UNIVERSIDAD DE TALCA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS ESCUELA DE AGRONOMÍA

EVALUACIÓN DE PROTOCOLOS DE IC-RT-PCR EN LA DETERMINACIÓN DE Grapevine leafroll associated virus-3 (GLRaV-3) EN TEJIDO DE VID

MEMORIA DE TÍTULO

CRISTIAN DIEGO MENDOZA SILVA TALCA – CHILE 2008

APROBACIÓN:

Profesor Guía: Dr. Claudio Sandoval Briones, Profesor Facultad de Ciencias Agrarias Universidad de Talca

Profesor Informante: Dr. Mauricio Lolas Caneo, Profesor Facultad de Ciencias Agrarias Universidad de Talca

Fecha de presentación de la Defensa de Memoria:

RESUMEN

Grapevine leafroll associated virus (GLRaV) es considerada una de las enfermedades con mayor importancia a nivel mundial, ya que produce diversas sintomatologías en plantas que van desde la disminución de la productividad hasta la muerte del hospedero. Debido a que el control de esta enfermedad es principalmente preventivo, se evaluó la implementación de dos protocolos de Transcripción reversa - Reacción en cadena de la polimerasa asociado a Inmunocaptura, (IC-PCR) para la detección de GLRaV-3 para un diagnóstico más simple y asertivo de la enfermedad sin necesidad de purificar el virus y extraer el RNA previamente. Se muestrearon 8 viñedos de la VII región en los que se colectaron 387 muestras con sintomatología posible de asociar a enfermedades de naturaleza viral, las que se analizaron mediante serología (DAS-ELISA) en una primera etapa para definir aquellas que presentaban el patógeno. Luego las muestras positivas fueron analizadas por diferentes protocolos de IC-RTPCR sin resultados favorables probablemente debido a diversos factores como distribución desuniforme del virus en el tejido leñoso, época de muestreo, o falta de puesta a punto de algunos pasos dentro de los protocolos evaluados. Este resultado deja de manifiesto que factores como la presencia de sustancias contaminantes que estarían presentes en los tejidos vegetales al momento de la extracción de los ácidos ribonucleicos (ARN) como polisacáridos y compuestos fenólicos, tienen un efecto directo sobre la viabilidad del ARN y la acción de la enzima ADN polimerasa (Taq) durante la realización de la PCR. Teniendo además en cuenta la distribución irregular y la baja concentración del virus en las muestras de tejido de vid es posible explicar los resultados negativos de los ensayos. En vista de lo anterior es imprescindible tener en cuenta al momento de reformular los protocolos evaluados, los aspectos ya mencionados para una correcta realización de la técnica molecular IC-RT-PCR, al igual que considerar el utilizar tejido verde obtenido en una época de muestreo diferente.

ABSTRACT

Grapevine leafroll associated virus (GLRaV) is considered one of the most important diseases worldwide, because of the several symptoms that produces in infected plants, ranging from the decline in productivity until the death of the host. Considering that the control of this disease is mainly preventive, the implementation of protocols of Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction associated with immunocapture (IC-PCR) for the detection GLRaV-3 seems important for a simple and assertive diagnosis without purification of the virus and RNA extraction. A total of 168 samples were taken from 8 vineyards located at the Seventh Region in Chile. These initially were analyzed through serology (DAS - ELISA) to determine the presence of the virus. Then, the positive samples were analyzed by different protocols of IC-RT-PCR, without positive results. This can be explain by different factors such as random distribution of the virus in the woody sample, sampling date, or errors in the implementation of some of the extraction procedures. This result makes it clear that factors such as non-removal of some compounds present in the ribonucleic acid extraction like polysaccharides and phenolic compounds have direct effect on the viability of the RNA and the performance of the enzyme DNA polymerase (Taq) in the PCR. Also if we have in mind the uneven distribution of the virus in the tissue samples we can explain the negative results obtained. According to this it seems important in the future to include in new IC-RT-PCR protocols these observations, and a different sampling date using vegetative tissue.

ÍNDICE Pág.

1. INTRODUCCIÓN

1

2. REVISIÓN BILIOGRÁFICA

4

2.1

Antecedente generales

4

2.2

Control de virosis en plantas

5

2.3

Virus de la vid

6

2.4

Virus en estudio

6

2.4.1

Sintomatología en la vid

7

2.4.2

Diagnóstico de la enfermedad

7

2.5

2.6

Técnicas serológicas de diagnóstico

8

2.5.1

Enzyme Linked Inmunosorbent assay (ELISA)

8

2.5.2

DAS-ELISA (Double Antibody Sandwich- ELISA)

8

Técnicas de diagnóstico molecular

9

2.6.1

Reacción en cadena de la polimerasa, PCR

10

2.6.2

Transcripción reversa - Reacción en cadena de la polimerasa, RT-PCR

2.6.3

11

Transcripción reversa - Reacción en cadena de la polimerasa asociado a Inmunocaptura, IC-PCR

3. MATERIALES Y MÉTODOS

11 12

3.1 Determinación de las áreas de muestreo

12

3.2 Forma de muestreo

12

3.3 Método de diagnóstico

13

3.3.1

Serología (DAS-ELISA)

13

a.

Preparación de las muestras

14

b.

Preparación de las muestras

14

3.3.2

Técnica Molecular (IC-RT-PCR)

a.

Protocolo de IC-RT-PCR descrito por Wetzel et al., 1991

17

y Olmos et al., 1997

17

b.

Protocolo de IC-RT-PCR descrito por INIA, España

19

c.

