VALORES DE REFERENCIA DE LINFOCITOS T CD4 Y T CD8 EN NIÑOS MEXICANOS BIEN NUTRIDOS

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA-

Iztapalapa

DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA SALUD

VALORES DE REFERENCIA DE LINFOCITOS T CD4 Y T CD8 EN NIÑOS MEXICANOS BIEN NUTRIDOS

Proyecto de Servicio Social Para obtener la Licenciatura en

Biología Experimental

PRESENTA Pérez Arechiga Julieta Isabel Asesoras: Dra. Leonor Rodríguez Cruz Dra. Maria Cristina González Torres 13 de junio de 2006

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INTRODUCCIÓN Diferentes tipos de inmunidad El sistema inmunológico es esencial para la vida, le permite a los seres vivos preservar su identidad. Para sobrevivir, un organismo necesita distinguir entre las moléculas propias y las extrañas a fin de aceptar las primeras y rechazar las segundas. Este sistema está estructurado para ejecutar su función con alta eficiencia, utilizando interacciones entre diferentes tipos de células (Rose y col., 1983). Existen principalmente dos mecanismos inmunológicos para defender al organismo del ataque de bacterias, virus, células transformadas y otros agentes extraños; el primero es conocido como inmunidad innata y el otro como inmunidad adquirida o específica. La inmunidad innata es llamada en ocasiones inmunidad natural, esta presente desde el nacimiento y comprende diversos elementos no específicos, como la piel que forma la primera línea de defensa contra la penetración de microorganismos. En este tipo de inmunidad participan células fagocitarias como macrófagos, monocitos y neutrófilos, además de las células asesinas naturales (NK), estos tipos celulares destruyen antígenos de manera inespecífica (Kägi y col., 1995). Cuando ocurre la penetración de microorganismos, los organismos invasores encuentran otros elementos del sistema inmunitario innato como lisozimas, que están distribuidas ampliamente en las secreciones, y pueden lesionar la pared celular de muchas bacterias (Stites y Terr, 1993) Por otra parte, la inmunidad adquirida puede ser de dos tipos: inmunidad humoral e inmunidad celular. La inmunidad humoral es mediada por los anticuerpos que son los responsables de reconocer al antígeno específico y de eliminarlo. En la inmunidad celular o inmunidad mediada por células, los linfocitos son los encargados del control y de la alta especificidad de este tipo de respuesta inmunológica (MacDonald y Nabholz, 1986)

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La inmunidad adquirida se distingue por su impresionante especificidad contra el inmunógeno agresor y por su memoria (es decir, se observan respuestas aumentadas ante encuentros subsecuentes con el mismo inmunógeno u otro estrechamente relacionado). En la respuesta adquirida, el agente extraño dispara una cadena de sucesos que dan como resultado la activación de linfocitos de memoria y la producción de anticuerpos que permite una respuesta más rápida y eficaz (Sittes y Terr, 1993). La integración de las respuestas innata y adquirida constituye un sistema de defensa notablemente eficaz gracias al cual, si bien pasamos nuestra existencia continuamente rodeados de microorganismos potencialmente patógenos, experimentamos enfermedades infecciosas con relativa baja frecuencia. Muchas infecciones son erradicadas con éxito por el sistema inmunitario innato y no causan patología, mientras que aquellas que activan la inmunidad adquirida suelen ser controladas de forma satisfactoria y seguida de inmunidad duradera (Janeway y col., 2000). Componentes del sistema inmunológico Todos los elementos celulares de la sangre, incluyendo las células rojas o eritrocitos que transportan el oxígeno, las plaquetas que activan la coagulación de la sangre en los tejidos lesionados, y las células blancas o leucocitos, se originan a partir de las mismas células progenitoras: las células madre hematopoyéticas residentes en la médula ósea. En particular, los leucocitos se clasifican como granulocitos (neutrófilos, eosinófilos y basófilos), monocitos y linfocitos (Figura 1).

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Figura 1. Se esquematizan todos los tipos de leucocitos.

