UNIVERSIDAD INTERNACIONAL SEK

FACULTAD DE CIENCIAS AMBIENTALES

Plan de investigación de fin de carrera titulado: “ESTUDIO DE LA CAPACIDAD DE CRECIMIENTO Y ESTRUCTURA POBLACIONAL DE CONSORCIOS BACTERIANOS EN PRESENCIA DE FENANTRENO, PROCEDENTES DE UN SUELO PRÍSTINO Y UNO CONTAMINADO DE LA REGIÓN AMAZÓNICA DEL ECUADOR.”

Realizado por: JOHANNA ALEXANDRA MALDONADO UQUILLAS

Director del proyecto: Doctor Pablo Jarrín (M. A., Ph. D)

Como requisito para la obtención del título de: INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA

2014

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DEDICATORIA

A mis padres Fernando Maldonado y Gina Uquillas y a mi hermana Kelly Maldonado. Gracias por caminar junto a mí en las buenas y en las malas, por enseñarme a luchar por lo que quiero y convertir mis sueños en realidad.

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“La esperanza es desear que algo suceda, la fe es creer que va a suceder y la valentía es hacer que suceda”. Gracias a todas esas personas que tienen fe en mí.

Patito gracias por una amistad verdadera y estar juntas en cada etapa de nuestras vidas. Andrés gracias por enseñarme a cambiar el miedo por la fe y a sonreír a los problemas.

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ÍNDICE DEL CONTENIDO

CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 1 1.1

PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN .............................................................................. 5

1.1.1

Planteamiento del problema: ........................................................................................ 5

1.1.1.1 Diagnóstico del problema ............................................................................................ 6 1.1.1.2 Pronóstico .................................................................................................................... 6 1.1.1.3 Control del pronóstico ................................................................................................. 7 1.1.2

Formulación del problema ............................................................................................ 7

1.1.3

Sistematización del problema ....................................................................................... 8

1.1.4 Objetivo general ................................................................................................................. 8 1.1.5 Objetivos específicos.......................................................................................................... 8 1.1.6 Justificaciones .................................................................................................................... 9 1.2

MARCO TEÓRICO ........................................................................................................ 10

1.2.1

Estado actual del conocimiento sobre el tema ............................................................ 10

1.2.2

Adopción de una perspectiva teórica .......................................................................... 13

1.2.3

Marco conceptual ....................................................................................................... 14

1.2.3.1 Introducción al petróleo .......................................................................................... 14 1.2.3.2 Suelo .......................................................................................................................... 16 1.2.3.2.1 Comunidad microbiana del suelo ........................................................................... 17 1.2.3.3 Tratamiento biológico del suelo: biorremediación .................................................... 24 1.2.3.4 Técnicas de laboratorio.............................................................................................. 29 1.2.4

Hipótesis ..................................................................................................................... 32

CAPÍTULO II. METODOLOGÍA................................................................................................ 33 2.1

NIVEL DE ESTUDIO ..................................................................................................... 33

2.2

MODALIDAD DE INVESTIGACIÓN.......................................................................... 34

2.3

MÉTODO ......................................................................................................................... 38

2.4

POBLACIÓN Y MUESTRA .......................................................................................... 38

2.5

SELECCIÓN DE INSTRUMENTOS DE INVESTIGACIÓN.................................... 39

2.5.1

Caracterización de los suelos ...................................................................................... 39 viii

2.5.1.1 Análisis de varianza (ANOVA) .............................................................................. 39 2.5.2

Aislamiento de los consorcios bacterianos: ................................................................ 40

2.5.3

Medios de cultivo y reactivos: .................................................................................... 40

2.5.4

Crecimiento bacteriano: .............................................................................................. 41

2.5.5

Extracción total de ADN bacteriano:.......................................................................... 41

2.5.6

Amplificación del gen ARNr 16s: .............................................................................. 43

2.5.7

Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE): .................................... 44

2.5.8

Análisis del patrón de bandas posterior al DGGE ...................................................... 45

CAPÍTULO III. RESULTADOS ............................................................................................... 47 3. RESULTADOS ....................................................................................................................... 47 3.1 Medición de pH y temperatura ............................................................................................ 47 3.2 Crecimiento bacteriano ....................................................................................................... 51 3.3 Extracción de ADN: ............................................................................................................ 60 3.4 Amplificación del gen 16s ARNr: ...................................................................................... 61 3.5 Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE): ............................................ 62 3.6 Análisis del patrón de bandas posterior al DGGE: ............................................................. 63 CAPÍTULO IV. DISCUSIÓN ...................................................................................................... 66 4.1

