UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE BIOANALISIS

Manual de Practicas de Laboratorio

Inmunologia Basica

TRABAJO PRACTICO EDUCATIVO que para obtener el titulo de Qrnmico Clinico presenta

Mario Ortiz Olivares

Directora M. en E. Sandra Luz Gonzalez Herrera

Xalapa, Ver.

Febrero 2010

INDICE Pag. Introduction

1

Procedimientos basicos para el manejo de los RPBI

4

Reglamento de laboratorio

6

Practica No. 1. Immunization de animales

7

Practica No. 2. Fagocitosis de Estafilococos opsonizados

13

Practica No. 3. Fagocitosis de Candida albicans

17

Practica No. 4. Hemolisis Radial Simple

20

Practica No. 5. Hemolisis por complemento

24

Practica No.6. Obtencion de sueros inmunes en animales de experimentation

29

Practica No. 7. Doble Inmunodifusion (Metodo de Ouchterlony)

33

Practica No. 8. Inmunodifusion Radial

38

Practica No. 9. Precipitation de medios Ifquidos .Metodo del anillo

41

Practica No. 10. Difusion simple en tubo .Metodo de Oudin

44

Practica No. 11. Deteccion de anticuerpos del sistema ABO

47

Practica No. 12. Aglutinacion cualitativa. Identificacion de microorganismos

50

Practica No. 13. Inhibicion de aglutinacion. Determinacion de secretores

53

Apendice

56

INTRODUCCION La inmunidad significa protection contra los diferentes agentes patogenos. Los antecedentes de la Inmunologla se remontan a la antigiiedad. " El primer reporte escrito coriocido de una infeccion viral (3700 a c) es un jeroglifico hecho en Menfis. Tambien se tienen registros de enfermedades y documentos epicos de

Babilonia. En la cultura China

epidemias en los

1000 anos A.C. ya se

utilizaba material desecado de las vesiculas de enfermos de viruela considerada endemica para inocularselo a personas sanas y conferirles inmunidad". Noticias de la salud (2009). El primer acercamiento a la inmunizacion con criterios racionales fue realizado por el medico ingles Edward Jenner (1749-1823), tras su constatacion de que los vaqueros que habian adquirido la viruela no eran atacados por la grave y deformante viruela humana. Jenner publico sus resultados en 1798, pronosticando que la aplicacion de su metodo podria llegar a erradicar la viruela. El primer abordaje plenamente cientifico de problemas inmunologicos se debio, a Louis Pasteur. Estudiando la bacteria responsable del colera aviar, observo (1880) que la inoculacion en gallinas de cultivos viejos, poco virulentos, las protegia de contraer la enfermedad cuando posteriormente eran inyectadas con cultivos normales virulentos. De esta forma se obtuvo la primera vacuna a base de microorganismos atenuados. Fue precisamente Pasteur quien introduce el termino vacuna, en honor al trabajo pionero de Jenner. La inmunologfa es una ciencia relativamente joven, autonoma y madura cuyos origenes han estado estrechamente ligados al desarrollo de la microbiologia. Desde

un

punto

de vista

historico,

inmunidad

implica

proteccion

contra

enfermedades, especfficamente patologia infecciosa. El objetivo principal de la inmunologia es el estudio de las respuestas de defensa que han desarrollado los organismos frente a la invasion por microorganismos o particulas extranas, mecanismos altamente evolucionados e integrados, dotados de especificidad y de memoria, frente a agentes reconocidos por el organismo como no propios. Las celulas y moleculas responsables de la inmunidad constituyen el sistema inmune y 1

la activacion coordinada y colectiva de los componentes del sistema inmune corresponde a la respuesta inmune. Si bien la funcion fisiologica del sistema inmune es la defensa frente a microorganismos patogenicos, sustancias noinfecciosas pueden tambien llevar a la activacion de este sistema y generar una respuesta inmune. La inmunologla es una ciencia experimental: las conclusiones que han llevado a explicar el fenomeno inmunologico deriva de observaciones experimentales en condiciones controladas. Guerrero, J. (2007). En los ultimos anos en el campo de la Inmunologla

