MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD CENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA

VARIANTES GENÉTICAS DE Aedes aegypti Y SU ASOCIACIÓN CON EL SEROTIPO DEL VIRUS DENGUE EN UNA ÁREA ENDÉMICA DEL PERÚ

SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº96

BLGO. OMAR ALBERTO CÁCERES REY BLGO. WALTER LEÓN CUETO

2007

VARIANTES GENÉTICAS DE Aedes aegypti Y SU ASOCIACIÓN CON EL SEROTIPO DEL VIRUS DENGUE EN UNA ÁREA ENDÉMICA DEL PERÚ

INFORME FINAL VARIANTES GENÉTICAS DE Aedes aegypti Y SU ASOCIACIÓN CON EL SEROTIPO DEL VIRUS DENGUE EN UNA ÁREA ENDÉMICA DEL PERÚ I.

Autores Blgo. Omar Alberto Cáceres Rey Investigador Principal Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular Av. Defensores Del Morro Nº 2268 Chorrillos Teléfono: 4674499 anexo 546 [email protected] Blgo. Walter León Cueto Co-Investigador Laboratorio de Entomología Av. Defensores del Morro 2268 Chorrillos Teléfono: 4674499 anexo 548 [email protected]

II.

Resumen

Aedes aegypti es el principal vector de la enfermedad del Dengue. Las epidemias pueden surgir en cualquier sitio en donde exista el vector y se introduzca el virus. A esto se suma la falta de una vacuna eficaz disponible, al abandono de los programas de control y vigilancia del mosquito, al transporte moderno y al rápido crecimiento de la población. Todo esto ha conllevado a la expansión del virus y su mosquito vector. Por lo tanto el conocimiento de su variabilidad genética y dispersión génica llevará a un mejor control de la enfermedad. Objetivo: Identificar mediante la técnica de AFLP, las variantes genéticas de A. aegypti procedentes de algunas localidades endémicas del Perú. Materiales y Métodos: Se muestrearon en 9 localidades (Zarumilla, Sullana, Chiclayo, el distrito de El Rimac, Jaén, Tingo María, Iquitos, Tarapoto, Pucallpa) del Perú y se analizó 5 mosquitos por localidad (n = 45). El análisis se determinó por AFLP, utilizando tres combinaciones de primers. Resultados: Mediante AFLP se determinó 111 marcadores, dando como resultado dos variantes genéticas; la variante Costera y la variante Sierra-Selva. Conclusión: La primera variante reveló un importante flujo génico (Fst = 0.106) y la segunda, una limitada dispersión génica del mosquito (Fst = 0.160). AFLP resultó ser una herramienta muy útil para identificar variantes genéticas; y apropiada cuando no se cuenta con un número alto de muestras, debido a su alto poder de discriminación.

III.

Introducción

El Dengue es una enfermedad viral transmitida por la picadura del mosquito Aedes aegypti, hay cuatro serotipos del virus llamados Dengue 1 (DEN-1), Dengue 2 (DEN-2), Dengue 3 (DEN-3) y Dengue 4 (DEN-4). Actualmente, está Variantes genéticas de Aedes aegypti y su asociación con el serotipo del virus dengue en una área endémica del Perú Blgo. Omar Cáceres Rey 11/06/2007