DISCUSIÓN ..................................................................................................................... 66

4.1.1

Medición de pH y temperatura: .................................................................................. 66

4.1.2

Crecimiento bacteriano: .............................................................................................. 69

4.1.3

Estudio molecular de la biodiversidad de las unidades microbianas del suelo. ......... 71

4.2

CONCLUSIONES............................................................................................................ 74

4.3

RECOMENDACIONES ................................................................................................. 77

BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................................... 78 ANEXOS ...................................................................................................................................... 84

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ÍNDICE DE TABLAS: Tabla 1: Medición de pH y Temperatura de los suelos. .............................................................. 47 Tabla 2: Análisis estadístico ANOVA ......................................................................................... 48 Tabla 3: Prueba post hoc, comparaciones múltiples entre los tipos de suelo y las variables. ..... 49 Tabla 4: Días de muestro del crecimiento microbiano. ............................................................... 51 Tabla 5: Días de muestro del crecimiento microbiano con refresco del medio. .......................... 51 Tabla 6: Valores de ABS de crecimiento microbiano. ................................................................ 51 Tabla 7: Comparación de la presencia / ausencia de bandas por carriles a través del sistema TOTALLAB 1D donde 1 denota presencia de una banda en ese carril y 0 denota ausencia. ...... 65

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INDICE DE FIGURAS Figura 1: Curva de crecimiento bacteriano. Fuente: Tiedje, 2000. ............................................. 21 Figura 2: Mapa de ubicación y límites de la Reserva Biológica de Limoncocha. ...................... 34 Figura 3: Punto de Muestreo de suelo (circulo verde) en la Reserva Biológica Limoncocha, Bosque primario (Lopez, 2010; Madera, 2011). .......................................................................... 35 Figura 4: Mapa Catastra Petrolero Ecuatoriano (EP Petroecuador, 2014). ................................. 36 Figura 5: Mapa Catastral Petrolero Ecuatoriano (EP Petroecuador, 2014). Refinería Shushufindi. ....................................................................................................................................................... 37 Figura 6: Curva de crecimiento bacteriano del Suelo contaminado 1. ....................................... 58 Figura 7: Curva de crecimiento bacteriano del Suelo contaminado 2. ........................................ 58 Figura 8: Curva de crecimiento bacteriano del Suelo Limpio. .................................................... 59 Figura 9: Curva de crecimiento bacteriano de los tres tipos de suelo. ........................................ 59 Figura 10: Extracción de ADN. Gel de agarosa 0.8%. MPM (1Kb), 1) Suelo Contaminado 1 sin fenantreno, 2) Suelo Contaminado 2 sin fenantreno, 3) Suelo Limpio sin fenantreno, 4) Suelo Contaminado 1 con fenantreno, 5) Suelo Contaminado 2 con fenantreno, 6) Suelo Limpio con fenantreno. .................................................................................................................................... 60 Figura 11: Amplificación del gen 16s ARNr. Gel de agarosa 2%. MPM (1Kb), 1) Suelo Contaminado 1 sin fenantreno, 2) Suelo Contaminado 2 sin fenantreno, 3) Suelo Limpio sin fenantreno, 4) Suelo Contaminado 1 con fenantreno, 5) Suelo Contaminado 2 con fenantreno, 6) Suelo Limpio con fenantreno, 7) NEGATIVO. ............................................................................ 61 Figura 12: Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE). Gel de poliacrilamida 10% (p/v). 1) Suelo Contaminado 2 sin fenantreno, 2) Suelo Contaminado 1 sin fenantreno, 3) Suelo Limpio sin fenantreno, 4) Suelo Contaminado 2 con fenantreno, 5) Suelo Contaminado 1 con fenantreno, 6) Suelo Limpio con fenantreno.......................................................................... 62 Figura 13: Patrón de reconocimiento de bandas de DGGE por medio de TOTALLAB 1D. Carril 1) Suelo Contaminado 2 sin fenantreno, Carril 2) Suelo Contaminado 1 sin fenantreno, Carril 3) Suelo Limpio sin fenantreno, Carril 4) Suelo Contaminado 2 con fenantreno, Carril 5) Suelo Contaminado 1 con fenantreno, Carril 6) Suelo Limpio con fenantreno. ..................................... 64

