REPUBLICA BOLlVARlANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULlA FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE MEDICINA

"UTILIDAD DEL METODO MOLECULAR (REACCIQN EN CADENA DI: LA POLIMERASA) PARA EL DIAGNOSTICO DE TUBER(2ULOSIS PULMONAR"

TRABAJO DE INVESTIGACION PARA OPTAR AL T~TULODE DOCTOR EN CIENCIAS MÉDICAS

AUTOR: ORLANDO JOSE NAVA PAZ MÉRICO CIRUJANO PROFESOR AGREGADO DE LUZ

TUTOR: DR. MANZUR S. HASSANHI H DOCTOR EN CIENCIAS MÉDICAS PROFESOR ASOCIADO DE LUZ

MARACAIBO, NOVIEMBRE DE 2004

UTILIDAD DEL METODO MOLECULAR (REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA) PARA EL DIAGNOSTICO DE TUBERCULOSIS PULMONAR

NAVA P., Orlando J. "Utilidad del Método Molecular (Reacción en Cadena de la Polimerasa) para el Diagnóstico de Tuberculosis Pulmonar". 7'esis Doctoral. Escuela de Medicina. Facultad de Medicina. Universidad del Zulla. Maracaitio. Venezuela. 2004. 49 p.

RESUMEN La utilidad de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP) fue evaluada en 31 muestras de esputo, de pacientes de ambos sexos, sin distrnción de raza y edades comprendidas entre los 17 y 80 años, con manifestacianes clínivas, hallazgos radiológicos y10 datos epidemiológicos sugestivos de tuberculosis pulrnonar. A todas las muestras, se les practicó baciloscopia utilizando la técnica de color3ción de ZieilNeelsen. Se utilizó el medio de cultivo Ogawa-Kudoh como estándar. Los objetivos para el ensayo de RCP fueron los genes que codifican la proteína de 32-KDa. y la secuencia de inserción IS6110. Luego de la amplificación, se obtuvo un fragmento de 984 pares de bases correspondiente a la secuencia de inserción IS6110 y otro de 506 parts, correspondiente al antígeno alfa 32-KDa. Del total de muestras exarninadas por el método de Ziehl-Neelsen, 19 resultaron positivas y 12 resultaron negativas (61.2:) y 38.71% respectivamente). De las 31 muestras sembradas 19 (61.29%) resultaron positivas y 12 (38.71%) fueron negativas al cultivo. De todas las muestras amplificadas, 22 (70.96%) mostraron la presencia de fragmentos de ADN correspondientes tanto a la secuencia de inserción IS6110, como al antígeno alfa 32 KDa., mientras que er S (29.04%) no se detectó la presencia de ADN micobacteriano por el método de RCP. L2 sensibilidad de la prueba RCP fue virtualmente de 100% y su especificidad fue del 75%. Se demostró que el RCP, basado en la amplificación simultánea clel elemento de inserción IS6110 y del gen que codifica el antígeno alfa en un sol3 paso, puede identificar infecciones por micobacterias a partir de muestras de esputo. Se concl~ye que esta técnica es más sensible que los procedimientos bacterioló!~icosde rutina (examen directo y cultivo) y la convierten en una herramienta muy poderosa para el diagnóstico de tuberculosis pulmonar y otras enfermedades micobacterianas. Palabras Claves: Tuberculosis, RCP, Examen directo, Cultivo [email protected]

NAVA P., Orlando J. "Utility for the Molecular Method (Polimerasa Cliain Reacticln) for the Diagnostic of Lung tuberculosis". Doctoral Thesis. School of hledicine. Abiiity of Medicine. Universidad del Zulia. Maracaibo, Venezuela. 2004. 49 p.

ABSTRACT

The utility of Polimerasa Chain Reaction of (PCR) it was evaluated in 31 sputiim samples, of patient of both sexes, without distinction of race and ages between 17 and 80 years, with clinical manifestations, discoveries radiological andlor suggestive epidemic data of lung tuberculosis. To al1 the samples they were practiced bacilosccpy using the technique of Ziehl-Neelsen. The Ogawa-Kudoh cultivation was used like standard. The objectives for the rehearsal of PCR were the genes that c ~ d the e protc?in 32-KDa (alpha antigen) and the insertion sequence IS6110. After the ar~plificationwas obtained a fragment of 984 couples of bases corresponding to the sequence of insrrt IS6110 and another of 506 couples corresponding to the alpha antigen. Of the total of samples examined by the Ziehl-Neelsen method, 19 were positive and 12 were negative (61.29 and 38.71% respectively). 19 samples (61.29%) were positive arid 12 (38.71%) were negative to the cultivation. Of al1 amplified samples, 22 (70.69%) showed the presence of fragments corresponding to DNA so much to the sequence of insert IS611G like the antigen alpha 32-KDa, while in 9 (20.04%) presence of DNA mycobacteriiim was not detected for RCP method. The sensibility of the RCP test was virtually 100% and its specificity was of 100%. It was demonstrated that RCP, based on the simultaneous amplification of the insertion element IS6110 and the gene that codes the alpha antigen in a single step, can identify mycobacterium infections. Wc3 conclude also that is more sensitive that routine bacteriological procedures (direct exam and cultivation) and can be a very powerful tool for the diagnosis of lung tiiberculosis and other mycobacterium diseases. Key Words: Tuberculosis, RCP, direct exam, cultivation [email protected]

~NDICEGENERAL Página

VEREDICTO

iv

RESUMEN

v

ABSTRACT

vi

~NDICEGENERAL

vii

~NDICEDE TABLAS

viii

~NDICEDE FIGURAS

ix

INTRODUCCI~N OBJETIVOS HIP~TESIS

MATERIALES Y MÉTODOS RESULTADOS DISCUSI~N

CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAF~A

~NDICEDE TABLAS

Tabla

Pagina

1. Distribución de muestras de esputo. Baciloscopia

.23

2. Distribución de muestras de esputo. Cultivo

:23

3. Distribución de muestras de esputo. RCP

25

4. Relación Prueba BK y Cultivo

26

5. Relación Prueba RCP y Cultivo

27

ix INDICE DE FIGURAS Figura

IPhgina

1. Estructura del locus DR en el genoma del Mycobacterium tuberculosis H37Rv.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

14

2. Amplificación de secuencias correspondientes al fragmento de inserción IS6110 y al antígeno alfa 32KDa.................

24

3. Sistema RCP en gel de agarosa correspondiente a todos los pacientes en estudio .....................................................

25

La Tuberculosis. Un problema actual.