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preocupando al mundo por estar categorizada como reemergente. Las epidemias pueden surgir en cualquier sitio en donde existan los vectores y se introduzca el virus, tanto en zonas urbanas como rurales, esto es principalmente en países ubicados en regiones tropicales y subtropicales (Gubler y Trent, 1993). Además de la enfermedad febril benigna auto limitante conocida como Dengue Clásico (DC), existen formas severas de la enfermedad como el Dengue Hemorrágico (DH) y el Síndrome de Shock por Dengue (SSD); los cuales comprometen la vida del paciente (Henchal y Putnak, 1990). A todo esto, se suma la evidencia de que pueden darse coinfecciones con hasta tres serotipos del virus en un mismo paciente (Loroño–Pino y Col., 1999); probablemente esto se puede deber a que las hembras de A. aegypti son capaces de llevar en su interior más de un serotipo (Cáceres, 2003). Hay cerca de 500,000 casos de fiebre hemorrágica por dengue/síndrome del shock por dengue (DHF/DSS) de gravedad cada año que requiere hospitalización, con las proporciones de caso/fatalidad tan altas (5%), que dependen de la disponibilidad del tratamiento (WHO, 2002). El reporte global de DH ha aumentado cinco veces en promedio en los últimos 20 años. A principios del siglo 21 se ha estimado entre 50 y 100 millones de casos de DC y varios cientos de miles de casos de DH (Gubler, 2002). Hasta el año 1999, en el Perú sólo circulaban DEN-1 y DEN-2 americano (no virulento). Casos de DH no se reportaron sino hasta los años 2001 y 2002, fecha de la introducción de DEN-2 asiático (virulento), DEN-3 y DEN-4 en donde se registraron 28815 casos de dengue con 251 casos dengue hemorrágico (Montoya Y y col., 2003). Recientemente, en el año 2005, surgió un brote epidémico de DC autóctono en el Distrito de Comas (Lima). La tipificación molecular determinó que se trataba del genotipo III del serotipo DEN-3 (Mamani y Col., 2005). El abandono de los programas de control y vigilancia del mosquito, el transporte moderno y el rápido crecimiento de la población; ha conllevado a la expansión del virus y su mosquito vector; haciendo que éste se adapte a nuevos ambientes. Por lo tanto, el factor humano, ambiental y evolutivo; han originado poblaciones polimórficas de A. aegypti a nivel genético, que podrían influenciar su capacidad vectorial para los virus que trasmite. A principios de los años 70s, las isoenzimas eran usadas extensamente como marcador para analizar la estructura genética de poblaciones naturales, como el caso de A. aegypti, donde se encontró una baja diferenciación genética entre poblaciones del mosquito de todo el mundo (Tabachnick y Powell, 1979). El Polimorfismo de Longitud de Fragmentos Amplificados (AFLP, del inglés Amplified Fragment Length Polymorphism), desarrollada por Vos y Col., 1995; es otra técnica de fingerprinting basado en las técnicas RFLP y PCR que utiliza el genoma completo del organismo. Utilizada inicialmente para el análisis de diversidad genética en plantas y bacterias, luego fue utilizada satisfactoriamente en insectos. Su robustez, alta reproducibilidad, elevado Variantes genéticas de Aedes aegypti y su asociación con el serotipo del virus dengue en una área endémica del Perú Blgo. Omar Cáceres Rey 11/06/2007

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poder discriminativo y facilidad de aplicación lo hace una técnica ideal para el estudio de variabilidad genética de organismos como Aedes aegypti. El análisis de AFLP ha dado información acerca de la variabilidad y estructuración poblacional de A. aegypti. Yan y Col. (1999), utilizaron y compararon los marcadores AFLP y RFLP en poblaciones de A. aegypti en Trinidad y Tobago. Similarmente, en Phnom Penh, Cambodia, se compararon tres marcadores moleculares, AFLP, isoenzimas y microsatélites, para determinar la variabilidad genética del mosquito vector (Paupy y Col., 2004). A nivel local, en el Noroeste de México, se determinó la diversidad genética de A. aegypti mediante AFLP y microsatélites, observándose un proceso de reinvasión (Ravel y Col., 2001); resaltando el gran poder de discriminación y reproducibilidad de ésta técnica. En el Perú, estarían circulando dos variantes genéticas de A. aegypti, la primera pertenece a la zona de la Costa-Norte y la segunda a la del NorOriente (Leiva y Cáceres, 2004). En dicho estudio se analizaron y compararon el Segundo Espaciador Transcrito Interno (ITS 2) de mosquitos provenientes de 7 localidades del Perú (Jaén, Tingo María, Iquitos, Lambayeque, el distrito de El Rimac, Sullana y Zarumilla) y una de Ecuador (Huaquillas). En este estudio, no se encontraron relación entre las distancias genéticas del mosquito y las distancias geográficas de las localidades analizadas, existiendo la posibilidad de que la Cordillera de los Andes esté actuando como una barrera geográfica. A pesar que se ha realizado muchos estudios con respecto a la enfermedad del Dengue, todavía no existe ninguna vacuna disponible y se estima que demorará de 5 a 10 años diseñar una vacuna eficaz. Pues bien, la única alternativa es el control del vector. Para mantener efectivo dicho control, es necesario conocer la genética y el flujo génico que hay entre las poblaciones del mosquito, y entender como está formada su población, es decir, si es una población monotípica o si presenta polimorfismo genético. Dicha información podría permitir la discriminación entre subpoblaciones resistentes a insecticidas y permitirá analizar la dispersión de estas subpoblaciones. Además permitirá establecer marcadores moleculares propios de A. aegypti resistentes o sensibles a insecticidas. También nos daría información acerca de la diversidad genética del vector y nos permitirá determinar sí la capacidad vectorial para la transmisión del virus está correlacionada con el polimorfismo genético Por lo tanto, en el presente trabajo se identificó mediante AFLP las variantes genéticas de A. aegypti procedentes de alguna áreas del Perú y se confirmo la existencia de las variantes genéticas de este vector previamente reportadas. IV.