Análisis de los productos de la reacción a través de electroforesis en gel de azarosa

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

21 23

4.1

Análisis de la prospección viral

23

4.2

Técnica Molecular IC-RT-PCR

23

5. CONCLUSIONES

26

6. BIBLIOGRAFÍA

27

7. ANEXO

30

1. INTRODUCCIÓN

La vid (Vitis vinifera L.) es considerada como una de las especies frutales de mayor importancia a nivel mundial, y ocupa la mayor superficie cultivada en comparación con otros frutales, reportándose 7.919.000 hectáreas para el año 2002 (SAG, 2004). La vid es el principal cultivo frutícola de nuestro país. Según cifras preliminares del VII Censo Nacional Agropecuario y Forestal, en Chile, la superficie cultivada con uva vinífera y de mesa es de más de 191.000 hectáreas (128.993 y 62.411 ha. respectivamente) (INE, 2007). Lo anterior no es menor, si además se considera que las empresas vitivinícolas nacionales generan un retorno de más de US$ 233 millones como concepto de las exportaciones de vinos nacionales. Por otro lado, si adicionamos las exportación de uva de mesa, el cultivo de la vid significa una entrada de divisas por sobre los US$700 millones para nuestra economía (Herrera y Madariaga, 2001).

Debido a la relevancia que tiene la vid como cultivo industrial para la agricultura nacional, es indispensable que el producto de esta actividad sea de la mejor calidad, para esto, es necesario mantener controlados aquellos microorganismos fitopatógenos que son susceptibles de infectar este cultivo. Dentro de ellos, han pasado a tomar importancia durante la última década, virus, viroides y fitoplasmas, los que se asocian a una variada sintomatología, disminuyendo la producción y la vida útil del viñedo. Las enfermedades causadas por virus constituyen uno de los problemas fitopatológicos de mayor incidencia a nivel mundial, afectando el normal desarrollo de las plantas.

A través de diversas investigaciones en el mundo, se han identificado 44 virus que atacan el cultivo de la vid (Martelli y Walter, 1998). No obstante, no todos ellos producen síntomas importantes, ya que la mayoría pasan inadvertidos en plantas asintomáticas. Los efectos de los virus que afectan el desarrollo de las plantas y la calidad de la producción se manifiestan de diferentes formas, como menor crecimiento de las plantas, disminución del

calibre del fruto, cambios en el color de la baya y azúcares, retrasos en la madurez, problemas de cuaja, aumento de susceptibilidad a otros fitopatógenos, incompatibilidad del patrón e injerto e incluso muerte de plantas (Pérez et al., 2000).

Dentro de las enfermedades más difundidas en el mundo causadas por virus y que pueden producir síntomas severos en la vid, se encuentran los asociados al Enrollamiento de la Hoja de la Vid (Grapevine leafroll associated virus, GLRaVs), grupo de virus perteneciente a la familia Closteroviridae, dentro del cual se encuentran relacionadas nueve formas virales filamentosas distintas (Digiaro, 1998).

Existen diferentes métodos para la identificación de estos fitopatógenos, entre ellos, el más utilizado para la detección de virus vegetales es la variante de ELISA (Enzyme linked inmunosorbent assay), DAS-ELISA. Sin embargo, está demostrado en diversos estudios que el método de trascripción reversa-y reacción en cadena de la polimerasa, denominado “Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction”, RT-PCR, es mucho más sensible que DAS-ELISA (Silva, 1999), permitiendo la detección específica de secuencias del genoma de los microorganismos contaminantes.

En relación a los virus pertenecientes al género Ampelovirus, estudios realizados por Silva (1999). muestran que el virus encontrado en mayor cantidad en la Región de Valparaíso y Región del Maule fue GLRaV-3. Lo anterior sugiere que este patógeno es de gran relevancia en cuanto se refiere al detrimento de la calidad de las plantas y posterior rendimiento del viñedo.

Es por ello que esta investigación tiene como objetivo evaluar diferentes protocolos de IC-RT-PCR, para la determinación de GLRaV-3 en tejido de vid de manera de realizar un diagnostico eficiente y precoz de este virus en plantas.

Por otra parte se tienen como objetivos específicos:

Evaluar dos metodologías de diagnóstico molecular de GLRaV-3 (RT-PCR asociado a inmunocaptura). Optimización de la técnica molecular IC-RT-PCR, para la detección de GLRaV-3, de manera de realizar una identificación correcta y segura de la enfermedad.

1.1

Hipótesis:

La técnica de RT-PCR ya ha sido utilizada para la detección de genomas virales y particularmente GLRaV-3 en plantas, obteniéndose un buen diagnóstico de este patógeno. Sin embargo no se han evaluado variantes de esta metodología como RT-PCR asociado a inmunocaptura (IC-RT-PCR), que permitiría un diagnóstico más simple sin necesidad de purificar el virus y extraer el RNA previamente. En otros virus ha sido evaluada esta metodología, por lo tanto se espera que para la determinación de GLRaV-3 sea efectiva.

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1

Antecedentes generales:

Los viriones o partículas virales están compuestos por moléculas de ácido nucleico en forma de RNA o DNA cubiertos por una cápside proteica. Estos microorganismos pueden replicarse independientemente de los cromosomas de una célula pero no independientemente de ella. Los virus utilizan la maquinaria metabólica codificada por los cromosomas de la célula hospedera para inducir su multiplicación. De esta manera los virus producen la enfermedad al alterar el metabolismo de la célula, lo que lleva a que ésta produzca sustancias anormales que influyen negativamente en las funciones del organismo (Silva, 1999). Se han descrito más de cuatrocientos virus de plantas que se clasifican en unos treinta y cinco grupos, hoy considerados géneros, en función de la naturaleza, de su material genético, de la estructura y propiedades de la partícula viral y de características biológicas como por ejemplo la forma de transmisión. La mayor parte de estos virus tienen como material genético moléculas de ARN monocatenario con polaridad de ARN mensajero (+), siendo en su mayoría, pequeños. Para que un virus pueda invadir una planta debe ser capaz de entrar en alguna célula, replicarse, propagarse a las células cercanas y por último desplazarse a zonas alejadas del punto de infección (Llacer et al., 2000). Los virus vegetales son responsables de un gran número de sintomatologías en las plantas. Entre los síntomas que producen está la menor tasa de crecimiento de la planta, moteados, mosaicos, manchas anilladas y enrollamiento de las hojas. Estos causan disminución del rendimiento y de la vida útil del vegetal, traducido en considerables pérdidas económicas, a causa de la producción deficiente del cultivo. En casi todas las enfermedades virales de las plantas, el virus se encuentra distribuido por todo el organismo vegetal, de ahí que los síntomas producidos se les denominen síntomas sistémicos. Sin embargo, existen virus que producen pequeñas lesiones necróticas y causan infecciones sólo a nivel de los puntos de

