LINFOCITOS T STEM CELL MEMORY CD8+ Y OTRAS SUBPOBLACIONES DE MEMORIA EN PACIENTES CON ENFERMEDAD DE CHAGAS

JOSE YESID MATEUS TRIVIÑO, Bact.

Trabajo de grado para optar al título de MAGISTER EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS PROGRAMA DE POSGRADO BOGOTÁ D.C., 2014

LINFOCITOS T STEM CELL MEMORY CD8+ Y OTRAS SUBPOBLACIONES DE MEMORIA EN PACIENTES CON ENFERMEDAD DE CHAGAS

JOSE YESID MATEUS TRIVIÑO, Bact.

ADRIANA CUÉLLAR, MSc, PhD. Directora

CONCEPCIÓN J. PUERTA, PhD. Directora

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS PROGRAMA DE POSGRADO BOGOTÁ D.C., 2014

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución No. 13 de julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vean en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

LINFOCITOS T STEM CELL MEMORY CD8+ Y OTRAS SUBPOBLACIONES DE MEMORIA EN PACIENTES CON ENFERMEDAD DE CHAGAS

JOSE YESID MATEUS TRIVIÑO, Bact.

APROBADO

CONCEPCIÓN J. PUERTA, PhD. Decana Facultad de Ciencias

MANUEL A. FRANCO, MD, PhD. Director de posgrado Facultad de Ciencias

TABLA DE CONTENIDO TABLA DE CONTENIDO..................................................................................................... 5 1. RESUMEN .................................................................................................................. 8 2. ABSTRACT ................................................................................................................. 9 3. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 10 4. MARCO TEÓRICO..................................................................................................... 13 4.1 ENFERMEDAD DE CHAGAS ............................................................................................ 13 4.1.1 AGENTE ETIOLÓGICO ....................................................................................................... 14 4.1.2 CICLO DE VIDA ................................................................................................................ 14 4.1.3 VARIABILIDAD ................................................................................................................ 15 4.1.4 FASES DE LA ENFERMEDAD Y MANIFESTACIONES CLÍNICAS ........................................................ 16 4.1.5 PATOLOGÍA ................................................................................................................... 17 4.2 GENERALIDADES DE LA RESPUESTA INMUNE ...................................................................... 19 4.2.1 SUBPOBLACIONES DE LINFOCITOS T CD8+ DE MEMORIA ......................................................... 22 4.2.2 RESPUESTA INMUNE FRENTE A T. CRUZI ............................................................................... 24 5. OBJETIVOS .............................................................................................................. 31 5.1 OBJETIVO GENERAL ..................................................................................................... 31 5.1.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................................................................... 31 6. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................ 32 6.1 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN ........................................................................................ 32 6.2 POBLACIÓN DE ESTUDIO ............................................................................................... 32 6.3 LISADO DE TRIPOMASTIGOTES DE T. CRUZI ........................................................................ 33 6.4 ANTICUERPOS CONJUGADOS FLUORESCENTES .................................................................... 34 6.5 MARCAJE DE MOLÉCULAS DE SUPERFICIE Y CITOQUINAS PARA CITOMETRÍA DE FLUJO ................... 34

5

6.6 DETECCIÓN DEL PARÁSITO MEDIANTE PCR CONVENCIONAL Y CUANTITATIVA ............................. 36 6.7 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ................................................................................................. 37 7. RESULTADOS ........................................................................................................... 38 7.1 FRECUENCIA

DE LAS SUBPOBLACIONES DE

LT CD8+

TOTALES EN PACIENTES CON ENFERMEDAD DE

CHAGAS EN FASE CRÓNICA .................................................................................................... 38 7.2 FRECUENCIA

DE LAS SUBPOBLACIONES DE

LT CD8+

ESPECÍFICOS DE

T.

CRUZI EN PACIENTES CON

ENFERMEDAD DE CHAGAS EN FASE CRÓNICA .............................................................................. 41

7.3 PERFIL DE LA ACTIVIDAD FUNCIONAL DE LAS SUBPOBLACIONES DE LT CD8+ ESPECÍFICOS DE T. CRUZI DE PACIENTES CON ENFERMEDAD DE CHAGAS EN FASE CRÓNICA ......................................................... 43

8. DISCUSIÓN .............................................................................................................. 49 9. CONCLUSIÓN ........................................................................................................... 56 10. PERSPECTIVAS ......................................................................................................... 57 11. BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................... 58 12. ANEXOS................................................................................................................... 75 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Moléculas para la determinación de las subpoblaciones de LT CD8+ .................... 23 Tabla 2. Paneles multicolor para evaluar las subpoblaciones de LT CD8+ y las subpoblaciones de LT CD8+ productores de IFN-, TNF-α o IL-2. ......................................... 36 Tabla 3. Características de los participantes del estudio. .................................................... 38 Tabla 4. PCC con parasitemia detectable ............................................................................. 48 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Selección de las subpoblaciones de LT CD8+.. ....................................................... 39 Figura 2. Distribución de las subpoblaciones de LT CD8+ totales de los PCC y CS.. ............. 40 Figura 3. Correlación entre los TSCM CD8+ y TTE CD8+ de los PCC.. ........................................ 41 6

Figura 4. Selección de los LT CD8+ que producen IFN-, TNF-α o IL-2.. ................................ 42 Figura 5. Distribución de las subpoblaciones de LT CD8+ específicos de T. cruzi de los PCC.. .............................................................................................................................................. 43 Figura 6. Actividad funcional de las subpoblaciones de LT CD8+ específicos de T. cruzi de los PCC.. ................................................................................................................................ 44 Figura 7. Proporción de la actividad funcional de las subpoblaciones de LT CD8+ específicos de T. cruzi de los PCC.. .......................................................................................................... 45 Figura 8. Actividad funcional de las subpoblaciones de LT CD8+ específicos de T. cruzi de los PCC con diferentes estados de gravedad de la enfermedad.. ........................................ 46 Figura 9. Perfil de los LT CD8+ específicos de T. cruzi en los PCC según el estado de gravedad de la enfermedad. ................................................................................................ 48 Figura 10. Modelo de las subpoblaciones de LT CD8+ en PCC.. ........................................... 55 ÍNDICE DE ANEXOS Anexo 1. Encuesta para la recolección de datos de pacientes con enfermedad de Chagas. .............................................................................................................................................. 75 Anexo 2. Documento de consentimiento informado. .......................................................... 80 Anexo 3. Rango de la frecuencia de las subpoblaciones de LT CD8+ de PCC productores de IFN-, TNF-α o IL-2 frente al estímulo con SEB. .................................................................... 85 Anexo 4. Rango de la frecuencia de las subpoblaciones de LT CD8+ de PCC productores de IFN-, TNF-α o IL-2 frente al estímulo con el lisado del parásito. ........................................ 86 Anexo 5. Artículo publicado. ................................................................................................ 87 Anexo 6. Artículo en preparación. ...................................................................................... 101 Anexo 7. Presentaciones en congresos. ............................................................................. 132

7

1. RESUMEN En la infección por Trypanosoma cruzi se ha mostrado que los linfocitos T (LT) CD8+ juegan un papel importante en el control de la infección. Los LT CD8+ son una población heterogénea que incluye subpoblaciones con diferentes grados de diferenciación y capacidad multifuncional: Stem cell memory (TSCM), memoria central (TCM), memoria transicional (TTM), memoria efectora (TEM) y efectores terminales (TTE). Los TSCM son una subpoblación temprana que tienen la capacidad de auto-renovarse y diferenciarse en otras subpoblaciones celulares. Para evaluar si la distribución de los TSCM y de las otras subpoblaciones celulares de LT CD8+ está asociada al control de la progresión de la enfermedad de Chagas, células mononucleares de sangre periférica de pacientes con enfermedad de Chagas en fase crónica (PCC) se marcaron con anticuerpos conjugados para el análisis de las subpoblaciones de LT CD8+ y de la actividad multifuncional de las subpoblaciones productoras de IFN-, TNF-α o IL-2, encontrándose que los PCC con formas más graves de la enfermedad presentan una menor frecuencia de TSCM y una mayor frecuencia de TTE. De hecho, en estos pacientes no se detectaron TSCM específicos del parásito. Además, se observó la pérdida de la multifuncionalidad en pacientes con estados más graves de la enfermedad con células productoras de IFN- y TNF-α. Estos hallazgos sugieren que los TSCM podrían estar asociados en el control de la progresión de la enfermedad de Chagas, dado que estas células participan en la generación de otras subpoblaciones que se encargarían de controlar la replicación del parásito.