Antecedentes

El virus dengue pertenece a la familia Flaviviridae y esta constituido por una cadena simple de ARN positivo, esta rodeado por una envoltura lipídica, su Variantes genéticas de Aedes aegypti y su asociación con el serotipo del virus dengue en una área endémica del Perú Blgo. Omar Cáceres Rey 11/06/2007

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genoma tiene aproximadamente 11 kb de longitud, la cual se traduce a una poliproteína que da origen a 3 proteínas estructurales y 7 proteínas no estructurales (Henchal and Putnak, 1990). Aedes aegypti es un mosquito que pertenece a la familia Culicidae y su ciclo de vida comprende el huevo, cuatro estadios larvales, un estadio de pupa y el de adulto. Es principalmente una especie doméstica, cuyas hembras hematófagas infestan recipientes naturales o artificiales que se encuentran en casas o cerca de poblados humanos (Nelson, 1986). El abandono de los programas de control y vigilancia del mosquito, el transporte moderno y el rápido crecimiento de la población humana ha conllevado a la expansión del virus y su mosquito vector haciendo que éste se adapte a nuevos ambientes. La fiebre por dengue es una enfermedad antigua que se ha distribuido mundialmente en los trópicos durante los siglos XVIII y XIX. La epidemiología global y la dinámica de transmisión del virus dengue cambiaron drásticamente en el sureste de Asia durante la segunda guerra mundial. La ruptura y el cambio en la ecología causada por la guerra tuvo como efecto la expansión geográfica y el incremento en la densidad de A. aegypti, haciendo que muchos países en ésta región sean altamente permisibles a la transmisión del virus (Gubler, 1997). Después del abandono del exitoso programa de erradicación de Ae. aegypti en las Americas en 1970, A. aegypti reinvade muchos países de la región. En los años 80s y 90s, el virus y su mosquito vector continuaron su expansión geográfica causando procesos de reinvasión y aumentando la emergencia de DH (Gubler, 2002). En el Perú, A. aegypti se detectó por primera vez en el año de 1852. Se cree que el mosquito se introdujo por el lado norte del Perú, a través de la región vecina de Guayaquil (Ecuador). Luego se fue estableciendo progresivamente a lo largo de la costa norte y central del Perú (Griffitts, 1934). En 1905, Barton reportó la presencia de A. aegypti en el puerto del Callao, departamento de Lima. Estos resultados pusieron en movimiento la primera campaña de control de A. aegypti en el Perú (Roe, 1924). Como resultado del programa de control de A. aegypti, en 1958, el Ministerio Peruano de Salud, bajo la consideración de la Organización Panamericana de la Salud (PAHO), anunciaron que A. aegypti había sido erradicado del país (Severo, 1958). Pero en 1984 personal del Ministerio de Salud reportaron la captura de A. aegypti en el departamento de Loreto, y en 1986, se expandió hacia los departamentos de San Martín y Huánuco. Más adelante, se reportó la presencia de A. aegypti en algunas provincias de los departamentos de Junín, Pasco, Tumbes, Piura, Lambayeque, La Libertad, Amazonas, Cajamarca y Madre de Dios. En Marzo del 2000, larvas y pupas fueron colectadas de contenedores de agua en una casa, en el distrito del Rímac (Lima). Hasta el 2001, A. aegypti ha sido colectado al menos en 15 de los 24 departamentos peruanos (Sevilla y Col., 2001). Variantes genéticas de Aedes aegypti y su asociación con el serotipo del virus dengue en una área endémica del Perú Blgo. Omar Cáceres Rey 11/06/2007

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En la actualidad es casi inexistente estudios acerca de variabilidad genética de este vector en el país, por lo que este trabajo constituye el segundo estudio de este vector realizado por este mismo grupo de investigación V.