Los granulocitos, también llamados leucocitos polimorfonucleares, son un conjunto heterogéneo de células cuyos gránulos prominentes les confieren su patrón característico; en estos se incluyen los neutrófilos que son células fagocíticas y son el componente más numeroso e importante de la respuesta inmunitaria innata ya que tienen la capacidad de abandonar el torrente sanguíneo para migrar a los focos de infección o inflamación. Por otro lado, los eosinófilos son esencialmente importantes en la defensa contra las infecciones por parásitos, del mismo modo que los basófilos. Los monocitos son células que maduran a macrófagos, los cuales están ampliamente distribuidos por los tejidos corporales donde desempeñan funciones esenciales en la inmunidad innata, además de su función como células presentadoras de antígenos (CPA). Los linfocitos (Figura 2) son células esféricas o discretamente ovoides, de 8 a 12 micras de diámetro. El núcleo ocupa el 90% del volumen de la célula y está formado por densos

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gránulos de cromatina que se tiñen intensamente de púrpura con los colorantes. El citoplasma de la célula es delgado, forma un anillo alrededor del núcleo y se tiñe de azul claro (Rojas, 1985).

Figura 2. La imagen muestra un linfocito, donde se aprecia que el núcleo ocupa un alto porcentaje del volumen total de la célula.

Las células más importantes especializadas en las funciones inmunológicas son los linfocitos. Existen tres tipos principales: linfocitos B, linfocitos T y linfocitos NK. Las células B maduran en la médula ósea, poseen inmunoglobulinas en la superficie celular que actúan como receptores de antígeno, una vez activadas en el torrente sanguíneo se diferencian a células plasmáticas que secretan inmunoglobulinas (anticuerpos) que constituyen una defensa frente a los gérmenes patógenos en el espacio extracelular del organismo. Los linfocitos T maduran en el timo y son responsables de las respuestas inmunitarias mediadas por células en la inmunidad adquirida. Estos linfocitos T reconocen fragmentos peptídicos de gérmenes patógenos intracelulares que han sido transportados a la superficie celular por las glicoproteínas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de las CPA y este mecanismo los activa estimulando la síntesis y secreción de diversas citocinas. Finalmente las células NK conocidas como células asesinas naturales son capaces de matar células tumorales o infectadas por virus. Los linfocitos circulan continuamente por el torrente sanguíneo a través de los órganos linfoides periféricos donde las células que muestran el antígeno son atrapadas, y regresan a la sangre a través de los vasos linfáticos. Los tres tipos principales de tejido linfoide periférico son el bazo que recoge antígenos procedentes de la sangre; los ganglios

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linfáticos, que captan antígenos de los lugares de infección en los tejidos y los tejidos linfoides asociados a mucosas (MALT), que recogen antígenos procedentes de las superficies epiteliales del cuerpo (Janeway y col., 2000). En la médula ósea los linfocitos T adquieren proteínas de membrana específicas que les permiten salir de ella hacia el timo, penetrarlo y colonizar en él. Durante su paso por el timo sufren nuevas transformaciones que les permiten ponerse en contacto con los distintos microorganismos que penetran al organismo, para iniciar así una respuesta inmunológica específica (Rojas, 1985). Dentro de los linfocitos T existen dos subpoblaciones, los linfocitos T cooperadores (CD4+) y los linfocitos T citotóxicos (CD8+).

SUBPOBLACIONES DE LINFOCITOS T Las células T CD4+ están especializadas en activar otras células y se dividen en dos clases funcionales (Figura 3): las células Th1 que activan macrófagos para llevar a cabo su función fagocítica para eliminar el antígeno. Este tipo de células también secretan citocinas que atraen macrófagos al foco de infección, por otro lado, las células Th2 activan a las células B para producir anticuerpos. Las células T CD8+ (Tc) reconocen a las células del organismo infectadas por virus o células transformadas. Existen dos tipos principales las células Tc tipo 1 cuya función principal es la citotoxidad, mientras las del tipo 2 tienen como función la supresión de la síntesis de anticuerpos. En las CPA existen moléculas especializadas en presentar péptidos antigénicos a las células T, éstas son glicoproteínas de membrana conocidas como MHC. Existen dos tipos de moléculas del MHC, llamadas MHC de clase I y MHC de clase II (Morrison y col., 1996). Las células T CD8+ reconocen complejos MHC de clase I, se activan para destruir células que exhiben péptidos extraños derivados de agentes patógenos citosólicos. Las células CD4+ reconocen complejos MHC de clase II, están especializadas en activar otras células

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inmunitarias efectoras, como por ejemplo las células B o macrófagos, para que actúen contra los antígenos o agentes patógenos extraños que han capturado (Morrison y col., 1996).

Figura 3. Las células CD4+ se pueden diferenciar en dos clases funcionales: Th1 y Th2.