8

2. ABSTRACT CD8+ T cells have been shown to play a crucial role in Trypanosoma cruzi infection. Memory CD8+ T cells can be categorised based on their distinct differentiation stages and functional activities as follows: stem cell memory (TSCM), central memory (TCM), transitional memory (TTM), effector memory (TEM) and terminal effector (TTE) cells. To characterise the CD8+ T cell subsets that could be participating in the control of T. cruzi infection, we compared circulating CD8+ T cell subsets among chronic chagasic patients (CCPs) with different degrees of disease severity, and phenotypic and functional activity analyses were performed with peripheral blood mononuclear cells from CCPs. We observed a decreased frequency of total TSCM along with an increased frequency of TTE in CCPs with severe disease. Antigen-specific TSCM cells were not detectable in CCPs with severe forms of the disease. Functional profile of CD8+ T cell subsets among CCPs revealed a high frequency of monofunctional CD8+ T cells in the most severe patients with IFN-+- or TNF-α+-producing cells. These findings suggest that CD8+ TSCM cells could be associated with the immune response to and outcome of Chagas disease, given that these cells may be involved in repopulating the T cell pool that controls infection.

9

3. INTRODUCCIÓN La enfermedad de Chagas, causada por el parásito intracelular Trypanosoma cruzi, representa un problema de salud pública en América Latina con alrededor de 8 millones de personas infectadas, incluyendo Colombia donde para el 2005 se habían reportado alrededor de 436.000 personas infectadas (Rassi et al., 2010; WHO, 2012). La enfermedad de Chagas ha cobrado importancia en zonas no endémicas para la enfermedad como resultado de la migración de personas de áreas endémicas (Basile et al., 2011). La enfermedad se presenta con una fase aguda que pasa desapercibida, progresa a una fase crónica asintomática y alrededor de 10 al 30% de los pacientes desarrollan, 10 a 20 años más tarde, alteraciones cardiacas o digestivas que pueden llevar a la muerte (Rassi et al., 2010). En humanos con infección crónica por T. cruzi, aún no son claros los mecanismos inmunológicos involucrados en el control de la infección que evitan la progresión a la fase sintomática de la enfermedad. En modelos murinos de infección aguda por T. cruzi, se ha encontrado que los linfocitos T (LT) CD8+ y la producción de interferón gama (IFN-) y perforina son necesarios para el control de la parasitemia y la sobrevida de los ratones. Por ejemplo, ratones genéticamente modificados que no tienen LT CD8+, IFN- o peforina, muestran una alta parasitemia y un disminuido porcentaje de sobrevida comparado con los ratones silvestres (Tzelepis et al., 2006). Además, la ausencia de los LT CD8+ conlleva al aumento de la parasitosis y la inflamación en tejido cardiaco de ratones con infección crónica (Tarleton et al., 1994). En pacientes con enfermedad de Chagas con infección crónica, los LT CD8+ parecen declinar tanto en número como en función a lo largo de las décadas de infección. Se ha mostrado que las formas más graves de la enfermedad se asocian con una menor frecuencia de LT CD8+ productores de IFN- en pacientes con enfermedad de Chagas (Albareda et al., 2006; Laucella et al., 2004). En general, el estudio de los LT CD8+ ha mostrado que un mayor grado de diferenciación celular se relaciona con la pérdida de la actividad multifuncional. De 10

hecho, en algunos modelos, la multifuncionalidad se asocia con protección o control de progresión de la enfermedad (Seder et al., 2008), como es el caso de la infección crónica por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) (Betts et al., 2006) y virus de la hepatitis C (VHC) (Ciuffreda et al., 2008; Choi et al., 2013). En pacientes con formas graves de la enfermedad de Chagas se ha reportado una alta frecuencia de LT CD8+ con un estado de diferenciación tardío, las cuales tienen una disminuida capacidad de producir IFN-, hecho que podría asociarse a una falla en el control de la infección (Albareda et al., 2006). El desarrollo de tecnologías como la citometría de flujo multiparamétrica y la disponibilidad de un mayor número de conjugados para la detección de nuevas moléculas, permite realizar análisis más detallados de la composición de una población celular. De esta manera, se conoce en la actualidad que los LT CD8+ son una población heterogénea que incluye subpoblaciones con diferentes características en cuanto a su actividad funcional, capacidad de proliferar, sobrevivir y recircular en los órganos periféricos (Farber et al., 2014). Para el momento actual, se ha descrito que el compartimiento de los LT CD8+ de memoria comprende células: Stem cell memory (TSCM), memoria central (TCM), memoria transicional (TTM), memoria efectora (TEM) y efectores terminales (TTE) (Mahnke et al., 2013). Los TSCM CD8+ se describieron recientemente como una subpoblación temprana de larga vida con una alta capacidad de autorenovarse y diferenciarse en otras subpoblaciones de memoria clásicas como TCM y TEM (Gattinoni et al., 2011), sin embargo, hasta el momento no se conoce el papel que juegan estas células en la respuesta inmune de pacientes con enfermedad de Chagas. Teniendo en cuenta que los LT CD8+ son una población celular heterogénea, que la distribución de las subpoblaciones de memoria y la actividad multifuncional de los LT CD8+ se relacionan con el control de la progresión de la enfermedad en algunos modelos de infección y que en la enfermedad de Chagas aún no se conoce el papel de las subpoblaciones de LT CD8+ de memoria recientemente descritas como los TSCM, la

11

pregunta de investigación del presente trabajo fue: ¿Cómo se distribuyen los linfocitos T stem cell memory CD8+ y las otras subpoblaciones de memoria en cuanto a frecuencia y actividad multifuncional en pacientes con enfermedad de Chagas en fase crónica con distintos estados de gravedad?

12

4. MARCO TEÓRICO 4.1 Enfermedad de Chagas La enfermedad de Chagas, causada por el protozoo flagelado T. cruzi, es endémica en América Latina con alrededor de 8 millones de personas infectadas (WHO, 2012). En Colombia se estimó que para el 2005, 436.000 personas estaban infectadas y que el 11% de la población se encontraba en riesgo de adquirir la infección (Rassi et al., 2010). En la actualidad, la enfermedad es considerada un problema de salud pública en el mundo, debido a las migraciones de personas de áreas endémicas para la enfermedad a áreas no endémicas (Basile et al., 2011). Aunque la infección es adquirida principalmente por vía vectorial, la vía oral ha constituido una importante forma de transmisión en algunos países de Latinoamérica. Además, se han considerado otras vías de transmisión: congénita, transfusiones sanguíneas, trasplantes de órganos y accidentes de laboratorio (WHO, 2012). La enfermedad cursa con una fase aguda y una crónica y su diagnóstico varía según la fase en la que se encuentre el paciente. En la fase aguda la parasitemia es alta y se utilizan métodos directos (como el microhematocrito o el método de Strout) e indirectos (como el xenodiagnóstico) (Telleria et al., 2010). En la fase crónica la parasitemia es baja, por lo que los métodos directos no son los mejores, por lo tanto, se recomienda el uso de pruebas serológicas como la inmunofluorescencia indirecta (IFI), hemaglutinación indirecta (HAI) o el inmunoensayo ligado a enzima (ELISA). El criterio diagnóstico en esta fase es que al menos 2 pruebas serológicas con principio inmunológico diferente deben ser positivas (WHO, 2002). Además, se ha planteado el uso de la técnica reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de la infección, utilizando distintos blancos moleculares, sin embargo, debido a la baja parasitemia observada en los pacientes con enfermedad de Chagas en fase crónica, aún no se recomienda el uso de la PCR en el diagnóstico de la infección (Britto, 2009; Cummings et al., 2003).