entrada, denominándose lesión local. También hay virus que se mantienen en las plantas sin presentar sintomatologías visibles, por lo que el hospedero se denomina asintomático (Agrios, 1996). Los métodos de transmisión de los virus de una planta a otra son muy variados, siendo los más frecuentes, la propagación vegetativa, mecánicamente a través de la savia y por medio de semillas, polen, insectos, ácaros, nemátodos, la cúscuta y los hongos. Los métodos que revisten mayor importancia son la propagación vegetativa y a través de semillas, ya que permiten que el virus sea transmitido de una generación de plantas a otra. En el primer caso, no sólo se logra que las nuevas plantas se enfermen, si no que en los casos de propagación mediante gemación o injerto, la presencia de un virus en la yema o el injerto puede resultar en una incompatibilidad entre patrón y variedad.

2.2

Control de virosis en plantas:

Las estrategias de control de las virosis no incluyen métodos directos de tipo físico o químico, si no que debe ser efectuada exclusivamente con métodos preventivos. Los más importantes son los siguientes: -

Uso de variedades y portainjertos resistentes o tolerantes a las virosis o a sus vectores. Estas formas de resistencia se pueden encontrar en el ámbito de la misma especie o adquirir de manera no convencional (plantas transgénicas) de otras especies vegetales o no.

-

Control de los vectores naturales de la enfermedad, como insectos, nemátodos, entre otros.

-

Multiplicación y distribución de material de propagación sano o sanitariamente mejorado, procedente de programas de selección clonal y sanitaria.

-

Adecuada acción de control en las aduanas para impedir la entrada de virus exóticos, a través de eficaces acciones de cuarentena (Digiaro, 1998).

2.3

Virus de la vid:

En el cultivo de la vid, se han identificado en el mundo más de 44 virus diferentes, pertenecientes a 5 familias y 16 géneros, sin embargo, sólo algunos de ellos tienen importancia económica. (Martelli y Walter, 1998). En nuestro país, al año 2004, ya se han detectado más de 14 virus, produciendo diversas sintomatologías en las vides. Las enfermedades de mayor frecuencia son: Enrollamiento foliar (Grapevine leafroll associated virus, GLRaV) y Hoja de abanico (Grapevine fanleaf vrus, GFLV). De estas dos enfermedades, según diversas investigaciones realizas en el ámbito de la virología en vides, GLRaV-3 se presenta de manera importante en los viñedos de nuestro país (Manzur, 2005).

2.4

Virus en estudio:

Los virus asociados al Enrollamiento de la hoja de la vid o (Grapevine leafroll associated virus, GLRaVs), pertenecen a la familia Closteroviridae. Dentro de esta, están implicadas al menos nueve distintas entidades virales filamentosas, entre las que se encuentra el virus GLRaV-3. Este virus es de amplia distribución mundial, afecta específicamente a vides, y su genoma presenta marcos de lectura que codifican para una metiltransferasa, una helicasa, polimerasa, una proteína de movimiento y proteína de la cápside.

Cuadro 2.1 Principales características del virus GLRaV-3 (Grapevine leafroll associated virus 3, GLRaV-3)

Género

Naturaleza del genoma

Closterovirus ssRNA (-) Fuente: Manzur, 2005.

Morfología

Filamentoso flexuoso

Tamaño genoma (kb)

Genoma (Nº segmentos)

Tamaño de la particula (nm)

Ubicación Tejido vegetal

19-20

1

1800-2100

Floema

En relación a su transmisión, el GLRaV-3 se disemina principalmente por material de propagación a partir de material infectado e injertación, sin embargo, la transmisión a corta distancia no deja de ser relevante, ya que pequeños organismos como cóccidos y pseudocóccidos, pueden ser importantes vectores de este virus, afectando la planta en forma aparentemente inespecífica y con modalidad semipersistente. Algunos de estos vectores son: Planococcus Ficus, Pl. citri, Pseudococcus longispinus.Ps. affinis, Ps. calceolariae, Ps. viburni, Ps. maritimus, Ps. comstocki, Pulvinaria vitis (Digiaro, 1998).

2.4.1

Sintomatología en vid:

Los síntomas que produce el virus del enrollamiento de la hoja de la vid, son entre otros: enrollamiento hacia abajo de la lámina foliar, acompañado de amarillez o coloración rojiza intervenal, según se trate de variedades de uva blanca o tinta. Este síntoma comienza a aparecer al final del verano y tiende a acentuarse en otoño. Como resultado las plantas infectadas pueden mostrar una reducción del vigor vegetativo y de la producción (en promedio desde el 10% hasta alrededor del 70%), formar racimos más chicos que maduran irregularmente, además de tener bajo contenido de azúcar y mayor acidez (Digiaro, 1998).