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LISTA DE ANEXOS Anexo A: Recolección de muestra del suelo prístino en el Bosque Húmedo Tropical Limoncocha, sendero de la Estación Científica Limoncocha. ...................................................... 84 Anexo B: Recolección de muestra del suelo contaminado (punto 1). Piscina de quema de gas en la Refinería Shushufindi de EP Petroecuador. .............................................................................. 85 Anexo C: Recolección de muestra del suelo contaminado (punto 2). Riachuelo contaminado por efluentes de Refinería Shushufindi de EP Petroecuador............................................................... 87 Anexo D: Replicas de cada tipo de suelo en estudio. ................................................................... 89 Anexo E: Cultivo de suelo en PBS (Phosphate buffered saline).................................................. 90 Anexo F: Agitación e incubación de los medios de cultivo de cada tipo de suelo. ..................... 91 Anexo G: Clasificación del suelo según su pH. Fuente: Casseres, 1998. .................................... 92

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RESUMEN

El objetivo del presente estudio es determinar el crecimiento y la estructura poblacional de consorcios bacterianos en presencia de fenantreno. Las muestras de suelo para el estudio fueron procedentes de un suelo prístino del Bosque Húmedo Tropical de Limoncocha y dos suelos contaminados por efluentes de crudo en la Refinería Shushifindi de Petroecuador. El crecimiento bacteriano se midió por medio de espectrofotometría (ABS 600 nm) y se comparó el desarrollo de las baterías de los tres tipos de suelo por medio de curvas de crecimiento. Para el estudio de las comunidades bacterianas se realizó técnicas moleculares como extracción de ADN bacteriano, amplificación del gen 16s ARNr, electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) y finalmente se realizó un análisis de patrón de bandas posterior al DGGE para confirmar presencia / ausencia de bandas y conocer la existencia de comunidades bacterianas en los tres tipos de suelo antes y después de la adición de fenantreno. En el crecimiento bacteriano en la fase de crecimiento exponencial se presentó una duplicación celular en los tres tipos de suelo, siendo el de mayor desarrollo el suelo cerca al riachuelo contaminado por efluentes de Refinería Shushufindi de EP Petroecuador, seguido por el suelo prístino del Bosque Húmedo Tropical Limoncocha,. En el análisis de bandas posterior al DGGE se encontró presencia de bandas en todos los suelos en estudio, es decir, que existe comunidades bacterias. La presencia de las bandas 4 y 5 se encontró en todos los tipos de suelos con y sin fenantreno y son comunidades bacterianas capaces de desarrollarse y adaptarse a los sustratos existentes y a las condiciones del medio. Por otro lado, en el estudio de las bandas después de la adición de fenantreno al medio, las bandas 1 y 2 desaparecen en todos los suelos siendo comunidades bacterianas no adaptadas al medio con fenantreno. La muestra del suelo prístino, antes y después de la adición de fenantreno, presenta un mayor número de bandas en referencia al resto de suelos. Es importante el uso de técnicas moleculares para el estudio de comunidades bacterianas en el suelo en presencia de contaminantes como el fenantreno para, posteriormente conocer las especies de bacterias capaces de degrada o transforma los contaminantes hasta formas menos tóxicas o inocuas gracias a la capacidad degradadora de algunas especies de bacterias que usan los contaminantes como fuente de carbono y energía. Palabras claves: comunidad bacteriana, fenantreno, suelo contaminado, suelo prístino, gen 16s ARNr.

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ABSTRACT

The aim of this study is determine growth and population structure of bacterial consortia in presence of phenanthrene. Soil samples for the study were from a pristine soil of Tropical Rainforest Limoncocha and two oil-contaminated soils of Petroecuador Shushifindi Refinery. Bacterial growth was measured by spectrophotometry (ABS 600 nm) and development of the batteries of the three types of soil is comparing by growth curves. To study bacterial communities were performed molecular techniques as bacterial DNA extraction , amplification of the 16S rRNA gene , gel electrophoresis, denaturing gradient (DGGE ) and finally bands analysis after DGGE to confirm presence / absence of the bands and find the existence of bacterial communities in three soil types before and after the addition of phenanthrene. The bacterial growth in the exponential growth phase, the cell duplication occurred in the three soil types, being the most developed soil from contaminated river by effluents from Refinery Shushufindi EP Petroecuador, followed by soil pristine from Rainforest tropical Limoncocha. In the post analysis of DGGE present bands was found in all soils, so is there bacteria communities. The presence of bands 4 and 5 were found in all soil types with and without phenanthrene because this bacterial communities are able to develop and adapt to existing substrates and environmental conditions. Furthermore, in the study of the bands after the addition of the medium phenanthrene lanes 1 and 2 away in all soil bacterial community not being suited to the environment with phenanthrene. Soil pristine sample before and after addition of phenanthrene, it presents a greater number of bands in reference to other floors. It is important to use molecular techniques to study bacterial communities in soil in the presence of pollutants such as phenanthrene to then know the species of bacteria able to degrade or transform contaminants to less toxic or nontoxic forms through the degrading capacity some species of bacteria that use the contaminants as carbon and energy source.