13

En la actualidad existen dos fármacos utilizados para el tratamiento de la infección: Benznidazol y Nifurtimox. De acuerdo con su efectividad, el tratamiento se recomienda para los casos agudos, congénitos, de reactivación de la infección, para todos los niños con infección y para pacientes en fase crónica con menos de 18 años (Bern, 2011; Rassi et al., 2010). Aunque la efectividad del tratamiento en la fase crónica de la infección es controversial, debido a la falta de ensayos clínicos en humanos en fase crónica asintomática y sintomática, el tratamiento en este grupo de pacientes se ha sugerido debido a que en algunos pacientes en fase crónica evita la progresión de la enfermedad y la disminución de anticuerpos séricos específicos de T. cruzi (Cancado, 2002; Saude., 2005; Viotti et al., 2006). Estos fármacos son altamente tóxicos y presentan efectos secundarios como fiebre, dolor abdominal y muscular, anorexia, nauseas, vómito, pérdida de peso, reacciones subcutáneas, entre otros (Bern, 2011). 4.1.1 Agente etiológico T. cruzi es un parásito protozoo flagelar que se caracteriza por organizar su ADN mitocondrial en un orgánulo conocido como Cinetoplasto, pertenece al dominio Eukaryota, filo Euglenozoa, orden Kinetoplastida y familia Trypanosomatidae. Presenta cuatro formas durante su ciclo de vida: epimastigotes, tripomastigotes metacíclicos, amastigotes y tripomastigotes sanguíneos (Stuart et al., 2008). 4.1.2 Ciclo de vida T. cruzi es transmitido al hombre a través de las heces de insectos hematófagos infectados de la familia Reduviidae, subfamilia Triatominae, que se alimentan principalmente de sangre. En Colombia, las especies de vectores que están asociadas a la transmisión de la infección son Rhodnius prolixus, Triatoma dimidiata, T. maculata y T. venosa (Guhl et al., 2007). El insecto vector ingiere los tripomastigotes sanguíneos a partir de un mamífero infectado, en el región media del intestino el parásito se diferencia en epimastigote y 14

se multiplica por fisión binaria. Luego, en la región posterior del intestino se diferencia en la forma infectiva, tripomastigote metaciclíco, el cual es depositado con las heces del vector en el momento de la picadura al mamífero. Estas formas metacíclicas, ingresan por mucosas o una herida e infectan fibroblastos y macrófagos (Teixeira et al., 2006). Dentro de las células, los tripomastigotes se diferencian en amastigotes y tras varias rondas de replicación se diferencian en tripomastigotes que son liberados al torrente sanguíneo por la ruptura de la célula. Los tripomastigotes tienen la capacidad de infectar otras células e iniciar el ciclo nuevamente (Stuart et al., 2008). 4.1.3 Variabilidad T. cruzi es un parásito que presenta una alta variabilidad genética. Por esto, se han propuesto diferentes marcadores moleculares que permiten agrupar las poblaciones de T. cruzi que se encuentran relacionadas genéticamente entre sí con el fin de correlacionar la biología, bioquímica y genética del parásito. Estos grupos de T. cruzi se conocen como unidades discretas de tipificación (DTU o Discrete Typing Units) y se han propuesto seis DTU: TcI, TcII, TcIII, TcIV, TcV y TcVI (Zingales et al., 2009). Recientemente, se ha propuesto un nuevo grupo conocido como TcBat, el cual incluye alrededor de 30 especies de tripanosomas que han sido encontrados en diferentes especies de murciélagos (Zingales et al., 2012). Adicionalmente, algunas DTU de T. cruzi se han asociado a las manifestaciones clínicas que desarrollan los pacientes infectados, en donde TcI, TcII, TcV y TcVI se han asociado al desarrollo de alteraciones cardiacas y TcII, TcV y TcVI al desarrollo de alteraciones digestivas o megasíndromes (Zingales et al., 2012). En Colombia se ha encontrado circulación de todas las DTU de T. cruzi entre mamíferos reservorios y vectores (Guhl et al., 2013) y la infección con T. cruzi está asociada principalmente a manifestaciones cardiacas en humanos. En los PCC provenientes de Colombia, aunque la DTU con mayor circulación es la TcI, se han encontrado pacientes infectados con TcII, TcIV y TcVI (Sanchez et al., 2013), así como

15

co-infección de TcI con TcII, TcIV (Mantilla et al., 2010; Sanchez et al., 2013) y TcBat (Ramírez et al., 2013). 4.1.4 Fases de la enfermedad y manifestaciones clínicas La enfermedad de Chagas cursa con dos fases secuenciales: una fase aguda, seguida de una fase crónica que se puede clasificar en asintomática y sintomática con alteraciones cardiacas o digestivas. La fase aguda de la enfermedad de Chagas se caracteriza por una alta parasitemia y tiene una duración de 4 a 8 semanas. En esta fase, alrededor del 90 al 95% de los pacientes pueden presentar signos y síntomas que se resuelven de manera espontánea. Por otro lado, entre el 5 y el 10% de los pacientes infectados

por

el

parásito

mueren

por

el

desarrollo

de

miocarditis

o

meningoencefalitis aguda (Rassi et al., 2010; Telleria et al., 2010). Sin embargo, existen pocos reportes de casos de individuos que de manera espontánea, son capaces de eliminar el parásito y curarse (Bertocchi et al., 2013; Dias et al., 2008; Francolino et al., 2003). En los pacientes que desarrollan síntomas en la fase aguda, el signo de Romaña y chagoma son las manifestaciones clínicas en el sitio de entrada del parásito y se caracterizan por una inflamación indolora de los párpados o la piel, respectivamente. Puede presentarse fiebre acompañada de astenia, anorexia y dolor de cabeza. Los principales signos sistémicos son adenopatía, hepatomegalia, esplenomegalia y edema subcutáneo. Generalmente no se observan alteraciones en electrocardiograma (ECG) o radiografía de radiografía de tórax, esófago y colon (Rassi et al., 2010; Telleria et al., 2010). Una vez finalizada la fase aguda, los pacientes que no logran la eliminación del parásito pasan a una fase crónica asintomática que puede durar toda la vida sin hallazgos anormales en ECG, radiografía de tórax, esófago o colon. Estos pacientes tienen un buen pronóstico y baja morbilidad (Rassi et al., 2010; Telleria et al., 2010).

16

Alrededor de 10 a 30 años después de la infección, cerca del 30 al 40% de los pacientes desarrollan la fase crónica sintomática con manifestaciones cardíacas o digestivas (Rassi et al., 2010). La forma cardíaca es la más común de las manifestaciones clínicas de la enfermedad en Colombia y está asociada a la alta frecuencia de la DTU TcI encontrado en los pacientes con infección por T. cruzi (Sanchez et al., 2013; Zingales et al., 2012). Esta forma de la enfermedad es caracterizada por arritmias, falla cardiaca y tromboembolismo. Las arritmias a menudo están acompañadas de palpitaciones y síncopes. La falla cardiaca es la manifestación más común y está asociada con una alta mortalidad. El cerebro es el sitio más frecuente de embolismos y se asocia con accidentes cerebrovasculares (ACV) y muerte súbita. En pacientes con la forma cardiaca de la enfermedad se encuentran alteraciones en ECG con aumento en el tamaño del corazón que se vuelve más evidente cuando la gravedad de la enfermedad aumenta (Rassi et al., 2010; Telleria et al., 2010). La forma digestiva de la enfermedad es caracterizada por alteraciones en las funciones motoras, secretoras y de absorción del tracto gastrointestinal ocasionadas por lesiones del sistema nervioso entérico, provocando megaesófago o megacolon. Los principales síntomas en el megaesófago son disfagia, regurgitación y dolor esofágico, pero pueden presentarse otros síntomas menos comunes como hipo, pirosis y sialorrea. En pacientes con megacolon los síntomas más comunes son estreñimiento, meteorismo, disquecia y con menos frecuencia, dolor cólico abdominal. Estos pacientes presentan un diámetro de los órganos aumentado, lo cual es evidente en la radiografía de esófago y colon (Telleria et al., 2010). 4.1.5 Patología La patología de la enfermedad de Chagas aún no es clara y se ha relacionado a una reacción inflamatoria progresiva con acumulación de células mononucleares que conlleva a la destrucción del tejido, daño neuronal, disfunción microvascular y fibrosis. La respuesta autoinmune y la persistencia del parásito en el corazón, son las dos

