. Evaluación actual de la infertilidad masculina. Rev. Invest. Clin., 45(4): 355-370. Terríquez, M. y González, J. 2003. Correlación entre el número de colonias bacterianas en espermocultivos con alteraciones en los índices del análisis seminal. Col. Mex. Urol., 18(3): 100-105. Torres, D. y Gonzáles, G. 1995. El factor masculino en un servicio de infertilidad de Lima. Rev. Invest. Clin., 34(2). 17-22. Vanrell, J.; Colon, J.; Balasch, J. y Visco, P. 2000. Infertilidad y esterilidad humana. Edición Masson. España. Villegas, J.; Sánchez, R.; Schulz, M.; Soto, L.; Iglesias, T.; Óveme, C. y Miska, W. 2001. Apoptosis en espermatozoides humanos inducida por bacterias patógenas. Rev. Med., 131: 613-616. Weidner, W. y Ludwig, M. 2003. Common organisms in urogenital infections with special impact on Prostatitis. Eur. Urol., 2: 15-18.

37

ANEXOS ANEXO 1 ENCUESTA EXPLORATIVA Fecha: ____________________

Muestra

Nº: ___________

Nombre:_______________________C.I.:______________Edad:_____ Días de Abstinencia: __________ Hora de Recolección:____________ 1. ¿Por qué se realiza un examen de líquido seminal? 2. ¿Tiene infecciones urinarias con frecuencia? Si_____

No_____

3. ¿Alguna vez ha sufrido de infecciones de transmisión sexual? Si_____

No_____

¿Cuáles? 4. ¿Padece de algunos de los siguientes trastornos? Varicocele_____

Tabaquismo______

Alcoholismo______

Otros___________

5. ¿Ha sido operado? Si_____ No_____ De ser “Si” su respuesta, señale cuál de ellas e identifique fecha (al menos el año): Varicocele______ Vasectomía_______ Otra(s): _________________ 6. ¿Presenta algún trastorno endocrino? Si_____ No_____ De ser “Si” su respuesta, señale cuál de ellas: Hipopituitarismo_____

Hipertiroidismo _____ Hipotiroidismo_____

Diabetes_____ Otra(s) ________________________________________ 7. ¿Actualmente está bajo tratamiento médico? Si_____ No_____ De ser “Si”, especifique: __________________________________________

38

ANEXO 2 CONSENTIMIENTO VÁLIDO Bajo la coordinación del MSc. José Gregorio Betancourt, profesor de Bacteriología Clínica del Departamento de Bioanálisis de la Universidad de Oriente de Sucre, se está realizando el proyecto de investigación titulado: Calidad espermática y su asociación con Enterococcus faecalis, aislado de pacientes con problemas de infertilidad, cuyo objetivo es el de evaluar la calidad espermática y su asociación con Enterococcus faecalis, aislado de pacientes con problemas de infertilidad, y como objetivos específicos: determinar la calidad espermática en los pacientes con problemas de infertilidad, a través del espermatograma; identificar Enterococcus faecalis en los espermocultivos, a través de métodos convencionales; determinar la susceptibilidad antimicrobiana de Enterococcus faecalis por medio de la difusión con discos; asociar la calidad espermática con la presencia de Enterococcus faecalis en las muestras de semen analizadas. Yo: C.I.:

Nacionalidad:

Estado Civil:

Domiciliado en:

Siendo mayor de edad, en uso pleno de mis facultades mentales y sin que medie coacción ni violencia alguna, en completo conocimiento de la naturaleza, forma, duración, propósito, inconvenientes y riesgos relacionados con el estudio indicado, declaro mediante la presente: 1. Haber sido informado de manera clara y sencilla por parte del grupo de investigadores de este proyecto de todos los aspectos relacionados con el proyecto de investigación titulado: Calidad espermática y su asociación con Enterococcus faecalis, aislado de pacientes con problemas de infertilidad. 39

2. Tener conocimiento claro de que el objetivo del trabajo antes señalado es evaluar la calidad espermática y su asociación con Enterococcus faecalis, aislado de pacientes con problemas de infertilidad. 3. Conocer bien el protocolo experimental expuesto por el investigador, en el cual se establece que mi participación en el trabajo consiste en: donar de manera voluntaria una muestra de semen. 4. Que

la

muestra

que

acepto

donar

será

utilizada

única

y

exclusivamente para evaluar la calidad espermática y para la realización de un espermocultivo. 5. Que el equipo de personas que realizan esta investigación coordinada por

el

MSc.

José

Gregorio

Betancourt,

me

ha

garantizado

confidencialidad relacionada tanto a mi identidad como a cualquier otra información relativa a mi persona a la que tengan acceso por concepto de mi participación en el proyecto antes mencionado. 6. Que bajo ningún concepto podré restringir el uso para fines académicos de los resultados obtenidos en el presente estudio. 7. Que mi participación en dicho estudio no implica riesgo e inconveniente alguno para mi salud. 8. Que cualquier pregunta que tenga relación con este estudio me será respondida oportunamente por parte del equipo de investigación, con quienes me puedo comunicar por el teléfono 0416- 1823683 con la Br. Rosimar Molina. 9. Que bajo ningún concepto se me ha ofrecido ni pretendo recibir ningún beneficio de tipo económico producto de los hallazgos que puedan producirse en el referido proyecto de investigación.

