Transferencia de Tecnología y Mejora de la Competitividad del Sector Corchero del Espacio SUDOE

Valoración enológica del tapón de corcho: reducción de organoclorados y aportación de compuestos positivos al vino

Valoración enológica del tapón de corcho: reducción de organoclorados y aportación de compuestos positivos al vino Autores:

ANTONIO PALACIOS GARCÍA



JOSÉ IGNACIO SAN ROMÁN



JORDI ROSELLÓ



MIQUEL PUXEU



Juan-josé r. coque



SERGIO MOUTINHO

Coordinación:

Jordi Roselló

Primera edición: Junio 2015 © texto: los autores © edición: VITEC - Parc Tecnològic del Vi Diseño gráfico: Gràficament ISBN: 978-84-606-9209-6 DL T 904-2015

Índice Introducción................................................................................................................................ 5 El problema del olor a moho del vino......................................... 7 Antonio Palacios García  y José Ignacio San Román Estudio del origen del 2,4,6-tricloroanisol (Tca) en el corcho................................21 Jordi Roselló, Miquel Puxeu  y Juan-José R. Coque Symbios: un proceso de cocido del corcho capaz de inhibir el desarrollo de sustancias causantes de desviaciones organolépticas................ 35 Sérgio Moutinho Estudio del perfil sensorial de los tapones de corcho natural para vinos tranquilos.............................47 Jordi Roselló, Miquel Puxeu y Juan-José R. Coque

Introducción La presente publicación ha sido elaborada en el marco del proyecto SUBERVIN, cuyo objetivo final es la mejora de la competitividad, el valor añadido y el posicionamiento internacional del sector corchero. La cadena corchera tiene un cliente fundamental, la industria vitivinícola, principal destino de sus productos. La pérdida de cuota de mercado del tapón de corcho frente a los cierres alternativos implica la necesidad de valorizar la industria corchera, que trasmite en su producto una serie de valores añadidos de respeto por el medio ambiente y responsabilidad social. El proyecto pretende poner al alcance de los enólogos datos objetivos y útiles sobre el beneficio del uso del tapón de corcho, y reenfocar el conocimiento existente sobre la relación corcho-vino para poner en valor los aspectos positivos sin perder de vista el objetivo de minimizar las debilidades. Los compuestos organoclorados, presentes ocasionalmente en el corcho, constituyen un reto de mejora para las empresas del sector corchero. El olor a moho es una desviación aromática causada por diferentes compuestos presentes o no en el corcho y que pueden transferirse al vino después del embotellado, provocando ciertos aromas desagradables, frecuentemente descritos como hongo, húmedo, tierra mojada. El interés 5

INTRODUCCIÓN

por el estudio del olor a moho y las causas que lo provocan se justifica por las incidencias económicas que conlleva al sector vitivinícola y al propio sector corchero. Los tres primeros capítulos de la presente publicación abordan el complejo problema de la presencia de organoclorados en el corcho desde tres distintos puntos de vista. En el primero se presenta el problema haciendo especial hincapié en el impacto sensorial del TCA en humanos. En el segundo capítulo se estudia el origen de TCA en el corcho a partir del análisis de otros compuestos organoclorados que aparecen simultáneamente. En el tercer capítulo se expone el método Symbios, un método preventivo que inhibe la formación de organoclorados en el corcho. En el último capítulo se determina el perfil aromático de tapones de corcho natural a partir de la detección de los compuestos positivos presentes en el corcho y que pueden contribuir a la calidad sensorial de los vinos. El análisis de los compuestos volátiles del corcho proporciona una extensa lista de compuestos que pueden tener efecto positivo sobre el vino. Muchos de estos compuestos son sustancias aromáticas de origen natural y en muchos casos provienen de la degradación de los polímeros que componen el corcho. El origen geográfico del corcho puede condicionar su concentración en el tapón acabado, pero también las técnicas utilizadas para el procesado; el cocido del corcho provoca, entre otros efectos, un aumento significativo de la concentración de vainillina. El corcho contiene también una gran cantidad de compuestos fenólicos de bajo peso molecular, principalmente aldehídos fenólicos, ácidos y taninos elágicos, presentes también en la madera de roble y que juegan un importante papel en los cambios producidos durante el envejecimiento. La presente publicación aporta datos objetivos sobre la calidad del corcho con el objetivo de conseguir que el enólogo vea en el corcho una herramienta a su disposición en el proceso de elaboración y mejora organoléptica de sus vinos.

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EL PROBLEMA DEL OLOR A MOHO DEL VINO y

Antonio Palacios García  José Ignacio San Román

EL PROBLEMA DEL OLOR A MOHO DEL VINO Antonio Palacios García1 y José Ignacio San Román2 1

Laboratorios Excell Ibérica, C/ Planillo nº 12, Pabellón B; 26006 Logroño, España, www.labexcell.com. E-mail: [email protected]

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Departamento de Fisiología y Farmacología, Universidad de Salamanca. Edificio Departamental, Campus Miguel de Unamuno. 37007 Salamanca, España.

Introducción Entre los cloroanisoles identificados como fuente de defectos de carácter “enmohecido”, el TCA es uno de los contaminantes más importantes. En el campo del vino y los espiritosos, la presencia de 2,4,6-tricloroanisol (TCA) ha sido mayoritariamente asociada a problemas de contaminación de los tapones de corcho, conocido como “sabor a corcho” y mejor denominado como “olor a moho”, como reza el título del capítulo. El origen de TCA en el corcho ha sido objeto de un gran número de investigaciones y existen numerosas publicaciones acerca de los diferentes orígenes posibles del 2,4,6-triclorofenol (TCP), el precursor directo de TCA, en las planchas y en los tapones de corcho. Las condiciones de transformación del TCP en TCA por la microflora de corcho son bien conocidas. También han sido ya más o menos elucidadas las condiciones de formación de estos contaminantes organohalogenados en el entorno forestal o durante el ciclo de fabricación de los corchos. Además, las condiciones de migración de TCA en el vino se conocen a la perfección y se han desarrollado técnicas analíticas de TCA como instrumentos rutinarios de control de calidad en la compra y uso de corchos en bodega. Por otra parte, los casos de contaminación de vinos y espirituosos por TCA sin contacto con corcho contaminado son menos frecuentes, pero relativamente fáciles de encontrar. En este artículo se podría poner en evidencia cientos de casos en la industria vitivinícola mundial con la existencia de defectos olfativos en diferentes vinos de carácter “enmohecido” que han sido comunicados por la madera de roble de 8

Antonio Palacios García y José Ignacio San Román

las barricas durante la crianza, o por materiales intrínsecos o extrínsecos de bodega que actúan como vectores indirectos a través del ambiente o directos cuando actúan por contacto. Incluso podríamos relatar casos donde el vehículo del contaminante es la propia agua utilizada para la limpieza de la bodega, bien sea procedente de pozos o fuentes naturales, o en algunos casos, del agua municipal contaminada por halofenoles y haloanisoles. Los problemas ambientales se concentran principalmente en las salas de crianza y maduración del vino. Ello se debe a que éstas cuentan, generalmente, con menor ventilación y estructuras de soporte de barricas y botellas de madera. Esta situación es especialmente preocupante, ya que en estas salas se guardan aquellos vinos que requieren mayor inversión, que se dirigen a mercados más exigentes y de los que se espera obtener mayores ingresos económicos. Existe una seria condición de riesgo para estos vinos, ya que la contaminación ambiental se adsorbe y concentra en materiales porosos y plásticos de uso corriente en bodega, tales como maderas de construcción, muros, pisos, maderas de roble (barricas, duelas, chips), bentonita, tierras de filtración, tapones de corcho y de silicona, cartones, ladrillos, mangueras, etc., que al estar en contacto directo o indirecto con el vino lo alteran. A veces no se trata solo de TCA, sino de 2,4,6-tribromoanisol (TBA), más propio de contaminación ambiental.

¿Es un problema exclusivamente del vino y las bodegas? A lo largo de la historia culinaria, los consumidores han visto alteradas las propiedades positivas de ciertos alimentos por la presencia de sustancias que generan mal sabor y que pueden reducir drásticamente la palatabilidad de los alimentos y bebidas. Debido a que algunos de estos contaminantes aparecen en concentraciones muy bajas, la identificación de las sustancias responsables se ha visto muy limitada a nivel científico. Uno de los compuestos más potentes identificado hasta la fecha como responsable de mal sabor es el 2,4,6-tricloroanisol (TCA), conocido específicamente por la inducción del llamado defecto de “olor a moho” en vinos. Pero no, con seguridad el vino no es la única víctima. Curiosamente, el TCA también se encuentra en manzanas, pasas, pollo, camarones, cacahuetes, nueces, sake, té verde, cerveza y el whisky, entre otros, además de en varios productos envasados. Por ello, la industria alimentaria debería prestar especial cuidado para evitar esta contaminación. Sin embargo, esto no ha sucedido por el momento, ni se toma 9

EL PROBLEMA DEL OLOR A MOHO DEL VINO

Figura 1: típica caja de madera de fruta con manzanas con potencial contaminación por anisoles.

en consideración el deterioro organoléptico que sufren los alimentos contaminados que, por lo tanto, se ven privados de sus cualidades sensoriales características. También son muchos los lugares públicos, como hoteles, restaurantes, hospitales, almacenes de ropa y otros establecimientos de diversos negocios, que deberían plantearse si uno de los elementos que pueden determinar un fracaso empresarial es ese aroma a “húmedo” y a “serrín mojado” que invade de forma permanente el local, y al que terminas acostumbrándote e incluso acaba “desapareciendo” cuando sufres exposiciones continuadas, pero que rompe el bienestar sensorial de quien de repente llega al establecimiento y nota algo extraño, sin prestar mucha atención, pero que incomoda por el recuerdo a moho.

Fisiología del impacto sensorial del TCA en humanos A lo largo de la historia de la humanidad, se han propuesto numerosas clasificaciones de los diferentes olores, todas las cuales tienen algo en común: ninguna es convincente. Tal vez el intento más acertado, a pesar de su simplicidad, se lo debemos al filósofo Platón, quien clasificó los olores en agradables y desagradables. Si nos atenemos a esta clasificación, es evidente que el TCA es una sustancia con olor, y que este olor es desagradable. Así, el TCA disuelto el agua pura (incolora, insabora e inodora) es fácilmente reconocible por su olor mohoso, a partir de una determinada concentración umbral, típicamente más alta en la población en general (8-9 ng/L) que en catadores entrenados (3-4 ng/L). De acuerdo con esto, la presencia de concentraciones elevadas (por encima del umbral) de TCA en un vino arruinará sus características organolépticas, como consecuencia de su mal olor característico. Este escenario relativamente simple, según el cual el 10