17

principales hipótesis de la patogenia de la enfermedad de Chagas (Gutierrez et al., 2009; Machado et al., 2012). La hipótesis autoinmune postula que el daño cardiaco es el resultado de una respuesta inmune contra antígenos propios del hospedero (Machado et al., 2012). Los mecanismos que se han propuesto en la hipótesis autoinmune son el mimestimo molecular encontrado entre antígenos del parásito y proteínas del hospedero, la existencia de antígenos crípticos liberados luego de la lisis de células del miocardio que han sido infectadas por el parásito y la activación policlonal de linfocitos por un “efecto de espectador” (Machado et al., 2012). En pacientes con infección crónica por T. cruzi se han encontrado auto-anticuerpos y LT autorreactivos que se generan por el mimetismo molecular entre antígenos del parásito y proteínas del hospedero (CunhaNeto et al., 2006), por ejemplo se ha encontrado LT autorreactivos específicos de la miosina cardíaca en los pacientes con formas graves de la enfermedad de Chagas, que son capaces de reconocer la proteína B13 de T. cruzi (Cunha-Neto et al., 1996). La hipótesis de la persistencia antigénica se basa en el daño causado por el parásito al miocito y la respuesta inmune del hospedero contra el parásito que conllevan a la inflamación y la lisis de las células cardiacas. Así, la presencia y persistencia del parásito en el tejido cardiaco constituyen el estímulo primario para mantener la inflamación del miocardio y el daño tisular. Esta hipótesis se basa en los siguientes hallazgos: (A) en pacientes infectados con T. cruzi se ha encontrado la presencia de nidos de amastigotes y antígenos de T. cruzi o ADN del parásito en tejido cardiaco durante la fase crónica de la enfermedad y una correlación positiva entre la presencia del parásito y la inflamación en el miocardio (Anez et al., 1999; Salomone et al., 2000); (B) la disminución de la gravedad de la enfermedad cardíaca seguida del tratamiento antiparasitario, lo cual sugiere que la disminución de la carga parasitaria puede resultar en la disminución de la inflamación y el daño cardiaco (Bertocchi et al., 2013); (C) la reinfección con T. cruzi conlleva al aumento de la carga parasitaria y de la gravedad de la enfermedad en modelos murinos de infección aguda y crónica

18

(Bustamante et al., 2002); (D) en individuos con infección crónica co-infectados con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) (Sartori et al., 1998) o pacientes que han sido tratados con inmunosupresores en el trasplante de órganos (Altclas et al., 1999) se ha encontrado que pueden generar o reactivar el daño cardiaco, lo cual sugiere que la presencia de la respuesta inmune es necesaria para el control de la replicación del parásito en el tejido cardiaco. 4.2 Generalidades de la respuesta inmune El sistema inmune contribuye a mantener la homeostasis del organismo permitiendo la eliminación de microorganismos patógenos y tolerando aquellos componentes propios o que no tienen un potencial patogénico tal como la flora comensal, antígenos ambientales o de los alimentos. La respuesta inmune se compone de dos mecanismos de defensa cuya interrelación permite el adecuado funcionamiento de la inmunidad definidos como inmunidad innata e inmunidad adaptativa (Chaplin, 2010). La inmunidad innata es la primera línea de defensa, incluye las barreras físicas y químicas como el tejido epitelial, moco, pH y los cilios epiteliales que evitan el ingreso de los microorganismos. El componente humoral está conformado por proteínas del complemento, citoquinas, quimioquinas, reactantes de fase aguda y proteínas de la coagulación cuya función principal es promover la inflamación. Las proteínas del complemento contribuyen a la opsonización o lisis de los patógenos mediante sus tres vías de activación (clásica, alternativa y de las lectinas) (Turvey et al., 2010). El componente celular está compuesto por polimorfonucleares, monocitos o macrófagos, células dendríticas (DC o Dendritic cells), mastocitos, células asesinas naturales (NK o Natural killer) y células T NK. Las células de la inmunidad innata se caracterizan porque no generan memoria inmunológica y expresan receptores que están codificados en la línea germinal y permiten detectar moléculas conservadas y comunes en distintos patógenos llamadas patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP o Pathogen-associated molecular pattern) (Chaplin, 2010; Turvey et al., 2010).

19

Mediante los receptores de reconocimiento de patrones (PRR o Pattern recognition receptor) como los receptores tipo Toll (TLR o Toll-like receptor) o NOD (NLR o Nucleotide-binding

oligomerization

domain

receptors)

se

generan

señales

intracelulares que conllevan a la producción de citoquinas pro-inflamatorias y quimioquinas que activan y atraen otras células. En un proceso inflamatorio con manifestaciones sistémicas, estas citoquinas inducen fiebre, promueven cambios vasculares, alteraciones en la presión sanguínea y favorecen la activación del endotelio. Estas señales inducen la producción de la pro-IL-1β y es el complejo multiprotéico inflamosoma quien se encarga de activar la IL-1β mediante un procesamiento proteolítico utilizando componentes de los NLR, la proteína adaptadora ASC (Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain) y caspasas (Turvey et al., 2010). La inmunidad adaptativa se caracteriza por una alta especificidad frente a diversas moléculas y la propiedad de generar memoria inmunológica luego del encuentro con el antígeno. En contraste de los receptores de la inmunidad innata, la inmunidad adaptativa depende de receptores que sufren procesos de recombinación somática de segmentos génicos que generan un repertorio de receptores altamente específicos. Estos receptores son los receptores de antígenos de los LT (TCR o T cell receptor) y LB (BCR o B cell receptor) (Bonilla et al., 2010). En la inmunidad adaptativa, el componente humoral está compuesto por citoquinas y las inmunoglobulinas (Ig) o anticuerpos, los cuales pueden unirse de manera específica a moléculas de los patógenos, neutralizar patógenos y reclutar moléculas del complemento o células para destruirlos. El componente celular está compuesto por los linfocitos B (LB) y linfocitos T (LT): CD4+ y CD8+. Los LB maduran en médula ósea y los LT maduran en timo y mediante un proceso de selección, adquieren un fenotipo CD4+ o CD8+ (Bonilla et al., 2010). Un vínculo entre la inmunidad innata y adaptativa son las células presentadoras de antígenos (CPA) como las DC. Estas células son las encargadas de capturar, procesar y

20

presentar en contexto del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) II o I los antígenos exógenos y endógenos a los LT CD4+ y CD8+, respectivamente. Durante este proceso, las DC maduran aumentando los niveles de expresión de las moléculas del CMH, moléculas coestimuladoras y la producción de citoquinas y quimioquinas. Las CPA migran a los órganos linfoides secundarios para llevar a cabo la activación linfoide mediante la sinapsis inmunológica, que resulta en la generación de señales intracelulares que contribuyen a la activación linfoide. Posteriormente, los LT activados entran en un proceso de expansión y diferenciación en células efectoras. Estas células adquieren patrones de migración a los tejidos u órganos donde se llevó a cabo el encuentro con el antígeno. Luego de la expansión clonal, en el órgano linfoide secundario ocurre un proceso de contracción en donde alrededor del 90 al 95% de las células mueren por apoptosis y de la población que sobrevive se generan las células de memoria (Bonilla et al., 2010). Los linfocitos que migran a los tejidos, mediante funciones efectoras contribuyen a la eliminación del antígeno. Los LT CD4+ o ayudadores secretan citoquinas que proporcionan señales esenciales para la activación de otras células de la respuesta inmune innata y adaptativa y de acuerdo a su perfil de citoquinas se agrupan en Th1 (IFN-, IL-2), Th2 (IL-4, IL-5), Th9 (IL-9, IL-10), Th17 (IL-17, IL-22) y Th22 (IL-22) (Annunziato et al., 2009). Adicionalmente, la inmunidad adaptativa cuenta con LT reguladores que se encargan de mantener un control negativo en la actividad de otros linfocitos y células inmunes contribuyendo a controlar la respuesta inmunitaria para evitar el daño tisular. Los LT CD8+ o citotóxicos destruyen células infectadas por patógenos intracelulares mediante la producción de proteínas como granzimas y perforinas y son capaces de producir citoquinas pro-inflamatorias como interferón gama (IFN-), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) e interleucina 2 (IL-2) (Bonilla et al., 2010).