2.4.2

Diagnóstico de la enfermedad:

En la actualidad, las técnicas que se utilizan para detectar virus en plantas incluyen tanto técnicas serólogicas, moleculares como también plantas indicadoras. La enfermedad del enrollamiento de la hoja en vides se diagnóstica en base a la injertación en los indicadores leñosos Cabernet Franc o Pinot Noir. Si la enfermedad está presente, se desarrollarán hojas rojas en el otoño luego de dos estaciones creciendo en el campo (Martelli y Walter, 1998). Los viriones se encuentran en el floema y ocasionalmente en el mesófilo y la epidermis. Produce

modificaciones

a

nivel

ultraestructural,

consistentes

en

proliferación

de

membrana,

degeneración y vesiculación de mitocondrias y formación de cuerpos de inclusión (Manzur, 2005).

2.5

Técnicas serólogicas de diagnóstico:

Las técnicas serológicas tienen una amplia aplicación en el diagnóstico de enfermedades de naturaleza viral, siendo uno de los métodos más usados actualmente para la detección e identificación de virus vegetales. Ésta se basa en la reacción que se produce entre antígenos (proteínas) y anticuerpos específicos (Madariaga, 1998).

2.5.1

Enzyme Linked Inmunosorbent assay (ELISA):

Unos de los métodos serológicos más usados por su rápido diagnóstico, bajo costo y gran número de muestras procesadas simultáneamente, es la técnica ELISA. Ésta técnica fue desarrollada por Clark y Adams en 1977 y se basa en que el antígeno (virus) es selectivamente atrapado e inmovilizado por el anticuerpo, haciéndose posteriormente reaccionar con una enzima unida este. Finalmente se añade un sustrato específico el cual a través de un cambio de coloración permite una observación cuantitativa y cualitativa de la presencia del virus. (Clark, 1981). En la actualidad la técnica se desarrolla en microplacas de poliestireno permitiendo el uso masivo y automatizable. Además se pueden obtener comercialmente, en forma de kit, anticuerpos contra virus junto con los tampones necesarios para desarrollar el método completo con gran facilidad con instalaciones mínimas de laboratorio., proporcionando un resultado óptimo de diagnóstico (Boscia et al., 1997).

2.5.2

DAS-ELISA (Double Antibody Sandwich- ELISA):

Dentro de las variantes de ELISA más utilizadas en la detección de virus vegetales, se encuentra DAS-ELISA. Ésta prueba es llevada a cabo sobre una placa de poliestireno con 96 pocillos, donde las superficies internas constituyen el sustrato sólido sobre el cual los distintos componentes de la prueba se fijan por inmunoabsorción. La presencia del antígeno en el jugo infectado es indirectamente detectado a través de una reacción colorimétrica, que se desarrolla por la reacción de una enzima (fosfatasa alcalina) conjugada a anticuerpos ante la presencia de un sustrato apropiado (Paranitrofenilfosfato). Es una reacción que puede ser observada visualmente o mediante una medida fotométrica a 405 nm. Las reacciones de cada paso tienen lugar durante un periodo de incubación que varía de 2 a 16 horas dependiendo de la tempeatura seleccionada que va de 4 a 37ºC. Los lavados entre pasos eliminan los componentes que están en exceso (Boscia et al., 1997).

2.6

Técnicas de diagnóstico molecular:

La mejor manera de realizar un diagnóstico preciso y confiable de una enfermedad en vid en la actualidad, es a través de métodos moleculares. Una de las técnicas recibe el nombre de Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR). Desde que el químico Kary B. Mullis en 1986 desarrolló este método, se ha ampliado enormemente el poder de investigación del DNA o RNA recombinante, incluso, reemplazando algunos métodos anteriores. El análisis de PCR ha encontrado aplicaciones en una amplia gama de disciplinas, entre las que se encuentra la biología molecular, la genética humana, la evolución, e incluso la medicina forense (Klugs y Cummings, 2001).

2.6.1

Reacción en cadena de la polimerasa, PCR:

La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite la amplificación (es decir, producir copias múltiples) de ARN viral, el que puede estar presente en la vid en bajas cantidades. La amplificación por PCR permite la detección específica de secuencias de ADN y así posibilita la determinación de microorganismos contaminantes. Consta de tres grandes pasos básicos, los cuales son: desnaturalización, hibridación y extensión. Cada grupo de tres pasos, se denomina ciclo, el que es repetido por 30 o 40 veces, dando como resultado la copia de una porción de la molécula de ADN de doble cadena para producir dos cadenas ADN hijas. Luego de dos ciclos habrá 4 copias, y así sucesivamente, siendo este un aumento exponencial del número de copias. Esto se realiza en un termociclador automatizado, que puede calentar y enfriar los tubos con la mezcla de la reacción en un tiempo muy corto. De acuerdo a esto, unos pocos nanogramos de ADN pueden ser amplificados millones de veces en un ensayo con PCR. Cada unos de los pasos que constituyen el ciclo se explica con más detalle a continuación: -

Primero, el DNA que se quiere amplificar se desnaturaliza en cadenas sencillas. Este DNA no necesita estar ni purificado ni clonado, y puede provenir de distintas fuentes. El DNA de doble cadena se desnaturaliza por calor (a unos 90ºC) hasta que se disocia en cadenas sencillas (normalmente unos 5 minutos).

-

Los cebadores o partidores (“primers”) hibridan al DNA de cadena sencilla. Estos cebadores son oligonucleótidos sintéticos que hibridan con las secuencias flanqueantes del segmento a amplificar. Generalmente se utilizan dos cebadores diferentes. Cada uno de ellos tiene secuencia complementaria a una de las dos cadenas del DNA. Los cebadores se alinean con sus extremos 3’ encarados ya que hibridan a cadenas opuestas. La utilización de cebadores sintéticos significa que se debe tener alguna información de la secuencia de DNA a amplificar.