La Tuberculosis es una de las enfermedades infecciosas que mata a más personas en el mundo entero. La mortalidad mundial por tuberculosis es aproximadamente de 2 millones de personas por año (36). Es producida por micobacterias peitenecientes al

Complejo Mycobacterium tuberculosis, que incluye al M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum y M. microti. Es una enfermedad con una gran trascendencia y es un problema de salud pública en el mundo entero y no solo en los países en vías (de desarrollo. El incremento de las inmigraciones, el advenimiento del síndrome de inmunodeficiencia adquirida, el descuido en los programas de control y el deterioro en la calidad de vida, ha traído consigo el recrudecimiento de la tuberculosis en los paísrs desarrollados y la aparición de cifras alarmantes en cuanto a tasas de morbilidaci y mortalidad se refiere. (17,24) El descubrimiento de la quimioterapia efectiva para erradicar la tisis (nombre por el cual se conoció durante mucho tiempo la enfermedad) trajo consigo la creencia que la tuberculosis sería fácilmente erradicable. Sin embargo, el tiempo se encargó de demostrar lo contrario y la conjunción de factores psicosaciales, epidemiológicos, administrativos, operativos han permitido que la tuberculosis continúe y se hzlla transformado, como mucho años atrás, en una verdadera plaga para el hombre. (17) Para que la tuberculosis sea, desde el punto de vista epideniológico, una enfermedad controlable, es necesario hacer diagnóstico precoz y masivo, así corno también garantizar que todos los enfermos inicien y culminen coripletamente e' tratamiento. Estos propósitos son difíciles de cumplir y más aún en los países en v as de desarrollo en donde los factores socioeconómicos y culturales determinan balas

2

tasas de cobertura diagnóstica y altos índices de incumplimiento y abandono cel tratamiento. (24) La OMS ha estimado que entre el año 2000 y el 2020, 200 millones de person'as enfermarán y 35 millones morirán de tuberculosis si no se hace un ri!~urosocontrol. Alrededor de 8 millones de personas en todo el mundo, enferma de tutlerculosis cada año. (36,72) Los datos obtenidos por la OMS permiten hacer las siguientes afirmaciones: Cada segundo una persona es infectada por primera vez por el bacilo tuberculoso. Cerca del 1% de la población mundial es infectada por primera vez por el bacilo tuberculoso cada año. Un tercio de la población mundial está actualmente infectada por el bacilo tuberculoso. Del 5 al 10% de las personas infectadas con el bacilo tuberci~loso(pero

10

infectado con HIV) enfermarán de tuberculosis en algún momento de su vida.. (72) El mayor número de casos de tuberculosis ocurre en la región del s~r-esteasiático (Bangladesh, India, Indonesia, Maldivia, Nepal, Sri Lanka, Tailandia, entrl3 otros), la cual es la responsable del 33% de todos los casos a nivel mundial. Las Américas representan entre el 4 al 6% de todos los casos de tuberculosis en el mundo. Sin embargo, la incidencia estimada per. cápita en la región del África Subsahariana. es cos veces mayor, de aproximadamente 350 casos por 100 mil habitantes. (72) Para el año 2002 se produjeron cerca de 2 millones de mciertes por tuberculosis er todo el mundo, siendo la región del sur-este asiático quien aportó la mayor proporciór

3 con 625 mil, seguida por la región africana con 556 mil. 1-as Américas aportaron aproximadamente 6 mil muertes por tuberculosis. (72) La pandemia del VIH ha traído un gran impacto en

la epideriiología de la

tuberculosis. Para finales del año 2000, aproximadamente 12 millores de las 36 millones de personas infectadas con el VIH en todo el mundo, tenían coinfección con

illi.

tuberculosis y 8.4 millones (70%) de esos coinfectados, viveri en la región del África Subsahariana (53). La infección por VIH incrementa 40% el riesgo de conversión (le infección a enfermedad (6,53) y por lo tanto también incrementa la trai~smisiónde la tuberculosis

a

la

población

general.

La

tuberculosis

es

responsable de

aproximadamente el 15% de las muertes por SIDA en todo el mundo. (53) Este impacto epidemiológico se ha manifestado por el hecho que en ausencia de infección por VIH, solo aproximadamente el 10% de las personas infectadas con ,M.

tuberculosis desarrollará tuberculosis activa, de las cuales alrededor de la mitad será infecciosa, es decir bacilífera (16,54,62). Así, solo 1 de cada 20 individuos infectadx con M. tuberculosis desarrollará tuberculosis infecciosa activa y cada caso infeccioso necesita, a su vez, infectar a alrededor de 20 individuos para generar otro caso infeccioso. En presencia de infección por VIH, aproximadamente el 40% de las personas infectadas por M. tuberculosis desarrollará la enfermedad activa en cualqu er momento de su vida, aumentando de esa manera los casos bacilíferos y a su vez incrementando la probabilidad de infección en la población. (62) El problema se combina con la emergencia de cepas de M. tuberculosis resistentes a las drogas actualmente usadas, principalmente a la lsoniazida y a la Ftifampicina, las dos drogas antituberculosas más potentes, originando cepas multirresistentes, las cuales han alcanzado proporciones alarmantes en algunos países, espesialmente en al antigua Unión Soviética. (6,20)

4 Venezuela, como país eminentemente tropical, no escapa de esta sitiiación. A partir del año 1950 la notificación de casos nuevos de tuberc-ilosis en todo el país experimenta un importante descenso hasta 1980. De acuerdo a cifras ot~tenidasde los Anuarios de Epidemiología y Estadística Vital del MSAS, en 1950 se not ficaron 10.3!57 casos nuevos de tuberculosis (todas las formas) para una tasa de 207.9 por 100 r ~ i l habitantes. En 1980 se notificaron 4.233 casos nuevos para una tasa de 28.2 por 100 mil habitantes. A partir de 1980 las cifras de notificación se estabiliz~ny adquieren tendencia al aumento, tendencia incrementada que se mantiene hasta los actuales momentos (3). Según cifras suministradas de los Seminarios Técnico Adrninistrativos de la División de Tuberculosis y Enfermedades Pulmonares del MSDS, pai-a el año 20112 se reportaron 6.204 casos para una tasa actual a nivel nacional de 25 por 100 niill habitantes (51,58).

Datos obtenidos por la OPS en su hoja informativa para Iss

Américas del año 2004, reportaron que para el año 2002 la coinfección TBCNIH era clel 4.7%. (51) En el Estado Zulia para el año 2004 se reportaron un total de 834 casos 3e tuberculosis (todas lasa formas) para una tasa de 23.8 (15). El Municipicl que reportó la mayor tasa de casos nuevos fue el Municipio Páez (tasa 97:1),

seguido del Municil~io

Jesús María Semprún (tasa 66.2) y en tercer lugar el Municipio Machiques (tasa 52.5) Nuestra población indígena (especialmente Guajiros, Yukpas, Baríes, Paraujanos), por razones todavía no bien establecidas (desnutrición, hacinam ento, factores genéticos, etc.), tienen una alta prevalencia de la enfermedad. Lo que determina, que el Estado Zulia, por la presencia de esta población, sea uno de los Estados con mayor morbilidad y mortalidad por tuberculosis. Toda esta problemática mundial y regional nos dibuja un panorama bastante sombrío, por lo que se hace necesario mejorar los programas de contro , para alcanzar

una mayor cobertura terapéutica y sobre todo para lograr un diagnó:jtico precoz y específico.

Diagnóstico de la Tuberculosis. El diagnóstico clínico de la tuberculosis es difícil de establecer. A tal punto que muchos autores la han catalogado como "la gran simuladora", presentáiidose muchas veces bajo la forma de cuadros clínico - radiológicos completamerite atipicos e inusuales, que desconciertan al médico en cuanto a la orientación diagióstica. Por lo tanto los hallazgos clínicos y radiológicos que se observan en los pacientiss tuberculosos, no aportan siempre datos patognomónicos que permitan !;u diagnóstico.

