UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR DECANATO DE ESTUDIOS PROFESIONALES COORDINACIÓN DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA

OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA FURB DE ANABAENA SP.

Por: Lorena Zuliani Álvarez Realizado con la asesoría de: Tutor Académico: Maria I. Gonzatti. Tutor Industrial: Mary Fillat.

INFORME DE PASANTÍA Presentado ante la Ilustre Universidad Simón Bolívar como requisito parcial para optar al título de Licenciada en Biología

Sartenejas, Marzo de 2010

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RESUMEN

El hierro es fundamental en el metabolismo celular, ya que está involucrado en una multitud de procesos biológicos esenciales. La homeostasis de Fe en procariotas es regulada mediante la proteína Fur (ferric uptake regulator), la cual actúa como represor transcripcional de genes regulados por hierro mediante la unión al ADN dependiente de Fe 2+. En Anabaena sp. se han descrito tres homólogos de Fur: FurA, FurB, y Fur C. De ellos, FurB ha sido poco estudiado debido a que no se ha aplicado un método de purificación que tenga un buen rendimiento. Es por esto, que el objetivo de este trabajo es optimizar el proceso de purificación de FurB, para poder realizar posteriores estudios estructurales y bioquímicos. Para ello, se ha clonado el gen en el vector pET-28a(+) que se introdujo dentro de las células de E.coli BL21 (DH3). Éstas se indujeron con IPTG para sobre-expresar la proteína dentro de la célula. Seguidamente, se realizó un escalado a 10L de cultivo para producir mayor cantidad de masa celular. Posteriormente se llevó a cabo la purificación mediante la cromatografía de afinidad IMAC –Zinc. Y por último, se efectuó un ensayo de retardo en gel (EMSA) para confirmar que la proteína estaba activa. En la electroforesis SDS/PAGE se observó la banda de 17 kDa que corresponde a la proteína FurB purificada, cuya concentración fue de 0,312 mg/mL, resultado tres veces mayor al obtenido en los anteriores protocolos de purificación, lo que demuestra que este sistema tiene un rendimiento mayor. Además, el proceso de clonaje e inserción de la cola de histidina a la proteína, es lo que hace efectivo este nuevo método, que se presenta como un protocolo sencillo y rápido, donde el producto obtenido es funcional y tiene un alto grado de pureza. Palabras clave: cromatografía de afinidad, proteína Fur, Anabaena sp.

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AGRADECIMIENTOS

Quisiera agradecer de forma muy especial a mis padres y a mi hermano, por haberme ensañado que a través del esfuerzo y la perseverancia se alcanzan los objetivos, pero sobretodo por haber llenado el hogar de cariño y apoyo incondicional durante la realización de este trabajo y a lo largo de mi carrera. A Manuel, por ser mi compañero de camino, por compartir conmigo los buenos y malos momentos, y por motivarme a dar lo mejor de mí en todo lo que me propongo. A mis tutoras, Marisa Gonzatti y Mary Fillat, por impartirme sus conocimientos y guiarme en esta tarea de la que hoy cosecho sus frutos. A mis compañeros de trabajo del laboratorio de biología estructural de la Universidad de Zaragoza, gracias por su ayuda y su amistad, ya que hay un pedacito de cada uno de ustedes que forma parte de este trabajo. A mis amigos, que siempre han sido una presencia constante durante mi carrera, y que han contribuido en el profesional que me convierto hoy. A todos lo que de alguna forma hicieron esto posible, ¡Muchas Gracias!

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ÍNDICE GENERAL

Página RESUMEN………………………………………………………………………….

iv

AGRADECIMIENTOS…………………………………………………………….

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LISTA DE SÍMBOLOS…………………………………………………………….

x

LISTA DE ABREVIATURAS……………………………………………………..

xi

INTRODUCCIÓN Antecedentes ………………………………………………………………………..

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Importancia del trabajo y Planteamiento del Problema………………………………

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Objetivos……………………………………………………………………………..

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CAPÍTULO 1. Descripción de la Empresa………………………………………….

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CAPÍTULO 2. Marco Teórico 2.1.- El hierro en bacterias…………………………………………………………..

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2.2.- Regulación de la homeostasis del hierro. Ferric uptake regulator (Fur)………

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2.3.- Estructura de Fur……………………………………………………………….

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2.4.- Genes regulados por Fur……………………………………………………….

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2.5.- Fur en Anabaena sp…………………………………………………………….

31

CAPÍTULO 3. Diseño Experimental. Materiales y Métodos 3.1.- Cepas utilizadas y Medios de cultivo………………………………………….

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7

3.2.- Clonaje…………………………………………………………………………

34

3.3.- Transformación de E.coli BL21 (DE3) con el plásmido pET-28a(+)………….

36 Página

3.4.- Screening de expresión de FurB y producción de masa celular………………

37

3.5.- Purificación de FurB mediante cromatografía de afinidad IMAC –Zinc……..

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3.6.- Ensayo de unión al ADN (EMSA: Electrophoresis Mobility Shift Assay)……

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CAPÍTULO 4. Resultados y Discusión. 4.1.- Clonaje y Screening de expresión……………………………………………..

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4.2.- Purificación y Concentración………………………………………………….

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4.3.- Ensayo de unión al ADN (EMSA)…………………………………………....

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CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES…………………………………...

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BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………...

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ÍNDICE DE TABLAS

Página Tabla 1.- Posibles roles de los homólogos de Fur en Cianobacterias…………………

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Tabla 2.- Propiedades bioquímicas de las proteínas Fur de Anabaena sp. PCC 7120………………………………………………………………

31

Tabla 3.- Composición de un gel de SDS/PAGE al 17%...............................................

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Tabla 4.- Composición del gel al 6% del EMSA……………………………………...

42

Tabla 5.- Mezclas utilizadas para realizar el EMSA…………………………………..

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ÍNDICE DE FIGURAS

Página Figura 1.- Reacción de Fenton………………………………………………………

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Figura 2.1.1- Estructura del sideróforo “schizokinen” de Anabaena sp…………….

23

Figura 2.1.2.- Estructuras de las proteínas de almacenamiento de Hierro………….

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Figura 2.2.1.- Secuencia consenso de Fur de 19 pb reinterpretada como motivos “6-1-6”……………………………………………………………………..

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Figura 2.3.1.- Representación de la estructura tridimensional del dímero de Fur de Pseudomonas aeruginosa………………………………………………………..