Objetivos generales y específicos

Objetivo general. Identificar mediante la técnica molecular AFLP las variantes genéticas de Aedes aegypti procedentes de algunas localidades del Perú. Objetivos específicos. 1. Estandarización de la técnica de extracción y purificación de ADN genómico de A. aegypti. 2. Estandarización de la técnica de AFLP. 3. Identificación y análisis de las variantes genéticas de A. aegypti generados por el AFLP fingerprinting 4. Establecer la relación entre las poblaciones de A. aegypti analizados en el presente estudio, mediante la construcción y análisis de un dendograma de similitud 5. Determinación y análisis de la variabilidad genética y la estructura genética poblacional (Fst) de la población de A. aegypti mediante el programa RAPDFST y probar su significancia a través del test estadístico AMOVA (análisis de varianza molecular) VI.

Metodología

Material biológico. Se trabajó con individuos adultos hembras de A. aegypti; los cuales fueron recolectados de diferentes localidades (con presencia del vector) del Perú: Zarumilla (Tumbes), Sullana (Piura), Chiclayo (Lambayeque), El Rímac (Lima), Jaén (Cajamarca), Tingo María (Huánuco), Iquitos (Loreto), Tarapoto (San Martín) y Pucallpa (Ucayali). De los mosquitos recolectados se escogieron 5 mosquitos por localidad. Por lo tanto, en el presente estudio se analizó una muestra total de 45 individuos de A. aegypti (n = 45). Extracción de ADN genómico de A. aegypti La extracción de ADN genómico se hizo mediante el Kit GenomicPrepTM Cells and Tissue DNA Isolation (Amersham Pharmacia Biotech Inc). Brevemente, cada mosquito se colocó en un tubo de 1.5 ml, el cual contenía 100 µl de PBS 1X (pH = 7), luego se adicionó 200 µl de buffer TE (pH = 8), 30 µl SDS 10% y 15 µl proteinasa K (20 mg/ml) y se dejo incubando a 55°C toda la noche. Después de la incubación, se añadió 3 µl de RNAsa A (10 mg/ml) y se incubó a 37ºC por 30 minutos, rápidamente se adicionó 200 µl de acetato de amonio Variantes genéticas de Aedes aegypti y su asociación con el serotipo del virus dengue en una área endémica del Perú Blgo. Omar Cáceres Rey 11/06/2007

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helado (7.5M) y se centrifugó a 14,000 rpm por 10 minutos. Se extrajo el sobrenadante y se llevó a un tubo limpio, al cual se le añadió 600 µl de isopropanol absoluto, para luego centrifugar a 14,000 rpm por 5 minutos. Se descartó el sobrenadante, sin llevarse el pellet y se lavó con 600 µl etanol helado (70%). Se centrifugó a 14,000 rpm por 5 minutos y finalmente se descartó el sobrenadante, se dejó secar a 37º C por 5 minutos y se hidrató con 70 µl de buffer TE (pH = 8). El ADN fue cuantificado para obtener su concentración, mediante un espectrofotómetro de UV (Spectronic 21D) a la longitud de onda de 260 nm. AFLP. Para el análisis de AFLP se utilizó el kit AFLP® Analysis System I (Invitrogen Life Technologies), siguiendo las instrucciones del fabricante con algunas modificaciones. Brevemente, se digirió el ADN genómico con las enzimas de restricción EcoRI y MseI, luego se añadieron los adaptadores, que se ligaron a los extremos cohesivos generados por dichas enzimas. Se diluyó la mezcla de reacción 1:10 con buffer TE. Luego se preamplificó la mezcla diluida realizando 20 ciclos de PCR usando dos primers (primers E y M) que contienen un nucleótido selectivo. Nuevamente se diluyó 1:10 los productos con buffer TE. Posteriormente, los productos de PCR diluidos fueron sometidos a una amplificación selectiva, usando 3 combinaciones de primers (EcoRI/ACG y MseI/CAA, EcoRI/ACG y MseI/CAG, EcoRI/ACG y MseI/CTT); los cuales contienen 3 nucleótidos selectivos (un PCR para cada combinación de primer). Los productos se cargaron en un gel de poliacrilamida denaturante al 8% y se sometió a electroforesis. El gel se tiñó mediante una solución de nitrato de plata con algunas modificaciones (Bassam, Caetano-Anolles y Gresshoff, 1991). Finalmente, el gel fue escaneado y luego colocado sobre papel filtro 3 MM, para llevarlo al secador de geles 583 Gel Dryer (BioRad) durante 30 minutos a 80ºC. El PCR preselectivo se llevo a cabo en un termociclador (Amplitron II, Thermolyne) con 20 ciclos de 94°C por 30 seg, 56°C por 60 seg y 72°C por 60 seg. Mientras que el proceso de PCR selectivo fue de un ciclo a 94° C por 30 seg; 65° C por 30 seg y 72° C por 60 seg. Luego se bajo la temperatura de alineamiento (0.7ºC) por cada ciclo durante los 12 ciclos siguientes. Finalmente se realizo 23 ciclos de 94°C por 30 seg; 56°C por 30 seg y 72°C por 60 seg. Determinación de las variantes genéticas de A. aegypti Las bandas presentes en el gel fueron analizadas y procesadas utilizando el software GeneProfiler versión 4.05 (Scanalytics, Inc., Fairfax, Va.). Solo se analizaron las bandas polimórficas y que no sean ambiguas, para obtener una matriz binaria de 0 (ausencia de banda) y 1 (presencia de banda). Luego se procedió a la construcción de un dendograma utilizando el método de Variantes genéticas de Aedes aegypti y su asociación con el serotipo del virus dengue en una área endémica del Perú Blgo. Omar Cáceres Rey 11/06/2007