(17) 1. Técnicas bacteriológicas: 1.1. La microscopia de la expectoración, empleando la tinción de Ziehl-Neelsen,

permite observar los bacilos como bastoncillos ligeramente curvados, de color rojo sobre un fondo azul. Cuando deben leerse muchos exámenes resulta m;is convenier te la microscopia fluorescente. En este caso se utiliza auramina fenolada como coloran.:e, con la cual los bacilos se toman fluorescentes cuando se los expone a la IJZ ultravioleta, haciéndose fácilmente visibles. Se pueden emplear así objetivos qJe amplían considerablemente cada campo microscópico, lo que permite examinar Jn número de campos 15 veces mayor que con la tinción de Ziehl-Neelsen. Infortunadamente, estos microscopios son costosos y sólo se justifican en grandes laboratorios, cuando deben procesarse más de 50 muestras diarias. (47) El diagnóstico bacteriológico de la tuberculosis no está exento de errores: la baciloscopia, a través del examen directo de la muestra y coloración con la técnica de Ziehl-Neelsen, no es 100% confiable, pues el bacilo no siempre es detectado en las

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muestras clínicas examinadas. La microscopía, utilizando la thcnica de coloración cle Ziehl - Neelsen, es rápida, económica y sencilla. La sensibilidad deja mucho qLe desear, varía dependiendo del tipo de muestra y la micobacteria involucrada, ya qiie como regla deben existir entre cinco mil a diez mil bacilos por ml. de expectoración pa8-a que tengan un 50% de posibilidades de ser detectados al microscopio; sólo cuando el numero de bacilos alcanza a más de 100.000 por ml. de expectoración, podemos esperar que las baciloscopias sean consistentemente positivas (33).Utilizando la tincion fluorescente, este número puede ser tan bajo como 1.O00 bacilos por ml. :33) Además la presencia de bacilos ácido alcohol resistentes en el exarnen directo de pues muestras clínicas, no siempre garantiza que se trate de un bacilo tub~~rculoso, puede tratarse de una micobacteria atípica o de otro microorganismo que comparta la característica de ácido alcohol resistencia (M. leprae, Actinomyces, hlocardia). Esto puede ocasionar graves problemas diagnósticos y terapéuticos El rango de sensibilidi3d de la baciloscopia, oscila entre 50 - 80% y la especificidad es virtualmente del 10OCi/o.

(33) 1.2. El Cultivo. Al lado de la baciloscopia, el diagnóstico bactei-iológico de la tuberculosis, debe complementarse con el cultivo. El cultivo es una téc:nica que tie3ie mayor sensibilidad (70-90%), ya que basta que existan más de 10 bacilos1 ml., en muestras digeridas y concentradas, para que sea positivo. Recordemos que la baciloscopia sólo utiliza 0 , l ml. de la muestra, efectuando un extendido de unos 10.030 campos microscópicos, de los cuales en el mejor de los casos, sólo se een 100 a 230 campos; en cambio, los cultivos procesan 0 , l ml. de expectoración. (35) El aislamiento de las micobacterias por cultivo es eritorpecido por su lerito crecimiento. Un promedio de incubación de 4 semanas en medios convencionales se requiere antes que pueda ser detectado crecimiento. Los métodos de identificación

7 convencionales después del cultivo incluyen determinacic5.i

de la velocidad cle

crecimiento, crecimiento a diferentes temperaturas, morfología de la coloriia, produccic)n de pigmentos y susceptibilidad a los agentes. De tal manera que en casos en los qiie se requiera una toma de decisiones rápidas para instaurar una terapéut ca efectiva :;u valor es muy limitado. (33,35,47) Medios sólidos incluyen medios basados en huevo tales comí:, Lowenstei1Jensen, Coletsos, Ogawa Kudoh, medios basados en agar tales coma Middlebrook 7HlO. Medios líquidos incluyen caldo de Kirchner y caldo de Middlebrook 7H9. Sin embargo, aproximadamente el 70% de los laboratorios utilizan sólo los medios sólidos para el cultivo de micobacterias. (71) El medio de Ogawa modificado por Kudoh, es más fscil de pr3parar que el Lowenstein-Jensen y es más económico ya que no contiene 1-asparagina, la cual es costosa y no está disponible en muchos países. El procedimiento de inoculación 3s simple, no requiere equipo especial y produce menos contaminación de los cultivos bajo condiciones desfavorables. Además la capacidad de amortiguación dl2l medio haze posible inocular la muestra sin ajustar el pH. (43,50) Se han hecho muchos intentos para mejorar los métodos de cultivo del bacilo tuberculoso, de modo que se pueda disponer de sus resultados en plazos más breves. Las técnicas más útiles a este respecto parecen ser las radiométricas, que permiten hacer el diagnóstico de muchas infecciones bacterianas en pocas horas y de la tuberculosis en pocos días. Además, tienen una mayor sensibilidad que los métodos bacteriológicos tradicionales. Se han descrito métodos de cultivo más rápidos como: El método radiométrico BACTEC, el sistema ESP Myco, el sistema MBIBacT Alert, el sistema de tubo MGIT, el sistema Septi-Chek AFB, la detección de microcolonias en

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medios sólidos (1,46,60,69). Desafortunadamente tales pruebas son costosas en su inicio, requieren de personal altamente calificado y su sensibilidad y especificidad son muy variables de uno a otro laboratorio. Por lo tanto no están disponibles en todos los países en vías de desarrollo.

Por lo tanto, las técnicas bacteriológicas tradicionales de laboratorio (baciloscopia y cultivo), a pesar que tienen una buena sensibilidad y especificidad, no son lo suficientemente útiles cuando se requiere de un diagnóstico precoz y espscífico (formas extrapulmonares, primoinfección tuberculosa en niños, formas cerradas, infeccitjn micobacteriana en pacientes VIH).

2. Técnicas de Biología Molecular: La aparición de las técnicas de biología molecular ha revolucionado el ámbito de la patología infecciosa, ya que permiten identificar el ácido desoxirribonucleico y ribonucleico (AND o ARN) del organismo (bacteria o virus) causante de una infeccicln, acelerar el proceso diagnóstico, identificar fuentes de infección, e incluso determinar la expresión de genes importantes en la patogénesis de la enfermedad. (49) De las técnicas de biología molecular, la amplificación de ácidos nucleicos como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP) es un instrumento muy útil para el diagnóstico bacteriológico de la tuberculosis, pues permite un diagiióstico rápiclo, sensible y específico, a través de la identificación del ADN o ARN presente en las muestras clínicas, pudiendo despejar los problemas derivados de los procedimientos habituales de laboratorio. (22) Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP): Es una técnica de biología molecular mediante la cual un pequeño fragmento de ácido nucleico se amplifica varias veces para obtener copias múltiples. La RCP puede

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utilizarse para diagnosticar enfermedades infecciosas y para investigar a evolución. (22,49) La RCP fue ideada por el bioquímico estadounidense Kary B. Mullis en 1983 y desarrollada posteriormente por Mullis y su colaborador Fred A. Faloona en la Cefus