21

4.2.1 Subpoblaciones de linfocitos T CD8+ de memoria Los LT CD8+ de memoria son una población celular heterogénea, incluye subpoblaciones con variada actividad funcional, así como diferente capacidad para proliferar, sobrevivir y recircular a diferentes tejidos u órganos (Farber et al., 2014). A la fecha, se han descrito distintas subpoblaciones de LT CD8+ de memoria de acuerdo con su grado de diferenciación: stem cell memory (TSCM, temprano), memoria central (TCM), memoria transicional (TTM), memoria efectora (TEM) y efectores terminales (TTE, tardío) (Mahnke et al., 2013). Las subpoblaciones de LT CD8+ pueden ser analizadas con base en su fenotipo, que consiste en el análisis de la expresión diferencial de moléculas de superficie. Recientemente, se propuso el uso de CD45, CCR7, CD28 y CD95 para la determinación de las subpoblaciones de LT CD8+ (Mahnke et al., 2013). La glicoproteína CD45 tiene distintas isoformas (CD45RA, RB, RC, RO) que son expresadas diferencialmente en los LT, el dominio citoplasmático de la proteína CD45 tiene actividad tirosina fosfatasa y su expresión está asociada a la capacidad de proliferación y activación de los LT (Leitenberg et al., 2007). La expresión de la isoforma CD45RA permite identificar a los LT vírgenes (TN) y LT con activación temprana como los stem cell memory (TSCM) (Gattinoni et al., 2011) y la expresión de la isoforma CD45RO a los LT de memoria, sin embargo, se ha reportado que los LT CD8+ efectores terminales (TTE) son capaces re-expresar la isoforma CD45RA (Henson et al., 2012). El receptor tipo 7 de quimioquinas CC (CCR7 o C-C chemokine receptor type 7) o CD197, pertenece al grupo de receptores acoplados a proteínas G, se une a las quimioquinas CCL19 (R. Yoshida et al., 1997) y CCL21 (R. Yoshida et al., 1998) y su expresión está asociada a la migración de los LT a los órganos linfoides secundarios. Se ha encontrado que los LT CD8+ con diferenciación temprana como los TN, TSCM

22

(Gattinoni et al., 2011) y memoria central (TCM) son capaces de expresar CCR7 (Appay et al., 2008). La glicoproteína CD28 es una molécula co-estimuladora que se une a los receptores del complejo B7 (CD80 y CD86), y se encuentra implicada en la activación de los LT (Sharpe et al., 2002). En conjunto con la molécula co-estimuladora CD27 (ligando de CD70) (Nolte et al., 2006), permite la identificación de LT con diferentes grados de diferenciación: temprano (CD28+CD27+), intermedio (CD28-CD27+) y tardío (CD28CD27-) (Appay et al., 2002). El receptor de muerte FAS o CD95 está implicado en la regulación de procesos de muerte programada o apoptosis (Lavrik et al., 2012) y su expresión permite diferenciar a los TN (CD95-) de los LT activados (CD95+) (Cossarizza et al., 2000). Adicionalmente, existen otras moléculas cuya expresión diferencial contribuye a la identificación de las subpoblaciones de los LT, como la cadena α del receptor de la IL-7 o CD127. Esta molécula, en conjunto con la cadena  común del receptor de la IL-2 o CD132, conforman el receptor de la IL-7, la cual es importante en la maduración y la proliferación homeostática de los LT (Tan et al., 2001). La disminución de la expresión de CD127 se ha asociado con un mayor grado de diferenciación en LT CD8+ (Appay et al., 2008; Burgers et al., 2009). Analizando la expresión de estos marcadores es posible identificar las diferentes subpoblaciones de LT CD8+ de memoria como se muestra en la Tabla 1. Tabla 1. Moléculas para la determinación de las subpoblaciones de LT CD8+

CD45RA CD95 CCR7 CD28 CD27 CD127

TN

TSCM

TCM

TTM

TEM

TTE

+ + + + +

+ + + + + +

+ + + + +

+ + + +

+ + -

+ + -

23

En cuanto a la actividad funcional de los LT CD8+, se ha propuesto que varía según el grado de diferenciación celular. Así, las células con un estado de diferenciación temprano, como las TCM tienen una alta actividad multifuncional para producir citoquinas como IFN-, TNF-α e IL-2 y a medida que las células aumentan su grado de diferenciación pierden actividad multifuncional, como las TTE que pierden la capacidad de producir TNF-α e IL-2 (Seder et al., 2008). 4.2.2 Respuesta inmune frente a T. cruzi Los mecanismos de defensa frente a la infección por T. cruzi implican tanto la respuesta inmune innata como la adaptativa. En infección aguda, mediante diferentes mecanismos, el parásito es capaz de evadir la respuesta inmune, invadir las células y diseminarse por vía hematógena a otros tejidos donde establece infección crónica. Los mecanismos que contribuyen a controlar la infección y evitar el progreso a la fase sintomática son poco conocidos. 4.2.2.1

Inmunidad innata

La activación de la inmunidad innata en la infección por T. cruzi inicia en el reconocimiento de moléculas presentes en el parásito, la inducción de la producción de citoquinas pro-inflamatorias y activación de células que se encargan de controlar la replicación del parásito. A la fecha, se ha mostrado que los TLR y NLR son los PRR implicados en el reconocimiento de las moléculas del parásito. Los TLR2 reconocen moléculas de anclaje glicofosfatidilinositol (GPI) (Campos et al., 2001) y la proteína secretada Tc52 de T. cruzi (Ouaissi et al., 2002), TLR4 reconoce compuestos de fosfolípidos de glicoinositol (GIPL) (Oliveira et al., 2010), TLR7 ARN del parásito (Caetano et al., 2011) y TLR9 regiones ricas en citosina y guanina (CpG) en el ADN del parásito (Bartholomeu et al., 2008). Aunque se desconoce si los NLR reconocen moléculas del parásito, en modelos murinos de infección por T. cruzi se ha encontrado que la ausencia de NOD1 (Nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 1) incrementa la 24

susceptibilidad a la infección comparado con los ratones silvestres (Silva et al., 2010). Recientemente, se mostró que componentes del inflamosoma como ASC, NLRP3 (perteneciente a la familia de los NLR) y la caspasa 1 tienen un papel importante en la activación de la IL-1β, la cual está involucrada en el control de la replicación del parásito puesto que la ausencia de estos componentes del inflamosoma conlleva al aumento de la carga parasitaria en modelos murinos de infección (Silva et al., 2013). Además, en la infección por T. cruzi se ha encontrado que se activan la vía alterna y la vía de las lectinas del complemento mediante el reconocimiento de moléculas presentes en la superficie del parásito como manosa, N-acetilglucosamina y galactosa (Cestari et al., 2009; Cestari et al., 2010). Finalmente, el reconocimiento de estas moléculas mediante los PRR inducen la producción de citoquinas pro-inflamatorias (IFN-, IL-12, IL-1β, TNF-α, IL-1β) y quimioquinas (IL-8, CCL-2, MIP-1β) (Bartholomeu et al., 2008; Caetano et al., 2011; Campos et al., 2001; Oliveira et al., 2004; Ouaissi et al., 2002). En la infección por T. cruzi los neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, células NK y células NKT están implicados en el control de la parasitemia. En general, se ha encontrado que estas células se encargan de eliminar los parásitos mediante fagocitosis o lisis de los parásitos y la secreción de citoquinas pro-inflamatorias y quimioquinas para reclutar y activar otros leucocitos (Bastos et al., 2007; Chen et al., 2001; Une et al., 2000; Vaena de Avalos et al., 2002). Los neutrófilos eliminan los parásitos mediante la liberación de especies reactivas de oxígeno (ROS o Reactive Oxygen Species) (Docampo et al., 1983), mieloperoxidasa y peróxido de hidrógeno (Villalta et al., 1983); los eosinófilos mediante la liberación de la proteína básica mayor (Villalta et al., 1984), los macrófagos mediante la producción de óxido nítrico (Ramos-Ligonio et al., 2004) y la liberación de ROS (Peluffo et al., 2004) y las células NK mediante la liberación gránulos líticos para la eliminación directa del parásito (Lieke et al., 2004). Aunque el mecanismo por el cual las células NKT contribuyen a la eliminación de los parásitos se desconoce, en ratones genéticamente modificados con ausencia de células NKT se encontró incremento de la parasitemia y muerte de los ratones (Duthie et al., 2006).