40

DECLARACIÓN DEL VOLUNTARIO Luego de haber leído, comprendido y aclaradas mis interrogantes con respecto a este formato de consentimiento y por cuanto a mi participación en este estudio es totalmente voluntaria, acuerdo: 1. Aceptar las condiciones estipuladas en el mismo y a la vez autorizar al equipo de investigaciones a realizar el referido estudio en la muestra de semen que acepto donar para los fines indicados anteriormente. 2. Reservarme el derecho de revocar esta autorización y donación en cualquier momento sin que ello conlleve algún tipo de consecuencia negativa para mi persona. Firma del voluntario: Nombre y Apellido: C.I.: Lugar: Fecha:

Firma del testigo:

Firma del testigo:

Nombre y Apellido:

Nombre y Apellido:

C.I.:

C.I.:

Lugar:

Lugar:

Fecha:

Fecha:

41

DECLARACIÓN DEL INVESTIGADOR Luego de haber explicado detalladamente al voluntario, la naturaleza del protocolo mencionado, certifico mediante la presente que, a mi leal saber, el sujeto que firma este formulario hace constar que este proyecto de investigación comprende la naturaleza, requerimientos, riesgos y beneficios de la participación en este estudio. Ningún problema de índole médico, de idioma o de instrucción ha impedido al sujeto tener una clara comprensión de su compromiso con este estudio. Por el proyecto, Nombre: Rosimar Molina Lugar y Fecha:

42

HOJA DE METADATOS

43

Hoja de Metadatos para Tesis y Trabajos de Ascenso – 1/5 Título

CALIDAD ESPERMÁTICA Y SU ASOCIACIÓN CON Enterococcus faecalis, AISLADO DE PACIENTES CON PROBLEMAS DE INFERTILIDAD.

Subtítulo

Autor(es) Apellidos y Nombres Molina De G., Rosimar A.

Código CVLAC /

e-mail

CVLAC 18079228 e-mail [email protected] e-mail CVLAC e-mail e-mail CVLAC e-mail e-mail CVLAC e-mail e-mail

Palabras o frases claves: Calidad espermática Infertilidad masculina Enterococcus faecalis

44

Hoja de Metadatos para Tesis y Trabajos de Ascenso – 2/5 Líneas y sublíneas de investigación: Área

Subárea Bioanálisis

Ciencia

Resumen (abstract):

Se evaluó la calidad espermática y su asociación con Enterococcus faecalis, aislado de pacientes con problemas de infertilidad. La población estuvo conformada por 83 pacientes de sexo masculino que acudieron al laboratorio de la Unidad de Fertilidad de la Clínica Santa Rosa de la ciudad de Cumaná, durante los meses marzo-julio 2010, a quienes se les realizaron: espermatogramas, según las normas de la OMS, aislamiento e identificación de E. faecalis utilizando métodos convencionales para la determinación de género, grupo y especie, susceptibilidad antimicrobiana de E. faecalis a penicilina, ampicilina, teicoplanina, eritromicina, ciprofloxacina, tetraciclina y vancomicina. Del total de muestras, 67,47% presentó motilidad espermática anormal, encontrándose también porcentajes de anormalidad de 55,42% para los parámetros: licuefacción, viscosidad y concentración espermática, 36,14% para la vitalidad espermática, 37,35% para el volumen y un 7,23% para el pH. De los espermocultivos evaluados, 13,25% presentaron E. faecalis. No se encontró asociación estadísticamente significativa entre la presencia de E. faecalis y el volumen, licuefacción, viscosidad, pH, concentración espermática, motilidad espermática y vitalidad espermática. En cuanto a la evaluación de la susceptibilidad antimicrobiana de E. faecalis aislado de las muestras en estudio, se encontró una resistencia del 100,00% a la penicilina, seguida de la eritromicina (72,73%) y la tetraciclina (63,64%); y una sensibilidad del 100,00% a la vancomicina y teicoplanina.

45

Hoja de Metadatos para Tesis y Trabajos de Ascenso – 3/5 Contribuidores: Apellidos y Nombres

ROL ROL

Betancourt, José Gregorio

/

Código CVLAC

CA

AS

X

/

TU

e-mail JU

8649514 e-mail [email protected] CVLAC e-mail ROL

Cruces, Patricia

CA

X

AS

TU

JU

12664848 e-mail [email protected] CVLAC e-mail ROL

CA

AS

TU

JU

X

Michelli, Elvia CVLAC 8644673 e-mail [email protected] e-mail ROL

CA

AS

TU

JU

Rada, Guillermo CVLAC 3174623 e-mail [email protected] e-mail

Fecha de discusión y aprobación: Año Mes Día 2011 06 08 Lenguaje: spa

46

X

Hoja de Metadatos para Tesis y Trabajos de Ascenso – 4/5 Archivo(s): Nombre de archivo Tesis-MolinaR.doc

Tipo MIME Aplication/Word

Alcance: Espacial: Nacional

(Opcional)

Temporal: Temporal

(Opcional)

Título o Grado asociado con el trabajo: Lcda. en Bioanálisis

Nivel Asociado con el Trabajo:

Licenciado

Área de Estudio: Bioanálisis

Institución(es) que garantiza(n) el Título o grado: Universidad de Oriente

47

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