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vino se echa a perder por el mal olor del TCA, podría en realidad ser mucho más complejo, tal y como ha publicado muy recientemente un grupo de investigación japonés en la prestigiosa revista científica Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. Pero para comprender bien cuál podría ser el efecto completo del TCA sobre el vino merece la pena que empecemos haciendo un breve repaso del funcionamiento del sentido del olfato. Todo receptor sensorial debe ser considerado, desde el punto de vista fisicoquímico, como un transductor de energía, es decir, son estructuras que captan un determinado estímulo y convierten su energía natural en cambios de potencial eléctrico en la membrana plasmática de la célula receptora, el único “lenguaje” que utiliza nuestro sistema nervioso. Los receptores olfatorios pertenecen al gran grupo de los quimiorreceptores, que informan al sistema nervioso central acerca de la presencia en el medio de determinadas sustancias químicas. Así, el olfato es un sistema de detección química de sustancias volátiles, presentes en el aire respirado y que, a diferencia de otros quimiorreceptores (por ejemplo, los que controlan la cantidad de glucosa en la sangre), da lugar a una serie de sensaciones conscientes. Los receptores olfatorios son neuronas diferenciadas, localizadas en la parte superior de la cavidad nasal, en concreto en el denominado epitelio olfatorio, en cuya superficie, típicamente cubierta de mucus, estas células tienen una serie de cilios, que son el lugar en el que se lleva a cabo la interacción entre las moléculas de la sustancia odorífera y la neurona receptora. Estas mismas neuronas tienen un axón, relativamente corto, que asciende y penetra en el interior del cráneo a través de la lámina cribosa del hueso etmoides, y hace sinapsis con

Figura 2. Esquema de la localización y ultra estructura del epitelio olfatorio en humanos. 11

EL PROBLEMA DEL OLOR A MOHO DEL VINO

neuronas secundarias de la vía olfatoria en los denominados bulbos olfatorios, parte ya del encéfalo (Figura 2). El conjunto de axones de estas neuronas forman el denominado nervio olfatorio. En la membrana de los cilios, estas neuronas poseen una gran variedad de receptores de membrana, proteínas que reconocen de manera específica las diferentes sustancias odoríferas. Tras la unión de la molécula con su receptor, se desencadenan fenómenos de señalización intracelular, que típicamente se inician por activación de una proteína G heterotrimérica, que a su vez es responsable de la activación de la adenilil ciclasa, una enzima ligada a la membrana, que cataliza la síntesis del mensajero intracelular AMP cíclico (cAMP) a partir de ATP (Figura 6). El siguiente acontecimiento en el proceso de transducción consiste en la unión de este cAMP a la porción intracelular de canales catiónicos inespecíficos, conocidos como CNG (Cyclic Nucleotides-Gated channels), promoviendo su apertura. Aunque hay muchas dudas acerca de las concentraciones extracelulares de cationes en el mucus que recubre los cilios (muy probablemente sean muy variables), la apertura de estos canales CNG implica necesariamente la entrada a la célula de cargas positivas, en forma de iones Na+, Ca2+ y, probablemente, algo de K+ que, en su conjunto, van a provocar la despolarización de la membrana plasmática. Secundariamente, la entrada de Ca2+ provoca un incremento de la concentración citosólica de este catión, que será ahora capaz de unirse y activar a otro tipo de canales, en este caso aniónicos, los CACC (Calcium-Activated Chloride Channels), por los cuales saldrá Cl−; esta salida de cargas negativas contribuye también a la despolarización de la membrana (Figura 3). Si la despolarización de la membrana de los cilios es lo suficientemente intensa, la neurona olfatoria producirá potenciales de acción, que se propagarán sin decremento a través de toda la membrana plasmática, incluyendo por supuesto la del axón, enviando así el correspondiente mensaje al sistema nervioso central e informándole de la presencia de esa sustancia odorífera en la cavidad nasal.

Figura 3. Esquema del proceso de transducción sensorial en receptores olfatorios. 12

Antonio Palacios García y José Ignacio San Román

Como apuntábamos antes, el grupo de investigación del Prof. Kurahashi, de la Universidad de Osaka, ha publicado recientemente unos resultados experimentales que supondrían, de confirmarse, un cambio radical en la forma en la que debemos considerar las acciones del TCA sobre el sentido del olfato. Utilizando como modelo experimental neuronas olfatorias de salamandra, cuyo tamaño es muy superior a las de mamífero, lo que facilita su manejo en el laboratorio, y métodos electrofisiológicos, en concreto la técnica de patch-clamp o “pinzamiento de membrana”, estos autores han puesto de manifiesto un potente efecto inhibidor del TCA sobre el flujo de cationes a través de los canales CNG, que se mantendría durante cerca de 1 minuto tras la exposición a esta sustancia. Este efecto del TCA implicaría, por lo tanto, que esta molécula no solo daría lugar a sensaciones olfatorias desagradables al interaccionar con algunas de las neuronas olfatorias, sino que ejercería un efecto general de inhibición de la transducción olfatoria en todos los demás receptores. Estaríamos hablando, en definitiva, de que el TCA dificultaría, de forma transitoria, nuestra capacidad para detectar, por medio del olfato, la presencia de otras sustancias volátiles en la cavidad nasal. En presencia de TCA estas moléculas se unirían a sus receptores específicos en las neuronas olfatorias, pero esta unión no traería como consecuencia un flujo de cationes a través de los CNG lo suficientemente intenso como para convertirse en señales nerviosas. Nuestro sistema nervioso central no recibiría, en consecuencia, ninguna información acerca de la presencia de esa sustancia si al mismo tiempo está actuando el TCA sobre los CNG. Dicho en términos menos fisiológicos, el TCA induciría un estado transitorio de “ceguera olfatoria”. Los fenómenos de “inhibición cruzada” son frecuentes en muchos sistemas sensoriales, y están muy bien caracterizados, por ejemplo, en el caso del tacto o de la visión. Su existencia en el sentido del olfato no se había descrito hasta muy recientemente: aunque había datos anteriores que apuntaban a esta posibilidad, la demostración definitiva de la existencia de este tipo de mecanismo en neuronas olfatorias vino nuevamente de la mano del grupo del Prof. Kurahashi, quienes demostraron en el año 2006 que varias moléculas odoríferas, de diferente naturaleza química, eran capaces de inhibir la actividad de los canales CNG en neuronas olfatorias de salamandra. Si pensamos en las consecuencias que puede tener este efecto inhibidor del TCA sobre el disfrute hedónico del vino, la primera pregunta que surge es evidente: ¿a qué concentración lleva a cabo el TCA ese tipo de efecto? Hay una serie de problemas metodológicos, e incluso de evidentes contradicciones, en el trabajo del grupo japonés, que dificultan enormemente la respuesta a esta pregunta. Takeuchi y cols. 13

EL PROBLEMA DEL OLOR A MOHO DEL VINO

Inhibición relativa

(2013) llegan a la conclusión de que este efecto del TCA se puede ejercer a concentraciones tan bajas como 1 attomolar (10-18M), si bien utilizando otro método de aplicación del TCA no observan respuestas inhibidoras significativas sobre las corrientes eléctricas mediadas por los CNG en ese rango tan bajo de concentraciones. Que una sustancia tenga efectos biológicos a la concentración de 1 aM se acerca peligrosamente al territorio de lo absurdo, si no está ya de lleno dentro de él. Ninguna otra sustancia tiene efecto de ningún tipo a esas concentraciones, y tendríamos que multiplicarlas al menos por un millón para acercarnos a aquellas a las que actúan los más potentes agentes biológicos conocidos. En cualquier caso, el artículo de Takeuchi y cols. pone de manifiesto que, sin ninguna duda, las acciones inhibidoras del TCA sobre los CNG se ejercen de manera significativa a concentraciones bastante inferiores a los límites de detección de esta sustancia, no solo en la población general (alrededor de 4×10-11M), sino también en los expertos entrenados (alrededor de 1,5×10-11M). Además, el efecto del TCA es dependiente de su concentración, logrando inhibiciones muy marcadas de la actividad de los CNG a concentraciones elevadas (Figura 7). Esto puede explicar, al menos de forma parcial, por qué los vinos contaminados con anisoles, aparte de parecer tremendamente neutros en cuanto a aromas, no huelen más que a humedad o a moho, despareciendo por completo cualquier otro aroma positivo, como los recuerdos a fruta o a madera tostada. Además, esto implica que el

[TCA] (M) Figura 4. Medidas de intensidad de corriente eléctrica y efecto supresor por la molécula de TCA sobre receptores olfatorios de salamandra. Los datos han sido elaborados a partir de los publicados por Takeuchi y cols. (2013). El punto rojo indica el umbral de detección olfatoria típico en catadores entrenados, y el punto marrón el de la población en general. 14

Antonio Palacios García y José Ignacio San Román

TCA, a concentraciones a las que su presencia no resulta detectable por el olfato humano, es capaz ya de inhibir la sensibilidad olfatoria a otras sustancias diferentes y, por lo tanto, no es difícil imaginar las consecuencias que esto puede tener a la hora del consumo hedónico de un vino contaminado con pequeñas concentraciones de TCA. Existen ya referencias bibliográficas y testimonios en las que se describe este efecto negativo de bajas concentraciones de anisoles en vinos, en los que gran parte de sus aromas característicos parecen haber desaparecido. Sorprendentemente, el TCA ejerció un efecto supresor mucho más potente sobre los canales CNG (100-1000 veces más) que otros agentes que funcionan como enmascarantes olfativos muy conocidos y ampliamente utilizados en perfumería, como el cis-diltazem, que actúa como bloqueante, y el geraniol, un potente agente enmascarante usualmente utilizado en perfumes. Esto puede explicar el aroma potente y embriagador que desprenden algunos vinos de la variedad Moscatel, ricos en geraniol. Takeuchi y cols. también investigaron los mecanismos de la acción del TCA sobre los CNG y, a la vista de su carácter lipofílico (cuantificado por su coeficiente de reparto en octanol/ agua a pH 7,4) y a que la cinética de su efecto inhibidor no se ajusta a una ecuación de Michaelis-Menten, sino a una regresión logarítmica, sugieren que el efecto sobre los CNG estaría mediado por la inclusión del TCA en la bicapa lipídica de las membranas plasmáticas de las células receptoras, desde donde, de alguna forma, alteraría la conductancia y/o el mecanismo de compuerta de los CNG. Por otra parte, Takeuchi y cols. analizaron la potencia relativa de diferentes anisoles y moléculas relacionadas, encontrando efectos muy similares del TCA y del TCB, moléculas que resultaron muchísimo más eficaces, en la anulación de las corrientes catiónicas a través de los CNG, que el TCP, precursor del TCA. Finalmente, como biólogos de formación, los autores de este artículo no podemos por menos que plantear una cuestión final: son demasiadas las diferencias interespecíficas que podemos encontrar en cualquier función biológica, muy a menudo en especies animales muy relacionadas evolutivamente entre sí, como para asumir sin más que los efectos del TCA observados en neuronas olfatorias de un anfibio son directamente extrapolables a la especie humana. Es obvio que serán necesarias más investigaciones para clarificar la eventual implicación de este fenómeno en el olfato humano, así como, en su caso, su importancia cuantitativa.