Keywords: bacterial community, phenanthrene, contaminated soil, pristine land, 16s rRNA gene.

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Capítulo I. INTRODUCCIÓN Ecuador, al ser un país con apenas 256,370 km2 de extensión territorial (Pro Ecuador, 2013), es considerado entre los más megadiversos del mundo, albergando alrededor de 9,2 especies por km2 (Melo, 2006). Esto es influenciado por una variedad de factores climáticos y geográficos, que permiten que sea uno de los países con mayor número de ecosistemas, ambientes naturales y diversidad biológica (Granda, 2011).La mayoría de la diversidad biológica del Ecuador se encuentra en la Región Amazónica o Región Oriental que gracias a la presencia de los bosques húmedos tropicales, el río Amazonas, un clima cálido, húmedo y lluvioso, forman un hábitat de gran riqueza en flora y fauna. (Mittermaier, 2007). En la última década, se ha orientado la mirada del mundo hacia la Amazonía como la mayor reserva estratégica de dos recursos que se consideran claves para garantizar la prevalencia de la vida en el planeta como son: la biodiversidad y el agua dulce. El 30% del agua del planeta proviene del sistema hidrográfico amazónico, la cual a más de ser la más grande del mundo, constituye la mayor reserva planetaria de agua dulce (Acosta et al. 2003).

Lamentablemente, hoy en día, la amazonía ecuatoriana se ve afectada por diversos factores como son, extracción de oro, hidroeléctricas, industria maderera, etc., y sobre todo, por la industria petrolera, que a causa de la extracción, refinación y manejo del petróleo, da como resultado pérdida de biodiversidad, contaminación y daño a los ecosistemas y al medio ambiente (Acosta et al. 2003).

Entre los siglos XIX y XX, el petróleo y sus aplicaciones resultaron ser los elementos más importantes para la economía y la vida del hombre en una civilización cambiante (Garcés, 2009). Desde las primeras décadas del siglo XX, la industria petrolera ingresó a explorar la Amazonia ecuatoriana con modestos resultados; solamente al finalizar la década de los 60 se confirmó la existencia de reservas importantes de crudo en la zona nororiental. En 1972, el sector 1

petrolero asume gran importancia en la estructura económica del país, cambiando el ideal financiero, mercantil y por ende la historia de la región amazónica y del Ecuador (Melo, 2006).

El petróleo es una mezcla natural y compleja de carbono (83 al 87 %), hidrógeno (11 al 14%) y distintos tipos de hidrocarburos sobre todo los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs) (Porter, 2005). Se constituye como una de

las materias primas más importantes para la

generación de energía en la Tierra, pero ha demandado la intromisión del hombre en vastas zonas de los ecosistemas mundiales. Generando un grave daño en dichas áreas, sobre todo causando un gran impacto e inevitable deterioro gradual del

ambiente donde se realiza el proceso de

extracción y manejo de este llamado oro negro (Gordillo, 2004).

La industria petrolera juega un papel determinante en el desarrollo de muchos países, extrayendo y refinando anualmente cientos de miles de toneladas de crudo proveniente de yacimientos subterráneos como es el caso de Ecuador (Narváez, 2005) Pero, por otro lado, la actividad petrolera presenta, sobre todo en países en vías de desarrollo, algunos problemas sociales y ambientales; como por ejemplo, violación de los derechos colectivos de los grupos y tribus indígenas, pérdida de la biodiversidad, incluyendo áreas protegidas como Yasuní, Sumaco Galeras, Llanganates, Cuyabeno y Limoncocha, etc (Kimerling, 2013). Es por esto que el proceso de integración de la Amazonia Ecuatoriana a la economía nacional es cada vez más dañina, sobre todo cuando las estrategias de crecimiento de la región giran en torno de las tendencias de la economía mundial como es la globalización y transnacionales (Acosta et al. 2007).