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agrupamiento UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic average), mediante el software Treecon versión 1.3b (Van de Peer and De Wachter, 1994). Esto permitió definir los clusters e identificar las variantes de la población de A. aegypti. Finalmente se determinó el estadístico Fst (Wright, 1951) mediante el programa RAPDFST (Apostol y Col., 1996), para determinar el grado de variabilidad de dicha población. Dicho estadístico fue corroborado por AMOVA (Análisis Molecular de Varianza)

VII.

Resultados

Los ADNs genómicos extraídos (Fig. 1) tuvieron un rango de concentración entre 45 a 191 ng/ul. Para el proceso de AFLP se utilizó cerca de 300 ng por muestra.

FIGURA 1. Gel de agarosa (1%) mostrando los ADNs genómicos extraídos (señalados por la flecha).

En el análisis de AFLP (Fig. 2) se obtuvo un total de 42, 39 y 30 loci por cada combinación de primer. Es decir; se obtuvo 111 marcadores. Los criterios para determinar un locus o marcador fueron: 1) Que las bandas del gel estuvieran en un rango de peso molecular de 0.1 a 1 Kb; 2) Si una misma banda está presente en todas las muestras analizadas, entonces no se considera polimórfica. 3) Los geles que mostraron bandas ambiguas no fueron tomadas en cuenta. A partir de los 111 marcadores se procedió a realizar una matriz de 1 y 0, indicando presencia o ausencia de la banda respectivamente. Se obtuvieron varios “score” por cada peso molecular obtenido. Con la matriz obtenida se obtuvo un dendrograma (Fig. 3) utilizando el método de agrupamiento UPGMA

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Score

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FIGURA 2. Diagrama arrojado por el software GENEPROFILER de un gel teñido con plata y escaneado. La flecha marca un marcador polimórfico, encima de las bandas el score generado.

A partir del dendograma generado se definieron los clusters de la población de A. aegypti, dando como resultado dos grandes clusters bien definidos: el cluster Costero, el cual involucra principalmente especimenes de A. aegypti del departamento de Tumbes, Piura, Lambayeque y Lima; y el cluster SierraSelva, que involucra especimenes de Huancayo, Loreto, San Martín, Ucayali, Cajamarca, Lambayeque y Lima. Un individuo denominado Ucay05 (de Ucayali) estuvo fuera de todos los patrones y se le consideró como un outgroup. El dendrograma fue sometido a 100 bootstrap, es decir cada cluster del dendrograma fue evaluado 100 veces, esto con la finalidad de analizar la consistencia a las ramas.

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VARIANTE SIERRASELVA

Fst: 0.160

VARIANTE COSTERA Fst: 0.106

FIGURA 3. Dendrograma mostrando valores Boostrap (>70) y las variantes genéticas con sus respectivos Fst.

Por otra parte, el estadístico Fst total (diferencia genética) fue de 0.113, para el cluster Costero fue de 0.106 y para el cluster Sierra-Selva fue de 0.160. El AMOVA dio como resultado un valor de 14.99% (p