Estudios de subpoblaciones de linfocitos Las células T se identifican en sangre periférica por sus marcadores de superficie específicos. Uno de los métodos utilizados para cuantificar éstas células es detectarlas mediante anticuerpos específicos, dirigidos contra sus marcadores de membrana. Se han realizado estudios para cuantificar los linfocitos de diferentes subpoblaciones, tanto en niños como en adultos. Mediante la técnica de citometría de flujo, Reichert y col (1991) analizaron la distribución de células (B) CD19+, células (T) CD4+, CD8+, y células (NK) CD56+ en sujetos sanos, para determinar los intervalos de referencia de estas células en adultos caucásicos. Se estudiaron 417 sujetos sanos con edades entre 18 y 70 años. Los resultados mostraron que las células CD19+ presentaron valores significantemente altos en relación a la edad y no encontraron diferencias entre hombres y mujeres. En relación a las células CD3+ y CD4+ demostraron que hubo mayor número de éstas células en los varones y que las CD3+ descendieron y las CD4+ se incrementaron con respecto a la edad, por el contrario las células CD8+ mostraron disminución en el número de células al incrementarse la

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edad. En las células NK (CD56+) demostraron que los varones tuvieron niveles más altos que las mujeres. Posteriormente, Denny y col (1992) evaluaron el número de linfocitos CD4+ y CD8+, en 208 niños sanos con edades de uno a 59 meses. Sus resultados demostraron que el conteo de linfocitos CD4+ fue significativamente alto en niños pequeños, en relación a los niños mayores, con respecto a las células CD8+ los niveles se incrementaron según aumenta la edad. Estos datos demuestran que es importante considerar la edad para la evaluación del número de células en cada una de las subpoblaciones de linfocitos en niños, ya que estos valores son especialmente importantes y juegan un papel central en el monitoreo de la progresión algunas enfermedades. En 1992, Kotylo y col. evaluaron mediante el citómetro de flujo, los intervalos de referencia para diferentes subpoblaciones de linfocitos en pacientes pediátricos, examinaron a un grupo de 130 niños en edades que fluctuaron entre un mes a 17 años. En este estudio se encontró que la proporción de linfocitos T CD4+ y T CD8+ fue mayor en niños menores de 3 años de edad que en los niños mayores. Además se observó que después de los 3 años y hasta la edad adulta la cantidad de linfocitos se mantienen en números similares. Robinson y col. (1996) realizaron el análisis en 233 niños sanos, entre 4.9 y 13.7 años, para determinar los intervalos normales de las subpoblaciones de linfocitos en niños europeos. Los resultados mostraron que las células CD4+ y CD8+ presentaron tendencias opuestas, mientras las células CD4+ bajaron en número y porcentaje, las células CD8+ se incrementaron gradualmente conforme avanza la edad. En 1997, Lisse y col. evaluaron las subpoblaciones de linfocitos en 803 niños sanos, con edades entre 2 y 71 meses, de tres comunidades diferentes del Oeste de África. Los resultados mostraron que las células CD4+ disminuyeron a partir del nacimiento y hasta los dos años de edad, posteriormente se incrementaron hasta los cuatro años y cinco años de edad. En relación a las células CD8+ se observó un incremento gradual desde el

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nacimiento. Por género se encontró que las niñas tuvieron menor proporción de células CD8+ que los niños. Shahabuddin y col. (1998) evaluaron las subpoblaciones de linfocitos mediante la técnica de citometría de flujo, analizaron la sangre de 102 niños originarios de Arabia Saudita de entre un mes a 13 años y 30 adultos de 18 a 44 años. Los investigadores demostraron que la subpoblacion de linfocitos T CD4+ decreció conforme fue avanzando la edad, el número de células fue muy similar entre los adultos y los niños mayores a cuatro años, mientras que las células CD8+ y CD3+ incrementaron sus valores gradualmente con la edad. Por otro lado, Bunders y col. (2005) establecieron intervalos de referencia de las subpoblaciones de linfocitos T CD4+ y T CD8+ en niños nacidos en Europa en particular para verificar si existe diferencia entre niños negros y blancos. El análisis se realizó a 484 niños negros sanos en edades de un día de nacidos a 5 años y en 1296 niños blancos de un día a 10 años de edad. Encontraron que el conteo de subpoblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ varió principalmente en los primeros 3 años de vida, en esta etapa observaron niveles altos de células T CD4+, en particular más altos en los niños blancos, después de los tres años los valores en ambos grupos comenzaron a descender. Para las células T CD8+ los valores después de los tres años se incrementaron, en los niños blancos se encontraron valores más altos que en los niños negros de la misma edad. Es importante recalcar que a pesar de que existen algunos estudios para establecer valores de referencia de las subpoblaciones de linfocitos, no existe uno en el que se hayan evaluado los números absolutos de células T CD4+ y CD8+ en niños mexicanos. Se consideró importante hacer el análisis en diferentes intervalos de edad en el que se incluyeron niños de hasta cinco años, debido a que en estudios previos se reporta que existen diferencias en la proporción de células entre niños menores y mayores de tres años. Por lo que resulta interesante evaluar si estas variaciones pueden apreciarse en diferentes intervalos de edad en niños mexicanos.