El Ecuador al ser un país petrolero, exporta barriles de crudo a diferentes partes del mundo y las divisas obtenidas por la venta y derivados del petróleo, es la segunda fuente principal de ingresos para nuestro país (Melo, 2006). Sin embargo, esto también presenta un costo significativo para la biodiversidad del Ecuador ya que durante la operación de las actividades petroleras es común accidentes como el derrame de crudo o gasolina por perdidas en los tanques de almacenamiento, 2

fugas en tuberías o tomas clandestinas, causando en grandes extensiones de terreno problemas ambientales y pérdidas en los valores de la biodiversidad (Gordillo, 2004).

Un suelo contaminado es aquel que contiene componentes químicos de carácter peligroso y de origen humano, que puede alterar las características del suelo, tanto físico-químicas como biológicas, en una concentración tal que compone un riesgo inaceptable para la salud humana o el medio ambiente.

En general, los suelos contaminados representan un grave problema ambiental, agravado por la insuficiente percepción social de sus posibles consecuencias. Es por esto que el valor de la biodiversidad incluye no solamente el servicio ecológico del bosque o el valor materia y cultural que tiene para las sociedades locales, sino además el valor de los recursos genéticos principios activos presentes en las plantas y microorganismos del bosque húmedo tropical (Kimerling, 2013). Por ejemplo, en el ecosistema terrestre, el suelo posee una inmensa diversidad bacteriana poco explorada debido principalmente al carácter no cultivable de una gran cantidad de microorganismos (Coyne, 2010). La interacción entre la parte biótica y la abiótica hace del suelo un sistema vivo (Prescott et al., 2009).

Las bacterias son uno de los grupos claves para la dinámica ecológica del suelo, debido que están presentes en diversos procesos. Por ejemplo, la transformación de la materia mineral y orgánica que contribuye a la fertilidad del suelo y la salud de las raíces vegetales. Además, las bacterias son esenciales para mantener los ciclos biológicos de los principales elementos que sostienen la vida en el suelo (Rodríguez, 2005). Pero al alterar esta armonía por medio de contaminantes como el petróleo, se requiere devolver el equilibrio al ecosistema del suelo. En este sentido, la biorremediación es una herramienta importante para la eliminación de sustancias contaminantes.

Uno de los componentes mayoritarios del petróleo son los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), que son un amplio grupo de compuestos químicos, derivados del benceno. Los HAPs fueron los primeros agentes químicos en ser reconocidos como carcinógenos ambientales y 3

causantes de tumores malignos en humanos (Haritash & Kaushik, 2009). La exposición humana a los HAPs por inhalación, ingestión o vía cutánea produce su absorción por el organismo y distribución a todos los tejidos, especialmente en órganos o tejidos con alto contenido graso; causando irritación en piel y mucosa, alteración en el sistema inmunitario, induce mutaciones en el ADN (genotóxico) y producen cáncer (Internacional Agency forResearch on Cancer, 19902012).

Los HAPs están presentes en la problemática de las industrias hidrocarburíferas, generando focos de contaminación debido a una inadecuada manipulación, extracción o transporte del petróleo, afectando al medio circundante a las zonas donde se encuentran las refinerías o las tuberías de transporte (Marín et al., 2005). Por esto, se crea la necesidad de constituir un campo de acción que permita la regeneración de las zonas afectadas, con afán de devolver el equilibrio al ecosistema. La biorremediación, se presenta como una solución solvente ya que permite la degradación de HAPs por acción de microorganismos, sin generar cambios en el ecosistema afectado y permitiendo su recuperación en la medida de lo posible (Moreno et al., 2004).

Se entiende como biorremediación microbiana al proceso que utiliza microorganismos que degrada o transforma los contaminantes hasta formas menos tóxicas o inocuas gracias a la capacidad degradadora que presentan ciertos microorganismos que usan los contaminantes como fuente de carbono y energía (Moreno et al., 2004). Los microorganismos realizan dicha degradación mediante enzimas que metabolizan los compuestos contaminantes o por rutas metabólicas que degradan el compuesto hasta su forma más básica para su eliminación (Ahumana & Gómez, 2009). Muchos microorganismos pueden producir surfactantes, que pueden emulsionar los aceites en el agua y facilitar su eliminación.