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Figura 2.3.2.- Modelo de la unión de un dímero de la proteína Fur de Pseudomonas aeruginosa al ADN……………………………………………….

29

Figura 3.2.1.- Estructura del plásmido pET-28a y la secuencia de la región polylinker……………………………………………………………………..

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Figura 4.1.1.- Colonias resultantes del proceso de transformación de E.coli BL21 (DE3) con el plásmido pET-28a(+)…………………………………….

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Figura 4.1.2.- Screening de expresión de FurB……………………………………...

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Figura 4.1.3.- Screening de expresión de las cuatro inducciones realizadas en el proceso de producción de masa celular………………………………………......

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Figura 4.2.1- Electroforesis SDS/PAGE 17% de las fracciones de 5 en 5 obtenidas mediante la cromatografía IMAC……………………................................................

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Figura 4.2.2.- Electroforesis SDS/PAGE 17% de las fracciones de 1 en 1 obtenidas mediante la cromatografía IMAC…………………………………………

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Figura 4.2.3.- Electroforesis SDS/PAGE 17% de los productos concentrados de primeras cuatro purificaciones mediante la cromatografía IMAC………………..

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Figura 4.3.1.- Ensayo de retardo en gel (EMSA) de FurB contra pfurA y pfurB…….. LISTA DE SÍMBOLOS Y UNIDADES

°C: grados centígrados

ε

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: Coeficiente de extinción molar.

μg: Microgramos μL: Microlitros µm: Micromilímetro. μM: Micromolar A: Ampere Da: Dalton D.O: Densidad óptica g.: Gramos h: horas kDa: kilo Dalton L: Litros M: molar min: minutos mL: mililitros mM: milimolar nm: nanómetros rpm: revoluciones por minuto. s: segundos V: Voltios

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LISTA DE ABREVIATURAS

A: Adenina ADN: Acido desoxirribonucleico ARN: Acido ribonucleico. BFr: Bacterioferritina BSA: Bovine serum albumin. Albumina de suero bovino. C: Citosina Cys: Cisteína. DNasa: Desoxirribonucleasa dNTP: Deoxiribonucleotidos trifosfato Dps: DNA binding proteins for starved cells. Proteínas de unión al ADN. DTT: ditiotreitol DtxR: dipheria toxin repressor. Represor de la toxina de diferia. EMSA: Electrophoretic mobility shift assay. Ensayo electroforético de movilidad en gel. Fe: Hierro Fur: ferric uptake regulator. Regulador de la incorporación del hierro. FurB-His: proteína Fur recombinante con la cola de histidina. G.: Guanina His: Histidina. IMAC: Immobilized metal ion affinity chromatography. Cromatografía de afinidad a un metal inmovilizado. IPTG: Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Irr: Iron response regulator. Regulador de la respuesta al hierro. LB: Medio Luria-Bertani

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LBK: Medio Luria-Bertani más Kanamicina. MntR: Manganese transporter regulator. Regulador del transporte de Manganeso. Mur: Manganese uptake regulator. Regulador de la incorporación de Manganeso. Nur: Nickel uptake regulator. Regulador de la incorporación de Níquel. PCR: Polymerase chain reaction. Reacción en cadena de la polimerasa. PerR: peroxidase regulator pI: Punto Isoeléctrico. PMSF: fenilmetilsulfonil fluoruro Pro: Prolina PSA: Persulfato de Amonio ROS: Reactive oxygen species. Especies reactivas de oxígeno. RT-PCR: Reverse transcription PCR. PCR en Transcripción Reversa. SDS/PAGE: sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico T: Timina TEMED: Tetrametiletilenodiamina Zn: Zinc Zur: Zinc uptake regulator. Regulador de la incorporación de Zinc.

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INTRODUCCIÓN

Antecedentes

Un descubrimiento clave en el entendimiento de la regulación del transporte de hierro en bacterias fue cuando Hantke en 1981 observó, en un mutante de E. coli, que la expresión de todos las funciones inhibidas por hierro (producción de sideróforos y biosíntesis de distintas proteínas de la membrana externa) se realizaba constitutivamente. Este mutante se comportaba de forma similar al de Salmonella typhymurium aislado unos años antes (Ernst et al., 1978), y el cual se había denominado fur (ferric uptake regulator, por sus siglas en inglés). Su comportamiento claramente sugería que muchos, sino todos, los genes dependientes de hierro estaban regulados por un represor dependiente del metal.

Estudios posteriores de fur en E.coli permitieron mapear el gen (Bagg y Neilands, 1985), clonarlo (Hantke, 1984) y secuenciarlo (Schaffer et al., 1985), así como la proteína pudo ser purificada por primera vez por Wee et al. en 1988.

A partir de entonces, se han descrito homólogos de Fur en muchas bacterias Gram-negativas, incluidos patógenos humanos como Yersinia (Staggs y Perry, 1991), Pseudomonas (Prince et al., 1993), Helicobacter pylori (Bereswill et al., 1998) e incluso en patógenos de plantas como Erwinia chrysanthemi (Franza et al., 1999). Asimismo, se han identificado proteínas Fur en bacterias Gram – positivas, como Bacillus subtilis (Bsat et al., 1998) y Staphylococcus (Heidrich et al., 1996). La mayoría de estos homólogos son capaces de complementar el mutante fur en E.coli, sugiriendo que los mecanismos moleculares que controlan la regulación de la transcripción por hierro, son compartidos por muchos microorganismos (Escolar et al., 1999).

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Hoy en día se conoce la estructura tridimensional de la proteína Fur presente en diversos microorganismos la cual puede encontrarse en las bases de datos, como es el caso de E. coli (Gonzales de Peredo et al., 1999), P. aeruginosa (Pohl et al., 2003), V. cholerae (Sheikh y Taylor, 2009), entre otras. Todas ellas son dímeros que contienen un dominio de unión al ADN en extremo amino-terminal y un dominio de dimerización en el extremo carboxi-terminal, donde además se sitúa el sitio de unión del metal regulador.

En el caso de las cianobacterias, la proteína Fur fue descrita por primera vez en Synechococcus PCC 7942 usando un ensayo de represión en vivo en E.coli. Con la finalidad de inactivar el gen fur, se produjeron mutantes merodiploides que, en condiciones de abastecimiento de Fe, presentaron un fenotipo deficiente en hierro, evidenciando el rol de esta proteína en la regulación de la incorporación de hierro en cianobacterias (Ghassemian y Straus, 1996).