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EL PROBLEMA DEL OLOR A MOHO DEL VINO

Consecuencias del impacto del TCA en bodega y durante el consumo de vino De todos los órganos de los sentidos, el olfato se distingue por la rapidez con la que se adapta al estímulo. Ello se debe a que, cuando las células olfatorias se “han acostumbrado” (fenómeno de acomodación) a un determinado olor, cesan de transmitirlo al cerebro. Esta facilidad para dejar de percibir un olor no constituye, sin embargo, una limitación muy seria para la vida del hombre, pero si puede constituir una limitación muy importante para el descubrimiento de una eventual contaminación en bodega y por supuesto, para un correcto disfrute del vino en su momento de consumo hedónico. Se estima por otra parte, que de todos los olores percibidos, el 75% son olores desagradables, por lo que la acomodación del sentido del olfato es de agradecer en la mayoría de los casos. • Contaminación ambiental de bodega: en el caso de estar sometidos de forma continua al impacto de una atmósfera contaminada por TCA, dicha molécula va a conseguir con su constante presencia una acomodación del sentido del olfato, no emitiéndose señales que avisen de su presencia, por lo que pasará desapercibida sin levantar señales de alarma que nos obliguen a corregir el grave problema que sufre el ambiente de la bodega. Esto se debe a que la percepción olfativa de ciertos agentes químicos puede estar alterada por contactos previos a los mismos, desarrollándose tolerancia cuando la exposición a un producto hace que disminuya la respuesta a exposiciones posteriores. En resumen, el TCA consigue que nos acostumbremos a su presencia sin molestarnos, lo que nos hace pensar que realmente el problema no existe y solo es fruto de la imaginación de los demás. Un problema añadido a la contaminación ambiental es que el vino ya nace desde origen con una ligera contaminación por anisoles, por lo que cualquier fuente externa adicional, como pueda ser un lote de corchos con problemas de contaminación, va a subir mucho la frecuencia de botellas afectadas por un contenido de TCA que sea superior a los umbrales de detección, pues se parte ya de un ruido base constante en todas las botellas. De ahí la importancia de realizar controles atmosféricos periódicos de posibles contaminaciones ambientales mediante trampas de fibras específicas a los anisoles y sus precursores. • Control de calidad de corchos o barricas contaminadas: esta es una práctica habitual de bodega para diagnosticar la presencia de TCA en vino, en materiales de corcho y en madera mediante la cata y análisis sensorial. En el caso particular de los anisoles tenemos 16

Antonio Palacios García y José Ignacio San Román

un claro problema de supresión temporal cuando nuestra pituitaria olfativa entra en contacto con la molécula, dejándonos inhabilitados hasta su recuperación, para lo que se necesita un tiempo de reposo después de recibir el estímulo. La adaptación olfativa se produce cuando un estímulo es constante o se repite con rapidez, lo que provoca que se acompañe de una respuesta cada vez menor. Por ejemplo, la exposición breve a disolventes disminuye de forma notable, pero pasajera, la capacidad de detección de los mismos. La adaptación también tiene lugar cuando se ha producido una exposición prolongada a concentraciones bajas o rápidamente, con algunos agentes químicos, en presencia de concentraciones muy elevadas. Esto último puede provocar una “parálisis” olfatoria rápida y reversible. Por esta razón siempre se deben acompañar la evaluación sensorial de vinos, y en su caso, los controles sensoriales de tapones por análisis químicos realizados mediante cromatografía de gases y espectrometría de masas, aparatos tecnológicos que no sufren estos fenómenos de acomodación y supresión sensorial. • Venta y consumo del vino: el mal llamado defecto del “olor a corcho”, que deberíamos denominar “olor a moho”, es el único defecto negociable a priori para devolver un vino en la mesa de un restaurante o una tienda especializada. Se trata además de un grave problema a nivel de distribución, causando conflictos entre productores y distribuidores en el mundo entero. Existe por otra parte un consenso a nivel de las concentraciones de TCA que dañan las propiedades sensoriales del vino, con unos varemos aproximados de 3-4 nanogramos/L de TCA a nivel de expertos y catadores entrenados y 8-9 nanogramos/L a nivel de consumidores. Estos umbrales sensoriales se llegan a definir mediante catas triangulares con paneles formados con amplias poblaciones de catadores y consumidores. El umbral de detección sensorial significa la concentración a la que no solo percibimos algo diferente en relación a un testigo, sino también a la que somos capaces de definir a que se debe la diferencia. Sin embargo, en el caso del TCA y moléculas equivalentes, el daño organoléptico se produce desde su concentración molar como hemos podido comprobar debido a su acción supresora sobre las células receptoras olfativas. Por lo tanto, para disfrutar del vino en su máxima expresión no se trata de superar o no unas concentraciones determinadas, si no de su total ausencia. No obstante, los umbrales definen concentraciones de riesgo comercial y siguen siendo válidos de cara a los controles cualitativos, tanto de tapones como de vinos. No se debe confundir placer hedónico en el consumo del vino con los conceptos técnicos que definen el problema de forma profesional. 17

EL PROBLEMA DEL OLOR A MOHO DEL VINO

Conclusiones • El principal responsable de la presencia de anisoles en los vinos y en otras bebidas y alimentos no es otro que el propio ser humano. No se debe culpabilizar a la industria del corcho, ni siquiera al apasionante mundo de los hongos, pues la fuente del TCA, el PCP, nació en los laboratorios. • La presencia de contaminantes en bodega constituye un serio problema que puede afectar a la calidad de los vinos: debido a su condición hidroalcohólica, el vino absorbe muy fácilmente cualquier contaminante capaz de volatilizarse a bajas temperaturas y viajar por la humedad relativa. La concentración de materiales albergados en una atmósfera contaminada puede aumentar con el tiempo. Nuestro sistema sensorial olfativo no nos permite detectar el problema de la presencia de TCA por nosotros mismos, por lo que se hace necesario un estricto control ambiental de los lugares sensibles de la bodega. Hoy en día existen sistemas específicos de muestreo de última generación, a base de polímeros absorbentes (fibras), mucho más selectivas que las trampas de bentonita. • El control sistemático de los materiales de construcción utilizados en las bodegas, así como el control de los insumos enológicos es imprescindible para eliminar potenciales fuentes de contaminación y asegurarse de la posterior ausencia de anisoles en el vino. Existen técnicas que permiten medir el riesgo de contaminación de las barricas nuevas y corchos en general y por TCA en particular. En caso de exportación de materiales a larga distancia, particularmente cuando se utilizan contenedores marítimos, es también indispensable proceder al control ambiental antes de su carga. • Los límites de consenso para definir a partir de qué concentración el TCA o el TBA perjudican las características sensoriales del producto pueden no ser del todo correctos, ya que, aunque para definir su presencia sí son válidos los umbrales de detección publicados en la bibliografía, según los resultados científicos aquí mostrados, el fenómeno de bloqueo de los canales CNG en los receptores olfatorios y, por lo tanto, de inhibición olfativa, pueden alterar la percepción de los aromas positivos de un vino a partir de concentraciones extremadamente bajas, aunque seguramente no tanto como se muestra en el trabajo publicado recientemente por el grupo japonés.

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Antonio Palacios García y José Ignacio San Román

Bibliografía [1] Álvarez-Rodríguez, ML. 2003. Análisis de la producción de 2,4,6-tricloroanisol por hongos filamentosos aislados de corcho. Tesis Doctoral. Facultad de Ciencias. Universidad de Extremadura. [2] Amon, J.M., Vandeepeer, J.M., Simpson, R.F. 1989. Compounds responsable for cork taint. Australian and New Zealand Wine Industry Journal, 4, 62-69. [3] Buser, H.R., Zanier, C., Tanner, H. 1982. Identification of 2,4,6-trichloroanisole as a potent compound causing cork taint in wine. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 30, 359-363. [4] Chatonnet, P., Guimberteau, G., Dubourdieu, D., Boidron, J.N. 1994. Nature et origen des odeurs de moisi dans les caves. Incidence sur la contamination des vins. Journal International des Sciences de la Vigne et du Vin, 28, 131-151. [5] Chatonnet, P. 2004. Índole, origen y consecuencia de la presencia de anisoles en el mundo vinícola. En: Informe técnico: anisoles y Brettanomyces. Causas, efectos y mecanismos de control. Pag.9-19. Fundación para la Cultura del Vino (ed.). Madrid. [6] Francis, L., Field, J., Gishen, M., Valente, P., Lattey, K., Hoj, P., Robinson, E., Godden, P. 2003. The AWRI closure trial: sensory evaluation data 36 months after bottling. Australian and New Zeland Grapegrower and Winemaker, 475, 59-64. [7] Hiroko, T., Hiroyuki, K., Takashi, K. 2013. 2,4,6-Trichloroanisole is a potent suppressor of olfactory signal transduction. www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/ pnas, 1-6. [8] Howland, P.R., Pollnitz, A.P., Liacopoulos, D., McLean, H.J., Sefton, M.A. 1997. The location of 2,4,6-trichloroanisole in a batch of contaminated wine corks. Australian Journal of Grape and Wine Research, 3, 141-145. [9] Takeuchia, H., Katoc, H., Kurahashia, T. 2013. 2,4,6-Trichloroanisole is a potent suppressor of olfactory signal transduction. Proceedings of the National Academy of Sciences, September 16, 2013, doi: 10.1073/ pnas.1300764110.

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ESTUDIO DEL ORIGEN DEL 2,4,6-TRICLOROANISOL (TCA) EN EL CORCHO Jordi Roselló, Miquel Puxeu y Juan-José R. Coque

ESTUDIO DEL ORIGEN DEL 2,4,6-TRICLOROANISOL (TCA) EN EL CORCHO Jordi Roselló1, Miquel Puxeu1 y Juan-José R. Coque2 1

VITEC - Parc Tecnològic del Vi, Carretera de Porrera, km 1, 43730 Falset, España, www.vitec.cat E-mail: [email protected]

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Instituto de Investigación de la Viña y el Vino, Universidad de León, Avenida de Portugal, 41, 24071 León, España

Introducción El corcho, obtenido de la corteza del alcornoque (Quercus suber L.), es reconocido como el método más eficaz para cerrar botellas de vinos a fin de permitir su correcta evolución y envejecimiento. Sin embargo, por tratarse de un producto natural, el tapón de corcho puede adolecer de algunos defectos, entre los que destaca el problema conocido como sabor a corcho u olor a moho. Consiste en la aparición en el vino de metabolitos de origen microbiano que son producidos en el tapón de corcho, y que éste cede al vino tras el embotellado, produciendo su contaminación por aromas indeseables, frecuentemente definidos como aromas a humedad, tierra mojada u hongos [1]. Estos aromas enmascaran los aromas naturales de los vinos; modifican negativamente sus propiedades organolépticas naturales e impiden su comercialización, ante el rechazo del consumidor, lo cual obviamente genera pérdidas económicas para el sector vitivinícola [2]. Aunque son varios los metabolitos microbianos causantes del olor a moho (como guayacol, geosmina, 2-metilisoborneol, pirazinas, etc.), el principal agente responsable de este defecto es el 2,4,6-tricloroanisol (TCA), ya que se ha identificado en más del 80% de los vinos afectados por este defecto [3]. El TCA a concentraciones muy bajas (1,5-3 ng/L) es capaz de conferir a los vinos un desagradable aroma fúngico o moho. Actualmente no existe ningún tratamiento totalmente efectivo para eliminar la contaminación por haloanisoles del corcho, aunque la industria corchera está haciendo grandes esfuerzos de investigación para tratar de minimizar el problema. Entre las recomendaciones que 22

