VARIABILIDAD GENÉTICA EN POBLACIONES CULTIVADAS DE LENGUADO SENEGALÉS (Solea senegalensis KAUP) EN BASE A MARCADORES MOLECULARES MITOCONDRIALES

Manchado, M.; Catanese, G.; Funes, V.; Perez, L.; Infante, C.

LABORATORIO DE IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES PESQUERAS Y ACUÍCOLAS CICEM “EL TORUÑO”. EL PUERTO SANTA MARÍA CONSEJERÍA DE AGRICULTURA Y PESCA. JUNTA DE ANDALUCIA

IMPORTANCIA EN ACUICULTURA •

CARACTERÍSTICAS PRODUCTIVAS

•

COMERCIALIZACIÓN

DEMANDA DE CONOCIMIENTOS

• •

REPRODUCCIÓN PATOLOGÍA

GENÉTICA

Larvas de Solea senegalensis

PRODUCCIÓN EN CAUTIVIDAD •

• •

CICEM “El Toruño” comenzó su cultivo en los ‘90. Desde entonces, se han obtenido, de forma sistemática, puestas periódicas en condiciones naturales de termoperíodo y fotoperíodo. Actualmente, se dispone de un colectivo de reproductores en cautividad de más de 100 ejemplares. La producción anual de este colectivo se sitúa entre 50-70 millones de huevos

• Distribución a empresas para su cultivo en intensivo

• Programas de repoblación POCA INFORMACIÓN GENÉTICA

Larva de Solea senegalensis tras la metamorfosis

MARCADORES MOLECULARES Existen 2 aplicaciones importantes de marcadores moleculares al cultivo de lenguado senegalés Información de pedigrí: Cultivo conjunto de machos y hembras Dificultad para establecer: Capacidad reproductiva--> Número efectivo de reproductores Endogamia--> Grado de parentesco Trazabilidad de características productivas

• • •

Programas de repoblación: La conservación de la diversidad genética en poblaciones naturales es un reto. Diferentes marcadores moleculares se han usado para evaluar la estructura genética de las poblaciones naturales y cultivadas, realizar marcaje genético para establecer el origen de los stocks cultivados y su integración con las poblaciones nativas

Instalaciones CICEM “El Toruño”

OBJETIVOS •Aportar nuevos marcadores moleculares para determinar la variabilidad genética y estructura poblacional del colectivo de reproductores en cautividad

•Para ello, se ha aislado, por primera vez, el ADN mitocondrial de esta especie. Su estructura, contenido y principales características serán discutidas.

•Además, se ha analizado la región de control o D-loop (>1000 pb) en 82 reproductores para estudiar la diversidad y estructura genética de nuestro stock.

Adultos Solea senegalensis

ADN mitocondrial •Molécula circular de pequeño tamaño (~16Kb)

•Alto número de copias por célula •Generalmente, homoplásmico •Tasa evolutiva mayor que el genoma nuclear (5-10 veces)

•Muy compacto (no intrones con pequeños espaciadores intergénicos).

•HERENCIA MATERNAL: Muy sensible a deriva genética, efectos fundacionales y cuellos de botella

Solea senegalensis alevin Estructura general del ADN mitocondrial

METODOLOGÍA

16S

IM

nd1

nd2 Q

16S•2

W

D

coI ANCY

coII

K

G

R

HSL

nd4

T

nd5

S

nd6

12S

L

coIII

V

atp8 atp6

F

leu•1 nd3 nd4L

16S•1

cytb E

leu•2

CR P

ESTRUCTURA DEL MITOGENOMA El ORDEN y CONTENIDO del mitogenoma de lenguado senegalés coincide con el modelo general de vertebrados

•13 genes codificantes

•3 subunidades del complejo de la citocromo c oxidasa •1 subunidad del complejo de la ubiquinol citocromo c oxidorreductasa •7 subunidades de la NADH ubiquinona oxidorreductasa •2 subunidades de la ATP sintasa

•2 genes de ARN ribosómicos (12S y 16S) •22 genes de ARN transferentes •2 regiones no codificantes (D-loop y oriL)

CARACTERÍSITICAS GENES CODIFICANTES

• • •

•

Longitud total: 16,659 pb. Todos los genes codificantes poseen ATG como codón de inicio excepto la COI y ND1 que comienzan por GTG y la ND3 con ATA. 3 de los 13 genes codificantes (COII, ND4 y cytb) terminan en un codón truncado (T). Se cree que la terminación de estos genes se transforma en TAA tras una poliadenilación del mensajero Existen 4 regiones de solapamiento entre genes codificantes en la misma cadena. ATP8 y ATP6 comparten 10 bases, ATP6 y COIII 1 base, ND4L y ND4 7 bases mientras que ND5 and ND6 8 bases.

Región oriL El origen de replicación de la cadena ligera (oriL) se localizó dentro de un grupo de genes de ARNt (región WANCY) entre el ARNt

Asn

y ARNt Cys. Su tamaño fue de 51 nucleótidos. Este formaba una estructura secundaria típica consistente en un brazo de 14 nucleótidos apareados y un lazo de 11 bases ricas en timinas. La secuencia conservada 5'-GCCCG-3'

se

localizo en la base de este lazo dentro de tRNACys

Estructura secundaria de oriL

Región D-loop •

La region D-loop tuvo 1018 pb de longitud. Su contenido promedio de bases fue: 33.7 % A, 31.8% T, 21.1% C, y sólo 14.0% G para la cadena ligera.

Domain I ETAS

Domain II Conserved

Domain III variable

Presentó distintas regiones conservadas.