La biorremediación es un proceso natural que no supone un impacto adicional sobre los ecosistemas. Es de bajo costo y se puede llevar a cabo tanto in situ como ex situ. El resultado final de un tratamiento de biorremediación depende en gran medida de la toxicidad, la 4

concentración inicial y biodegradabilidad de los contaminantes y las propiedades del suelo contaminado (Moreno et al. 2004).

Uno de los pasos fundamentales en el proceso de biorremediación es el estudio de la capacidad de degradación y la caracterización de las bacterias autóctonas presentes en la zona afectada, con el fin de optimizar el proceso de biodegradación. Es por esto que el objetivo del presente estudio fue determinar el crecimiento y la estructura poblacional de los consorcios bacterianos procedentes de un suelo prístino del Bosque Húmedo Tropical de Limoncocha y un suelo contaminado de la refinería Shushufindi de Petroecuador en presencia de Fenantreno.

1.1

PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN

1.1.1

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA:

Desde finales de los años 60, el petróleo se convierte en el brazo principal de la economía de Ecuador debido a la cantidad de ingresos que empieza a generar para el país. Hoy en día, es la segunda fuente de ingreso principal por la exportación de barriles de crudo y derivados a diferentes partes del mundo (Narváez, 2005).

El problema de la industria hidrocarburífera en el Ecuador, es la manipulación inadecuada en los diferentes procesos como: extracción, manejo y disposición del petróleo, liberando productos tóxicos al medio ambiente causando desastres ambientales y efectos nocivos para la salud los seres vivos.

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Por esto, es necesario implementar y constituir un campo de acción con alternativas amigables al medio ambiente, para la regeneración de las zonas afectadas devolviendo el equilibrio a los diferentes ecosistemas.

1.1.1.1 Diagnóstico del problema

El petróleo es la materia prima necesaria para el desarrollo económico tanto del Ecuador como del mundo. Es la fuente de generación de energía y materia prima para la elaboración de varios productos. Lamentablemente, la necesidad de una sociedad cada vez más consumista, exige una constante demanda de extracción y refinación de crudo para que la economía global, el mercado e industrias crezcan constantemente.

A causa del consumismo y la economía se han devastado gran cantidad de diversos ecosistemas, provocando daños y costos ambientales debido a la explotación irracional petrolera. Este perjuicio afecta principalmente al suelo y al agua, por las diferentes causas de derrames de petróleo, cambiando sus componentes y modificando su estructura natural.

1.1.1.2 Pronóstico

En caso de no encontrar comunidades bacterianas autóctonas que biodegraden HAPs en los suelos contaminados, no sería factible la biorremediación, lo que implicaría utilizar métodos tradicionales químicos y físicos, los cuales no son ecológicamente amigables.

6

1.1.1.3 Control del pronóstico

La concentración, composición de la comunidad microbiana y la tasa de transformación de contaminantes está influenciada por factores ambientales, de sustrato y microbiológicos (Moreno et al. 2004).

En los factores ambientales se incluyen humedad, aireación, temperatura, pH y disponibilidad de nutrientes. Dentro de las propiedades del sustrato que pueden afectar la biorremediación se incluyen toxicidad, concentración, solubilidad, volatilidad, y estructura química de los contaminantes (Bartha, 2012).

Los microorganismos resultan ser efectivos siempre y cuando se cumpla con los factores limitantes de su crecimiento y desarrollo. En caso que estos factores no sean idóneos, se recurriría a acondicionar el medio donde se encuentran, como por ejemplo con la adición de elementos esenciales que permitan el desarrollo deseado para el proceso de biorremediación y biodegradación.

1.1.2

FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

¿Cuál es la diferencia entre la comunidad bacteriana y crecimiento bacteriano, procedente de un suelo prístino y un suelo contaminado, si como fuente de carbono y energía se agrega fenantreno para su desarrollo?

7

1.1.3

SISTEMATIZACIÓN DEL PROBLEMA

 ¿Qué conlleva a determinar la capacidad de degradación de HAPs de un consorcio bacteriano procedente de un suelo prístino y uno contaminado?  ¿A través de que método se identificará el crecimiento y estructura poblacional de las bacterias presentes con HAP?