Jordi Roselló, Miquel Puxeu y Juan-José R. Coque

llevan a cabo las empresas que fabrican tapón de corcho se pueden mencionar las siguientes: • Aplicación de estándares de calidad que minimicen las posibilidades de contaminación por cloroanisoles. • Evitar la introducción en las instalaciones industriales de materiales contaminados, fundamentalmente madera tratada con pentaclorofenol (PCP) o pinturas y barnices que contienen 2,4,6-tribromofenol (TBP). De igual modo, se están aplicando distintas estrategias tecnológicas (protegidas bajo patente en muchos casos) cuyo objetivo es la eliminación parcial o total del compuesto TCA, siendo las más representativas las siguientes: • Aplicación de vapor, agua a presión o mezclas hidroalcohólicas para extraer los compuestos presentes en el corcho. • Extracción a base de CO2 en estado supercrítico, que, según estudios independientes, ha dado buen resultado. El inconveniente de esta técnica es que solo puede aplicarse de momento a triturado de corcho. • Esterilización total del tapón de corcho a partir del desarrollo de un acelerador de electrones, eliminando los microorganismos que podrían producir el TCA. Todas estas estrategias de reducción del TCA presentan dos inconvenientes importantes: por un lado, no eliminan el problema, ya que solo consiguen reducirlo en un determinado porcentaje, y, por el otro, se aplican principalmente sobre corcho triturado. Paralelamente al desarrollo industrial de métodos curativos, el avance en el conocimiento del origen del TCA en el corcho permitirá el diseño e implementación de estrategias preventivas que eviten la generación del problema. El origen del TCA en el corcho está sometido a fuerte controversia y ha sido objeto de distintas publicaciones [4, 5]. Las hipótesis aceptadas actualmente son las siguientes: • Síntesis química: Formación de 2,4,6-triclorofenol (TCP) a partir de niveles bajos de cloro y de fenoles presentes en el medio ambiente, con posterior biometilación y acumulación del TCA resultante en el corcho. • Deshalogenación del PCP antropogénico presente en el medio ambiente por acción de los microorganismos. 23

ESTUDIO DEL ORIGEN DEL 2,4,6-TRICLOROANISOL (TCA) EN EL CORCHO

• Uso de pesticidas en el bosque que contengan TCP; posterior biometilación y acumulación en el corcho. • Utilización de cloro en el proceso de fabricación. • Biosíntesis de novo de compuestos organoclorados. La síntesis química de los clorofenoles Burttschel [5] publicó que 2,5 equivalentes de cloro reaccionan con fenol en disolución acuosa para formar mezclas de 2-clorofenol y 4-clorofenol (componentes minoritarios), 2,4-diclorofenol y 2,6-diclorofenol y TCP como componente mayoritario. Estas reacciones se ven afectadas por el pH, siendo 8 su pH óptimo. No se detectaron fenoles metasustituidos ni tetraclorofenol ni pentaclorofenol. El cloro es presente en el suministro de aguas urbanas, en productos de limpieza y de sanitización. Es capaz de entrar en los sistemas de recogida de aguas residuales donde puede reaccionar con fenoles derivados de material vegetal, proporcionando las condiciones adecuadas para producir clorofenoles de hasta 3 átomos de cloro. El TCP puede formarse también a partir de la incineración de materiales orgánicos, contribuyendo a la presencia de clorofenoles en el medio ambiente y proporcionando oportunidades para su acumulación en tejidos de plantas vivas. Degradación de los clorofenoles en el medio ambiente Los clorofenoles con mayor número de átomos de cloro (TCP, TeCP y PCP) han sido fabricados y utilizados con muchos objetivos desde los años 70 del siglo XX, desde que las compañías Dow i Monsanto introdujeron el PCP como conservante para la madera el 1936. El TCP ha sido utilizado como biocida bajo los nombres comerciales de Dowcide 2S, Omal y Phenaclor. El PCP es el biocida más efectivo entre estos tres organoclorados, por su mayor toxicidad y persistencia. Generalmente los preparados de PCP son mezclas con un 3-10% de TeCP y proporciones menores de TCP (como subproductos) pero no contienen diclorofenoles. Una cantidad estimada de 200.000 toneladas de clrofenoles han sido utilizadas cada año en el mundo a partir de los años 70, la mitad era PCP. Los clorofenoles han sido aplicados a la agricultura como biocidas (herbicidas, fungicidas e insecticidas) en la industria como conservantes de la madera y, específicamente el PCP, como termicida, agente antimicrobiano en torres de refrigeración, adhesivos, pinturas de látex o revestimientos de latas destinadas a alimentos. 24

Jordi Roselló, Miquel Puxeu y Juan-José R. Coque

Como consecuencia de la síntesis de compuestos clorados y de su uso como biocidas, los clorofenoles se han acumulado en cursos de agua y en la tierra, incluso en áreas remotas. El uso de biocidas clorofenólicos ha sido prohibido o restringido desde los años 80 del siglo XX. La biodegradación de los clorofenoles ha sido estudiada como método de biorremediación de suelos severamente contaminados por PCP y fenoles relacionados. Varios microorganismos han mostrado capacidad para degradar estos compuestos aunque las condiciones necesarias son improbables en la naturaleza. Varios artículos explican tratamientos de descontaminación de suelos mediante microorganismos capaces de degradar clorofenoles. Las técnicas utilizadas para activar estos microorganismos son la exposición a compuestos relacionados pero de menor toxicidad, la introducción de oxígeno y nutrientes en el medio, y, si es posible, el aumento de la temperatura. Distintos géneros de bacterias aeróbicas son capaces de degradar clorofenoles introduciendo un grupo hidroxilo en posición pararespecto al grupo hidroxilo existente para producir la correspondiente clorohidroquinona; posteriormente se elimina el cloro de la molécula y finalmente se rompe el anillo aromático para producir metano y dióxido de carbono. La susceptibilidad de degradación de los clorofenoles se reduce al aumentar el número de átomos de cloro. La posición de los átomos de cloro en la molécula también afecta la susceptibilidad, los compuestos que muestran cloros en posición meta- respecto al fenol presentan una mayor resistencia a la degradación. Las bacterias anaerobias usan la decloración reductiva para degradar los clorofenoles, y los átomos de cloro son reemplazados por átomos de hidrógeno. La velocidad de degradación del PCP y el TCP son similares en condiciones anaerobias. Mikesell y Boyd [7] muestran la formación de TeCP y TCP como productos intermedios de la degradación del PCP junto con otros clorofenoles y cloroanisoles. Puhakka y Melin [8] muestran que la deshalogenación del PCP en condiciones anaerobias produce diclorofenoles y monoclorofenoles. Bryan y Schultz [9] listan 25 metabolitos de la degradación del TCP, pero ni el TCP ni el TCA están presentes. En general, los compuestos generados a partir del PCP tienden a retener los cloros en posición meta- respecto al grupo hidroxilo y no se produce ni TCA ni TCP como compuestos mayoritarios. Los hongos basidiomicetos son los principales responsables del reciclaje de la materia orgánica de origen vegetal debido a su habilidad para degradar hemicelulosa, lignina y celulosa. Los basidiomicetos son capaces de degradar los clorofenoles antropogénicos y por esta razón han sido usados para el tratamien25

ESTUDIO DEL ORIGEN DEL 2,4,6-TRICLOROANISOL (TCA) EN EL CORCHO

to de suelos contaminados por biocidas. Son organismos eficientes en transformar un amplio rango de compuestos clorados mediante reacciones de óxido-reducción. Las enzimas extracelulares como las peroxidasas y lacasas son activas en la degradación de las ligninas y se consideran responsables de la degradación de organoclorados. Estos hongos son capaces de convertir PCP y TCP en la correspondiente p-benzoquinona y posteriormente en p-benzohidroquinona. Bajo ciertas condiciones estos metabolitos pueden mineralizarse hasta dióxido de carbono, pero en otros casos son parcialmente metabolizados y se incorporan estos productos intermedios al humus del suelo. El uso de biocidas en el bosque Biocidas elaborados en base a PCP y 2,3,5,6-tetraclorofenol (TeCP) y TCP han sido utilizados en el bosque en tiempos pasados (hasta la década de los 80 del siglo pasado). En muchas ocasiones el alcornocal forma parte de un sistema mixto en que se producen productos forestales, agrícolas y ganaderos en un mismo espacio y esto puede implicar una mayor exposición del corcho a productos agroquímicos. La o-metilación de los clorofenoles es un mecanismo común usado por los microorganismos para reducir la toxicidad de estos compuestos. Algunos basidiomicetos son capaces de convertir los clorofenoles, incluido el PCP, en sus correspondientes metil ésteres. Algunas bacterias pueden producir o-metilación, pero no de forma tan rápida ni de forma tan eficiente como ciertos hongos. Muchos de los microorganismos presentes en el corcho presentan esta capacidad. Formación de clorofenoles en el proceso de producción del corcho Hay dos procesos que pueden provocar la formación de clorofenoles en el corcho: el cocido del corcho en agua que contenga cloro y el lavado de los tapones con hipoclorito. Las planchas de corcho extraídas del árbol son hervidas; actualmente está prohibido el uso de aguas cloradas por el Código Internacional de Prácticas Taponeras [6]. Antes de 1990 muchos tapones de corcho eran tratados con una disolución de hipoclorito de calcio para blanquear su superficie y mejorar su apariencia. Este tratamiento ha desaparecido debido a los altos niveles de TCP que pueden formarse en el corcho con el consiguiente riesgo de producción de TCA en presencia de la microflora asociada al corcho. 26

Jordi Roselló, Miquel Puxeu y Juan-José R. Coque

Biosíntesis de novo de compuestos clorados Diferentes estudios muestran la existencia de más de 3.700 compuestos organohalogenados, principalmente clorados y bromados, que son producidos por organismos vivos, des de compuestos muy simples hasta estructuras muy complejas. Los hongos basidiomicetos son una fuente importante de estos compuestos organoclorados en ambientes terrestres. Producen una gran cantidad de clorometano y de compuestos alifáticos y aromáticos halogenados. Son capaces de sintetizar clorofenoles de novo, compuestos como pueden ser 4-clorofenol y 2,6-diclorofenol, que han sido identificados como metabolitos minoritarios de determinados hongos.

El conjunto de compuestos organoclorados producidos por cada una de estas posibles rutas de síntesis del TCA es distinta y, en consecuencia, la presencia o ausencia de determinados clorofenoles y cloroanisoles junto al TCA puede proporcionar evidencias a favor o en contra de ciertas hipótesis. La mancha amarilla del corcho es una alteración que se manifiesta en manchas grisáceas en la corteza y una decoloración del tejido suberoso subyacente. Es un defecto reconocido como causante de aromas indeseables, y el Código Internacional de Prácticas Taponeras (C.E.Liège, 20006) obliga a eliminar el corcho afectado del proceso de fabricación de tapones de corcho para vino. El análisis químico de la mancha amarilla indica una importante presencia de TCA. El objetivo del presente estudio fue determinar el origen el TCA del corcho a partir del estudio de los compuestos organoclorados que aparecen simultáneamente con este compuesto. Para ello se caracterizó a nivel químico la mancha amarilla del corcho como modelo de degradación del corcho y producción de compuestos organoclorados.