-

A la mezcla de reacción se le añade una DNA polimerasa resistente al calor (la DNA Taq polimerasa). Esta enzima extiende los cebadores en dirección 5’ - 3’, utilizando como molde al DNA de cadena sencilla unido al cebador. El producto es una molécula

de DNA de doble cadena con los cebadores incorporados en el producto final (Klugs y Cummings, 2001).

2.6.2

Transcripción reversa - Reacción en cadena de la polimerasa, RT-PCR:

Debido a que todos los virus conocidos que infectan la vid están conformados por ARN, previo a realizar la PCR, el ARN debe ser convertido en ADN. Esta técnica es denominada RTPCR y requiere una porción de ARN viral y un iniciador o partidor para lograr el inicio del proceso de copiado. Estos segmentos cortos de ADN activan el proceso de copiado genético. Con ayuda de una transcriptasa reversa (DNA polimerasa RNA dependiente) se forma un cDNA a partir del ARN viral inicial. Luego se sigue con la PCR, como ya se ha explicado en el punto anterior, donde la duplicación es repetida varias veces con cada copia haciendo más copias. Así, luego de 40 ciclos, se han producido más de un billón de copias. Ahora, con un número exponencialmente alto de copias, el virus puede ser detectado (Monis, 2006).

2.6.3

Transcripción reversa - Reacción en cadena de la polimerasa asociado a Inmunocaptura, IC-PCR:

Esta técnica combina la captura de partículas virales por anticuerpos con la amplificación por PCR. En este método el virus es inmunoabsorbido por los anticuerpos para ser fijado a una superficie, siendo luego eliminado por calor con un surfactante iónico (Triton X-100). Una vez ocurrido esto, los ácidos nucleicos son amplificados mediante la técnica RTPCR (Webster et al., 2004).

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1

Determinación de las áreas de muestreo:

Para definir las distintas áreas de muestreo se consideraron los sectores de mayor importancia en la producción de uva vinífera de la región del Maule, utilizando como parámetros la superficie cultivada como también la presencia de distintas variedades. Las zonas muestreadas fueron Panguilemo, Pencahue, Batuco, San Clemente, San Rafael, Duao, Molina y Cauquenes. Una vez definidos los sectores a muestrear, previo permiso de los agricultores o empresas vitivinícolas según correspondiera, se procedió a realizar las visitas a terreno las cuales se efectuaron en los meses de Marzo y Abril del año 2008. Basándose en la información proporcionada por los propios agricultores o encargados de los predios entregada en ésta, se pudieron definir los sectores a prospectar.

3.2

Forma de muestreo:

El muestro se realizó en forma dirigida hacia plantas con diferentes grados de sintomatología viral de tipo visual, consistiendo cada muestra en brotes lignificados de la temporada, ubicados en las zonas intermedias de cada planta. (Figura 2.1). Una vez recolectadas las muestras fueron colocadas en bolsas plásticas previamente identificadas, las que se guardaban en un lugar sombreado para mantenerlas frescas en terreno. Luego se mantuvieron en cámara de frío a 4ºC hasta el momento de realizar el análisis serológico DAS-ELISA, lo que ocurrió dentro de los próximos 30 a 60 días. Los análisis se llevaron a cabo en el Laboratorio de Sanidad vegetal, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad de Talca.

Se recolectaron 387 muestras de 8 predios diferentes, ubicados en la VII Región del Maule.

Cuadro 3.1. Número total de muestras colectadas en la VII Región, Chile, en las distintas zonas de producción vitivinícolas visitadas. Temporada 2007/2008. Zona Vitivinícola Panguilemo Pencahue Batuco San Clemente San Rafael Duao Molina Cauquenes Total muestras colectadas

3.3

Nº de muestras colectadas 80 27 7 38 56 24 45 110 387

Método de diagnóstico:

El análisis de las muestras obtenidas se realizó sobre la base de la técnica de diagnóstico DAS-ELISA (Double Antibody Sandwich - ELISA) en una primera etapa para definir aquellas que presentaban el virus. Luego estas fueron analizadas por IC-RT-PCR (Immunocapture - Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction). El virus a prospectar fue GLRV-3. (anexo 3.1).

3.3.1

Serología (DAS-ELISA):

Para analizar las muestras y determinar aquellas en que se encontraba presente el virus se utilizó el método estándar de doble anticuerpo en la detección de antígenos por conjugados enzimáticos (Clark et al., 1976). Primero se prepararon los diferentes tampones

(cuadro 3.2) y se procedió a sensibilizar las placas de carbonato de poliestireno con 100 microlitros del anticuerpo del virus a determinar, en buffer de carbonato a p.H. 9.6 por cada celdilla. A continuación se incubo la placa por un periodo de 3 horas a una temperatura de 36ºC. Posteriormente se procedió a lavar éstas, tres veces con PBS-T conteniendo este [(0.05% Tween 20 v/v (PBS-tween)] por periodos de tres minutos cada uno.

a.

Preparación de las muestras:

De las muestras obtenidas en terreno, se recolectó mediante bisturí 1 gramo de tejido floemático el que se diluyó en 5 mililitros de tampón de extracción general (cuadro 3.2), siendo maceradas en forma separada en morteros estériles. (Figura 2.1).

b.

Análisis de las muestras:

Una vez obtenido el extracto se procedió a tomar 100 microlitros de cada muestra, los que se colocaron en las placas de carbonato de poliestireno previamente sensibilizadas. Con el objeto de impedir una inactivación del virus producto de temperaturas elevadas, las placas se mantuvieron en el refrigerador. Una vez colocadas las muestras a analizar en las distintas celdillas, se procedió a incubar durante toda la noche a una temperatura de 4ºC. Al día siguiente cada placa fue lavada de la misma forma antes descrita utilizando para su efecto PBS-tween. Posteriormente se adicionaron 100 microlitros por celdilla del conjugado, que se preparo diluyendo el anticuerpo conjugado con tampón conjugado (Cuadro 3.2). Luego de un periodo de incubación de 4 horas a 36ºC, las placas fueron lavadas nuevamente de la forma indicada anteriormente, adicionando luego 200 microlitros del buffer sustrato incluyendo para nitro fenilfosfato (PNP) en concentración de 1mg/ml. Las reacciones fueron leídas con la ayuda de un equipo lector de absorbancia para placas de ELISA electrónico, denominado VICTOR III. (Figura 3.1).