Corporafion de Emeryville, California. Aunque la utilidad de esta témica no se reconoció inmediatamente, en 1991 su uso ya se había generalizado (49). En 1993 Mullis obtuvo el Premio Novel de Química por este trabajo. La RCP opera en forma de ciclos. Cada ciclo duplica la cantidad de ADN, por Ic que permite obtener hasta mil millones de copias de un solo fragmento eri unas pocas horas. La técnica es relativamente sencilla y pueden utilizarla científicos sir demasiada formación en biología molecular. Los elementos necesarios para llevarla E cabo se comercializan en forma de juego, y se utilizan en medios muy variados, desde, la investigación forense hasta el diagnóstico clínico. (22,64) Funcionamiento de la RCP: La reacción en cadena de la polimerasa imita el

fenómeno de replicación o reproducción del ADN que ocurre de forma natural en las células vivas. La mayor parte del ADN es de doble cadena (es decir, cada cadena de ADN está apareada con otra complementaria). Durante la replicación las dos cadenas se separan y una enzima especializada llamada Polimerasa hace una copia de cada una de las cadenas, utilizando la original como plantilla o modelo. Normalmente este proceso de copia tiene lugar cuando la célula se divide y da lugar a la formación de Jn par de cadenas hijas por cada una de las cadenas paternas. (22) La polimerasa necesita otros dos ingredientes para copiar ADN. El primero es una reserva de los cuatro bloques básicos que constituyen la mol6cula de ADN, llamado!; nucleótidos o bases. El segundo es una fibra corta de ADN copiado, que se llama

'O

cebador oligonucleofídico o primer; está formado por varios nucleótidos que inician IE replicación. La RCP utiliza estos mismos ingredientes para copiar ADN. (;!2,64) La reacción tiene lugar en tres fases. Durante la primera o desnatoralización,

12

plantilla o fragmento original de ADN se calienta hasta una temperatura de 90° a 95 O C durante 30 segundos; esto provoca la separación de las dos cadenas. En la segun& fase, llamada templado o alineación, la temperatura de la mezcla se baja hasta 55 O C durante 20 segundos para que los cebadores oligonucleotídicos se enlacen con el ADN desnaturalizado. En la tercera fase o de polimerización, la temperatura de IEI mezcla se eleva hasta 75 "C para que la polimerasa copie rápidamente la molécula de ADN. (22,64) Estas tres fases tienen lugar en un mismo tubo y constituyen un ciclc completo d e RCP, que se realiza en aproximadamente de dos minutos. Teóricamente, el ciclo de RCP se puede repetir sin límite, pero la polimerasa, los nucleótidos y los cebadore:; suelen agotarse al cabo de unos 30 ciclos (La vida media cle la polinierasa es de aproximadamente 90 minutos). Estos 30 ciclos, que duran menos de tres horas, bastan para producir mil millones de copias de ADN. (22,64) La polimerasa utilizada en los primeros experimentos de RCP resultaba fácilmente destruida por el calor, lo que obligaba a añadir más enzima en cada ciclo para sustituir a la inactivada por las elevadas temperaturas de la primera fase. Pero en la:; versiones modernas de la RCP se utiliza una polimerasa termoestable llamada Taq. Inicialmente se extraía de Thermus aquaticus, una bacteria termófila que vive en

10.5

manantiales de agua caliente del Parque nacional de Yellowctone (Estados Unidos). Como la polimerasa Taq no resulta destruida por las elevadas temperatiiras a las que

'1

transcurre la RCP, basta con añadirla una vez, al principio de la -eacción. La polimerasa Taq se fabrica ahora con bacterias modificadas genhticamente. (30) El uso de la RCP exige mucho cuidado. Lo más importante es evitar Is contaminación de la mezcla reactiva. Es tan sensible, que permite multiplicar accidentalmente

cantidades

mínimas

de

ADN

contaminante.

Se

utilizar

procedimientos especiales para evitar la contaminación. En medicina, la RCP resulta particularmente útil en el diagnóstico prenatal de, enfermedades genéticas. Otras aplicaciones médicas de la RCP son la identificaciór de virus, bacterias y células cancerosas en tejidos humanos. (22) Los resultados del RCP igual que los de la microscopía, pueden ser obtenidos 24 horas después de recibir la muestra. La especificidad y sensibilidad excede a la de la microscopía. Estudios han reportado sensibilidades entre 74-91% y c?specificidad'?s entre 95-100%. (70) Se han descrito muchos ensayos de RCP para la detectación de bacterias clel Complejo M. tuberculosis. Muchos laboratorios han introducido técnicas basadas en la amplificación de secuencias de ADN micobacteriano por RCP, como !una alternativa muy promisoria para la detección rápida, sensible y específica de M. ~'uberculosissn muestras clínicas, siendo de especial interés para uso con aquellas muestras que contienen pocas micobacterias. (2,7) Existen dos métodos basados en la amplificación de ácidos nucleicos aprobados por la FDA (Food and Drug Administration) para la detección de M. tuberculosis, a partir de muestras respiratorias con baciloscopias positivas. Ellas son la prueba IdTD (Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct Test) de en-probe@, San Diego, California; y la

12 prueba AMPLICOR de ~ o c h e @ Diagnostic Systems, Inc., Branrhburg, New Jersey (1 1). En este sentido, la prueba de AMPLICOR desarrollada por Roche Diagn~sticsysfemsB ha mostrado ser una herramienta muy útil para el diagnóstico precoz ce tuberculosis, con una sensibilidad y especificidad de 76.4% y 99.8% respectivamente (13,39,61), l o solo a partir de muestras respiratorias sino también a partir de muestr;x de fluidos y tejidos corporales. (61) Se han publicado estudios basados en la amplificación de muchas secuencias de

M.

tuberculosis, la secuencias de proteínas de 32 kDa (5), 65 kDa (7). El antígeno de 32 kDa, denominado antígeno alfa esta presente en una gran variedad de micobacteri~is, es secretado en forma abundante en sobrenadantes de cultivos de uria variedad Je micobacterias y parece ser el principal estimulante de la inmunidad ceular y humo-al contra las micobacterias. El antígeno alfa, también llamado MPB59, pertenece al complejo 85. Este complejo es codificado por tres genes homólogos pero estructuralmente diferentes

(Ag85A, Ag85B, Ag85C), mostrando iina diversidad

genética en especies de micobacterias de crecimiento lento y rápido. (5) Sin embargo, el objetivo más común para la amplificación es la secuencia rle inserción IS6110, la cual sólo está presente en las micobacterias que pertenecen al

Complejo M. tuberculosis (18,21,37,39,41,65). Las secuencias de inserción (1s) s3n elementos genéticos móviles, de 0.8 a 2.5 kilobases en longitud, con una repeticijn invertida en cada punta y un marco abierto de lectura, la cual codifica u r a transposasa, mediando su movilidad (45). Ellas difieren de los transposones porque solo llevan genes necesarios para su propia replicación. Se cree que la transposición es hecha al a z x , generando órdenes de inserción diversos a través de los cromosomas. 1-as secuencias de inserción pueden jugar un papel en la introducción de diversidad biolt~gicadentro de