27

ESTUDIO DEL ORIGEN DEL 2,4,6-TRICLOROANISOL (TCA) EN EL CORCHO

Materiales y métodos Muestreo del corcho Las muestras de corcho han sido recogidas en el momento de la extracción del alcornoque. Se han obtenido planchas de corcho afectadas por mancha amarilla y planchas de corcho sano, no afectadas por mancha amarilla. Las planchas afectadas de mancha amarilla han sido descritas olfativamente y clasificadas según si el aroma dominante era el TCA. De este modo se han analizado tres muestras de corcho con mancha amarilla y olor a TCA (12M10, 12M12, 12M13), tres muestras de corcho con mancha amarilla sin olor a TCA (12M6, 12M15, 12M16) y tres muestras de corcho sin mancha amarilla (12MB1, 12MB2, 12MB3). Determinación de organoclorados volátiles presentes en las muestras de corcho Las nueve muestras de corcho se molturaron hasta obtener un diámetro de partícula de 0,5 mm. Posteriormente seis gramos de corcho molturado fueron introducidos en un vial de 20 ml con tapón de rosca y junta de teflón para el análisis del espacio de cabeza mediante microextracción en fase sólida (SPME). La extracción por SPME se llevó a cabo con una fibra de 100 µm y 10 mm de PDMS subministrada por Supelco (Bellefonte, PA, USA) expuesta en el espacio de cabeza en viales de 20 ml que contenían 6 g de corcho molturado, incubados a 35º C durante un minuto para su acondicionamiento y durante 30 minutos para su extracción. Seguidamente al proceso de extracción por SPME, la fibra fue introducida en el inyector split-splitless para su desorción térmica durante 3 minutos a la temperatura de 250º C. La separación de los compuestos se realizó mediante un cromatógrafo de gases GC 7890 (Agilent Tecnologíes, Wilmington, USA) acoplado a un detector de espectrometría de masas MSD 5975C (Agilent Tecnologíes, Wilmington, USA). La columna utilizada fue una HP5-MS (Agilent Tecnologíes, Wilmington, USA) de dimensiones 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm y como gas portador se utilizó helio. El programa de temperaturas fue de 40ºC (durante un minuto), 5º C/minuto hasta 225º C, 20º C/minuto hasta 290º C. Los compuestos volátiles se identificaron mediante comparación de los espectros de masas con la librería NIST (Agilent Tecnologíes, Wilmington, USA) y mediante sus tiempos de retención. Las temperaturas de la fuente de ionización y del cuadrupolo fueron 250º C y 150º C, respectivamente. 28

Jordi Roselló, Miquel Puxeu y Juan-José R. Coque

Determinación de fenoles clorados presentes en el corcho Para el análisis de fenoles en corcho se maceraron 3 g de corcho molturado de cada una de las muestras de estudio en 15 ml de disolución hidroalcohólica al 12% durante 48 horas. Finalizada la maceración, se filtró la disolución y se ajustó el pH a 3,6. Se introdujo una barra magnética agitadora recubierta de PDMS de dimensiones 0,5 mm x 10 mm (Twister, Gerstel GmbH, Mulheim, Germany) en la disolución obtenida del proceso de maceración junto a 200 µl patrón interno (octanoato de metilo). La muestra se agitó durante un hora a 1.000 rpm a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo, la barra magnética se separó de la muestra líquida, se lavó con agua destilada, fue secada con papel de celulosa y se introdujo en los viales transportadores para ser desorbida en la unidad de desorción térmica (TDU). El programa de desorción térmica en la TDU fue de 4 minutos a 20º C, incrementando 60º C/minuto hasta 300º C y 10º C/s hasta 295º C en el inyector CIS. Las condiciones del cromatógrafo de gases y del espectrómetro de masas fueron las mismas que las usadas para los organoclorados volátiles.

Resultados El análisis de las seis muestras de corcho afectadas por mancha amarilla permitió identificar 9 compuestos clorados distintos: tres de ellos son anisoles clorados, cinco dimetoxibenzenos y un fenol clorado (tabla 1). En las muestras de corcho no afectado por mancha amarilla no se encontró ningún compuesto clorado. Los tres anisoles contienen uno, dos y tres átomos de cloro respectivamente y son: 2-cloro-4-metoxi benzaldehído (CMBA), 2,4-dicloroanisol (DCA) y 2,4,6-tricloroanisol (TCA). El TCA es el único compuesto que aparece en todas las muestras afectadas con mancha amarilla que se han analizado, tanto en aquellas en que este compuesto es el descriptor principal del aroma como en aquellas en que los aromas principales son distintos. Los dos anisoles restantes aparecen en la literatura como productos de síntesis de hongos basidiomicetos.

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30

-

-

V

-

-

V

-

-

-

TJB

TJC

TJD

TJE

TJF

SA

SB

SC

Cl

V

O

OCH 3

-

Cl

OCH 3

TJA

Muestras

Compuestos Cl

-

-

-

-

-

-

-

V

V

Cl

OH Cl

Cl

-

-

-

V

-

-

V

-

-

OCH 3

OCH 3 Cl

Cl

-

-

-

-

V

-

-

V

V

OCH 3

Cl

OCH 3

Cl

-

-

-

V

V

V

V

V

V

Cl

OCH 3 Cl

Cl

-

-

-

-

-

-

-

-

V

Cl

OCH 3

Cl

Cl

OCH 3 Cl

-

-

-

-

-

V

V

V

V

Cl

OCH 3

Cl

OCH 3

Cl

Cl

-

-

-

-

V

V

-

-

-

OCH 3

OCH 3

Cl

Cl

ESTUDIO DEL ORIGEN DEL 2,4,6-TRICLOROANISOL (TCA) EN EL CORCHO

Tabla 1. Compuestos organoclorados detectados en las muestras de corcho analizadas. V indica presencia del compuesto.

Jordi Roselló, Miquel Puxeu y Juan-José R. Coque

Entre los compuestos dimetoxibenzénicos, dos de ellos presentan dos átomos de cloro [1,4-dimetoxi-2,5-diclorobenceno (pDMDCB) y 1,2-dimetoxi-3,4-diclorobenceno (DMDCB)], uno presenta tres átomos de cloro [1,2-dimetoxi-3,4,5-triclorobenceno (DMTCB)], y dos más presentan cuatro átomos de cloro [1,2-dimetoxi-3,4,5,6 tetraclorobenceno (DMTeCB) y drosofilina A metil eter (DAME)]. Sólo se ha detectado un fenol clorado y no han sido detectados clorofenoles de origen antropogénico de tres o más átomos de cloro en ninguna de las muestras analizadas. La no detección de 2,4,6-triclorofenol (TCP) en ninguna de las muestras parece indicar que los anisoles detectados en las muestras analizadas con mancha amarilla no provienen directamente de la metilación del TCP antropogénico. Los niveles de bioconversión máximos detectados se sitúan alrededor del 40% y por lo tanto esperaríamos la presencia de TCP conjuntamente con el TCA. Tampoco aparece como sustrato en corcho sin mancha amarilla.

Discusión Comparando los fenoles clorados detectados en mancha amarilla, con los compuestos esperados en cada una de las posibles rutas de síntesis del TCA, se podrán descartar o aceptar las distintas hipótesis en función de la compatibilidad con los resultados obtenidos. Hipótesis 1 Síntesis química: Formación de TCP a partir de niveles bajos de cloro y de fenoles presentes en el medioambiente, seguida de biometilación y acumulación en el corcho. OH

OH

Cl

Cl

Cl

Cloro

OH

+

+ Cl

Cl

Figura 1. Producción de fenoles clorados mediante síntesis química.

31

ESTUDIO DEL ORIGEN DEL 2,4,6-TRICLOROANISOL (TCA) EN EL CORCHO

Productos esperados: TCA y dicloroanisol como compuesto minoritario. Hipótesis incompatible con la aparición de compuestos metasustituidos y compuestos con más de tres átomos de cloro. En las muestras analizadas hemos encontrado compuestos metasustituidos y compuestos con más de tres átomos de cloro que no pueden ser originados por síntesis química. OCH 3

Cl O

Figura 2. Compuestos detectados en mancha amarilla que no pueden ser generados por síntesis química a partir de cloro y fenoles presentes en el medio ambiente.

Hipótesis 2 Degradación de PCP antropogénico por los microorganismos. Las bacterias aeróbicas son capaces de degradar clorofenoles introduciendo un grupo hidroxilo en posición para- respecto al grupo hidroxilo existente para producir la correspondiente clorohidroquinona La deshalogenación del PCP en condiciones anaerobias produce un conjunto complejo y conocido de clorofenoles y cloroanisoles. Los hongos son capaces de convertir PCP y TCP en la correspondiente p-benzoquinona y posteriormente en p-benzohidroquinona. En las muestras analizadas hemos encontrado compuestos con átomos de cloro en posición para- respecto al grupo metoxi que no pueden ser sintetizados por degradación de PCP por bacterias aerobias o hongos basidiomicetos. OH Cl

OCH 3

OCH 3

Cl

OCH 3

Cl

Cl

Cl

Bacterias anaerobias Cl

Cl

Cl

OH

OH Cl

Cl

Bacterias aerobias Cl

Cl Cl

Conjunto complejo de cloroanisoles y clorofenoles O

Nos encontramos estos compuestos en la mancha amarilla OCH 3

OCH 3

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

OCH 3

Basidomicetos O

Cl Cl

Cl

Figura 3. Producción de fenoles clorados por degradación microbiana del PCP antropogénico. 32

Jordi Roselló, Miquel Puxeu y Juan-José R. Coque

En las muestras analizadas no se han encontrado los compuestos detectados en la degradación de PCP por bacterias anaerobias. Hipótesis 3 Uso de pesticidas en el bosque que contengan TCP. Posterior biometilación y acumulación en el corcho. OCH 3

OH Cl

Cl

Cl

OCH 3 Cl

Cl

Cl

OH

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

OH

Biometilación

Cl

Cl Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

OCH 3

Cl

Cl

Cl

Cl Cl

Cl

Figura 4. Producción de anisoles clorados por uso de pesticidas en el bosque.

Productos esperados: PCA, TeCA y TCA. En las muestras analizadas no se han encontrado los productos esperados y estos no pueden producirse a partir de biocidas en base a PCP. Hipótesis 4 Utilización de cloro en el proceso de fabricación. Las muestras analizadas han sido recogidas en el árbol, antes de cualquier tratamiento industrial, por lo tanto esta hipótesis no puede explicar la presencia de compuestos organoclorados en las muestras analizadas. Hipótesis 5 Biosíntesis de novo de compuestos organoclorados. Productos esperados: Mezcla compleja de compuestos clorados. Tres de los compuestos encontrados en mancha amarilla figuran en las listas publicadas (figura 5). OCH 3

OCH 3

OCH 3

Cl

Cl

Cl

OCH 3

Cl

Cl

Cl

Cl

OCH 3

Cl

Cl O

Figura 5. Cloroanisoles presentes en las muestras de mancha amarilla analizadas que figuran en las listas publicadas de compuestos producidos por hongos basidomicetos. 33

ESTUDIO DEL ORIGEN DEL 2,4,6-TRICLOROANISOL (TCA) EN EL CORCHO

Conclusiones El origen del TCA en la mancha amarilla del corcho no puede explicarse por la síntesis química del TCP, ni por la biosíntesis a partir de compuestos clorados de origen antropogénico ni tampoco por la utilización de compuestos clorados en el proceso de fabricación del tapón. La hipótesis compatible con los resultados obtenidos es la biosíntesis de novo de compuestos organoclorados.

Bibliografía [1] Amon, J.M., Simpson, R.F., Vandepper, J.M. 1989. Compounds responsable for cork taint in wine. Australian and New Zealand Wine Industry Journal, 4, 62-69. [2] Hall, C.W. 2007. Reviews on Drying: 1982-2006. Drying Technology, 25, 19-28. [3] Buser, H.R., Zanier, C. & Tanner, H. 1982. Identification of 2, 4, 6 –trichloroanisole as a potent compound causing cork taint in wine. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 30, 359-362. [4] Capone, D.L., Skouroumounis, G.K., McLean, H.J., Pollnitz, A.P. and Sefton, M.A. 1999. Absorption of chloroanisoles from wine by corks and by other materials. Australian Journal of Grape and Wine Research, 5, 91-98. [5] Burttschell, R.H., Rosen, A.A., Middleton, F.M. and Ettinger, M.B. (1959) Chlorine derivatives of phenol causing taste and odor. Journal of the American Water Works Association, 51, 205-214. [6] CE-Liège, 2006. Código Internacional de Prácticas Taponeras versión 5 Ed. Confédération Européene du Liège, Santa Maria de Lamas, Portugal. [7] Mikesell, M.D. and Boyd, S.A. 1986. Complete reductive dechlorination and mineralization of pentachlorophenol by anaerobic microorganisms. Applied and Environmental Microbiology, 52, 861-865. [8] Puhakka, J.A. and Melin, E.S. 1996. Bioremediation of chlorinated phenols. Biotechnology Research Series, 6 (Biomediation: Principles and Applications), pp. 254-299. [9] Bryant, S.E. and Schultz, T.W. (1994) Toxicological assessment of biotransformation products of pentachlorophenol: Tetrahymena population growth impairment. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 26, 299-303.