1.1.4 OBJETIVO GENERAL

 Determinar el crecimiento y la estructura poblacional de los consorcios bacterianos procedentes de un suelo prístino del Bosque Húmedo Tropical de Limoncocha y un suelo contaminado de la refinería Shushufindi de Petroecuador en presencia de Fenantreno (FEN).

1.1.5 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Determinar el crecimiento de los consorcios bacterianos procedentes de un suelo contaminado y de un suelo prístino que se encuentran en un medio que contiene Fenantreno.  Establecer si existen diferencias significativas entre suelo contaminado y prístino en cuanto a pH y temperatura.  Establecer la estructura de las comunidades bacterianas por medio de DGGE (Electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente).  Comparar la composición de las comunidades bacterianas entre el suelo prístino y los suelos contaminados antes y después de la adición de fenantreno en el medio de cultivo.

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1.1.6 JUSTIFICACIONES

La extracción y refinación del crudo de petróleo ha causado contaminación al medio ambiente, tanto para el agua, aire, flora y fauna nativa, pero sobre todo al suelo donde se encuentran las industrias petroleras, afectando la salud de las poblaciones locales (Leahy & Colwell, 2010). Este impacto ambiental ha llevado a la necesidad de realizar diferentes investigaciones destinadas a dar una solución a esta problemática, como para el desarrollo y mejoramiento de técnicas aplicables a la biorremediación de estos ambientes.

La actividad y desarrollo de los microorganismos en zonas contaminadas, juegan un rol importante en la limpieza de estos ambientes (Bartha, 2012). Es así como surge la necesidad de identificar microorganismos para explotar su potencial biotecnológico y explorar su uso en ambientes contaminados. Por la cual se realiza la presente investigación con la finalidad de conocer la capacidad de degradación de HAPs, crecimiento y estructura poblacional de un consorcio bacteriano procedente de un suelo prístino del Bosque Húmedo Tropical de Limoncocha y uno contaminado de la refinería Shushufindi de Petroecuador.

Además, esta investigación aportar a la sociedad nuevas técnicas de tratamiento a suelos contaminados por la industria petrolera y a su vez se genera una nueva alternativa en beneficio y sostenibilidad del medio ambiente a través de la utilización de métodos naturales, que generan un menor impacto en su realización en comparación con los métodos de remediación químicos.

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1.2

MARCO TEÓRICO

1.2.1

ESTADO ACTUAL DEL CONOCIMIENTO SOBRE EL TEMA



Narváez et al. (2008) realizaron un estudio a partir de sedimentos del Caribe colombiano. Se realizaron 31 aislamientos bacterianos en medio mínimo de sales suplementado con hidrocarburos (ACPM o petróleo crudo) como única fuente de carbono. Las cepas aisladas se sometieron a pruebas de selección en diferentes concentraciones de hidrocarburos y se escogieron once de ellas tolerantes al crudo y ACPM en un ámbito del 1-8% v/v. Las mediciones de la biomasa en Unidades Formadoras de Colonias (UFC)/mL fueron empleadas para elaborar la curva de crecimiento del cultivo mixto y la remoción de hidrocarburos se cuantificó por cromatografía de gases acoplada a masas. El cultivo mixto fue capaz de degradar el 68.6 % de los hidrocarburos alifáticos con preferencia de los n-alcanos de cadena larga (C12- C31), alcanzando un crecimiento máximo de 3.13 x 109 UFC / mL. Nueve de las once cepas se identificaron mediante los sistemas bioquímicos BBL crystal y API 50 CHB/E como bacterias correspondientes a los géneros Klebsiella, Chromobacterium, Flavimonas, Enterobacter, Pseudomonas y Bacillus, estas cepas tienen potencial enzimático para degradar hidrocarburos.



Araujo et al. (2004) aislaron cepas bacterianas autóctonas de suelos contaminados con hidrocarburos cerca del lago Maracaibo, y éstas se sometieron a una prueba de eficiencia para la remoción de gasoil (fuente de carbono). Se realizaron contajes bacterianos de heterótrofos mesófilos, y se seleccionaron los que presentaron los mayores porcentajes de remoción de hidrocarburos totales. Se analizaron los hidrocarburos totales (HT), saturados, aromáticos, resinas y asfaltenos (SARA), y metales totales (Cd, Cr, Ni, Zn). La correlación entre los heterótrofos mesófilos con los hidrocarburos totales, nitrógeno y fósforo, resultó negativa y altamente significativa (p .8,6

Muy alcalino

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