Fur también ha sido estudiada en otras cianobacterias como Anabaena sp., Synechocystis y Microcystis aeruginosa (tabla 1). En el caso de Anabaena, el homólogo de Fur fue descrito por primera vez por Bes et al. en el 2001, en el Laboratorio de Biología Estructural de la Universidad de Zaragoza. Estudios posteriores demostraron la existencia de tres ortólogos fur en el genoma de Anabaena sp. PCC 7120, codificados por los genes all1691, alr2473 y all0957, denominados furA, furB y furC, respectivamente y cuyos marcos de lectura abiertos contienen el motivo rico en histidina característico de la familia Fur. Por otra parte, se han realizado estudios del estado de oligomerización (Hernández et. al, 2002) y análisis de interacción Fur-ADN, para observar las interacciones de la proteína con sus promotores (Hernández et al., 2004).

De estas tres proteínas, FurA ha sido la más estudiada y también se ha demostrado su relación con el metabolismo del nitrógeno en cianobacterias (López-Gomollón et al., 2007). De FurB solo se conoce que su función está relacionada con la defensa ante el estrés oxidativo, ya que se ha visto que se une inespecíficamente al ADN protegiéndolo del daño que puede ocasionar los radicales hidroxilos o la DNasa I (López-Gomollón et al., 2009). FurC, en cambio, no se conoce con exactitud su función, pero se ha especulado que puede modular la actividad de FurA y FurB,

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así como puede estar involucrada con funciones relacionadas a los mecanismos fotosintéticos, procesos que están ausentes en microorganismos heterótrofos (López – Gomollón et al., 2009).

Tabla 1.- Posibles roles de los homólogos de Fur en Cianobacterias. Tomado de: Fillat M., en prensa Cepa de cianobacteria Synechoccocus 7942

Homólogos de Fur S7942 0987



Anabaena PCC 7120

All 1691 (FurA)

  

Anabaena PCC 7120

Alr 2473 (FurB)



Anabaena PCC 7120

All 0957 (FurC)



Synechocystis 6803

Slr 1738 (PerR)



Synechocystis 6803 Slr 1937 (Zur) Microcystis aeruginosa MAE 37080 NIES - 843

 

Rol regulatorio propuesto Homeóstasis del hierro Homeóstasis del hierro Defensa ante el estrés oxidativo Metabolismo del nitrógeno. Defensa ante el estrés oxidativo Modula la actividad de FurA y FurB mediante la formación de heterodímeros Defensa ante el estrés oxidativo Transporte de Zinc Modulación de la síntesis de microcistina

Referencia Ghasemian y Straus, 1996 Hernández et al., 2009 Lopéz- Gomollón et al., 2007 López – Gomollón et al., 2009 López – Gomollón et al., 2009 Hernández et al., 2004

Singh et al., 2003 Pakrasi et al., 2001 Martín- Luna et al., 2006

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Importancia del trabajo y Planteamiento del Problema

El hierro es fundamental en el metabolismo celular, ya que funciona como co-factor para un gran número de enzimas, además de estar involucrado en una multitud de procesos biológicos esenciales (Wackett et al., 1989). Además, en cianobacterias una gran parte del “pool” de hierro es utilizado para construir proteínas que participan en el transporte de electrones en la fotosíntesis y en la cadena respiratoria, así como en rutas de asimilación y fijación de nitrógeno (Straus, 1994); llegando a ser los requerimientos de este nutriente alrededor de 10 veces más altos que en un microorganismo heterótrofo (Keren et al., 2004).

Por consiguiente, este metal es un factor limitante en el crecimiento celular, al mismo tiempo que es uno de los principales determinantes de la productividad primaria en los océanos (Coale et al., 1996). La falta de hierro también es una señal importante ambiental para desencadenar la expresión de factores de virulencia (Litwin y Calderwood, 1993). De igual forma, su deficiencia puede acarrear la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés). En Anabaena sp. PCC 7120 se comprobó que la producción de ROS era similar en deficiencia de hierro como en condiciones de estrés oxidativo. Este hecho no se produce en bacterias heterotróficas, por lo que se propuso que era un proceso característico de organismos fotosintéticos (Latifi et al., 2005).

Pero no sólo una escasez de hierro puede causar daños negativos, un exceso de Fe resulta potencialmente tóxico. Este metal es capaz de catalizar la formación de radicales hidroxilos OH mediante la reacción de Fenton (figura 1). El radical hidroxilo es extremadamente reactivo y puede perjudicar a la gran mayoría de biomoléculas (Imlay, 2003)

H2O2 + Fe2+

OH- + FeO2+ + H+ Figura 1.- Reacción de Fenton

Fe3+ + OH- + OH

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El hierro que cataliza la reacción de Fenton se conoce como “hierro libre”, ya que no está formando parte de proteínas de reserva o de enzimas. Este hierro procede de enzimas que espontáneamente pierden su metal, como ocurre con la aconitasa de E. coli. Los iones superóxidos y los radicales hidroxilos, contribuyen al estrés oxidativo aumentando los niveles de hierro libre en la célula, ya que una de sus dianas preferidas son los grupos sulfoférricos, y como consecuencia de su acción, rompen el centro y liberan el átomo de hierro (Imlay, 2003).

La incorporación de Fe tiene que ser cuidadosamente regulada para mantener la concentración intracelular del metal dentro de los límites deseables. Este proceso de control es llevado a cabo por reguladores transcripcionales, cuyo principal representante es la familia de proteínas Fur.

Como el hierro influencia tantos procesos en la célula, es tentador considerar a Fur como un regulador global que ajusta todo el metabolismo a causa de las fluctuaciones en la disponibilidad de hierro en el entorno, en lugar de ser sólo un factor de transcripción muy específico para unos pocos promotores de sideróforos (Escolar et al., 1999).

Al hacer una inspección de los genes regulados por Fur se ha descubierto que esta proteína además participa en otras funciones que no están relacionadas directamente con el metabolismo del hierro. Esto incluye diferentes procesos celulares como defensa ante el estrés oxidativo (Tardat y Touati, 1993), quimiostasis (Karjalanien et al., 1991), rutas metabólicas (Hantke, 1987; Stojiljkovic et al., 1994), bioluminiscencia (Makemson y Hastings, 1982), producción de toxinas y otros factores de virulencia (Litwin y Calderwood, 1993), entre otros.