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SYMBIOS: UN PROCESO DE COCIDO DEL CORCHO CAPAZ DE INHIBIR EL DESARROLLO DE SUSTANCIAS CAUSANTES DE DESVIACIONES ORGANOLÉPTICAS Sérgio Moutinho

SYMBIOS: UN PROCESO DE COCIDO DEL CORCHO CAPAZ DE INHIBIR EL DESARROLLO DE SUSTANCIAS CAUSANTES DE DESVIACIONES ORGANOLÉPTICAS

SYMBIOS: UN PROCESO DE COCIDO DEL CORCHO CAPAZ DE INHIBIR EL DESARROLLO DE SUSTANCIAS CAUSANTES DE DESVIACIONES ORGANOLÉPTICAS Sérgio Moutinho CTCOR - Centro Tecnológico da Cortiça, Calle Amélia Camossa, 4536-904 Santa Maria de Lamas, Portugal. www.ctcor.com.

Introducción La preparación industrial del corcho, para poder fabricar tapones, implica el cocido de las planchas de corcho en agua hirviendo y posterior estabilización en almacén. La estabilización del corcho, post-cocido, trascurre durante el periodo de tiempo necesario para conseguir el reequilibrio estructural del material y la pérdida del exceso de agua adquirida en el cocido. Durante esta fase varios factores bióticos y abióticos contribuyen a un elevado desarrollo microbiológico y fúngico en la matriz corcho, que ocurre de forma no controlada tanto por el tipo de microorganismos (género) como por la cantidad. En condiciones específicas, la actividad de ciertos microorganismos en el corcho, especialmente hongos filamentosos, está guiada por mecanismos biológicos defensivos de biometilación. Al encontrar la presencia de halofenoles (compuestos potencialmente tóxicos), los microorganismos recorren a la biometilación, provocando la formación de haloanisoles y la detoxificación del medio. La incidencia de los anisoles, con particular relevancia del éter aromático clorado 2,4,6-tricloroanisol (TCA), se caracteriza por su elevado potencial odorífico del descriptor: moho. La contaminación de alimentos por TCA es un factor que devalúa fuertemente el perfil organoléptico del producto. En el caso de los tapones de corcho, y como consecuencia del mecanismo expuesto anteriormente, el tapón puede actuar como vehículo de transmisión del TCA al vino. Dependiendo de los niveles de 36

Sérgio Moutinho

cesión, el vino podrá sufrir una desviación en el perfil sensorial, el olor a moho. Diversas innovaciones tecnológicas están siendo implementadas por el sector para erradicar el problema. Actuando en una fase posterior a la formación del TCA en el corcho, estas innovaciones son comúnmente designadas como procesos curativos. Las características de la molécula de TCA y su afinidad por el corcho son un fuerte obstáculo para su erradicación mediante este tipo de procesos. De este modo, las herramientas de que dispone actualmente el sector para resolver el problema resultan inevitablemente un compromiso entre la reducción de las concentraciones de TCA a niveles aceptables y la salvaguarda de las características físico-mecánicas del corcho.

Descripción de la innovación El proceso Symbios se presenta como una técnica innovadora de preparación de corcho. La innovación se basa en la intervención directa sobre el medio de cocido del corcho, mediante la activación química del mismo. Se adicionan determinados compuestos químicos al agua de hervido en condiciones previamente establecidas (conforme al manual de aplicación del proceso). Por fenómenos de difusión en el medio acuoso hirviendo, los aditivos Symbios son fijados en las estructuras morfológicas del corcho ricas en lignina como son las paredes interiores de los canales lenticulares y la corteza del corcho. Las planchas de corcho tratadas de este modo presentan un fuerte control de la actividad microbiológica y se inhibe la formación de cloroanisoles durante las fases siguientes de transformación industrial (estabilización, fabricación, procesado de subproductos, etc.)

Conformidad alimentaria Los aditivos utilizados en el proceso Symbios son parte integrante de sistemas biológicos vivos y de su entorno inorgánico. Se encuentran de forma ubicua en la naturaleza y se clasifican como “seguros para el consumo humano” por la Food and Drug Administration (FDA). El potencial micotoxicológico del proceso de Symbios se evaluó analizando la ocratoxina-A. Los resultados muestran que la actividad micotoxicológica en planchas de corcho sometidas a procesamiento Symbios no presenta ningún inconveniente para la salud. De hecho, 37

SYMBIOS: UN PROCESO DE COCIDO DEL CORCHO CAPAZ DE INHIBIR EL DESARROLLO DE SUSTANCIAS CAUSANTES DE DESVIACIONES ORGANOLÉPTICAS

las mediciones realizadas muestran que el potencial de migración de ocratoxina-A (de las planchas de corcho al vino) es del orden de 0,08% del contenido máximo admisible de vinos: 2 mg/L (Reglamento (CE) n° 123 / 2005).

Experimentación Efecto barrera y efecto simbiótico El proceso Symbios se caracteriza por la aparición simultánea de estos dos efectos bioquímicos, cuya acción es de vital importancia para lograr el objetivo propuesto. • Efecto barrera del proceso Symbios: Pequeña profusión de hifas en el interior de las células de corcho con el mantenimiento del micelio sobre la superficie externa de las estructuras de lignina (raspa, pared interna de los poros, etc.). Este comportamiento indica que los microorganismos se enfrentan a un medio interno poco atractivo. • Efecto simbiótico del proceso de Symbios: La presencia de aditivos (nutrientes) en la superficie de las estructuras de lignina implica que los microorganismos se fijan en la interfase, entre la corteza y el tejido suberoso, donde tienen mejores condiciones fisiológicas. La figura 1 muestra la degradación enzimática del tejido suberoso cocido mediante el método tradicional. Aparecen corrugaciones y densificación de la membrana celular. La figura 2 muestra la fijación del micelio en la superficie externa de los poros en un corcho cocido mediante el método Symbios. Se observa ausencia de hifas en el tejido suberoso y el mantenimiento de la características morfológicas del tejido adyacente a la interfase. La acción simultánea de estos dos efectos descritos impide las reacciones de metilación de los compuestos fenólicos halogenados y, consecuentemente, inhibe la formación de cloroanisoles en la matriz del corcho.

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Sérgio Moutinho

Figura 1. Imagen de la superficie del corcho cocido mediante el sistema tradicional.

Figura 2. Imagen de la superfície del corcho cocido mediante el sistema Symbios.

Ensayos a escala de laboratorio Para consolidar la base teórica inherente al proceso de Symbios, se han realizado varios experimentos de laboratorio. Uno de los experimentos más ilustrativos se describe a continuación. Tres placas de corcho fueron divididas en cuatro secciones del mismo tamaño. De las doce piezas resultantes, seis se sometieron a un cocido en agua limpia por un período de 90 minutos, simulando condiciones tradicionales. Las piezas restantes fueron sometidas al mismo tiempo de cocción en agua limpia adicionada con el producto Symbios. Después de la cocción, las muestras de corcho se colocaron por separado en una cámara de estabilización. Semanalmente y durante 6 semanas, se llevó a cabo la humectación forzada de las muestras con agua nebulizada. 39

SYMBIOS: UN PROCESO DE COCIDO DEL CORCHO CAPAZ DE INHIBIR EL DESARROLLO DE SUSTANCIAS CAUSANTES DE DESVIACIONES ORGANOLÉPTICAS

Después del período de estabilización de 6 semanas, se procedió a seccionar las muestras en un plano tangencial para obtener de un lado la parte de la corteza (espalda del corcho) y por otro lado la parte interior (vientre del corcho). Las muestras sometidas al procesamiento tradicional presentaron una alta contaminación de TCA en la matriz de corcho, potenciada por las condiciones forzadas de la estabilización post-cocido (tabla 1). La inhibición del fenómeno de biometilación debida a la acción del método Symbios se comprueba por los bajos valores de TCA, claramente inferiores a los obtenidos en condiciones tradicionales. Tabla 1. Concentración de TCA en el corcho.

Cloroanisoles (ng/L) Referencia

TCA Mín.

Máx.

TeCA

PCA

Mín.

Máx.

Mín.

Máx.

Fracción espalda (estabilización posthervido tradicional)

66,8 118,2

nd

nd

nd

nd

Fracción vientre (estabilización posthervido tradicional)

12,2

31,0

nd

nd

nd

nd

Fracción espalda (estabilización posthervido Symbios)

nd

3,4

nd

nd

nd

nd

Fracción vientre (estabilización posthervido Symbios)

nd

nd

nd

nd

nd

nd

Notas: nd – no detectado

Límites de detección: 2,4,6-TCA en corteza: 0,7 ng/L 2,3,5,6-TeCA en corteza: 1,8 ng/L PCA en corteza: 3,8 ng/L

Ensayos a escala piloto Se diseñaron otro tipo de experiencias para evaluar la capacidad de extracción del cocido Symbios. Para ello, se procedió a cocer planchas de corcho en condiciones Symbios vs. condiciones tradiciona40

Sérgio Moutinho

les. Los experimentos se realizaron en una planta piloto instalada en CTCOR. Después de la cocción se procedió a tomar muestras de agua y posteriormente se caracterizaron los siguientes parámetros: sólidos totales en suspensión y polifenoles. 250

Polifenoles (mg/L)

200

150

100

50

Conc. 4

Conc. 3

Conc. 2

Conc. 1

Ref. 1

0

Figura 3. Polifenoles en agua de cocido a concentraciones crecientes de aditivos Symbios desde Conc. 1 hasta Conc. 4. La columna Ref. indica el valor obtenido en cocido tradicional. 70

SST (mg/L)

60 50 40 30 20 10

Conc. 4

Conc. 3

Conc. 2

Conc. 1

Ref. 1

0

Figura 4. Sólidos solubles totales en agua de cocido a concentraciones crecientes de aditivos Symbios des de Conc. 1 hasta Conc. 4. La columna Ref. indica el valor obtenido en cocido tradicional.

Los resultados obtenidos demuestran que las concentraciones de polifenoles y sólidos en suspensión extraídos del corcho en condiciones del proceso Symbios son superiores a los obtenidos en condicio41

SYMBIOS: UN PROCESO DE COCIDO DEL CORCHO CAPAZ DE INHIBIR EL DESARROLLO DE SUSTANCIAS CAUSANTES DE DESVIACIONES ORGANOLÉPTICAS

nes de procesado tradicionales. Además, aumenta la capacidad extractiva del medio de cocido a medida que aumenta la concentración de aditivos Symbios en el medio. En comparación con el proceso tradicional, se demuestra una mayor eficacia del proceso de cocido Symbios en la limpieza y extracción de compuestos hidrosolubles de la matriz corcho. También se estudió la capacidad extractiva del medio de cocido Symbios en cocidos consecutivos. 1000

Polifenoles (mg/L)

800 600 400 200

Conc. 4.4

Conc. 4.3

Conc. 4.2

Conc. 4

Conc. 3

Conc. 2

Conc. 1

Ref. 1

0

Figura 5. Capacidad extractiva de distintas concetraciones de aditivo Symbios (rojo) y extracción en cocidos sucesivos (marrón).