13 un género. El conocimiento de la biología de las IS es fundamental para a comprensijn de la biología y evolución del género Mycobacterium .(63) Más de 16 IS diferentes, pertenecientes a 5 familias se han reportado en micobacterias (45). Las IS micobacterianas se utilizan para estudiar la epidemiología del M. tuberculosis (66) y se espera que el mejoramiento en la comprensión de la

transmisión de la tuberculosis traiga como resultado de la aolicación (le métodos de tipificación de las IS. (29,31) La IS IS6110 es un miembro de la familia IS3. Los miembros de esta familia son los grupos de IS bacterianas más ampliamente extendidas, siendo encontradas en más 3e 24 géneros de bacterias Gram positivas y Gram negativas (37). La mayoría de las cepas de M. tuberculosis tienen entre 8 y 15 copias del elemento de inserción IS61"O. (37,45). La especificidad y la naturaleza repetitiva del /S6110 lo hacen un objetivo idcal para la amplificación por RCP. (66) La secuencia de inserción IS6110 frecuentemente se encuentra en un locus único en el genoma del complejo M. tuberculosis denominado región "Birect Repeaf' (DR) (37). La región DR consiste en secuencias repetitivas de 36pb separadas por espaciadores no repetitivos cuyas longitudes varían de 27 a 41 pb (34,37). Esta región ha sido completamente secuenciada en M. tuberculosis (Fig. 1). La gran mayoría de las cepas contienen uno o más elementos IS6110 en la región DR. Herramientas de biología molecular, tales como Fingerprinting (RFLf3: polimorfisrno de longitud de fragmentos de restricción) o la más reciente técnica de Spoligotyping (40,48) es altamente efectiva para tipificar las micobacterias y determinar los genoti~os de los aislamientos clínicos. En tuberculosis humana la tipificación molecular se l o g r ~ por el uso de la secuencia de inserción IS6110 (9,10,18,37). En M.bctvis, IS6110 es

14 menos Útil porque el genoma de la mayoría de las cepas contiene solo algunas copirs de lS6170 (37,67). Recientes estudios han indicado que algunas cepas de Al. tuberculosis pueden ser más fácilmente transmitidas y ultimadamente, m6s exitosas en la producción de infección y10 enfermedad. (28) Para incrementar nuestro conocimiento sobre la biología del bacilo tiiberculoso, se ha determinado la secuencia genómica completa de la cepa más ampliarriente utilizad,a, H37Rv (Fig. 1) (14). Análisis de bioinformática han llevado a la identificación cle aproximadamente 4.000 genes en la secuencia genómica de 4.41 Mb y han provisto un gran aporte al desarrollo de la bioquímica, genética e inmunología de esta temida bacteria. La información de la secuencia genética de esta cepa está centralizada en

Fig. 1. Estructura del locus DR en el genoma del Mycobacfenum tuberculosis H37Rv

La causa más frecuente de falsos positivos en la RCP, resulta de la contaminaci(5n de pequeños fragmentos de ADN amplificados, llamados amplicones, a través (le aerosoles, propagados por los trabajadores de laboratorio durante la manipulación de productos del RCP (41,42). Estos productos, son particularmente peligrosos para la contaminación debido al gran número de moléculas producidas eri el RCP. -a contaminación con una molécula es suficiente para obtener un falso positivo (41). El uso de uracil ADN glicosilasa en combinación con dUTP en lugar de dTTF' es una forrna eficiente de prevenir la contaminación por amplicones.(44)

15

Otra gran preocupación en el RCP son los resultados falsos negativos, originadc~s por inhibidores de la ADN polimerasa. La adición de pequeñas cantidades de ADN cle M. tuberculosis, se ha hecho una práctica común para control~reste proolema (41,421). Sin embargo, este método incrementa considerablemente el numero cle pruebas cle RCP necesarios para cada muestra clínica. Recientemente, se ha descrito la construcción de una cepa de M. smegmatis, que contiene un fragmento modificado /S6110 integrado al genoma. Esta cepa de M. smegmatis modificado es capaz (le servir como un control interno efectivo para supervisar la eficacia de la extracción cel ADN y detectar la presencia de inhibidores del RCP. La gran ventaja de las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos, sobre el cultivo es la velocidad con la cual el diagnostico puede ser hecho. A ciferencia de la microscopia, el Mycobacterium infectante puede ser directamente identificado.

OBJETIVOS O B J E N O GENERAL: l.Evaluar la utilidad de la Reacción en Cadena de la Polimerasa corrio herramien:a

para el diagnóstico de la tuberculosis

OBJETIVOS ESPECIFICOS:

1. Detectar el agente causal de la tuberculosis por el método de RCP a partir de muestras clínicas.

2. Establecer la sensibilidad y especificidad del RCP en el diagnóstico de la tuberculosis.

3. Comparar la utilidad diagnóstica del RCP con los métodos de laboratorio habituales (microscopía y cultivo).

HIPOTESIS Dada la problemática en cuanto a sensibilidad, especificidacl y velocid~~d diagnóstica, aportada por las pruebas tradicionales de laboratorio, es posible utilizar las técnicas de biología molecular, como la Reacción en Cadena de la Po'imerasa, pai-a obviar tales dificultades en el diagnóstico de Tuberculosis Pulmonar.

MATERIALES Y METODOS POBLACION Se procesaron 31 muestras de esputo, de pacientes de ambos sexos, sin distinción de raza y edades comprendidas entre los 17 y 80 años, con manifestacionirs clínicas, hallazgos radiológicos y10 datos epidemiológicos sugestivos cle tuberculosis pulmonar. Las mismas se obtuvieron de individuos procedentes del área (le hospitalización de Neumonología y de la consulta de tisiología del Hospital General cel Sur de Maracaibo, el cual es Centro de Referencia Regional para el diagnóstico de esta enfermedad. Se excluyeron de este estudio individuos con diagnóstico establecido (le tuberculosis o que estén recibiendo quimioterapia o profilaxis anti TBC. METODOLOGIA. 1. Examen directo: A todas las muestras, se les practicó examei microscópi:~

directo (baciloscopia) utilizando la técnica de coloración de Ziehl-Neelsen. Para lo cual se tomó como referencia el Servicio de bacteriología tiel laboratorio del Hospital General del Sur de Maracaibo. 2. Cultivo: Se utilizó el medio de cultivo Ogawa-Kudoh como estándar para la

siembra de las muestras de esputo. La siembra se realizó er el Laboratorio de HLA e Inmunogenética del Banco de Sangre de Marscaibo, en una campana de flujo laminar y utilizando el procedimiento de dei;contaminación de la muestra por el método de Kudoh: 1. Impregnar un hisopo estéril con la muestra de esputo. 2. Introducirlo en un tubo con 3 ml de NaOH al 4%, dejarlo durante 2

minutos, retirarlo con cuidado sin tocar las paredes del tubo.