Por esta razón, esta familia de proteínas ha despertado interés en los investigadores, que buscan descubrir las funciones y los mecanismos en los que está involucrada en la célula. En el caso de Anabaena, se han descrito tres homólogos de Fur: FurA, FurB y Fur C, de los cuales se han estudiado mayormente características funcionales de FurA, pero en relación a FurB sólo se ha descubierto que puede intervenir en la protección contra el estrés oxidativo (López-Gomollón, 2009). Se puede decir que una de las razones por las cuales FurB ha sido menos estudiada es

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porque no se ha aplicado un método de purificación que tenga un buen rendimiento. Cabe destacar que estas proteínas tienden a agregarse fácilmente, es decir, a formar dímeros o heterodímeros debido a la presencia de puentes disulfuros intermoleculares e interacciones hidrofóbicas (Hernández et al., 2002), dificultando la solubilidad de los productos obtenidos mediante la purificación

Según anteriores publicaciones, la proteína FurB puede ser purificada mediante dos pasos: cromatografía heparin-Sepharose 6 Fast Flow, seguido por la columna MonoS FPLC (GE Healthcare). Pero en este caso, no se conseguía una cantidad suficiente y homogénea de proteína que permitiera hacer otro tipo de estudios, como cristalizarla para conocer su estructura tridimensional, y así tener una idea de la función estructural de la familia Fur en cianobacterias.

Conociendo las características de FurB, es posible diseñar un método más práctico y más eficiente, para obtener como resultado una buena cantidad de proteína, que sea soluble y pura, que nos permita realizar ensayos para descifrar su función como parte de la familia Fur y poder caracterizarla bioquímicamente.

Por eso es importante realizar un nuevo proceso de purificación y en el laboratorio de Biología Estructural de la Universidad de Zaragoza, se ha propuesto utilizar la Cromatografía de Afinidad IMAC (Immobilized metal ion affinity chromatography) para solventar este problema.

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Objetivo General

Optimizar el proceso de purificación de FurB de Anabaena sp., para obtener proteína a gran escala y, posteriormente, poder realizar estudios estructurales y bioquímicos.

Objetivos Específicos



Realizar un Screening para verificar la sobre-expresión de FurB en la cepa E.coli BL21 (DE3)



Sistematizar el protocolo de purificación de FurB, utilizando el método IMAC –Zinc (Immobilized Metal ion Affinity Chromatography).



Estudiar la actividad de la proteína mediante ensayos de unión al ADN (EMSA: Electrophoretic mobility shift assay).

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CAPÍTULO 1 DESCRIPCIÓN DE LA EMPRESA

En la Facultad de Ciencias de la Universidad de Zaragoza en España, se encuentra el Departamento de Bioquímica y Biología Celular, que nace en 1976 gracias al profesor Grande Covián, un fisiólogo venido de la Universidad de Minnesota. Allí se ubican los laboratorios de investigación de diferentes grupos y se lleva a cabo la mayor parte de la tarea docente: se imparten las licenciaturas de Bioquímica, Química, Máster en Biología Molecular y Celular, así como un Doctorado en Mención de Calidad. El equipo del departamento lo integran una veintena de profesores permanentes, al igual que una decena de contratados, que imparten las asignaturas en varias carreras ofertadas por la universidad, y realizan trabajos de investigación de reconocimiento nacional e internacional.

Dentro de los grupos de investigación que allí se encuentran están: grupo de biogénesis y patología mitocondrial, grupo de apoptosis, inmunidad y cáncer, grupo de biología de la reproducción, grupo de investigación en neurociencias, grupo de genética de los trastornos del metabolismo lipídico y el grupo de biología estructural. En este último, las profesoras e investigadoras María Fillat, y María L. Peleato tienen como principal objetivo el estudio de la regulación y el mecanismo de acción de la proteína Fur en Cianobacterias.

A partir del descubrimiento de la secuencia del gen fur en Anabaena sp. en el año 2001, este grupo de investigación se ha volcado en la caracterización de estas proteínas, así como en conocer las funciones que desempeña cada miembro de la familia Fur. Para ello están realizando estudios estructurales, funcionales y fisiológicos tales como: estudios del patrón de oligomerización, análisis de interacción con el ADN, estudios de la regulación de la expresión de

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los genes de la familia Fur mediante fusiones a genes informadores, RT-PCR y análisis de Northern y Western blots, entre otros.

También se han caracterizado algunos de los genes relacionados con la síntesis de cianotoxinas y con los mecanismos de defensa frente al estrés oxidativo. Se ha clonado y sobreexpresado la proteína Fur de Microcystis aeruginosa y se han llevado a cabo diversos estudios en relación a la regulación del operón mcy, implicado en la síntesis de la cianotxina microcistina.

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CAPÍTULO 2 MARCO TEÓRICO

2.1.- El hierro en bacterias

El hierro es un elemento esencial para los microorganismos. Tanto el Fe 2+ como el Fe3+ son iones relativamente pequeños que forman fácilmente complejos hexacoordinados con ligandos que contienen Carbono, Nitrógeno o Azufre. En las proteínas encontramos átomos de hierro formando parte de grupos hemos y centro sulfoférricos, o también jugando un papel estructural y catalizador (Litwin y Calderwood, 1993).

Sin embargo, en condiciones de vida actuales, es decir, en presencia de O 2 y a pH neutro, el Fe2+ es rápidamente oxidado a Fe3+, el cual forma óxidos e hidróxidos insolubles reduciendo drásticamente la cantidad de hierro disponible (Straus, 1994). A pH 7 la concentración de Fe 3+ en disolución es de 103 iones por mililitro, valor que se sitúa muy por debajo de los 10 5 iones de hierro requeridos para la supervivencia de una sola bacteria (Braun et al., 1991).

Es por ello que, como primer paso, los microorganismos han desarrollado diferentes estrategias para la solubilización del hierro y posterior asimilación del mismo, como: acidificación del medio extracelular para aumentar la solubilidad de hierro; reducción del ión férrico a ferroso, mucho más soluble; o la utilización de moléculas quelantes del ión férrico.