Ensayos a escala industrial Se llevaron a cabo experiencias de implantación del sistema Symbios en cinco empresas corcheras de tamaño medio, con el procesamiento industrial verticalizado. Trabajando con diferentes empresas, y por lo tanto diferentes materias primas y diferentes condiciones de procesamiento, se trató de ser representativo de la realidad industrial. Se seleccionó un lote de corcho, que fue paletizado para cocer. La mitad de los palets se coció en condiciones tradicionales y la otra mitad en condiciones Symbios. En cada situación se inició el primer cocido con agua limpia (+ aditivos en el caso Symbios), y posteriormente se realizaron cocidos de forma consecutiva durante un día de trabajo sin cambiar el agua. Después de la cocción, los corchos permanecieron en la estabilización, en el mismo espacio (almacén de estabilización) durante 3 semanas. Transcurrido el período de estabilización, se fabricaron los 42

Sérgio Moutinho

tapones procedentes de los dos conjuntos de corcho, y se lavaron con peróxido. Los lotes obtenidos de este modo fueron designados tapones PT (tapones procedentes de corcho preparados bajo condiciones tradicionales) y PS (tapones procedentes de corcho preparados bajo condiciones Symbios). Se analizaron individualmente tapones de cada referencia para determinar el perfil sensorial y los cloroanisoles extraíbles. De los tapones PT se analizaron 905 unidades, doce de los cuales mostraron niveles cuantificables de TCA. Los resultados obtenidos se presentan en la tabla 2. De los tapones PS se analizaron 905 unidades, tres de los cuales mostraron niveles cuantificables de TCA. Los resultados obtenidos se presentan en la tabla 3. Tabla 2. Valores de TCA de los tapones PT (ng/L).

MUESTRAS PT Determinación de cloroanisoles extraíbles 12 tapones con niveles cuantificables de TCA extraíble Concentración 29,1 4,0 8,9 1,5 28,4 66,4 5,0 15,0 21,2 9,7 75,8 6,2 (ng/L)

Tabla 3. Valores de TCA de los tapones PS (ng/L)

MUESTRAS PS Determinación de cloroanisoles extraíbles 3 tapones con niveles cuantificables de TCA extraíble Concentración (ng/L)

1,9

1,6

6,6

Teniendo en cuenta que el umbral de percepción olfativa de TCA en el vino es de 4 ng/L y admitiendo, en el peor de los casos, que un tapón pudiera ceder todo el TCA extraíble, vemos que, de los doce tapones PT, el corcho que presenta un valor de 1,5 ng/L de TCA extraíble debe ser excluido para el cálculo de la tasa de incidencia de olor a moho. Del mismo modo, de los tres tapones de PS en los que se ha detectado 2,4,6-TCA, sólo el corcho que presenta un valor de 6,6 ng/L 43

SYMBIOS: UN PROCESO DE COCIDO DEL CORCHO CAPAZ DE INHIBIR EL DESARROLLO DE SUSTANCIAS CAUSANTES DE DESVIACIONES ORGANOLÉPTICAS

de TCA extraíble debe ser considerado para calcular la incidencia de olor a moho en el vino. De este modo las incidencias de olor a moho son: • En el conjunto PT: 11/109 tapones = 1,2% • En el conjunto PS: 1/1.184 tapones = 0,08% El experimento descrito anteriormente permitió determinar que: • La incidencia de olor a moho en los tapones Symbios es residual (menos de 1/1.000) y, cuando se produce el nivel de concentración de TCA, es bajo. • Las muestras de tapones Symbios muestran una mejor notable del perfil sensorial y una mayor homogeneidad Además de la seguridad de las características sensoriales, tratamos de evaluar las características de funcionalidad de los tapones Symbios, particularmente en lo que concierne al comportamiento físico y mecánico. La figura 6 presenta los resultados del análisis de los siguientes parámetros: densidad, compresión y relajación. Estos parámetros se testaron en los tapones Symbios y en tapones tratados por el método tradicional, procedentes del mismo lote de corcho.

Fuerza de relajación (daN)

20 15 10 5 0 PT1

PT2

PS1

PS2

PT1

PT2

PS1

PS2

Fuerza de compresión (daN)

100 80 60 40 20 0 44

Sérgio Moutinho

Masa volúmica (daN)

250 200 150 100 50 0 PT1

PT2

PS1

PS2

Figura 6. Resultados del análisis de la densidad, compresión y relajación en tapones hervidos con sistema tradicional (PT1 y PT2) y mediante el sistema Symbios (PS1 y PS2).

La caracterización físico-mecánica de los corchos estudiados muestra el cumplimiento de las especificaciones y valores orientativos propuestos por CTCOR: • Los resultados de masa volúmica muestran la homogeneidad y regularidad estructural de la materia. • Los valores de la resistencia de compresión están en el rango de referencia de CTCOR: F1 = 80 ± 15 daN. • Los valores de fuerza de relajación están en el rango de CTCOR referencia: F2 = 15 ± 5 daN.

Conclusiones Con la realización de este estudio se ha podido controlar y evaluar el proceso de Symbios en condiciones de aplicación reales. El enfoque experimental ayudó a revisar y consolidar la base teórica subyacente en el proceso. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto la eficacia del proceso de Symbios en la inhibición de la biosíntesis de cloroanisoles en el corcho. El proceso Symbios aparece como un proceso biológico de carácter preventivo, que promueve el desarrollo de microorganismos benignos en el corcho, en detrimento de las especies con potencial de formación de metabolitos no deseados. Además, el proceso de Symbios muestra un aumento notable en la capacidad de extracción del cocido, lo que asegura una mayor eficiencia en la limpieza y la eliminación de compuestos hidrosolubles del corcho. Los tapones Symbios muestran un perfil sensorial de notable limpidez y homogeneidad. 45

SYMBIOS: UN PROCESO DE COCIDO DEL CORCHO CAPAZ DE INHIBIR EL DESARROLLO DE SUSTANCIAS CAUSANTES DE DESVIACIONES ORGANOLÉPTICAS

El proceso Symbios es inocuo y respeta las normas comunitarias de materiales destinados a entrar en contacto con productos alimenticios. Los subproductos de la fabricación de corchos procedentes del sistema Symbios son más limpios tanto física como organolépticamente. Las ventajas de Symbios son extensibles a la fabricación de corchos aglomerados. Por último, el proceso de Symbios no introduce ninguna desviación en el comportamiento mecánico y físico del corcho, salvaguardando la funcionalidad del tapón de corcho.

En conclusión, este estudio demuestra la eficacia del proceso Symbios, cumpliendo así con los términos y condiciones del Código Internacional de Prácticas Taponeras.

46

ESTUDIO DEL PERFIL SENSORIAL DE LOS TAPONES DE CORCHO NATURAL PARA VINOS TRANQUILOS Jordi Roselló, Miquel Puxeu y Juan-José R. Coque

ESTUDIO DEL PERFIL SENSORIAL DE LOS TAPONES DE CORCHO NATURAL PARA VINOS TRANQUILOS Jordi Roselló1, Miquel Puxeu1 y Juan-José R. Coque2 1

VITEC - Parc Tecnològic del Vi, Carretera de Porrera, km 1, 43730 Falset, España, www.vitec.cat E-mail: [email protected]

2

Instituto de Investigación de la Viña y el Vino, Universidad de León, Avenida de Portugal, 41, 24071 León, España

Introducción El envejecimiento en botella es un proceso muy importante en la elaboración de los vinos. Durante el tiempo de almacenamiento en botella el vino sufre complejos cambios químicos que pueden afectar la composición aromática, las sensaciones en boca, el color y, en conjunto, la percepción de calidad del producto. El tapón de corcho desarrolla un papel muy importante en la crianza en botella por sus características particulares. La difusión del oxígeno a través del tapón de corcho es el principal causante de los cambios químicos que ocurren en este proceso de crianza. Dependiendo de la cantidad de oxígeno que entra en la botella a través del tapón de corcho el vino puede mejorar sus características o desarrollar aromas defectuosos. Las elevadas exposiciones al oxígeno provocarán la degradación de aromas varietales y aparecerán los compuestos responsables del aroma de oxidación, como pueden ser el sotolón y determinados aldehídos. Contrariamente, cuando la exposición al oxígeno es excesivamente baja, aparecerán aromas de reducción descritos como huevo podrido o agua estancada. El tapón de corcho adecuado a cada vino será aquel que aporte al vino el oxígeno necesario para optimizar la expresión aromática, la sensación en boca y el color. El tapón de corcho también puede afectar positivamente la calidad del vino mediante la aportación de compuestos positivos que pueden migrar del corcho al vino. Compuestos presentes en el corcho, como pueden ser alcoholes, ácidos, aldehídos y cetonas, pueden contribuir positivamente a la calidad sensorial del producto [1]. 48

Jordi Roselló, Miquel Puxeu y Juan-José R. Coque

La estructura física y la composición química del corcho le confieren particulares características: impermeabilidad, compresibilidad, recalcitrancia a la degradación y una gran tendencia a comportarse como un material químicamente inerte. El corcho está constituido esencialmente por suberina, celulosa, lignina y una pequeña proporción de compuestos extraíbles [2]. Entre estos últimos se encuentran determinados compuestos que pueden ser extraídos por una disolución hidroalcohólica como es el vino. La composición química del corcho y su perfil sensorial se ven afectados por el proceso de fabricación del tapón. [3] El corcho se extrae del alcornoque (Quercus suber L.) en turnos que van de los 9 a los 14 años; posteriormente es almacenado a la intemperie antes del cocido. En este proceso el corcho se sumerge en agua hirviendo, las células se dilatan de forma irreversible y la plancha de corcho aumenta el grosor y pierde densidad. El corcho es clasificado en función del grosor y la calidad visual según su destino: refugo para triturar, corcho destinado a producir tapones cilíndricos y corcho delgado destinado a producir arandelas para tapones de vino espumoso. Para producir tapones para vino, las planchas de corcho son cortadas en rebanadas y son perforadas, produciendo cilindros de corcho que, una vez lavados, marcados y aplicado el tratamiento de superficie, se convierten en el tapón acabado. Los procesos de reposo y de cocido del corcho son los que presenta mayor impacto en la composición aromática del tapón acabado; el cocido implica, por ejemplo, un incremento en la concentración de vainillina. El origen geográfico del corcho también puede incidir en su composición química [4]. El corcho es el tejido vegetal que constituye la corteza del alcornoque, que presenta la peculiaridad de regenerarla después de cada extracción. El alcornocal se desarrolla en la zona oeste de la región mediterránea, desde las costas atlánticas del norte de África y la península Ibérica hasta las regiones del sureste de Italia, incluyendo las islas del oeste del Mediterráneo y la franja costera del Magreb. Algunos componentes minoritarios pueden utilizarse para discriminar las poblaciones de origen del corcho. El análisis de las poblaciones de alcornocal mediante marcadores del DNA de los cloroplastos (microsatélites) identifica 5 diferentes halotipos, cada uno de ellos distribuido en las poblaciones de una determinada área geográfica [5]. Esta variabilidad genética puede ser origen también de variabilidad en la composición química. El objetivo de este trabajo fue determinar los compuestos positivos presentes en el corcho y que pueden contribuir a la calidad sensorial de los vinos. Para ello se ha determinado el perfil aromático de tapones de corcho natural de nueve zonas distintas. 49

ESTUDIO DEL PERFIL SENSORIAL DE LOS TAPONES DE CORCHO NATURAL PARA VINOS TRANQUILOS

Materiales y métodos Tapones de corcho Se analizaron tapones acabados producidos a partir de corcho de 9 procedencias distintas de 4 países distintos (figura 1). • Portugal: Vale do Tejo, Alentejo y Algarve. • España: Extremadura, Cataluña y Valencia. • Italia: Toscana y Cerdeña. • Marruecos: Maâmora. En todos los casos las dimensiones de los tapones fueron 44x24 mm, la clase visual extra y el tratamiento de superficie de silicona. Maceración Los tapones de corcho fueron triturados hasta 0,5-1 mm de diámetro de partícula, y 25 g fueron macerados en un litro de disolución hidroalcohólica (12% vol.) durante 10 días a temperatura ambiente.