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Para cuantificar el número absoluto de las subpoblaciones de linfocitos T en niños mexicanos, fue esencial disponer de técnicas capaces de permitir el análisis cuantitativo simultáneo de las subpoblaciones. Un instrumento muy potente para definir y enumerar linfocitos es el citómetro de flujo, que detecta y cuenta individualmente las células en una corriente de líquido iluminada por un haz de láser. Citómetro de flujo El citómetro de flujo es un aparato que examina las células de manera cuantitativa, y revisa sus propiedades físicas o biológicas de un modo preciso. La utilización del citómetro de flujo en la práctica clínica en el área inmunológica, hematológica y en el estudio de enfermedades neoplásicas, optimiza el trabajo. Es un aparato rápido, eficaz, sensitivo y práctico. La manera en que el citómetro de flujo analiza las células se basa en una serie de detectores electrónicos ópticos (Figura 4) que pueden incrementar y amplificar la señal producida durante la interacción de un haz de luz. Los resultados de los pulsos electrónicos son digitalizados, los datos son almacenados, analizados y mostrados a un sistema de cómputo. Los resultados finales proporcionan información cuantitativa de cada célula que ha sido analizada (Riley y col, 1993). La identificación y cuantificación de antígenos celulares por el uso de anticuerpos monoclonales es una de las aplicaciones más importantes del citómetro de flujo. El citómetro de flujo se utiliza para estudiar poblaciones celulares identificadas mediante anticuerpos monoclonales marcados con tinción fluorescente dirigidos contra proteínas de la superficie celular, o bien, mediante anticuerpos específicos seguidos de antiinmunoglobulinas marcadas. La mezcla de células marcadas se introduce en una celda de flujo, de forma forzada, con un volumen mucho mayor de solución salina, a fin de crear una corriente capilar de líquido que contenga las células individuales separadas entre sí. Cuando cada célula pasa a través del haz del láser, hace que se disperse la luz, entonces las moléculas de fluorocromo que se encuentren unidas a la célula serán excitadas y fluorescerán.

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Tubos fotomultiplicadores sensibles detectan tanto la luz dispersada, que proporciona información sobre el tamaño y granularidad de cada célula, como las emisiones de fluorescencia, que suministran información sobre la unión de los anticuerpos monoclonales marcados y por lo tanto sobre la expresión de las proteínas de la superficie de cada célula (Riley y col, 1993) .

Figura 4. Se muestra el sistema de detección que utiliza el citómetro de flujo.

Cuando las células se marcan con un sólo anticuerpo fluorescente, los datos se representan mediante un histograma de intensidad de fluorescencia frente al número de células. Si se utilizan dos o más anticuerpos, cada uno conjugado con diferentes fluorocromos, los datos suelen representarse con un diagrama bidimensional de dispersión o un diagrama de contornos, en el cual la fluorescencia de cada célula para el anticuerpo marcado con el primer fluorocromo se confronta con el marcaje del segundo; por lo tanto, una población de células marcadas con el primer fluorocromo puede subdividirse en función de su marcaje con el segundo anticuerpo. Una vez que se examinaron las células, el citómetro puede proporcionar información con respecto a la cantidad de células que posen diferentes marcadores, como las inmunoglobulinas de 12

superficie que caracterizan a las células B, las moléculas asociadas al receptor de células T y las proteínas receptoras CD4 y CD8 que distinguen las principales subpoblaciones de células T (Riley y col, 1993).

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA El objetivo principal de este trabajo fue conocer los números absolutos de las subpoblaciones de linfocitos T, en niños mexicanos bien nutridos sanos menores de cinco años, para así establecer intervalos de referencia normal. A nivel médico estos datos permitirán conocer posibles alteraciones del sistema inmunológico en poblaciones que presenten alguna patología asociada. Así mismo, se podrían establecer si los niños mexicanos presentan diferencias con respecto a los patrones de referencia de otros grupos poblacionales.