De todos los sistemas, la utilización de compuestos quelantes es el más utilizado por procariotas. Los quelantes producidos por microorganismos, denominados sideróforos, son

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moléculas de bajo peso molecular (menor de 100 Da), que mantienen el Fe 3+ soluble durante horas o días debido a su lenta cinética de disociación (Rose y Waite, 2003). Aunque su estructura es muy variada, todos forman complejos hexacoordinados octaédricos con el Fe 3+. Una vez que el sideróforo ha unido un átomo de hierro, es introducido dentro de la célula por sistemas de transporte específicos. Tanto la producción de sideróforos como la de sus receptores está regulada por la disponibilidad de hierro (Guerinot, 1994).

Aunque se ha determinado la producción de sideróforos para muchas cianobacterias, sólo se han caracterizado estructuralmente el sideróforo “schizokinen”, un citrato – hidroxamato producido por Anabaena sp. (Lammers y Sanders-Loehr, 1982) (figura 2.1.1) y “anachelin”, un catecolato aislado de Anabaena cylindrica (Beiderbeck et al., 2000). Existen algunas estirpes de cianobacterias que no producen sideróforos, por lo que su mecanismo de adquisición de hierro se basa en la utilización de los quelantes excretados al medio de otros organismos. Además, las estirpes productoras de sideróforos también suelen ser capaces de transportar a su interior el hierro acomplejado por quelantes producidos por otros microorganismos. De hecho, se ha sugerido que la capacidad que tienen las cianobacterias de asimilar hierro mediante este mecanismo es lo que les permite prevalecer sobre las algas eucariotas durante las proliferaciones celulares (Murphy et al., 1976).

Figura 2.1.1- Estructura del sideróforo “schizokinen” de Anabaena sp. Tomado de: http://www.genaxxon. com/images/catalogue/schizoki_fe_gr.jpg

Como los sideróforos suelen ser moléculas polares, no son capaces de atravesar la membrana, por lo que son excretadas proteínas de transporte propias. Por ejemplo, el sistema de transporte

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para “schizokinen” en Anabaena sp. es específico y en contra gradiente, por lo que está asociado al consumo de ATP (Lammers y Sanders-Loehr, 1982).

Debido a la capacidad del hierro libre de catalizar la producción de radicales libres, tras su transporte al interior celular, debe ser almacenado de forma que siga siendo utilizable pero no tóxico. En bacterias, las proteínas encargadas de esta tarea son las bacterioferritinas (BFr) y Dps (DNA binding proteins for starved cells) (figura 2.1.2). Las bacterioferritinas están compuestas por 24 unidades que forman un anillo en cuyo interior pueden albergar hasta 2000 átomos de hierro, además también pueden unir de forma no covalente grupos hemo (Andrews et al., 2006) Las Dps están formadas por 12 unidades que pueden alojar unos 500 átomos de hierro en su interior. Además, ésta proteína protege al ADN del daño oxidativo mediante una unión no específica.

Figura 2.1.2.- Estructuras de las proteínas de almacenamiento de Hierro. A la izquierda la estructura de bacterioferritina B de Pseudomonas aeruginosa (resolución: 2,10 Å) (Weeratunga et al., 2010), y a la derecha la de Dps de Vibrio cholera (resolución: 1,67 Å) (Nocek et al., en prensa). Tomado de Protein Data Bank (PTB).

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2.2.- Regulación de la homeostasis del hierro. Ferric uptake regulator (Fur)

La homesostasis del hierro es mantenida en casi todos los procariotas mediante dos familias diferentes de proteínas represoras, ambas actuando a nivel transcripcional. Las dos familias principales de reguladores se denominan Fur, presente en la mayor parte de los microorganismos, y DtxR (dipheria toxin repressor), que actúa como regulador en bacterias Gram-positvias con alto contenido en G + C (Andrews et al., 2006).

El DtxR regula la adquisión del hierro, la expresión de la toxina de la diteria (tox) o la expresión de la hemooxigenasa hmuO (Schmitt, 1997). Es muy frecuente la existencia de varios metaloreguladores de cada familia en un mismo microorganismo. Así, por ejemplo Bacillus subtilis o Staphylococcus aureus contienen al menos cuatro reguladores de la homeostasis de metales, tres de los cuales son proteínas homólogas a Fur (Fur, PerR, Zur), y la cuarta es un miembro de la familia DtxR (MntR).

Aunque Fur y DtxR poseen muy poca similitud en su estructura primaria, se ha visto que su funcionamiento es similar, ya que ambas son represores dependientes de hierro que se unen al ADN en forma de dímero (Andrews et al., 2006).

La proteína Fur es un polipéptido de unos 13-20 kDa que actúa como represor transcripcional de genes regulados por hierro mediante una actividad de unión al DNA dependiente de Fe2+ (Bagg y Neilands, 1987) Cuando el hierro no es un elemento limitante, Fur en forma de dímero, utilizando un átomo de Fe 2+ como co-represor, se une a una secuencia palindrómica de DNA denominada “iron box” o caja Fur, impidiendo la transcripción del gen. Por el contrario, en escasez de hierro, Fur libera el átomo co-represor y deja de ejerce su acción represora, de forma que quedan accesibles las zonas promotoras de los genes para que la ARN polimerasa lleve a cabo la transcripción (Escolar et al., 1999). De hecho, se ha demostrado que la unión del catión divalente al sitio regulador produce un cambio conformacional en el dominio Nterminal de la proteína, en el cual reside la capacidad de unión al ADN (Coy y Neilands, 1991).

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Este modelo explicaba la acción represora de Fur, de forma que se expresaban sus genes dianas en deficiencia de hierro. Sin embargo, existen algunos genes cuya transcripción está reprimida en déficit ferroso, como la superóxido dismutasa o la bacterioferritina en E.coli (Dubrac y Touati, 2000). Este hecho se pudo explicar gracias al descubrimiento en E.coli del ARN antisentido RythB. Es un pequeño ARN de 90 nucleótidos cuya transcripción esta reprimida por Fur. De esta forma, la represión de algunos genes observada en deficiencia de hierro se debe a un efecto indirecto de Fur al activar la transcripción del ARN antisentido que impide la traducción de dichos genes (Masse y Gottesman, 2002).