Cabe mencionar que se utilizó un control positivo (extracto con virus) y uno negativo por cada prueba realizada para verificar el correcto funcionamiento de la técnica.

Cuadro 3.2 Tampones utilizados en técnica DAS-ELISA. PBSt (Base o de lavado)

16 gramos cloruro de sodio 2,3 gramos de fosfato de sodio dibásico 0,4 gramos sulfato de potasio monobásico 0,4 gramos cloruro de potasio 1 cm3 de Tween 20 Disolver en 2 litros agua destilada

Tampón de extracción general

1 litro de PBSt Base 1,3 gramos de sulfito sódico 20 gramos de (Polivinilpirrolidona) PVP 0,2 gramos ácida sódico 2 gramos de albúmina 20 cm3 Tween 20

Tampón conjugado

1,59 gramos de carbonato sódico 2,93 gramos de bicarbonato sódico 0,2 gramos ácida sódica Disolver en 1 litro de agua destilada

Buffer sustrato

p-nitrofenil fosfato (PNP) Dietanolamina

Sintomatología viral de tipo visual

Obtención de floema mediante bisturí

Recolección de las muestras

Medición de la muestra

Ubicación de las muestras en placas de poliestireno

Maceración

Equipo lector de absorbancia para placas de Elisa

Figura 3.1 Obtención, preparación y análisis de las muestras de vid obtenidas en terreno a través de la técnica de diagnóstico DAS-ELISA.

3.3.2

Técnica Molecular (IC-RT-PCR):

Para la realización de la técnica de amplificación por IC-RT-PCR (Figura 3.2) se utilizaron aquellas muestras que resultaron positivas a la presencia del virus a través de la prueba serológica DAS-ELISA mediante el método estándar de doble anticuerpo en la detección de antígenos por conjugados enzimáticos (Clark et al., 1976). Se evaluaron dos protocolos distintos de esta técnica:

Protocolo para la detección descrito por Wetzel et al., 1991 y Olmos et al., 1997 Protocolo para la detección descrito por INIA, Madrid, España.

Toma de muestras Extracción de ARN viral Captura de partículas virales por anticuerpos

Amplificación por PCR de una copia de ADN Copiar el ARN a ADN (Transcripción Reversa)

Electroforesis del producto de PCR

Figura 3.2 Pasos seguidos para el desarrollo de la IC-RT-PCR para la determinación del Grapevine leafroll associated virus-3 (GLRaV-3) en muestras de vid.

a.

Protocolo de IC-RT-PCR descrito por Wetzel et al., 1991 y Olmos et al., 1997:

Primero, para la realización de la fase de inmunocaptura, el anticuerpo comercial se diluyó de acuerdo a lo señalado por el proveedor en tampón carbonato 0,05 M, Ph 9,6 (Cuadro 3.3). Luego en cada tubo utilizado para la amplificación, identificado previamente, se agregaron 100 ul de esta dilución e incubaron a 37° C durante tres a cuatro horas.

Una vez finalizada la incubación se lavaron los tubos tres veces con 150 ul de tampón de lavado estéril (Cuadro 3.3). Paralelamente se obtuvo el extracto de las muestras analizadas utilizando nitrógeno líquido y luego se agregó tampón de extracción (Cuadro 3.3) en proporción 1:5 o 1:10 p/v. (Figura 3.2). El extracto de la muestra obtenido se clarificó 5 minutos a 13.000 revoluciones/min a 4 °C, utilizando una microfuga. (Figura 3.3) En seguida, desde la porción superior (sobrenadante) se recuperaron 100 ul por muestra adicionándolo a cada tubo previamente sensibilizado e identificado. Inmediatamente los tubos se incubaron a 37ºC durante tres horas. Finalmente los tubos fueron lavados tres veces al modo ya indicado empleando 150 ul de tampón estéril por tubo y por lavado.

Cuadro 3.3. Tampones utilizados en protocolo para la detección de GLRaV-3 a través de IC-RT-PCR, descrito por Wetzel et al., 1991 y Olmos et al., 1997. Tampón carbonato

1,59 gramos de carbonato sódico 2,93 gramos de bicarbonato sódico 0,2 gramos ácida sódica Disolver en 1 litro de agua destilada

Tampón de lavado, PBS-Tween

8 gramos de cloruro de sodio 0,2 gramos de cloruro de potasio 1,44 gramos de fosfato sódico dibásico 0,24 gramos fosfato de potasio monobásico 0,5 ml Tween 20 Disolver en 1 litro y esterilizar en autoclave

Tampón de extracción

50 ml Tris ácido clorhídrico 1 M Ph 8,3 3 ml de cloruro de sodio 5 M 50 µl Tween 20 2 gramos Polivinilpirrolidona-40 1 gramo Polietilenglicol (6000) 20 mg Acido sódico Disolver en 100 ml de agua destilada y esterizar a 120ºC por 20 minutos

Una vez finalizado el procedimiento anterior con el lavado de los tubos, se procedió a agregar la mezcla necesaria para la realización de la RT-PCR. (Cuadro 3.4).