se ha

avanzado

vertiginosamente tanto en el aspecto teorico como en el tecnologico y hoy podemos ver con mayor claridad su aplicacion practica para conocer la fisiologla de diferentes padecimientos y encontrar la logica de numerosas enfermedades. La inmunidad por si misma ocupa un sitio en las ciencias biomedicas; de los descubrimientos que se le atribuyen y que han generado grandes campos de desarrollo podemos mencionar la relacion entre el cancer y las respuestas inmunitarias, la inmunoterapia, las interleucinas, el enorme desarrollo de la ingenieria

genetica,

inmunologicos,

las

las

pruebas

de

laboratorio

enfermedades

del

sistema

que

requieren

inmunitario

como

reactivos alergias,

inmunodeficiencias, autoinmunidad, en el campo de la histocompatibilidad, los transplantes y otros. Todo lo expuesto anteriormente demuestra la importancia de incluir dentro del plan de estudios de la carrera de Qulmica Cllnica la experiencia educativa de Inmunologfa Basica para que los alumnos, futures profesionales de la salud, obtengan los conocimientos de la estructura y funcionalidad del sistema inmune en el organismo humano, mismos que aplicaran en el desarrollo de metodos y tecnicas en el laboratorio y en la interpretation correcta de los resultados. Por lo tanto se considera relevante contar con un manual de practicas de Inmunologla Basica que de manera sencilla y precisa complemente el programa del curso y le sirva de gula al estudiante en su desempeno dentro del laboratorio de ensefianza.

Con tal fin el presente manual se estructura de la siguiente manera:

inicia con

una breve explicacion de los procedimientos para manejar los residuos peligrosos biologico-infecciosos y de reglas basicas dentro del laboratorio, posteriormente se describen trece practicas que acorde al programa del curso abarcan los temas de inmunidad innata y adquirida. Cada practica cuenta con un sustento teorico, objetivos, description y procedimientos para su realization, listado de material, reactivos y equipo a utilizar y finaliza con un cuestionario para que el alumno investigue y evalue sus conocimientos.

PROCEDIMIENTOS BASICOS PARA EL MANEJO PELIGROSOS BIOLOGICO -INFECCIOSOS (RPBI).

DE

LOS

RESIDUOS

En 1995 se publico en el Diario Oficial de la Federation la primera norma para regular el manejo de los residuos peligrosos, biologico-infecciosos (RPBI).EI objetivo primordial de esta norma fue el de proteger al personal de salud de los riesgos relacionados con el manejo de estos residuos, asf como proteger el medioambiente y a la poblacion que pudiera estar en contacto con estos residuos dentro y fuera de las instituciones de atencion medica; posteriormente se realizaron modificaciones a la norma NOM-087-ECOL-1995 siendo sustituida por la NOM-087-ECOL-SSA1. Esta norma incorpora los siguientes conceptos en el manejo de los RPBI: •

Para que un residuo sea considerado un RPBI debe de contener agentes biologicos infecciosos senalados como «cualquier organismo que sea capaz de producir enfermedad Para ello se requiere que el microorganismo tenga capacidad de producir dano, este en una concentration suficiente, en un ambiente propicio, tenga una via de entrada y estar en contacto con una persona

susceptible».

Por

lo tanto

los desechos

(panales,

toallas

femeninas, condones, etc.) que provengan de pacientes que no sean sospechosos de alguna enfermedad infectocontagiosa, como pacientes traumatizados, mujeres en trabajo de parto, o enfermedades cronico degenerativas, no deben de ser considerados RPBI. •

La cantidad de sangre o fluido corporal en el material de curacion es determinante para poder ser considerado como peligroso, por lo tanto solo los materiales de curacion que esten empapados, saturados o goteando

alguno

de

estos

fluidos

(liquido

sinovial,

pericardico,

cefaloraquideo, sangre, etc) deben de ser considerados RPBI. Dado que la conservation del medio ambiente y el autocuidado de la salud son valores para el alumno de Qufmica Clfnica, es obligatoria, dentro del laboratorio de ensenanza, la realization de los siguientes pasos (NOM-087-ECOL-SSAI-.2002) •