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OBJETIVOS

• Cuantificar el número de linfocitos T del tipo CD4+ en niños bien nutridos mexicanos, en edades que fluctuaron entre 0 y 5 años de edad. • Cuantificar el número de linfocitos T CD8+ en niños bien nutridos mexicanos, en edades que fluctuaron entre 0 y 5 años de edad.

GRUPO DE ESTUDIO

CRITERIOS DE INCLUSIÓN: El estudio se realizó con niños en edades que fluctuaron entre los 0 y 5 años de edad, clínicamente sanos, bien nutridos con peso y talla correspondientes a su edad cronológica de acuerdo los valores reportados para niños mexicanos (Ramos-Galván, 1976).

CRITERIOS DE EXCLUSION: Niños mayores de 5 años de edad. Niños que presentaron algún tipo de infección viral o bacteriana. Niños que se encontraron por debajo de su peso y talla ideal de acuerdo a su edad.

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METODOLOGIA El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del IMSS. Los niños que participaron en el estudio formaban parte del programa de Niño Sano de la Clínica 35 del IMSS y para su inclusión se solicitó el consentimiento firmado de los padres.

I.- Obtención de muestras Se obtuvieron aproximadamente 2 mL de sangre de niños que cumplieron con los criterios de inclusión y no presentaron ninguno de los criterios de exclusión. Estos niños fueron integrados en alguno de los siguientes subgrupos de estudio de acuerdo a su edad: Grupo 1: Niños de 0 a 12 meses Grupo 2: Niños de 13 a 24 meses Grupo 3: Niños de 25 a 36 meses Grupo 4: Niños de 37 a 48 meses Grupo 5: Niños de 49 a 60 meses Las muestras de sangre se obtuvieron por vía venosa por punción con un Vacutainer que contenía EDTA como anticoagulante. Para llevar a acabo el análisis se utilizaron tubos TruCOUNT Becton Dickinson (No. Catálogo 340334) diseñados para determinar cuentas absolutas de células. II.- Procedimiento 1. Para cada muestra se etiquetó un tubo TruCOUNT, al que se le adicionaron 10 µL de los anticuerpos marcados: anti CD3-FITC, anti CD4-PE y anti CD45-PerCP. 2. Posteriormente a cada tubo se le adicionaron 50 µL de sangre. 3. Se cubrieron los tubos con papel aluminio y se agitaron en el vortex vigorosamente, se incubaron por 15 min. en oscuridad a temperatura ambiente. 4. Se les adicionaron a cada tubo 450 µL de solución de lisis (para eliminar a los eritrocitos). 15

5. Se cubrieron los tubos con papel aluminio y se agitaron en el vortex gentilmente, posteriormente se incubaron por 15 min. en oscuridad a temperatura ambiente. 6. Después de este tiempo las muestras estuvieron listas para leerlas en el citómetro de flujo. 7. Se analizaron 20,000 células de cada una de los tubos, utilizando un citómetro de flujo modelo FACScalibur (Becton Dickinson) y el software CELL Quest. Se verificó previamente el funcionamiento del equipo y la adecuada discriminación de las diferentes fluorescencias (compensación) empleando las perlas de calibración (CaliBRITE) y el software FACSCOMP. Los resultados se analizaron empleando el software CELL Quest, con el cual se desplegaron gráficas de punto (dot plot) (Figura 5), se eligieron las regiones de análisis y a partir de ella se detectaron las células positivas para cada uno de los marcadores.

CD4+

CD8+

Región de análisis (Linfocitos) Figura 5. Gráficas de puntos (Dot plot) a partir de las cuales primero se seleccionó la región de análisis (figura de la izquierda) y posteriormente se graficaron células CD3+ contra CD4+ de donde se obtuvieron los datos del número de células CD4+ y CD8+.

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III.- Análisis de datos En todos los casos se evaluó el número de células positivas para los marcadores de superficie. La cuenta absoluta de células de las diferentes subpoblaciones se realizó utilizando los tubos TruCount (Becton Dickinson) y fueron calculados basándose en la siguiente fórmula:

# de eventos de la población celular

Cuenta = absoluta # de eventos de la población de perlas (R2)

X

# total de perlas de cuenta absoluta Volumen de sangre

Los resultados fueron expresados como media ± error estándar. Las diferencias entre grupos de edad fueron analizadas utilizando la prueba no paramétrica U- de MannWhitney. Las diferencias con valores de p