'9 3. Sembrar con este hisopo en un tubo de medio Ogawa-Kudoh, rotando

el hisopo por toda la superficie del medio. 4. Repetir el procedimiento y sembrar en otro tubo de inedio OgawaKudoh. Los cultivos se incubaron a 37 grados centígrados en estufa de incubaciOn (Precision Scientific C . 0 ) y con las tapas ligeramente flojas los dos primeros días y luego se cerraron. Los cultivos se revisaron a los 4, 8, 15, 30 y 60 días y se hicieron registros de tiempo de crecimiento de los mismos. No se practicó análisis e identificación bioquimica de los cultivos obteriidos. 3. Obtención de ADN a partir de esputo: Tanto la extracción del ADN como la

amplificación del mismo, se practicó en el Laboratorio de HLA, Inmunologízi y Genética del Banco de Sangre del Estado Zulia. Se utilizarori las siguientes soluciones base: Hidróxido de sodioIN-acetil-L-cisteína: NaOH 2% y 0.59; de N-acetil.-Lcisteína y 1.45% de citrato de sodio. Se disuelven 2 g cle NaOH, 0.5 g de N-acetil-L-cisteína y 1.45 g de la sal dihidratada de citrato de sodio en 100 ml de agua. Guardar a 4OC hasta por una semana. Solución de acetato de sodio 3 M: Disolver 4.08 g de a~zetatode sodic trihidrato en agua destilada. Ajustar el pH a 5.2 con ácido acétic:~. Completar con agua hasta 10 ml. Fenol:Cloroformo:Isoamílico (2524: 1 vlv): Mezclar 25 artes de feiiol equilibrado (en 150 mM NaCI, 50 mM Tris HCI, pH 7.5, 1 mM ED7-A:'

20 con 24 partes de cloroformo y una parte de alcohol isoarnílico. Guarcar a 4OC no más de 6 meses. Cloroformo:lsoamílico (24:l vlv): Guardar a 4°C en una botella o s a r a no más de 1 mes. Procedimiento: 1. Tomar 2 ml de la muestra clínica y diluir en un volurren igual de la mezcla hidróxido de sodio1N-acetil-L-cisteínalcitrato de sodio. Agitar por 15 minutos en un tubo con tapa de rosca de 15 ml. 2. Centrifugar a 4000 rpm por 15 minutos en centrífuga con tapa (le seguridad para evitar contaminación. Descartar con mulzho cuidado el sobrenadante en una solución de hipoclorito al 4%. 3. Añadir un volumen igual de TrisIHCI 50 mM pH 8.3 y lavar el sedimento centrifugando de nuevo a 4000 rpm poi- 15 minutcs. Descartar el sobrenadante en una solución de hipocloritcl al 4%. 4. Agregar al sedimento 100 ml de amortiguador TE IX y dividirlo en dos alícuotas

en un tubo con tapa de rosca. Marcar adecuadamente

ambas muestras. Hacerlo por duplicado. Incubar a 100°C por :!O minutos. 5. Añadir 10 p I de proteinasa K y SDS a una concentracitjn final de 250 pglml y 1% respectivamente. Incubar por 1 hora a 65°C o toda la noche a 37°C. lnactivar la proteinasa K al calentar la mezcla cfe incubación por 20 minutos a 100°C. 6. Extraer

el

ADN

con

un

volumen

igual

de

la

mezcla

fenollcloroformolisoamílico a mezclar vigorosamente en iin agitador.

:! 1

7. Centrifugar a 12.000 rpm por 10 minutos, tomar la fase ;acuosa de 1fiO

en 150 p1 y pasarla a un tubo limpio

8. Extraer

nuevamente

la

fase

acuosa

con

iina

solucitjn

cloroformo/isoamílico y repetir el pasos 6 y 7. 9. Ajustar la molaridad de la fase acuosa obtenida a 0.3 M de acetato (le

sodio y precipitar el ADN con 0.6 volúmenes de isoprclpanol a -2OCC por al menos 1 hora 10. Centrifugar la suspensión a 12.000 rpm por 15 minutos. 11. Lavar el sedimento obtenido con etanol al 70%. 12. Dejar secar el sedimento a temperatura ambiente o utilizando vacío 13. Resuspender el sedimento en amortiguador TE (50-100 JI) 14. Hacer una dilución 1: 10 de ADN obtenido. 4. Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP): Los objetivos para el ensayo

de RCP fueron los genes que codifican la proteína de 32-KDa y la secuenc:ia de inserción IS6110. Para la amplificación del elemento de inserción IS617 0, fueron desarrollados primers específicos (IS5 - IS6) utilizanclo el prograria de computación Oligo versión 4.0. IS5 (5'CGGAGACGGTGCGTAAGTGG) e IS6 (5'GATGGACCGCCAGGGClTGC). También se desarrollaron prim~rs específicos (MTI y MT2) MTI (5'TTCCTGACCAGCGAGCT(3CCG) y MT2

(5'CCCCAGTACTCCCAGCTGTGC); para amplificar el gen que codifica el antígeno alfa 32-KDa (5) presente en todas las micobacterias descritzis. Todas las reacciones se realizaron en un volumen final de 50 p1 contenienjo 100 ng de ADN purificado, buffer de reacción 1 X, 2.5 U de Taq polimerasa, 0.2 mM de cada desoxynucleótido trifosfato, 15 pmol de IS5 - IS6, 10 pmol .de

22 MTI - MT2. La reacción fue llevada a cabo en un termociclador automatizado MJ Research Inc. Las muestras fueron desnaturalizadas a 94°C: por 5 minutos y se practicaron 35 ciclos de amplificación. Los ciclos consistieron en

desnaturalización a 91"C por 1 minuto, alineación a 71"C por 30 segundos y extensión a 72°C por 2 minutos. Después de lo cual las muestras fueron incubadas por 10 minutos a 72°C. Se establecieron controles positivos y controles negativos de la reacción. 5. Verificación de la ampliación: Después de la amplificaciói, 10 pI de la mezcla la reacción fue analizada por electroforesis con gel de 2garosa al 1%. El gel corrió a 80V por 2 horas. Los productos amplificados fueron teñidos con bromuro de ethidio (0.5 pglml) y fueron visualizados por transiluminacijn ultravioleta a 302 nm. Los fragmentos producidos por RCP fuerm identificados por comparación con un marcador de peso molecular (Ladcrer

PromegaB 100 pb).

RESULTADOS Microscopía Directa:

De las 31 muestras de esputo examinadas por el método de Zielil-Neelsen, 19 resultaron positivas (BK +) y 12 resultaron negativas (BK -). Lo cual ,-epresenta Ln porcentaje de 61.29% y 38.71% respectivamente. Tabla 1 Distribución de muestras de esputo. Baciioscopia

BK

Positivo %

Negativo OYÓ

Total %

Total

19 (61.29)

12 (38.71)

31 1100)

F.I.: Laboratorio de Bacteriología. Hospital General del Sur de Maracaibo. Cultivo:

Utilizando como estándar el medio de cultivo Ogawa

- Kudoh, se sembrarcm

todas las muestras de esputo. De las 31 muestras sembradas 19 (61.2!3%) resu1tarc)n positivas y 12 (38.71%) fueron negativas al cultivo. Tabla 2 Distribución de muestras de esputo. Cultivo

CULTIVO

Positivo %

Negativo %

T.3tal %

Total

19 (61.29)

12 (38.71)

3' (100)

F.I.: Laboratorio HLA e Inmunogenética. Banco de Sangre de Maracaibo RCP:

Cuando se amplificó el ADN obtenido a partir de las muestras de esputo utilizando los primers específicos IS5 - IS6, se visualizó claramente en la electroforesis en gel de agarosa,

un fragmento de 984 pares de basas correspondiente a la

24 secuencia de inserción IS6110. Utilizando los primers MTI y MT2, se observó un fragmento de 506 pares de bases, correspondiente al antígeno alfa 32-KCla. (Fig. 2)

FIGURA 2

FIG.2. Amplificación de secuencias correspondientes al fragmento de inserción IS6110 (984 pb) y al antígeno alfa 32 KDa (506 pb). L= marcador de peso molecular Ladder Promega 100 pb. C+ control positivo. C- control negativo. Líneas 1 - 9 pacientes en estudio

2U

FIGURA 3

Fig. 3. Sistema RCP en gel de agarosa correspondiente a todos los pacientes en e:;tudio. Productos amplificados y teñidos con bromuro de ethidio. C+ contro posti\ro. L marcacor de Pm

De todas las muestras amplificadas, 22 (70.96%) mostraron

12

presencia de

fragmentos de ADN correspondientes tanto a la secuencia de inserción 6 6 110, como al antígeno alfa 32 KDa. Mientras que en 9 (29.04%) no se detectó la presencia de ACIN micobacteriano por el método de RCP. Tabla 3 Tabla 3 Distribución de muestras de esputo. RCP

RCP

Positivo %

Negativo O h

Total %

Total

22 (70.96)

09 (29.04)

31 (100)

F.I.: Laboratorio HLA e Inmunogenética. Banco de Sangre de Maracaibo Cuando se relacionaron los hallazgos obtenidos en la microscopía, cultivo y RCP, se obtuvieron los siguientes resultados:

Tabla 4 Relación Prueba BK y Cultivo

Cultivo

Cultivo

Positivo

Negativo

BK Positivo

18

1

19

BK Negativo

1

11

12

T o t I~

Total F.I.: Laboratorio HLA e Inmunogenética. Banco de Sangre de Mas-acaibo En nuestro estudio se utilizó como estándar de oro el cultivo para determinar la sensibilidad y especificidad de la pruebas BK y RCP. Del total de muestras estudiadas, se obtuvo 1 cultivo positivo proveniente de u i a baciloscopia negativa, el resto de los cultivos positivos (19), también fueron positivos. a la baciloscopia. Sólo se obtuvo un cultivo negativo proveniente de u r a baciloscopia positiva, el resto de los cultivos negativos ( I I ) , también fueron riegativos a la baciloscopia

De esta manera, puede decirse

que la sensibilidad del BK

es clel

94,74%, mientras que la especificad se estima en 91,67%. También es factible concl ir que la capacidad predictiva de resultados positivos del BK respecto al cultivo es clel 94,74% mientras que la capacidad predictiva de resultados negativos e> de 91,67 O h En forma análoga, al relacionar la prueba RCP con respecto a 1 ci~ltivose tiene:

Tabla 5 Relación Prueba Cultivo y RCP

Cultivo Positivo

Cultivo Negativo

T'otal

RCP Positivo

19

3

22

RCP Negativo

O

9

9

Total

19

12

31

F.I.: Laboratorio HLA e Inmunogenética. Banco de Sangre de Maracaibo.

De las 22 amplificaciones positivas, 3 resultaron negativas al cultivo y el resto de las amplificaciones positivas (19) fueron también positivas al cultivo. Mientras que de las 9 amplificaciones negativas obtenidas ninguna resultó positiva al cultivo. Luego se

puede concluir que la sensibilidad de la prueba RCP es del 100% y su especificidad es del 75%. Además, la capacidad predictiva positiva de la prueba RCP respecto al cultivo es de 86.4% mientras que su capacidad predictiva de resultados negativos es del 100%. A los mismos resultados se llega al relacionar los datos de la prueba RCP y la prueba de cultivo.

DISCUSI~N La Tuberculosis, en los actuales momentos, sigue siendo un prol~lemade salud pública a nivel mundial. Se requiere de un diagnóstico precoz y específico principalmente en las formas extrapulmonares, infección tuberculosa en iiiños infeccior micobacteriana en pacientes VIH y formas cerradas muy poco bacilífercis, en donde la microscopía y el cultivo tienen grandes limitantes. El rango de sersibilidad de lo baciloscopia, oscila entre 50 - 80% y la especificidad es virtualmente del 100% (33). El cultivo es una técnica que tiene mayor sensibilidad (70-90%) (35). El aislamiento de las micobacterias por cultivo es entorpecido por su lento crecimiento. Un promedio de incubación de 4 semanas en medios convencionales se requiere antes que pueda ser detectado crecimiento. De tal manera que en casos en los que se requiera una toma 3e decisiones rápidas para instaurar una terapéutica efectiva su valor es muy limitatlo. (33,35,47). La RCP ha mostrado ser una herramienta muy útil para el diagnóstico de tuberculosis (2). En la actualidad se han desarrollado varios ensayos de RCP, para la detección de M. tuberculosis a partir de muestras de esputo mostrando cliversos grados de sensibilidad y especificidad (2,7,11,13,18,21,41,42). Nosotros realizamos un estudio prospectivo en donde nos propusiinos evaluar la utilidad de la RCP para el diagnóstico de tuberculosis pulmonar, comparándola con las técnicas bacteriológicas habituales, como la baciloscopia y el cultivo. Al analizar los resultados obtenidos entre la baciloscopia y el cultivo, encontram~s que la sensibilidad de la baciloscopia fue del 94,74%, mucho mayor que la reportada ?n los trabajos publicados por Gording y colaboradores (33). Esto probablemente s~?a debido al hecho que los resultados de la baciloscopia dependen sustanc;ialmente de la carga bacilar de la muestra y nuestros pacientes fueron seleccionados previamente For

2S hallazgos clínicos y radiológicos sugestivos de tuberculosis pulmonar, por lo que es de esperar que las baciloscopias sean consistentemente positivas en estos pacientes. El mismo fenómeno se observó en el caso de los cultivos. Apreciamos uria baciloscol~ia positiva con un cultivo negativo. Al estudiar la historia clínica de este paciente (No. 7) nos encontramos que se encontraba recibiendo tratamiento antituberculoso para el momento de la toma de la muestra. Por lo tanto este fenómeno puedlz deberse a la presencia de bacilos inviables o muertos que son incapaces de crecer eri los medios rle cultivos. Este paciente igualmente resultó positivo cuando se le practicj amplificacijn de ácidos nucleicos, ya que esta prueba detecta la presencia del ADN mii;obacteriano Encontramos que la sensibilidad de la RCP en nuestro estudio fue virtualmente clel 100% y la especificidad fue del 75%. Sin embargo algunos estudiosmreportan uiia sensibilidad relativamente más baja, como Andersen y cols. (2) y Cohen y colaboradores (13), quienes encontraron sensibilidades para sus ensayos de RCP (le 63 y 73% respectivamente. La RCP es una técnica que requiere una estandarizaci(jn minuciosa para evitar los problemas de la contaminación. Estas bajas sensibilidades encontradas por estos autores pudieran explicarse por condiciones subjptimas de la prueba. Los resultados de este estudio pueden compararse con 'os resultados obtenidos por Shah y colaboradores (61), quienes obtuvieron sensibilidsdes similares utilizando la prueba Amplicor de Roche. Cuando comparamos los resultados de la amplificación de ácidos niicleicos con el con el cultivo observamos que la sensibilidad de la PCR fue mayor que las técnicas bacteriológicas tradicionales. Todos los pacientes con baciloscopias posii:ivas y cultivc)~ positivos, resultaron también positivos cuando se aplicaron las técnicas dci amplificacicln de ácidos nucleicos. En tres pacientes con examen directo y cultivo negativo la RCP fue positiva. Por lo tanto la RCP puede considerarse una herramienta muy útil para