La secuencia consenso de unión de Fur es una secuencia palindrómica rica en A y T. Este resultado se obtuvo mediante ensayos de protección de ADN frente a la digestión de DNasas con Fur de E.coli, identificando una secuencia palindrómica de 19 pb que resultaba protegida (de Lorenzo et al., 1987). Aunque era claro que Fur se unía a esta secuencia, habían resultados que concordaban que Fur se uniera solo a esta secuencia propuesta. Por lo tanto, este modelo de caja Fur fue reinterpretado posteriormente como una serie de, al menos, 3 repeticiones de un motivo de 6 pb, sin importar la orientación (figura 2.2.1). El hexámero NATA/TAT parece ser la unidad de interacción con Fur en el sitio de unión. Esto pudiera proveerle a la proteína la capacidad de comportase como un represor específico así como un regulador más general (Escolar et al., 1999).

Consenso Figura 2.2.1.- Secuencia consenso de Fur de 19 pb reinterpretada como motivos “6-1-6”. Tomado de Escolar et al., 1999.

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Sin embargo, puede que este modelo de caja Fur no sea el que se encuentre en todos los procariotas, ya que existen casos, como el de B. japonicum donde la secuencia reconocida por Fur no muestra similitudes con el consenso establecido (Friedman y O’Brian, 2003)

2.3.- Estructura de Fur

El análisis de las secuencias primarias de Fur revela la existencia de regiones altamente conservadas, como un dominio rico en Histidinas H3-5X2CX2X, característicos de esta familia, o el motivo GXCX2-5C, presente en el extremo C-terminal. Además de estos dominios, algunos residuos están muy conservados, como la tirosina 57 (según secuencia de Fur de E.coli), presente en todos los homólogos, la glicina 67 o la glicina 131 conservada en prácticamente todas las proteínas Fur (Vasil y Oschsner, 1999).

Esta proteína puede encontrarse en diversos estados de oligomerización (dímero, trímeros, tetrámeros, etc.), como se ha observado mediante ensayos in vitro en Anabaena sp. (Hernández et al., 2002). Este fenómeno no es extraño, ya que la oligomerización es una característica bastante común entre proteínas de unión a ADN. Además, la proteína puede oligomerizar unida al ADN como se observó en el acoplamiento de Fur de E.coli sobre el promotor de la aerobactina mediante microscopia electrónica (Frechon y Le Cam, 1994).

Se ha determinado la estructura tridimensional de Fur y como ejemplo se tiene la de Pseudomonas aeruginosa (Pohl et al., 2003) La estructura propuesta es un dímero, donde cada monómero posee dos sitios de unión a metal, uno de unión a Zn 2+, con fines estructurales, en el que el metal se encuentra en un entorno tetraédrico, y otro sitio regulador de unión a Fe 2+, donde el metal está coordinado en un entorno octaédrico (figura 2.3.1)

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Figura 2.3.1.- Representación de la estructura tridimensional del dímero de Fur de Pseudomonas aeruginosa (Resolución 1,8 Å) (A) Vista perpendicular al eje binario cristalográfico (B) Vista sobre el eje binario. El dominio N-terminal se representa en azul, mientras que el dominio C-terminal se representa en verde. Los átomos de Zn2+ presentes en la estructura se representan como esferas rojas. H: hélice. S: hebra. Tomado de Pohl et al., 2003

En la estructura se observan dos dominios diferenciados: uno amino-terminal implicado en la unión al ADN, y otro carboxi-terminal de dimerización, donde además se sitúa el sitio de unión del metal regulador. A pesar de que las secuencias de Fur y DtxR no muestran homología significativa, ambos dominios de unión al ADN comparten el mismo plegamiento (D’Aquino et al., 2005).

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A partir de esta estructura tridimensional se realizó un modelado de la unión de la proteína al ADN. La mejor concordancia entre los datos estructurales y los conseguidos mediante ensayos in vitro de protección frente a la acción de DNasas, se obtenían cuando dos dímeros de Fur interaccionaban en el surco mayor en caras opuestas de la doble hélice, provocando un cambio conformacional del ADN (figura 2.3.2) (Pohl et al., 2003)

Figura 2.3.2.- Modelo de la unión de un dímero de la proteína Fur de Pseudomonas aeruginosa al ADN. Tomado de Pohl et al., 2003

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2.4.- Genes regulados por Fur

El principal grupo de genes regulados por Fur es el relacionado con el metabolismo del hierro, como los implicados en la síntesis de sideróforos o de sus receptores. Esto constituye una medida de ahorro además de protección frente a la entrada de péptidos tóxicos. De una forma indirecta a través del ARN antisentido RythB, en E.coli induce la expresión de bacterioferritinas (Masse y Gottesman, 2002). También se ha demostrado la regulación mediante Fur de proteínas implicadas en la defensa frente al estrés oxidativo, como IsiA, la superóxido dismutasa (Masse y Gottesman, 2002) o la catalasa-peroxidasa (Pym et al., 2001).

El aparato fotosíntetico sufre una serie de adaptaciones a la deficiencia de hierro, por lo que no resulta raro que Fur esté involucrado en esta transformación. Este proceso se engloba dentro de las medidas de economía del hierro en condiciones de deficiencia. Por ejemplo, el transportador de electrones flavodoxina codificado por el gen isiB es inducido drásticamente en condiciones de deficiencia de hierro, para sustituir a la ferredoxina en la cadena fotosintética (Singh et al., 2003).

Una proteína Fur de Microcystis aeruginosa se ha visto que participa en la producción de toxina microcistina (Martin-Luna et al., 2006), así como otros homológos de Fur pueden estar involucrados en el desencadenamiento de factores de virulencia en distintas bacterias (Litwin y Calderwood, 1993).

Una de las consecuencias de la deficiencia de hierro es la disminución en la síntesis de proteínas y el aumento del tiempo requerido para la división celular, por lo que no resulta de extrañar que parte de la maquinaria de transcripción, como los genes de las proteínas ribosomales, estén reprimidos en deficiencia de hierro (Singh et al., 2003).

Además de Fur, se han identificado otras proteínas homólogas implicadas en diversas funciones celulares, lo que ha permitido establecer hasta este momento varias subclases de la

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familia Fur: aquellas que responden a la disponibilidad de metales, como hierro (Fur), Zinc (Zur), Manganeso (Mur) o Níquel (Nur) o también las que responden a otros estímulos, como la disponbilidad de hemo (Irr) o el estrés oxidativo (PerR) (Lee y Helmann, 2006). Todas estas proteínas son represoras transcripcionales que se unen al DNA en forma de dímero.

2.5.- Fur en Anabaena sp.

En Anabaena sp. se han descrito tres secuencias homologas a Fur denominadas FurA, FurB y FurC (Hernández et al., 2004) Sus características bioquímicas fueron estudiadas y se presenta en resumen en la tabla 2.