Identification de los residuos

Los

desechos

deben

de

ser

identificados

inmediatamente

despues

del

procedimiento que los genera y en el sitio donde se originaron. Para su correcta identification y posterior envasado, la separation de los residuos se debe de realizar de acuerdo a su estado fisico (liquido o solido) y su tipo, como se indica a continuation: -Objetos punzocortantes (tijeras, agujas, bisturi etc.). -Residuos no anatomicos (gasas, torundas empapadas

o goteando liquidos

corporales). -Patologicos (placentas, piezas anatomicas que no se encuentran en formol). -Sangre liquida y sus derivados. -Utensilios desechables utilizados para contener, transferir inocular y mezclar cultivos de agentes biologicos infecciosos y muestras biologicas para analisis. •

Envasado de los residuos generados

Una vez que los residuos han sido identificados y separados de acuerdo al tipo y estado fisico, estos deberan ser envasados de acuerdo a la tabla siguiente TIPO DE RESIDUOS Punzocortantes: Agujas de jeringas desechables, navajas, lancetas, agujas de sutura, bisturis y estiletes de cateter. EXCEPTO MATERIAL DE VIDRIO ROTO DE LABORATORIO. No anatomicos: Materiales de curacion empapados en sangre o liquidos corporales. Sangre liquida, y sus derivados excluyendo sangre seca. Muestras para analisis de laboratorio excluyendo orina y excremento. Materiales desechables usados para el cultivo de aqentes infecciosos •

ESTADO FISICO Solidos

ENVASADO/COLOR Recipientes rigidos polipropeno/ROJO

de

Solidos

Bolsas de plastico /ROJO

Liquida

Recipiente hermetico/ ROJO Recipiente hermetico /AMARILLO Bolsas de plastico /ROJO

Liquido Solido

Una vez terminada la practica los RPBI envasados seran entregados al personal

encargado

del

laboratorio

para

su

disposition

final.

REGLAMENTODE LABORATORIO 1. El uso de bata es obligatorio para todo trabajo en el laboratorio. 2. El alumno se presentara con su manual de practicas. 3. El alumno debera leer y estudiar cuidadosamente las practicas antes de realizarlas. 4. No esta permitido fumar, comer o ingerir bebidas dentro del laboratorio. 5. Las mesas de trabajo deberan limpiarse y desinfectarse antes y despues de cada sesion de trabajo. 6. Para trabajar en el laboratorio deberan agruparse en equipos. 7. Los equipos de trabajo deberan contar con el material biologico solicitado para la realizacion de la practica de laboratorio. 8. Todos los desechos se manejaran de acuerdo a los procedimientos basicos de los RPBI. 9. Los accidentes como cortadas, quemaduras, o derrames de llquidos deberan reportarse inmediatamente al maestro. 10. Al terminar la practica el alumno responsable de cada equipo de trabajo debera entregar el material y equipo de laboratorio utilizado. 11. El alumno debera lavarse las manos con agua y jabon al finalizar cada practica. 12.Dadas las caracterlsticas y funciones de cada laboratorio el alumno debera someterse a las normas especiales, marcadas en cada uno de ellos.