Cuadro 3.4. Mezcla utilizada para la realización de la RT-PCR (GLRaV-3) descrito por Wetzel et al., 1991 y Olmos et al., 1997. Tampón Taq polimerasa 10 X Agua estéril libre de nucleasas Taq polimerasa 1 U/µl dNTPs 5 Mm 4% Triton X-100 MgCl2 25 Mm M-MLV 20 U/µl 25 µM partidor P1 25 µM partidor P2

2,5 µl 15,25 µl 0,5 µl 1,25 µl 2,00 µl 1,50 µl 0,05 µl 1,00 µl 1,00 µl

Para la detección de GLRaV-3 por RT-PCR, los partidores utilizados corresponden a: CP3U cuya secuencia es 5’ ATGGCATTTGAACTGAAATTAGGGC 3’ y CP3D cuya secuencia es 5’ CGGCGCCCATAACCTTCTTACA 3’

Los partidores descritos por Turturo et al., 2005, fueron sintetizados en una empresa comercial dedicada a este fin. (Fermelo Biotec, Cat # Z3101, SV Total RNA Insolation System Trial, http://www.fermelo.cl)

Las temperaturas y tiempos empleados para la reacción de PCR en el termociclador fueron: 45 minutos a 42ºC, luego 5 minutos a 94ºC y 35 ciclos por 30 segundos a 94ºC para desnaturalización, 20 segundos a 57ºC para anillamiento, 5 segundos a 72ºC para extensión, 1 ciclo de 7 minutos a 72ºC y finalmente se lleva a 4ºC para mantención. (Figura 3.3).

Nitrógeno líquido

Maceración

Microfuga

Termociclador

Figura 2.3 Extracción del virus mediante nitrógeno líquido, uso de la microfuga para la clarificación de la muestra y utilización del termociclador para la amplificación del virus por PCR.

b.

Protocolo de IC-RT-PCR descrito por INIA, España:

Para la realización de este protocolo se efectuaron los mismos pasos descritos para la fase de inmunocaptura mencionados en el protocolo anterior, utilizando igualmente los mismos tampones (Protocolo de IC-RT-PCR descrito por Wetzel et al., 1991 y Olmos et al., 1997). La diferencia en este segundo procedimiento radica en esta fase en la etapa final de incubación a 37ºC durante tres horas, ya que en este caso se realizó una incubación a 4ºC durante toda la noche, para luego finalmente lavar las placas tres veces empleando 150 ul de tampón estéril. Una vez finalizado el procedimiento anterior, se procedió a adicionar los 20 ul de la mezcla necesaria (Cuadro 3.5) para la realización de la transcripción reversa a los tubos previamente lavados. A diferencia del protocolo anterior, en este caso primero se lleva a cabo la transcripción reversa (síntesis del cDNA).

Cuadro 3.5 Mezcla utilizada para la realización de la transcripción reversa descrito por INIA, España. Tampón transcriptasa 5X dNTPs 10 Mm Inhibidor de ribonucleasas 10 uM partidor reverso CP3D Transcripatasa inversa (200 unidades) Agua DEPC

4 µl 2 µl 0,5 µl 2 µl 1 µl 10,5 µl

Luego de agregar la mezcla a cada pocillo, se incubó a 37ºC durante una hora, y pasado este tiempo se llevó rápidamente a 95 ºC por 5 minutos para inactivar la transcripatasa inversa. Finalmente se llevaron los tubos a hielo. Una vez obtenido el cDNA y para llevar a acabo la siguiente fase de ampliación se preparó la siguiente solución de premezcla: (Cuadro 3.6).

Cuadro 3.6. Mezcla utilizada para la realización de la fase de amplificación descrito por INIA, España. 10 uM partidor CP3U Tampón Taq polimerasa X Agua estéril Taq DNA polimerasa X MgCl 25 Mm

2 ul 6 ul 30,5 µl 0,5 µl 1 µl

Para la realización de esta etapa y la anterior (RT) para la detección de GLRaV-3, los partidores utilizados corresponden a los mencionados anteriormente (CP3U y CP3D). La premezcla anterior fue añadida a los 20 µl de reacción de la transcripción reversa de la fase anterior. Finalmente las temperaturas y tiempos empleados para la reacción de amplificación en el termociclador fueron: 40 ciclos por 30 segundos a 92ºC para desnaturalización, 30 segundos a 60ºC para anillamiento, 1 minuto a 72ºC Para extensión, 1 ciclo por 10 minutos a 72ºC y finalmente se lleva a 4ºC para mantención.

c.

Análisis de los productos de la reacción a través de electroforesis en gel de agarosa:

Se preparó un gel de agarosa al 2% en tampón TAE (Cuadro 3.7) usando guantes protectores. Todo el análisis fue realizado de igual forma para los dos protocolos.

Se pesó 1 gramo de agarosa y se mezcló con 100 ml de tampón TAE 50 X. Luego se calentó en el microondas hasta que se inicie la ebullición. En seguida se retiró del microondas y se dejó enfriar unos segundos para luego verterlo sobre la bandeja, dejando el gel polimerizar y enfriar. Una vez polimerizado el gel se trasladó a la cubeta de electroforesis horizontal. Posteriormente se recogió una alícuota de cada reacción (20 ul de cada tubo) y se agregó 3 ul de tampón de carga (Cuadro 3.7). Se centrifugaron brevemente las muestras y se cargaron sucesivamente los pocillos del gel. También en el pocillo situado más a la izquierda se agregó un marcador de peso molecular de DNA de 100 pb. La electroforesis se efectuó a 160 V constantes por un tiempo de 40 minutos. Finalizado el tiempo se tiñó el gel con bromuro de etidio 1 ug/ml por 15 minutos para visualizarlo mediante un transiluminador ultravioleta.