25

4.2.2.2

Inmunidad adaptativa

En la infección aguda por T. cruzi, aunque se ha encontrado que la infección conlleva a una activación policlonal de los LB (el Bouhdidi et al., 1994), la inmunidad humoral es importante para el control de la parasitemia, de hecho, la eliminación de los LB conlleva a un aumento de la parasitemia y la muerte rápida de ratones infectados (Kumar et al., 1998). Además, la transferencia de anticuerpos a ratones infectados, permite la eliminación de los parásitos que se encuentra en circulación (Brodskyn et al., 1989). En la fase crónica de la infección, a la inmunidad humoral se le ha atribuido un doble papel, por un lado al control de la parasitemia y por otro lado al desarrollo de la patología de la enfermedad de Chagas. Por ejemplo, los anticuerpos líticos específicos median la lisis de las formas infectivas del parásito y estos se encuentran disminuidos en las formas más severas de la enfermedad al comparar con las formas menos severas, lo cual sugiere un papel protector de estos anticuerpos en el control de la progresión de la enfermedad (Cordeiro et al., 2001; Gazzinelli et al., 1991). Sin embargo, en PCC se ha encontrado anticuerpos que reconocen antígenos del parásito, pero que mediante reacción cruzada pueden reconocer proteínas del hospedero, los cuales podrían estar implicados en el daño tisular y la patología de la enfermedad (Cunha-Neto et al., 1995). Estudios realizados con LT CD4+ totales (Rottenberg et al., 1993), LT CD4+ reguladores (CD25+) (Mariano et al., 2008) y LT CD4+ productores de IL-17 (Guedes et al., 2010) muestran que la ausencia de estas poblaciones se asocian con aumento de la parasitemia y muerte de los ratones infectados. En los PCC se ha observado una relación inversa entre la frecuencia de LT totales específicos y el estado de gravedad de la enfermedad (Laucella et al., 2004). Además, se ha reportado que los LT CD4+ de PCC adultos muestran una respuesta monofuncional con la producción de IFN- y ausencia de células productoras de TNF-α (Albareda et al., 2013). Lo anterior sugiere que alteraciones de la respuesta linfoide puede llevar al desarrollo de la patología de la enfermedad. Sin embargo, en los PCC en fase asintomática se ha observado una

26

mayor frecuencia de LT CD4+ reguladores (CD25+) productores de IL-10 y LT CD4+ productores de IL-17 comparado con pacientes en fase crónica sintomática, sugiriendo que la regulación de la respuesta inmune es importante para evitar el desarrollo de la patología (de Araujo et al., 2011; Guedes et al., 2012). Por lo tanto, en la infección crónica por T. cruzi el papel de los LT CD4+ es controversial. En modelos murinos de infección aguda por T. cruzi, se ha encontrado que los LT CD8+ y la producción de IFN- y perforina son necesarios para el control de la parasitemia y la sobrevida de los ratones (Rottenberg et al., 1993; Tzelepis et al., 2006). Además, la ausencia de estas células conlleva al aumento de la parasitosis y la inflamación en tejido cardiaco de ratones con infección crónica (Tarleton et al., 1994). En tejido cardiaco de PCC sometidos a trasplante de corazón, se encuentra infiltrado predominante de LT CD8+ (Giraldo et al., 2011; Reis et al., 1993). Además, en PCC en fase crónica sintomática, se ha sugerido que los LT CD8+ están implicados en el control de la progresión de la enfermedad de Chagas, teniendo en cuenta que se ha reportado una menor frecuencia de LT CD8+ que producen IFN-, una mayor frecuencia de LT CD8+ con un estado de diferenciación tardío comparado con pacientes con enfermedad de Chagas en fase crónica asintomática. 4.2.2.3

Mecanismos de evasión de la respuesta inmune

T. cruzi tiene la capacidad de invadir distintos tipos de células nucleadas de mamíferos como: células del tejido conectivo, estriado, músculo liso, células germinales, mononucleares, fagocíticas, entre otras, lo cual le permite sobrevivir a la respuesta inmune del hospedero (Teixeira et al., 2006). La invasión de T. cruzi involucra dos pasos, la adhesión y la internalización del parásito dentro de la célula del hospedero. La adhesión del parásito se ha asociado a las moléculas de la superficie del parásito como mucinas, transialidasas y glicoproteínas que interactúan con moléculas de las células del hospedero como carbohidratos que contienen residuos de galactosil, manosil o sialilo y proteínas tipo lectinas. La internalización del parásito se ha relacionado con mecanismos de endocitosis mediada por microdominios de 27

membrana compuestos por caveolina o flotilina y mediada por clatrina, así como macropinocitosis y fagocitosis. Mediante estos mecanismos de endocitosis, los parásitos internalizados son transportados al interior de la célula en una vacuola formada por la membrana plasmática conocida como endosoma temprano, el cual puede fusionarse o no a los lisosomas formando la vacuola parasitófora. Otro mecanismo propuesto en la invasión por T. cruzi a las células del hospedero se relaciona con la inducción de un proceso de reparación de la membrana plasmática en respuesta al daño ocasionado por el parásito, lo cual conlleva al aumento intracelular de calcio y la exocitosis de lisosomas que se fusionan con la membrana y facilitan la entrada del parásito mediante la formación de la vacuola parasitófora (Barrias et al., 2013). El parásito se libera de la vacuola parasitófora mediante la secreción de proteínas como TcTox y LYT1 que forman poros en la membrana de la vacuola para su posterior liberación y diferenciación en amastigotes (Epting et al., 2010). T. cruzi es un parásito altamente variable con cepas que difieren en patogenia y virulencia. Este parásito expresa proteínas mucinas ancladas a glicosilfosfatidilinositol (GPI) que le permiten evitar el reconocimiento por la respuesta inmune y establecer la infección. Estas mucinas son aceptores de residuos de ácido siálico, que es transferido de las glicoproteínas de las células del hospedero por las transialidasas (TS), un grupo de proteínas pertenecientes a la familia de las mucinas ancladas a GPI. Las mucinas ancladas a GPI están involucradas con la adherencia del parásito a las células y la evasión de la respuesta inmune (Buscaglia et al., 2006). Además, la variabilidad encontrada entre las cepas de T. cruzi está asociada con la expresión diferencial de las mucinas ancladas a GPI en los diferentes estadíos de vida del parásito (Buscaglia et al., 2006). Las mucinas son capaces de modular la activación de las DC e inducir la producción de IL-10 y del factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) (Poncini et al., 2008), inhibir la activación de los LT y la secreción de IL-2 (Alcaide et al., 2004) así como la inducción de anergia en LT (Argibay et al., 2002).