PRACTICA No 1 INMUNIZACION DE ANIMALES

Sustento teorico. El

proceso

de

inmunocompetente

inmunizacion

con

antigeno

consiste

en

en condiciones

inocular adecuadas

un de

organismo cantidad,

sustancias acompahantes y dosis necesarias para conseguir una buena respuesta inmune. En general se divide en 2 fases: Inmunizacion primaria en la cual se administra una determinada cantidad de antigeno en presencia de adyuvante, e inmunizacion de memoria, en la que el antigeno es administrado en forma soluble o bien con adyuvante. Existen numerosos protocolos de inmunizacion, con una duration variable. El contacto de un individuo inmunocompetente con un antigeno especifico, en forma natural o artificial, induce una respuesta inmunologica que puede ser humoral, celular o ambas dependiendo de factores como dosis, via de administration, tipo de antigeno, etc. Como consecuencia de la respuesta inmunitaria y en el curso de la enfermedad infecciosa, o en un posterior contacto con el agente causal, el organismo se defiende en forma mas eficaz y con mecanismos espetificos. La defensa antiinfeccion depende de mecanismos inespecificos naturales y de mecanismos espetificos adquiridos .De ahi la distincion entre inmunidad natural e inmunidad adquirida, ambos sistemas son esenciales para la salud, actuan en conjunto y dependen entre si para lograr una eficacia maxima, con frecuencia las acciones de un sistema pueden influir sobre el otro. Collado, R. Porras, R. Cotoli, M. Gomez, E.(2008).

Objetivos. Al finalizar la practica, el alumno sera capaz de: a) Utilizar diferentes vias para la inoculation y la obtencion de muestras sanguineas en animates de experimentation. b)

Preparar antigenos solubles y particulados.

c) Inducir una respuesta inmunologica en un conejo para obtener un antisuero. 7

Descripcion de la practica. El animal de experimentation, en este caso el conejo (Orcytolagus cunicullus), es sangrado para obtener un suero control negativo; posteriormente se le aplica un antigeno soluble o particulado utilizando las vlas de administration y las dosis senaladas en un protocolo de immunization. Una vez finalizado el proceso, el conejo es sangrado por puncion cardiaca con el fin de obtener un suero con alta concentration de anticuerpos. Procedimientos para la realizacion de la practica. En la realizacion de esta practica debemos seguir los siguientes pasos: I Sangrado de control. Para todos los antlgenos es necesario sangrar al animal antes de las inmunizaciones para contar con un suero control negativo. Los animales de laboratorio: conejos, ratas, perros, etc. suelen cooperar bien cuando son tratados adecuadamente, con firmeza pero con cuidado, en un medio ambiente sin ruidos innecesarios. Es aconsejable tener conocimiento de los pasos a seguir para tener a la mano el material necesario; torundas, jeringas, tubos, etc. Tecnica. Si se trata de conejos la sangrla puede hacerse en la vena marginal de la oreja (para pequenos volumenes) o por puncion cardiaca (para mayores cantidades). a. Sangria de la vena de la oreja. Puede pincharse la vena y dejar que la sangre fluya o puede utilizares aguja y jeringa. 1. Mantener inmovil al animal 2. Frotar vigorosamente la oreja para estimular la circulation sangulnea .limpiar con alcohol y hacer un corte pequeno longitudinal con una hoja de afeitar o una lanceta. 3. Recoger el volumen deseado de sangre en un tubo de ensayo. 4. Mantener un algodon seco apretado sobre la puncion hasta que cese la hemorragia para evitar hematomas.

b. Puncion cardiaca. El sangrado del corazon suele ser simple y puede llevarse a cabo repetidas veces en un animal si se utiliza buena tecnica. Es recomendable utilizar algun anestesico para mantener sedado al animal. 1.- Cortar el pelo en la zona que cubre el esternon y desinfectar con alcohol o yodo. 2.- Localizar la zona de pulsation maxima, generalmente a mitad del camino del esternon, ligeramente a la izquierda e introducir una aguja (se recomienda sea larga del No. 18) a traves del espacio intercostal, avanzando en linea recta hacia el hombro derecho empujando suavemente hasta que el latido del corazon se sienta contra la punta de la aguja, entonces se da un pinchazo corto hacia adelante para que entre al corazon. Pueden extraerse sin peligro hasta 50 ml de sangre de un conejo mediano. Si se experimenta dificultad para llegar al corazon extraer casi completamente

la aguja

e

insertarla

nuevamente

en otra direction.