Cuadro 3.7. Tampones utilizados para la observación de los productos de la reacción de RT-PCR a través de electroforesis en gel de agarosa. Tampón TAE 50 X

57,1 ml de ácido acético glacial 100 ml de EDTA 0,5 M pH 8 242 gramos de Tris base Disolver en 1 litro con agua destilada

Tampón de carga

250 mg de Azul de bromofenol 30 ml de glicerol 70 ml de agua estéril

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1

Análisis de la prospección viral:

Se recolectó un total de 387 muestras con sintomatología viral de tipo visual, las cuales fueron analizadas mediante la técnica serológica DAS-ELISA para el virus en estudio. El virus se detectó en 29 muestras (7,5%) del total recolectado, distribuidas entre las localidades de Panguilemo, Pencahue, Batuco, San Clemente, San Rafael, Duao, Molina y Cauquenes. El que del alto número de muestras tomadas solo un 7.5% resultara positiva a la técnica DAS-ELISA, podría ser explicado principalmente a que deficiencias de nutrientes y daños de herbicida puede provocar el desarrollo de síntomas que se pueden confundir con la presencia del virus. También la existencia de otros patógenos, particularmente virus, podrían ocasionar los mismos síntomas visuales.

4.2

Técnica Molecular IC-RT-PCR:

Los resultados de la RT-PCR asociado a inmunocaptura para la detección de la presencia del virus GLRaV-3 a través de los dos protocolos descritos anteriormente fueron infructuosos. Esto se podría explicar a través de varios factores, entre otros, la posible existencia de sustancias inhibitorias que estarían presentes en los tejidos vegetales al momento de la extracción de los ácidos nucleicos, las que no fueron removidas adecuadamente. Se evaluaron diferentes alternativas para optimizar los protocolos específicos de extracción del virus tales como variación en la concentración la muestra en el de tampón de extracción (1:5 y 1:10 p/v) y la obtención del extracto de las muestras utilizando nitrógeno líquido. Sin embargo, los resultados obtenidos, a pesar de estas modificaciones fueron negativos, no obteniéndose en ningún caso los productos de amplificación esperados.

Durante la realización del proceso de extracción del ácido nucleico, las sustancias inhibitorias no fueron completamente removidas interfiriendo con la etapa de amplificación, inhibiendo la acción de la enzima ADN polimerasa (Taq). También la presencia de componentes como polisacáridos y compuestos fenólicos pudo haber tenido un efecto en la viabilidad del ácido ribonucleico, disminuyéndola o facilitando su degradación (Cocolin et al., 2003). Asociado a lo mismo, y a pesar del uso en las distintas etapas de agua libre de ribonucleasas, estas enzimas pueden haberse mantenido en restos vegetales que no fue posible eliminar. Otros autores han informado que el principal factor limitante para la aplicación de técnicas moleculares en el diagnóstico de enfermedades radica en la obtención de ácido nucleico de buena calidad, en concentraciones apropiadas, y libre de inhibidores de la PCR. Esto se aplica especialmente para el caso de plantas leñosas como la vid y también para muchos árboles frutales de los géneros Malus, Prunus y Pyrus, donde se dificulta el proceso de extracción. Se debe tener presente que la mayoría de los procedimientos estándar de obtención de ARN totales desde tejidos vegetales no eliminan los contaminantes que pueden tener efectos inhibitorios directos en la realización de la PCR (MacKenzie et al., 1997). En relación a lo anterior, Wetzel et al. (1992) señala que la IC-RT-PCR es mucho más sensible al momento de preparar las extracciones de ARN por métodos convencionales en comparación con la técnica regular de la RT-PCR en lo que se refiere a evitar los efectos nocivos de los potenciales inhibidores de la PCR. Otro factor que puede haber limitado el correcto diagnóstico a través de herramientas moleculares de este patógeno, es la distribución irregular y la baja concentración de este virus, y en general de los closterovirus en las muestras de tejido de vid. En relación a esto, Monis y Bestwick, 1996 detectaron que los antígenos asociados a GLRaV-1, 2 y 3 se distribuyen de manera desigual en los tejidos infectados, encontrando las concentraciones más altas de virus en la parte inferior de la planta. También informaron que los antígenos asociados al virus se detectaron a lo largo del año (exceptuando la temporada de comienzos del crecimiento) en la

zona basal del tallo y pecíolo de las muestras, sugiriendo que la recolección de las muestras se deba realizar en estos tejidos para la detección de GLRaV sin ambigüedades. Basado en lo anterior, sería recomendable realizar la recolección de las muestras a mediados de temporada, después de registrarse la etapa de brotación y adelantándose a la época de maduración de la uva, ya que en este periodo, el virus se encontraría en una concentración adecuada en la planta, evitando de esta manera el aumento en la proporción de sustancias inhibitorias para la acción de la ADN polimerasa (Taq) como polisacáridos y compuestos fenólicos. Además sería importante también modificar el tipo de muestra recolectadas como también la zona de donde éstas son extraídas, cambiándolas por brotes de la zona basal del tallo o por pecíolos ubicados preferentemente en la zona inferior de cada planta. De esta manera estaríamos sustituyendo los brotes lignificados, con los que se efectuó este estudio, por tejido vegetal herbáceo que contendría una menor cantidad de inhibidores de la PCR. Resumiendo, y considerando los resultados obtenidos, sería adecuado realizar una nueva toma de muestras a las plantas ya prospectadas y que resultaron positivas a la presencia de GLRaV-3 a través de la técnica serológica DAS-ELISA, modificando eso sí, los diferentes aspectos ya mencionados.

5. CONCLUSIONES

•

Los dos protocolos de IC-RT-PCR para la detección y análisis de GLRaV-3 fueron ineficaces para determinar la presencia del virus en muestras de sarmiento de vid recolectadas en invierno.

•

En la electroforesis de los productos de IC-RT-PCR no fue posible observar las bandas de amplificación esperadas.

•

Modificaciones a los protocolos evaluados, como variación en la relación peso /volumen entre muestra y tampón de extracción o el empleo de nitrógeno líquido en la maceración no fueron efectivas.

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