28

Otro mecanismo de evasión de la respuesta inmune por T. cruzi es la inhibición de la lisis mediada por el complemento. Los tripomastigotes de T. cruzi expresan proteínas homólogas a la proteína reguladora del complemento factor acelerador del decaimiento (DAF o Decay-accelerating factor) (Beucher et al., 2008; Norris et al., 1991), las cuales les permite inhibir la formación de la C3 convertasa mediante la unión a las proteínas C3b y C4b del complemento (Norris et al., 1997). Otra proteína de T. cruzi que tiene la capacidad de inhibir la activación del complemento es la calreticulina, una proteína de membrana que se une a C1q e inhibe la activación de la vía clásica (Ferreira et al., 2004). Por último, se ha encontrado que los tripomastigotes que expresan la proteína CRIT (Complement C2 Receptor Inhibitor Trispanning protein) son capaces de inhibir la activación de la vía de las lectinas del complemento (Cestari et al., 2008). En el modelo murino de infección por T. cruzi, se ha encontrado que la inducción de una respuesta linfoide de tipo 2 (Th2) está asociada con la persistencia del parásito, ya que en ratones genéticamente modificados, deficientes de los genes STAT4 o STAT6 (Signal Transducer and Activator of Transcription) los cuales están encargados de inducir una respuesta tipo 1 o tipo 2, respectivamente, se observó que la deficiencia de STAT6 se asocia con el control de la infección, sin embargo, los ratones deficientes de STAT4 tenían una alta susceptibilidad a la infección por T. cruzi (Tarleton et al., 2000). Además, en modelos murinos se ha demostrado que las mucinas ancladas a GPI (Kahn et al., 1997) y los GIPL (N. Gomes et al., 1996) de T. cruzi son capaces de inhibir la secreción de IL-2 e inducir la producción de IL-4 en los LT. T. cruzi modula la maduración de las DC mediante la disminución de las moléculas del CMH y moléculas co-estimuladoras las cuales están relacionadas con la presentación antigénica a los LT. Así, en modelos in vivo e in vitro las DC infectadas por el parásito, disminuyen la expresión de las moléculas del CMH y moléculas co-estimuladoras así como la secreción de TGF-β e IL-10, lo cual está asociado a la generación de células dendríticas que mantienen un ambiente regulador modulando la activación de los LT,

29

favoreciendo la persistencia del parasito en el hospedero (Alba Soto et al., 2003; Poncini et al., 2008).

30

5. OBJETIVOS 5.1 Objetivo general Comparar los linfocitos T stem cell memory CD8+ (TSCM) y otras subpoblaciones de memoria circulantes: memoria central (TCM), memoria transicional (TTM), memoria efectora (TEM) y efectores terminales (TTE) y su actividad multifuncional entre pacientes con enfermedad de Chagas en fase crónica con distintos estados de gravedad de la enfermedad. 5.1.1 Objetivos específicos 1. Comparar la frecuencia de las subpoblaciones de LT CD8+ de memoria circulantes: TSCM, TCM, TTM, TEM y TTE en pacientes con enfermedad de Chagas en fase crónica con distintos estados de gravedad de la enfermedad. 2. Comparar la frecuencia de las subpoblaciones de LT CD8+ de memoria específicos de Trypanosoma cruzi circulantes: TSCM, TCM, TEM y TTE que producen IFN-, TNF-α e IL-2 entre pacientes con enfermedad de Chagas en fase crónica con distintos estados de gravedad de la enfermedad.

31

6. MATERIALES Y MÉTODOS 6.1 Diseño de la investigación Este trabajo corresponde a un estudio descriptivo de corte transversal con datos recolectados en un único punto de tiempo. 6.2 Población de estudio Para el presente trabajo se incluyeron 9 individuos sanos como controles (CS) y 32 pacientes con enfermedad de Chagas en fase crónica (PCC). Los datos de los pacientes fueron recolectados por encuesta e historia clínica en consulta médica en el Instituto Nacional de Salud, la Fundación Abood Clínica Shaio y el Hospital Universitario San Ignacio en Bogotá, Colombia (Anexo 1). Se obtuvo la firma del consentimiento informado de todos los individuos incluidos en el estudio que estuvieron de acuerdo con su participación, en donde se les explicó las generalidades de la enfermedad de Chagas, los objetivos de la investigación, riesgos, derechos y beneficios de su participación en el estudio (Anexo 2). El presente trabajo fue avalado y aprobado por el Comité de Ética del Instituto Nacional de Salud, la Fundación Clínica Abood Shaio y la Facultad de ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana. Los PCC y CS fueron diagnosticados para la infección mediante pruebas serológicas para la determinación de anticuerpos específicos de T. cruzi por el Inmunoensayo ligado a enzima (ELISA o Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), Inmunofluorescencia indirecta (IFI) y Hemaglutinación indirecta (HAI). El criterio para establecer la infección por T. cruzi fue la obtención de al menos 2 pruebas serológicas positivas. Los PCC se clasificaron en cuatro grupos de acuerdo con la gravedad de la enfermedad, de menor a mayor gravedad: A, B, C y D con base a los parámetros previamente descritos (Bern et al., 2007). El grupo de pacientes A incluye individuos con hallazgos normales en el electrocardiograma (ECG), tamaño de corazón y fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI) normales y la valoración funcional de la insuficiencia cardiaca mediante la escala de la Asociación del Corazón de New York (NYHA o New York Heart 32

Association) clase I; el grupo B, individuos con hallazgos anormales en el ECG, tamaño de corazón normal, FEVI normal y valoración funcional de la escala de la NYHA de clase I; el grupo C, individuos con hallazgos anormales en el ECG, incremento en el tamaño del corazón, reducción en la FEVI y valoración funcional de la escala de la NYHA de clase II o III; y el grupo D, individuos con hallazgos anormales en el ECG, incremento en el tamaño del corazón, reducción de la FEVI y valoración funcional de la escala de NYHA de clase IV. 6.3 Lisado de tripomastigotes de T. cruzi El lisado de tripomastigotes de T. cruzi se realizó a partir de tripomastigotes de cultivo en células VERO (ATCC CCL-81, Manassas, VA, USA), según lo reportado previamente con algunas modificaciones (N. Yoshida et al., 1989). Brevemente, formas tripomastigotas de la cepa de T. cruzi I MHOM/CO/01/DA fueron incubadas 24 horas con células VERO a 37°C y 5% de CO2 en medio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Eurobio; Les Ulis, Francia), suplementado con suero fetal bovino al 10% en una relación parásito:célula de 10:1. La obtención del lisado de tripomastigotes de T. cruzi se realizó de acuerdo con lo descrito en el 2007 con algunas modificaciones (Martinez-Calvillo et al., 2007). Brevemente, los tripomastigotes se lavaron con PBS 1X, se re-suspendieron en tampón de lisis (10 mM Tris–HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1% NP40), teniendo en cuenta que por 1 millón de parásitos se adicionó 1µl de tampón de lisis, Triton X-100 (Sigma-Aldrich; Saint Louis, MO, USA) a una concentración final de 1,4% y un coctel inhibidor de proteasas (Sigma-Aldrich) a una concentración final de 2%. Posteriormente, se incubó en hielo durante 30 minutos y se centrifugó a 12.000 rpm durante 15 minutos a 4°C. La concentración de proteínas del lisado del parásito fue determinada por el método de Bradford y el análisis del perfil de proteínas, fue evaluado en un gel de poliacrilamida (BIORAD) con sodio dodecil sulfato al 10% (Sigma-Aldrich) (SDS-PAGE) teñido con nitrato de plata (Sigma-Aldrich) o azul de Coomassie R250 (Gibco BRL; Grand Island, NY, USA) (Sambrook et al., 2001).