Valle del Tajo

Algarve

Valencia

Cataluña

Maâmora

Cerdeña

Alentejo

Toscana

Extremadura

Figura 1. Procedencias del corcho analizado sobre el mapa de distribución mundial del alcornocal (en rojo). 50

Jordi Roselló, Miquel Puxeu y Juan-José R. Coque

Extracción en fase sólida Se utilizó resina LiChrolut EN empaquetada en cartuchos de 200 mg (Merk, Darmstadt, Alemania). Los cartuchos fueron lavados y acondicionados con 5 ml de diclorometano, 4 ml de etanol y, finalmente, con 5 ml de disolución hidroalcohólica. Cien mililitros del macerado de corcho, a los que se ha añadido 100 µl de disolución de 2-octanol como patrón interno, pasaron a través del cartucho de extracción en fase sólida (SPE) a 2 ml/minuto. Posteriormente el sorbente fue secado y los analitos fueron recuperados con 5 ml de diclorometano. Las muestras fueron concentradas al rotavapor hasta 300 µl. Análisis por GC-MS El análisis por GC-MS se realizó mediante un cromatógrafo de gases GC 7890 (Agilent Tecnologíes, Wilmington, USA) acoplado a un detector de espectrometría de masas MSD 5975C (Agilent Tecnologíes, Wilmington, USA). La columna utilizada fue una HP5-MS (Agilent Tecnologíes, Wilmington, USA). El programa de temperaturas fue de 40º C (durante un minuto), 5º C/minuto hasta 225º C, 20º C/minuto hasta 290º C. Los compuestos volátiles se identificaron mediante comparación de los espectros de masas con la librería NIST (Agilent Tecnologíes, Wilmington, USA) y mediante sus tiempos de retención. El calibrado se realizó mediante el análisis de soluciones de concentración conocida de los patrones de los distintos compuestos en diclorometano.

Resultados Se detectaron 29 compuestos aromáticos en las muestras de corcho analizadas, que han sido agrupados en las siguientes familias: vainillina y derivados, fenoles volátiles, aldehídos, cetonas, cetonas aromáticas, alcoholes, terpenoles, furanos, ácidos aromáticos, ésteres etílicos y ácidos grasos. La vainillina es el compuesto con impacto positivo sobre el vino, que se ha detectado en el corcho a mayor concentración y está presente en el aroma de los vinos criados en barrica. Otros compuestos detectados y que aportan aromas relacionados son la acetovainillona y la vainilil metil cetona.

51

ESTUDIO DEL PERFIL SENSORIAL DE LOS TAPONES DE CORCHO NATURAL PARA VINOS TRANQUILOS

4.000 3.500 3.000

mg / g corcho

2.500 2.000 1.500 1.000 500

Vainilil metil cetona

Acetovainilllona

-500

Vainillina

0

Vainillina y derivados

Figura 2. Media y desviación estándar de la concentración de vainillina y derivados en las muestras de corcho analizadas.

Otros compuestos detectados han sido: • Fenoles volátiles: eugenol, vinilguaiacol, isoeugenol, guaiacol y cerulignol (figura 3). • Alcoholes: alcohol feniletílico y alcohol bencílico (figura 4). • Aldehídos: benzaldehído, bencenacetaldehído y nonanal (figura 4). • Cetonas: 2-octanona y acetofenona (figura 4). • Terpenoles: β-terpineol, 4-terpineol, α-terppineol, alcanfor, veratrol y borneol (figura 5). • Ésteres etílicos: octanoato de etilo, γ-nonalactona (figura 6). • Ácidos grasos: ácido nonanoico y ácido dodecanoico (figura 6) • Furanos: furfural y 2-pentilfurano (figura 7). • Cetonas aromáticas: benzofenona (figura 8). • Ácidos aromáticos: ácido bencenacético (figura 9). La mayoría de estos compuestos se detectan frecuentemente en el vino y contribuyen a su aroma. Algunos pueden aparecer en alimen52

Jordi Roselló, Miquel Puxeu y Juan-José R. Coque

tos como la miel, el queso, o en aceites esenciales, o son productos de degradación de la madera. Lista de símbolos utilizados para indicar la contribución aromática de los compuestos positivos detectados en el corcho:

Frutas

Verde

Crema de vainilla

Cítricos

Pino

Coco

Rosa

Almendras

Caramelo

Floral

Especias

Miel

Clavel

Clavo

Humo

Verduras

Madera

Cera

Menta

Vainilla

Queso

53

ESTUDIO DEL PERFIL SENSORIAL DE LOS TAPONES DE CORCHO NATURAL PARA VINOS TRANQUILOS

800 700 mg / g corcho

600 500 346,6

400 300

5,1

7,4

9,7 Cerulignol

14,6

Isoeugenol

100

Eugenol

200

Vinilguaiacol

-100

Guaiacol

0

Fenoles volátiles

Figura 3. Media y desviación estándar de la concentración de fenoles volátiles en las muestras de corcho analizadas.

35 30 mg / g corcho

25 20

16,6

15 5,1 10

2,2

3,1

5

2,9

0,7

0,5

Aldehídos

Cetonas

Alcohol bencílico

Alcohol feniletílico

Actofenona

2-octanona

Bencenacetaldehído

Nonanal

-5

Benzaldehído

0

Alcoholes

Figura 4. Media y desviación estándar de la concentración de aldehídos, cetonas y alcoholes en las muestras de corcho analizadas. 54

Jordi Roselló, Miquel Puxeu y Juan-José R. Coque

15

mg / g corcho

13

9,4

11 9 7

3,8 2,8

5 3

1,3

0,7

0,3

a-Terppineol

4-Terpineol

Borneol

Veratrol

β-Terpineol

-1

Alcanfor

1

Terpenoles

Figura 5. Media y desviación estándar de la concentración de terpenoles en las muestras de corcho analizadas.

14 12 5,3

mg / g corcho

10 8 3,3

6

4,7

4 2

0,1

Ésteres etílicos

Ácido dodecanoico

Ácido nonanoico

g-nonalactona

-2

Octanoato de etilo

0

Ácidos grasos

Figura 6. Media y desviación estándar de la concentración de ésteres etílicos y ácidos grasos en las muestras de corcho analizadas. 55

ESTUDIO DEL PERFIL SENSORIAL DE LOS TAPONES DE CORCHO NATURAL PARA VINOS TRANQUILOS

600 500

193,4

mg / g corcho

400 300 200 100

3,7

1,1

3,2 Ácido bencenacético

Furanos

Benzofenona

Furfural

-100

2-Pentilfurano

0

Cetonas aromáticas

Ácidos aromáticos

Figura 7. Media y desviación estándar de la concentración furanos, cetonas aromáticas y ácidos aromáticos en las muestras de corcho analizadas.

La desviación estándar es muy elevada en muchos de los compuestos e indica diferencias importantes entre las concentraciones detectadas en los 9 corchos analizados. En la figura 7, figura 8 y figura 9 se muestran las diferencias de concentración de ácido dodecanoico, vainillina y benzenacetaldehído. 20

mg / g corcho

15

10

5

España

Italia

Portugal

Maâmora

Algarve

Alentejo

Valle del Tajo

Cerdeña

Toscana

Extremadura

Valencia

Cataluña

0

Marruecos

Figure 8. Concentración de ácido dodecanoico en los 9 corchos analizados. 56

Jordi Roselló, Miquel Puxeu y Juan-José R. Coque

60

mg / g corcho

50 40 30 20 10

España

Italia

Portugal

Maâmora

Algarve

Alentejo

Valle del Tajo

Cerdeña

Toscana

Extremadura

Valencia

Cataluña

0

Marruecos

Figura 9. Concentración de bencenacetaldehído en los 9 corchos analizados.

8.000 7.000 mg / g corcho

6.000 5.000 4.000 3.000 2.000 1.000

España

Italia

Portugal

Maâmora

Algarve

Alentejo

Valle del Tajo

Cerdeña

Toscana

Extremadura

Valencia

Cataluña

0

Marruecos

Figura 10. Concentración de vainillina en los 9 corchos analizados.

A partir de los datos de concentraciones de los distintos compuestos en los tapones de distintas procedencias se ha llevado a cabo un análisis de componentes principales (PCA). El primer componente 57

ESTUDIO DEL PERFIL SENSORIAL DE LOS TAPONES DE CORCHO NATURAL PARA VINOS TRANQUILOS

principal, que recoge el 40% de la variabilidad, ordena los corchos según su origen. Los corchos atlánticos y de España continental aparecen a la izquierda del gráfico y los corchos mediterráneos a la derecha. Teniendo en cuenta los dos primeros componentes principales se establecen cuatro grupos. Un primer grupo formado por los corchos de Alentejo y Valle del Tajo con una importante contribución de aldehídos y vainilla. Un segundo grupo, por los corchos de Algarbe, Extremadura y levante español, cuya contribución principal son los fenoles volátiles. El corcho de Marruecos se diferencia del resto por su contribución de furanos, ácidos aromáticos y ésteres etílcos. Finalmente, los corchos Italianos (Cerdeña y Toscana) se caracterizan por la contribución de cetonas, alcoholes y ácidos grasos (figura 11).

Biplot (ejes F1 y F2: 60,70%)

4 Ácidos aromáticos Ácidos grasos

3 Ésteres de etilo

Alentejo

F2 (20,36%)

1

Alldehídos

Furanos

Cerdeña

Marruecos Terpenoles

2

Alcoholes Cetonas Toscana Cetonas aromáticas

Valle del Tajo Vainillina y derivados

0 Cataluña

-1 Algarve

-2

Extremadura

Valencia

-3 Fenoles volátiles

-4 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 F1 (40,34%)

Figura 11. Análisis de componentes principales (PCA) de las familias de aromas en los distintos corchos analizados (PC1 vs. PC2).

58

Jordi Roselló, Miquel Puxeu y Juan-José R. Coque

Conclusiones • El corcho presenta compuestos aromáticos que pueden ser extraídos por un medio hidroalcohólico, como es el vino, capaces de tener un impacto positivo sobre la calidad sensorial. Muchos de estos compuestos positivos se encuentran también en el vino aportando aromas de fruta, floral, madera, tostado. • El perfil sensorial de los distintos tapones de corcho analizados y en consecuencia el potencial efecto positivo sobre el vino es muy diverso. Existe una gran diferencia entre la composición aromática de los distintos tapones analizados. Se observan concentraciones muy distintas en compuestos con elevado impacto positivo sobre el vino como puede ser la vainillina, el ácido dodecanoico o el furfural. • Las muestras analizadas muestran una relación entre el perfil sensorial de los tapones y la zona de procedencia del corcho. Puede resultar interesante profundizar en la relación entre la zona de origen del corcho y su perfil sensorial.

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