21

30 diagnóstico de tuberculosis pulmonar, con sensibilidades mayores que las pruebas bacteriológicas rutinarias. Todas las amplificaciones positivas mostraron las bandas correspondientes a las secuencias objetivo: una banda de 506 pares de bases, que corresponde a la secuencia de bases que codifica a la proteína de 32 KDa, llamada antígeno alfa, el cual está presente en todas las micobacterias (incluyendo Complejo M. tubercu1o:;is y M. leprzie)

(5). Y otra banda de 984 pares de bases, que corresponde a los genes que codificar1 a la secuencia de inserción IS6110, el cual es específiw para el Complejo M. tuberculosis,

que

incluye

el

mybacterium

tuberculoso

humario

y

bovino

(21,37,41,42,63,65). Estos resultados coinciden con los realizados por Borremanc y colaboradores (5) quienes lograron clonar la secuencia genómica de la proteína de 32 kilodalton de M. tuberculosis. En el mismo orden de ideas nuestro esti~dioconcuerda con los resultados alcanzados por Hermans (37), Kox (42), T. D. Mchugti (63), Thierrl y colaboradores (65) quienes hallaron que la amplificación secuencizi de inserción IS6110, a partir de muestras clínicas, permite identificar infecciones producidas por el Complejo M. tuberculosis, con mucha mayor sensibilidad y especificidad que el examen directo y el cultivo. Sin embargo recientes reportes han demostrado que existen algunas cepas de M. tuberculosis que no poseen la secuencia IS6110 en sus genomas (73). Así, el uso de métodos de RCP basados en IS6110 pueden conducir a resultados falsos negativos. Por otra parte, métodos de RCP basados exclusi\~amenteen la secuencia IS6110, no discriminan entre M. tuberculosis y otras micobacterias del Complejo M. tuberculosis (66). En otras muestras clínicas la RCP ha mostrado resultados variables. En derrame pleural tuberculoso, la RCP tiene una sensibilidad de 20-80% (dependiendo de la secuencia genómica amplificada y el procedimiento utilizado en la extracción del ADN) y

31

una especificidad de 78-100% (25). Un estudio español reciente, demostró un 81% de especificidad y una 98% de sensibilidad para la RCP cuando se utilizó un segmento de 126 pares de bases de

M. tuberculosis,

en la evaluación de derrame pleural (68). La

RCP es positiva en el 100% de los cultivos positivos de Iíquido pleural y solo en 30-60% de los cultivos negativos de líquido pleural (25). En el caso de meningitis tuberculosa, la RCP ha mostrado una sensil:,ilidad del 75% y una especificidad del 94% en Iíquido cefalorraquídeo, cuando se uliliza la IS6110 como objetivo de amplificación (4) (59). En el presente estudio, demostramos que el uso de las técnicas de amplificación Ae ácidos nucleicos, como la RCP, basadas en la amplificación simultánea cel elemento Je inserción IS6110 y del gen que codifica el antígeno alfa en un solo paso pueje identificar infecciones por micobacterias a partir de muestras de esputo. En conclusión los resultados presentados demuestran que esta tcknica es m i s sensible que los procedimientos bacteriológicos de rutina (examen directl:, y cultivo) y la convierten en una herramienta muy poderosa para el diagnóstico cle tuberculo:;is pulmonar y otras enfermedades micobacterianas. Según el reporte de MMWR 49(26):593-594,2000 (11), las pruebas da amplificaci(5n de ácidos nucleicos indudablemente aumentan la rapidez diagnóstica, pero ellas, hasta la actualidad, no reemplazan el examen directo del esputo o el cultivo niicobacteriaro, esencial para la identificación del microorganismo (las pruebas de amplificación sclo dan resultados para el Complejo M. tuberculosis), así como para la realización cie pruebas de sensibilidad a antimicrobianos. Tampoco reemplazan el juicio clínico. Su especificidad es muy variable entre diferentes laboratorios. Además las pruebas (le amplificación de ácidos nucleicos frecuentemente permanecen positiva:; después que los cultivos se hacen negativos durante la terapia y pueden permanecer positivas

32 incluso después de finalizar la terapia antituberculosa. Por lo tanto las pruebas de amplificación de ácidos no sustituyen a las pruebas bacteriológicas tradicionales para el diagnóstico de la tuberculosis. No se recomienda utilizarlas en forma r~tinariapara el diagnóstico de la enfermedad, sino dependiendo del contexto clínico, epidemiológicc) y radiológico del paciente. Parece ser que sus principales aplicaciones se presentan cuando las pruebas bacteriológicas tradicionales no establecen iin diagnóstico concluyente, en el momento de tomar decisiones terapéuticas inmediatas (meningitis tuberculosas) y en los casos de tuberculosis infantil o asociada a SIDA.

CONCLUSIONES

1. En nuestro estudio la sensibilidad del BK fue del 94,74%, rriientras que la especificad se estima en 91,67%. 2. La sensibilidad de la prueba RCP es del 100% y su especificidad es del 75%. 3. El uso de las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos, zomo la RCP,

basadas en la amplificación simultánea del elemento de inserciói IS6110 y clel gen que codifica el antígeno alfa en un solo paso puede identificar infeccionss por micobacterias a partir de muestras de esputo. 4. La RCP es una herramienta muy Útil y poderosa para el cfiagnóstico de tuberculosis pulmonar y otras enfermedades micobacterianas.

RECOMENDACIONES

1. Utilizar en forma rutinaria las técnicas de amplificación de ácidos n~cleicosen los

siguientes casos: Formas cerradas de tuberculosis poco bacilíferas: tuberc:ulosis infan2:il, tuberculosis extrapulmonar, tuberculosis en infectados por VIH o ctn pacientes muy debilitados o ancianos. Necesidad de diagnóstico precoz para instaurar terapéutica inmediata (meningitis tuberculosa) Duda diagnóstica: baciloscopia y10 cultivo negativo con hallgazgosclínicos, epidemiológicos y10 radiológicos sugestivos de tuberculosis. 2. lmplementar objetivos de amplificación más específicos que permi.tandiscriminar

entre las diferentes especies del Complejo M. tuberculosis (bacilo tuberculo!;~ humano y bovino). 3. Realizar estudios de epidemiología molecular a partir de los meclios de cultivo,

como el DNA Fingerprinting y el Spoligotyping, los cuales permiten la identificación de cepas individuales del Micobacterium tuberculosi:; y por lo tanto identificar pacientes infectados por una fuente común y de esa rnanera trazar, identificar y controlar fuentes y vías de transmisión e investigar brotes definidos. Así el futuro en la erradicación de la tuberculosis está en la identificación de las fuentes de infección a través las técnicas de epidemiología molecu'ar.

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2000.

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