33

6.4 Anticuerpos conjugados fluorescentes Los conjugados seleccionados para el análisis por citometría de flujo fueron: CD3Pacific Blue (BD Pharmingen; Clona UCHT1; Catálogo No. 558117; San Diego, CA, USA), CD8-APC H7 (BD Pharmingen; Clona SK1; Catálogo No. 641400), CD45RA-PE (BD Pharmingen; Clona HI100; Catálogo No. 555489), CCR7-PE-Cy7 (BD Pharmingen; Clona 3D12; Catálogo No. 557648), CD28-PerCP-Cy5.5 (BD Biosciences; Clona L293; Catálogo No. 337181; San Jose, CA, USA), CD27-Alexa Fluor 700 (BD Pharmingen; Clona M-T271; Catálogo No. 560611), CD95-APC (BD Pharmingen; Clona DX2; Catálogo No. 558814) y CD127-FITC (BD Pharmingen; Clona HIL-7R-M21; Catálogo No. 560549). Los anticuerpos conjugados para el marcaje de citoquinas intracelulares: IFN-γ-FITC (BD Pharmingen; Clona 4S.B3; Catálogo No. 554551), IL-2-PerCP-Cy5.5 (BD Pharmingen; Clona MQ1-17H12; Catálogo No. 560708) y TNF-α-Alexa Fluor 700 (BD Biosciences; Clona MAb11; Catálogo No. 557996). Adicionalmente, se incluyó el marcador de viabilidad Fixable Aqua Dead Cell Stain (Invitrogen; Catálogo No. L34957; Eugene, OR, USA). 6.5 Marcaje de moléculas de superficie y citoquinas para citometría de flujo Se realizó la titulación de los anticuerpos conjugados fluorescentes y cada panel de anticuerpos conjugados para moléculas de superficie y citoquinas intracelulares fue evaluado según la metodología previamente descrita (Mateus et al., 2013). Para evaluar la frecuencia de las subpoblaciones LT CD8+, se incubó un millón de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) en oscuridad a temperatura ambiente durante 20 minutos con el marcador de viabilidad y posteriormente, fueron lavadas con el tampón de tinción. Luego, las células fueron marcadas con los anticuerpos de superficie: anti-CD3, anti-CD8, anti-CD45RA, anti-CCR7, anti-CD28, anti-CD27, antiCD127 y anti-CD95 (Tabla 2, Panel 1) e incubadas en oscuridad durante 30 minutos a 4°C y posteriormente lavadas con el tampón fosfato salino para tinción (PBS 0,01 M pH 7,4 (PBS 1X) (Eurobio) con suero fetal bovino al 1%). Para evaluar las subpoblaciones de LT CD8+ específicos de T. cruzi que producen IFN-, TNF-α e IL-2, se cultivó un millón 34

de CMSP por 6 horas en presencia de los anticuerpos anti-CD28 y anti-CD49d, brefeldina A y lisado de tripomastigotes de T. cruzi. Como control negativo se cultivaron las células con medio y como control positivo se cultivaron con la enterotoxina B de Staphylococcus aureus (SEB) (Sigma-Aldrich). Las 6 horas que corresponden al tiempo para evaluar la producción de IFN-, TNF-α e IL-2 en los LT CD8+ se determinó de acuerdo a lo descrito previamente (Mateus et al., 2013). Posteriormente, las células fueron marcadas con el marcador de viabilidad como se describió anteriormente. Luego, las células fueron marcadas con los anticuerpos de superficie: anti-CD3, anti-CD8, anti-CD45RA, anti-CCR7 y anti-CD95 e incubadas en oscuridad durante 30 minutos a 4°C y lavadas con el tampón fosfato salino para tinción. Después, las células fueron fijadas y permeabilizadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante del estuche comercial Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences). Finalmente, las células fueron incubadas con los anticuerpos anti-citoquinas en oscuridad durante 30 minutos a 4°C y lavadas con Perm/Wash 1X (BD Biosciences) (Tabla 2, Panel 2). Las lecturas se realizaron en el citómetro de flujo BD FACSAria II (BD Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA) y se adquirieron al menos 50,000 LT CD8+. Los datos obtenidos fueron analizados usando el programa FlowJo versión 9.3.2 (Tree Star; Ashland, OR, USA), Pestle 1.7 (National Institutes of Health (NIH), Bethesda, MD, USA) y SPICE 5.3 (NIH). El criterio de positividad de la producción de IFN-, TNF-α e IL-2 en las subpoblaciones de LT CD8+ se definió por la sustracción del ruido de fondo de las citoquinas (frecuencia de LT CD8+ productoras de IFN-, TNF-α e IL-2 cuando las células fueron cultivadas con medio) y por una frecuencia de las subpoblaciones de LT CD8+ >0,05% (la frecuencia se determinó por el promedio de la frecuencia de la respuesta de LT CD8+ de los CS cultivados con el lisado de T. cruzi más 3 desviaciones estándar).

35

Tabla 2. Paneles multicolor para evaluar las subpoblaciones de LT CD8+ y las subpoblaciones de LT CD8+ productores de IFN-, TNF-α o IL-2. Panel #

2## CD3-Pacific Blue CD8- APC-H7 CD45RA-PE CCR7-PE CD95-APC IFN--FITC TNF-α-Alexa Fluor 700 IL-2-PerCP-Cy5.5

1 CD3-Pacific Blue CD8- APC-H7 CD45RA-PE CCR7-PE CD28-PerCP-Cy5.5 CD27-Alexa Fluor 700 CD127-FITC CD95-APC # Marcaje de las células ex vivo. ## Marcaje de las células cultivadas

6.6 Detección del parásito mediante PCR convencional y cuantitativa La detección de la parasitemia se realizó mediante la prueba de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR o Polymerase chain reaction) convencional y cuantitativa. A partir de muestras de sangre anticoagulada con EDTA y preservadas con solución amortiguadora de clorhidrato de guanidina a 4°C, se obtuvo el ADN de las muestras de sangre de los PCC de acuerdo con las instrucciones del fabricante del estuche comercial High Pure PCR Template Preparation (Roche, Mannheim, Alemania). Posteriormente, con el fin de comprobar la integridad del ADN y descartar la presencia de inhibidores en las muestras, se realizó una PCR convencional utilizando los iniciadores de la β-globina F-R previamente descritos (Virreira et al., 2005). Para la PCR convencional

se

utilizaron

los

iniciadores

S35

(AAATAATGTACGGG(T/G)GAGATGCATGA) y S36 (GGGTTCGATTGGGGTTGGTGT) que tienen como blanco de amplificación la región variable del minicírculo del ADN del cinetoplasto (ADNk) (Sturm et al., 1989). Las condiciones de reacción utilizadas fueron de acuerdo a las previamente descritas (Barrera et al., 2008). Para la PCR cuantitativa se

utilizaron

los

iniciadores

Cruzi

1

(ASTCGGCTGATCGTTTTCGA),

Cruzi

2

(AATTCCTCCAAGCAGCGGATA) y la sonda Cruzi 3 (6FAM-CACACACTGGACACCAA-BBQ) que tienen como blanco de amplificación e hibridación una región de 166 pb del ADN

36

satelital del parásito (Piron et al., 2007). Cada muestra se montó por duplicado y la carga parasitaria se estimó con base en una curva estándar realizada con diferentes concentraciones de ADN genómico del parásito mezcladas con sangre de un CS entre un rango de 105 a 100 parásitos/mL (Duffy et al., 2009) y utilizando el software 4.0 del LightCycler 1.5 Instrument (Roche). Para ambas PCR se incluyeron los siguientes controles: reacción (agua en el cuarto de preparación de la mezcla de reacción), gris (agua en el cuarto de adición de las muestras a la reacción), negativo (ADN de un CS) y positivo (para la PCR convencional, ADN genómico de T. cruzi I; para la PCR cuantitativa, ADN genómico de T. cruzi I correspondiente a 103 y 100 parásito/mL). 6.7 Análisis estadístico Para determinar las diferencias estadísticas entre dos grupos se aplicó la prueba de Mann-Whitney. Las diferencias entre de la frecuencia de las subpoblaciones de LT CD8+, las subpoblaciones celulares específicas o la actividad funcional de los LT CD8+ entre los PCC con diferentes estados de gravedad de la enfermedad y los CS se analizaron mediante la prueba para múltiples comparaciones Kruskal-Wallis con el post-test de Dunn. La asociación entre la frecuencia de las subpoblaciones de LT CD8+ de PCC se analizó mediante el coeficiente de correlación de Spearman. Para determinar las diferencias entre las células con 1 y 2 funciones cuando fueron estimuladas con SEB y lisado de T. cruzi se aplicó la prueba de los rangos con signo de Wilcoxon. Las diferencias estadísticas se consideraron significativas cuando p