• • •

TAS

La “termination-associated sequence” (TAS) se situo en la región de control cercano al ARNtPro como un grupo de 3 repeticiones repetidas en tándem. Una secuencia homóloga a la región CSB-D se ubicó en en área central Adyacente al ARNtPhe , se identificaron los 3 bloques conservados CSB-1, CSB2 y CSB-3.

A C ATATAT GTATT

CSB-D

ATTC CT G G C ATTTG G CT CT

CSB-1

ATATC AT G A G C ATA A

CSB-2 GTTA A A C C C C C C C TAC C C C C C C

CSB-3 CT G C A A A C C C C C C G G A A A C A

HETEROPLASMIA

•La región D-loop de 10 individuos se amplificó por PCR usando cebadores específicos y los productos obtenidos se clonaron en células DH5α α.

•Se secuenciaron 10 clones por individuo. Un total de 100 secuencias de a aproximadamente 1018 pb se analizaron.

•NO HUBO EVIDENCIA de heteroplasmia de longitud o secuencia en los individuos estudiados

ESTUDIO DE VARIABILIDA GENÉTICA Reserva 2 T5

GRUPO CONTROL

T1 AÑO 1999 T2 Reserva 1 T3 AÑO 2001 T4 Río S. Pedro Reserva 1 muy influencia por el agua del Río S. Pedro Reserva 2, muy aislada y se supone que sólo contiene animales salvajes

DATOS HAPLOTÍPICOS Todos los animales se creen inicialmente de origen salvaje La región D-loop se secuenció en un total de 82 individuos

Reserva 2

Reserva 1

Individuos

Haplotipos

Diversidad haplotípica

Diversidad nucleotídica

T1

21

9

0.63

0.4 %

T2

18

11

0.86

0.6 %

T3

13

7

0.73

0.3 %

T4

15

7

0.72

0.4 %

T5

15

14

0.99

0.7 %

nº individuos

FRECUENCIA DE HAPLOTIPOS

Se hallaron un total de 39 haplotipos El haplotipo 1 se detectó 37 veces, aproximadamente el 45% de los individuos analizados El haplotipo 2 y 3 se presentaron 3 veces mientras que los haplotipos 7, 11 y 26 sólo dos. El resto de haplotipos eran únicos

Distribución haplotipo 1

El haplotipo 1 se observó en todos los tanques Sin embargo, no estaba uniformemente distribuido entre ellos Este haplotipo fue más frecuente en los tanques de la reserva 1 (T1-T4). Estos valores oscilaban entre el 47% al 62 %. En el tanque control este valor fue de tan solo el 13%

Haplotipo 1. Ratio H/M

Si consideramos la relación H/M para los individuos del haplotipo 1, encontramos que los animales de la misma reserva y año tenían valores semejantes. Tanques 1 y 2 poseían un ratio de 4.3 y 6 respectivamente. Los tanques 3 y4 tenían valores de 0.4 y 0.6 respectivamente mientras que el tanque control no poseía hembras de este haplotipo. Estos datos son muy importantes porque un total de 10 y 6 hembras en los T1 y T2 comparten este mismo haplotipo. Esto dificultaría el uso de este marcador molecular para la trazabilidad de las puestas en las hembras para estos dos tanques

MINIMUN SPANNING TREES Tank 1 Estos árboles representan la variabilidad haplotípica encontrada en los 5 grupos estudiados. Los haplotipos encontrados en cada lote se indican mediante círculos negros. Su tamaño es propocional a la frecuencia de este haplotipo en cada tanque. Tank 2 El haplotipo 1 se observó en ambos tanques y fue el más frecuente. La distribución de haplotipos fue muy similar en ambos tanques.

MINIMUN SPANNING TREES Tank 3

Tank Tank 5 5

Tank 4

Los tanques 3 y 4 presentaron una frecuencia y un patrón de distribución similar a lo observado en los tanques anteriores Por el contrario, el tanque 5 presenta una baja frecuencia del haplotipo 1 aunque con un patrón de distribución muy similar.

RESULTADOS AMOVA JERÁRQUICA* 3 Groups definidos: Source of variation

T1 y T2 d.f.

T3 y T4

Variance components

T5

Percentage of variation

*Basada en frecuencias haplotípicas

Fixation indices

P value

Among groups

2

0.014

3.42

0.034

0. 14 ns

Among populations within groups

2

0.001

0.18

0.002

0. 02 *

Within populations

77

0.389

96.40

0.036

0. 04 *

AMOVA mostraron que la mayor variación se encuentra dentro de las poblaciones (>96%). Los grupos definidos no mostraron diferenciación mientras las poblaciones dentro de grupo mostraron diferencias significativas Al calcular la probabilidad asociada a los valores de Fst entre poblaciones, el grupo control se diferenció significativamente de los tanques T1, T3 y T4

CONCLUSIONES •El contenido y orden de los genes del mitogenoma del lenguado senegalés era similar a otros teleósteos

•La ausencia de heteroplasmia observada en tamaño y secuencia posibilita la secuenciación directa de los fragmentos de PCR sin clonación previa como método rápido y fiable para asignar el parentesco y estudios de estructura genética

•La región de control ha demostrado su utilidad para estudios de variabilidad genética en el banco de reproductores. De forma genérica, se pude decir que se ha detectado una alta diversidad haplotípica. Esto posibilita que este marcador sea usado para monitorizar la conducta reproductiva de las hembras (a excepción de aquellas de los tanques 1 y 2)

CONCLUSIONES •

Sobre estructura genética, no hubo diferenciación en los grupos de animales observados.

•

La alta presencia del haplotipo 1 en los grupos de animales de la reserva 1 indica que estas poblaciones salvajes están expuestas a un proceso importante de deriva genética en el que descendencia de nuestro banco de reproductores han sido englobados en las poblaciones naturales.