Tabla 2.- Propiedades bioquímicas de las proteínas Fur de Anabaena sp. PCC 7120. Tomado de Fillat, en prensa. Peso molecular (Dalton)

ε

276

Aminoácidos

pI

# Cys

motivos

m-1 cm-1

CXXC

# His

Motivos ricos de histidina

Unión grupo Hemo

FurA

17144

13760

149

6,8

5

2

12

H5X2CX2C

+

FurB

15116

5720

132

8,67

5

2

7

H2X2CX2C

+

FurC

17328

13490

149

5,34

3

0

6

HXHX2CX2T

-

La proteína FurA que posee la mayor homología con las Fur de enterobacterias, es el miembro de esta familia mejor conocido en cianobacterias. Además es la más abundante en células de Anabaena que crecen en condiciones estándares (Hernández, 2004).

La presencia de dos sitios de unión a metal, con roles reguladores y estructurales respectivamente, es común en la familia Fur. Por lo general, es un Zinc estructural que está coordinado por 4 cisteínas, como en el caso FurB de Mycobacterium tuberculosis (Lucarelli et

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al.,2007). Estas cisteínas son parte de dos motivos CXXC, que están conservados en FurA de Anabaena, pero no están involucrados en la coordinación de un ión Zinc auxiliar.

FurA está involucrada en la regulación de los genes de la toma de hierro y almacenamiento del mismo, además de participar en la modulación de varias rutas relacionadas con el metabolismo del nitrógeno y la homeostasis reductora (Fillat, en prensa).

La proteína de estudio en este trabajo es FurB. Ésta presenta un peso molecular ligeramente menor que sus homólogos y tiene un punto isoeléctrico mucho mayor. Posee un dominio de histidinas característico de la familia Fur y el dominio de cisteína en su extremo carboxi-terminal (tabla 2). Además tiene un dominio regulador de hemo formado por la secuencia de aminoácidos CP (Cys-Pro) y la presencia de este grupo impide la unión con el ADN (LópezGomollón et al., 2009).

Los niveles de FurB en la célula se ven afectados durante el estrés oxidativo, lo cual aumenta la transcripción de furB unas 30 veces. La habilidad de FurB de proteger el ADN del clivaje producido por radicales hidroxilos o DNasaI, y el incremento de supervivencia de células de E.coli que sobre-expresa la proteína, sugiere que posiblemente ésta proteja a la célula del ROS, evadiendo el daño al ADN mediante la unión inespecífica, actuando de forma similar a una proteína Dps (López-Gomollón et al., 2009). FurB podría jugar un papel dual dependiendo del nivel de expresión. En la ausencia de estrés oxidativo, la transcripción de furB es menor y el regulador se unirá a sitios específicos del ADN. Sin embargo, bajo condiciones oxidantes el nivel de FurB será lo suficientemente alto como para unirse de forma inespecífica al ADN y prevenir el daño oxidativo (Fillat, en prensa).

Por último, FurC es el miembro de esta familia que posee el contenido más bajo de histidina y a diferencia de FurA y FurB no es capaz de unir el grupo hemo (tabla 2). Se ha visto que FurC no puede unirse por sí sola al ADN, sin embargo la presencia de FurA o FurB, activa la habilidad de unirse a secuencias de ADN (Hernández et al., 2004). La presencia de esta proteína entonces parece modular la actividad de los otros homólogos, aumentando la capacidad de FurA

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de unirse al ADN y disminuyendo la actividad de unión de FurB. Sin embargo, se necesita más investigación en esta área para conocer si esta modulación se lleva a cabo in vivo y cuáles son los mecanismos que están involucrados. La función que tiene FurC en cianobacterias es todavía desconocida.

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CAPÍTULO 3 DISEÑO EXPERIMENTAL. MATERIALES Y MÉTODOS.

3.1.- Cepas utilizadas y Medios de cultivo

Las cepas utilizadas fueron E.coli DH5α de Invitrogen que contenía el plásmido pET28a(+) de Novagen; y E.coli BL21 (E3) que fue usada para la sobre-expresión de la proteína FurB. El medio de cultivo fue el Luria-Bertani (LB) en caldo y sólido, el cual estaba compuesto por: 10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura, 5 g/L de NaCl, y un 1,5% de agar para el medio sólido. También se utilizó el medio LB complementando con el antibiótico Kanamicina (LBK) a una concentración final de 50 μg/mL.

3.2.- Clonaje

El clonaje fue realizado previamente en el laboratorio, utilizando para la amplificación de furB

mediante

PCR

los

siguientes

cebadores:

Primer

foward:

GGAATTCCATATGAGAGCCATACGC, con un sitio de restricción para NdeI; y el Primer Reverse: CAGTAGTTTAAGCTTTTGACTA, con un sitio de restricción para HindIII. La mezcla de la reacción incluye 0,5 μM de cada primer, 200 μM de cada dNTP, 1,5 mM MgCl2 y 2,5 unidades de Taq DNA Polymerase (GIBCO-BRL) en un volumen final de 50 μL de PCR buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.4; 50 mM KCl). Antes de la amplificación, los tubos fueron incubados a 95°C por 3 min para asegurar la completa desnaturalización de las bandas de ADN. La amplificación se realizó por 30 ciclos de 93°C (0,5 min) para la desnaturalización, 51°C (1 min) para hibridación y 72°C (1 min) para la elongación. Un paso final en la extensión se realizó a

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72°C por 10 min. Luego el producto de la PCR fue clonado en el vector pET-28a(+) de Novogen (figura 3.2.1).

Figura 3.2.1.- Estructura del plásmido pET-28a y la secuencia de la región polylinker

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3.3.- Transformación de E.coli BL21 (DE3) con el plásmido pET-28a(+)

Aislamiento del plásmido

Las células de E.coli DH5α recombinante con el vector pET-28a se cultivaron en 10 mL de medio LBK (5 μg/ml) toda la noche a 37°C, 180 rpm. Luego se procedió a purificar el plásmido con el kit Genelute Plasmind Miniprep de Sigma. El ADN obtenido fue almacenado a -20°C.

Obtención de células competentes

A partir de de una colonia en agar LB de E.coli BL21 (DE3) de 18-24 h, se inoculó un vial de 10 mL de caldo LB que se incubó a 37°C, 200 rpm durante toda la noche.