Los

movimientos de la aguja dentro de la cavidad pericardica tienen peligro de desgarrar el corazon y causar la muerte inmediata. c. Separation del suero. 1. Dejar coagular la sangre y remover el coagulo con un aplicador para facilitar la retraction del mismo. 2. Incubar la sangre coagulada a 37°C durante 30 minutos y separar el suero centrifugando 5 minutos a 3500 rpm. 3. Conservar el suero en tubos o frascos de vidrio rotulados con el numero de equipo y la fecha de extraction. Preservar el suero agregando 1 gota de Merthiolate al 1:10,000 o llevando a congelation. II Esquemas de Inoculacion. Cuando se desea obtener un suero inmune experimentalmente deben tomarse en consideration las caracteristicas de los antigenos: inoculando antigenos particulados se obtendran sueros aglutinantes y la inoculacion de antigenos solubles nos dara sueros precipitantes.

!

2.1 Antigenos particulados. a) Antigenos bacterianos. Se inmunizaran conejos con suspensiones de antigenos "O" y "H" de S. typhi, de S. aureus y de C. albicans ajustadas a una concentration equivalente a los tubos #3, #2 y #

16 del

nefelometro

de

McFarland,

respectivamente.

Esto

nos

dara,

aproximadamente, las siguientes concentraciones: 900 millones de S. typhi ,600 millones de S aureus y 5000 millones de C. albicans por ml de suspension. Las inmunizaciones se haran de acuerdo al siguiente protocolo: Inyeccion

Tiempo

Dosis

Via

1

DlaO

0.5 ml

Intravenosa (IV)

2

Dfa 4

1.0 ml

Intravenosa (IV)

3

Dfa 8

2.0 ml

Intravenosa (IV)

4

Dla 12

3.0 ml

Intravenosa (IV)

Sangrado

Dla 18

b) Antigenos eritrocitarios. Se inmunizaran conejos con suspensiones al 50% de eritrocitos lavados por centrifugacion con solution salina de acuerdo al siguiente protocolo: Inyeccion

Tiempo

Dosis

Via

1

DlaO

1.0 ml

Intravenosa (IV)

2

Dfa 4

1.0 ml

Intravenosa (IV)

3

Dfa 8

1.0 ml

Intravenosa (IV)

4

Dfa 12

1.0 ml

Intravenosa (IV)

5

Dfa 16

1.0 ml

Intravenosa (IV)

Sangrado

Dfa 20

j

2.2. Antigenos solubles. a)

Suero humano normal.

Inocular al conejo con suero humano calentado a 63 C durante 20 minutos con objeto de obtener un cierto grado de agregacion de los componentes del mismo. El protocolo de immunization es el siguiente:

b)

Dosis

Tiempo

Inyeccion

Via

1

DiaO

0-5 ml

Intravenosa (IV)

2

Dia 3

1.0 ml

Intravenosa (IV)

3

Dia 6

1.5 ml

Intravenosa (IV)

4

Dia 9

2.0 ml

Intravenosa (IV)

Sangrado

Dia 14

Proteinas solubles.

Albumina de huevo: preparar con buffer fosfato salina pH 7.2 una solution que contenga 50 mg. de albumina por ml. Plasma: preparar una dilution 1:2 del plasma en solution salina. Estos antigenos son inoculados con aceite mineral de acuerdo al siguiente protocolo: Inyeccion

Tiempo

Dosis

Via

1

DlaO

2.0 ml

I.M. (1.5 ml en c/pierna)

Dia 6

2.0 ml

I.D (1 ml por 3 veces a lo largo de la columna)

Dia 13 Sangrado

I.M. (1.5 ml en c/pierna)

2.0 ml

Dia 19

Nota: agregar a cada c osis 1 m

de aceite mineral.

Material a utilizar. Material por equipo de 4 alumnos 6 tubos de ensaye d e 1 3 x 100 2 tubos de ensaye de 12 x 75 con tapon 1 palillo largo de madera 4 pipetas pasteur con bulbo 1 gradilla 1 vaso de precipitado de 50 ml Torundas con alcohol

Material biologico, equipo, reactivos y soluciones por qrupo: 500 ml de solution salina al 0.85% esteril Solution sedante para animales Solution de cloro para inactivar residuos Antigenos bacterianos 2 centrifugas Bano maria o estufa a 37 C Contenedores para desechos biologicos

Cuestionario. 1.- ^Que tipo de inmunidad es aquella que obtiene el feto por transferencia transplacentaria? 2.-