Luego 1% de este cultivo se inoculó en 200 mL de caldo LB, el cual se incubó a 37°C, 200 rpm hasta alcanzar una D.O600: 0,35-0,45 (fase midlog).

Posteriormente se colocó el cultivo en hielo durante 20 min. Se centrifugó a 4000 rpm, 4°C durante 5 min. Se desechó el sobrenadante y se resuspendió lentamente en 1-2 mL de Buffer 1 (1,47 g CaCl2; 1,42 g MgCl2; 0,32 g CH3COONa en 100 ml de H2O), hasta completar 40 mL mezclando suavemente.

Luego se volvió a centrifugar a 4000 rpm, 4°C durante 15 min. Se desechó el sobrenadante y se resuspendió en 4 mL de Buffer 2 estéril frío (1,47 g CaCl 2 + 15 mL glicerol en 100 mL de H2O). Por último, las células se almacenaron en alícuotas de 200 μL a -70°C.

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Transformación

Se añadieron 2 μL de DNA a 200 μL de células competentes recién descongeladas. Se mezclaron suavemente y se incubaron en hielo durante 30 min.

Luego se transfirieron a baño María a 42°C durante 90 s, para ser colocadas posteriormente en baño de hielo durante 1-2 min.

Se adicionaron 800 μL de medio LB caldo y se incubaron durante 45 min a 37°C, 180 rpm. Por último, la mezcla de ADN y células competentes fue sembrada uniformemente en placas de agar LBK y se incubó durante 18 horas a 37°C.

3.4.- Screening de expresión de FurB y producción de masa celular

Screening de expresión

Para comprobar la sobre-expresión de FurB en E.coli BL21 (DE3), se realizó un screening de expresión. Para ello, se inocularon 4 colonias de BL21 (DE3) /pET28a-FurB y de BL21 (DE3), como control, en 10 mL de caldo LBK y LB, respectivamente, a 37°C, 180 rpm, durante toda la noche.

Seguidamente, 200 µL de estos cultivos se incubaron en 10 mL del caldo LBK y LB, a 37°C, 200 rpm, hasta D.O.600nm= 0.5. Cuando la densidad óptica fue alcanzada, los cultivos (células recombinantes y control) fueron inducidos con Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) a 1 mM de concentración final, e incubados a 37°C, 200 rpm durante 5 horas. Por último, 1 mL de cada muestra fue centrifugado durante 2 min y el pellet se almacenó a -20°C.

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De este pellet se tomó 1 µL del extracto puro de las células recombinantes que se diluyó sólo en 10 µL de H2O destilada; mientras que el resto fue resuspendido en 100 µL de agua destilada, al igual que el pellet de las células control. 10 µL de estas muestras fueron mezclados con 3µL de buffer muestra 6X (60 mM Tris; 6 mM EDTA; 15% SDS; 35% β-mercaptoetanol; 42% glicerol; 0.12% azul de bromofenol). Estas mezclas fueron incubadas a 95°C durante 5 minutos.

Se cargaron 10 µL de cada mezcla en un gel de SDS/PAGE al 17% (tabla 3). La electroforesis se llevó a cabo durante 45 min a 35 A, utilizando un buffer de corrida 5X (15 g/L Tris; 75 g/L glicina; 5 g/L SDS) diluido hasta 1X. Luego el gel fue coloreado con Azul de Coomassie (250 mL/L metanol; 100 mL/L ácido acético; 20 mL/L glicerol; 0.25% azul de Coomassie) por 30 minutos y fueron decolorados durante toda la noche con la solución decolorante (250 mL/L metanol; 100 mL/L de ácido acético; 20 mL/L glicerol).

Tabla 3.- Composición de un gel de SDS/PAGE al 17% Componente

Gel Separador (mL)

Gel Concentrador (mL)

H2O

0,36

1,4

Acrilamida:Bis-acrilamida 30%

3,4

0,33

Tris-HCl 1.5 M, pH 8.8

2,24

_

Tris-HCl 0.5 M, pH 6;8

_

0,25

SDS 20%

0,030

0,010

Persulfato de Amonio (PSA) (0.1 mg/mL)

0.020

0.010

TEMED

0.010

0.010

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Producción de masa cellular

Se inocularon 200 mL de caldo LBK partiendo de una colonia recombinante crecida en agar LBK. Se incubó a 37°C, 200 rpm durante toda la noche.

Seguidamente, se tomaron 10 mL para inocular cada litro de LBK (al final fueron 10 L en total) que se incubaron a 37°C, 200 rpm hasta D.O.600nm = 0.4. Luego se bajó la temperatura y las células se incubaron a 30°C hasta alcanzar D.O.600nm = 0.5. La producción de proteína fue inducida con IPTG 1 mM, y se incubó a 30°C durante toda la noche a 200 rpm.

Los cultivos obtenidos fueron centrifugados a 8000 rpm, 4°C durante 10 min. El pellet fue lavado con solución salina al 0,8%, y nuevamente centrifugado; para posteriormente ser conservado en alícuotas de 10 g a -20°C. El proceso de sobreexpresión de la proteína FurB fue verificado mediante la realización de una electroforesis en PAGE/SDS al 17%.

3.5.- Purificación de FurB mediante cromatografía de afinidad IMAC –Zinc (Immobilized metal ion affinity chromatography)

Preparación de la columna Para 10 mL de matriz Matrix Chelating Sepharose TM Fast Flow (Amersham), 10 volúmenes de agua destilada fueron agregados para lavar la matriz a un flujo de 4 mL/min. Luego, 3 volúmenes de ZnSO4 0.25 M fueron aplicados y lavados con 5 volúmenes de agua destilada. Finalmente, 5 volúmenes de buffer de lisis (100 mM NaH2PO4; 300 mM NaCl, pH 8) fueron pasados a través de la columna.

40

Purificación y recuperación de la columna

El pellet almacenado fue descongelado y resuspendido en 5 volúmenes de buffer de lisis más 2 mM de PMSF. Esta solución fue sonicada en razón de 10 ciclos por 30 x 30 s.

Después, la solución fue centrifugada 2 veces durante 20 minutos a 15000 rpm y filtrada por 0.45 µm. El sobrenadante fue aplicado en la columna a un flujo de 2 mL/min y se colectó el volumen muerto. Luego se lavó la columna con el buffer de lavado (buffer de lisis; 35 mM glicina) hasta observar que DO280nm