REVISTA ESPAÑOLA DE

ESCLEROSIS MÚLTI L E

Modelos de experimentación animal para la investigación en esclerosis múltiple Beatriz García-Díaz, Guillermo Estivill-Torrús

Volumen I - Nº 7 - Junio de 2008

Instituto de Neurociencias Clínicas. Grupo de Investigación en Neurofarmacología de Transmisores Lipídicos. Laboratorio de Investigación, Fundación IMABIS. Hospital Regional Universitario Carlos Haya. Málaga.

Vitamin D and autoimmune diseases: observations in multiple sclerosis Joost Smolders1, 2, Jan Damoiseaux2, Raymond Hupperts1 School for Mental Health and Neuroscience. Department of Internal Medicine, division of Clinical and Experimental Immunology. Maastricht University Medical Center. Maastricht. The Netherlands. 1 2

La hipótesis higiénica en la esclerosis múltiple Jorge Correale Instituto de Investigaciones Neurológicas Dr. Raúl Carrea, FLENI. Buenos Aires. Argentina.

Novedades bibliográficas Ana Mª Alonso Torres Unidad de Neuroinmunología. Hospital Regional Universitario Carlos Haya. Málaga.

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ESCLEROSIS M Ú LT I L E S T A F F Director:

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Sumario REVISTA ESPAÑOLA DE

ESCLEROSIS M Ú LT I L E

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Volumen I - Nº 7 - Junio de 2008

Modelos de experimentación animal para la investigación en esclerosis múltiple Beatriz García-Díaz, Guillermo Estivill-Torrús Instituto de Neurociencias Clínicas. Grupo de Investigación en Neurofarmacología de Transmisores Lipídicos. Laboratorio de Investigación, Fundación IMABIS. Hospital Regional Universitario Carlos Haya. Málaga.

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Vitamin D and autoimmune diseases: observations in multiple sclerosis Joost Smolders1, 2, Jan Damoiseaux2, Raymond Hupperts1 School for Mental Health and Neuroscience. Department of Internal Medicine, division of Clinical and Experimental Immunology. Maastricht University Medical Center. Maastricht. The Netherlands. 1 2



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La hipótesis higiénica en la esclerosis múltiple Jorge Correale Instituto de Investigaciones Neurológicas Dr. Raúl Carrea, FLENI. Buenos Aires. Argentina.

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Novedades bibliográficas Ana Mª Alonso Torres Unidad de Neuroinmunología. Hospital Regional Universitario Carlos Haya. Málaga.

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Agenda de congresos

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REVISTA ESPAÑOLA DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE

Nº 7 - Junio de 2008

Modelos de experimentación animal para la investigación en esclerosis múltiple Beatriz García-Díaz, Guillermo Estivill-Torrús

Instituto de Neurociencias Clínicas. Grupo de Investigación en Neurofarmacología de Transmisores Lipídicos. Laboratorio de Investigación, Fundación IMABIS. Hospital Regional Universitario Carlos Haya. Málaga.

RESUMEN. La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune inflamatoria del sistema nervioso central en la que intervienen numerosos factores. Con el fin de poder avanzar en el estudio de esta enfermedad se han desarrollado numerosos modelos animales. Sin embargo, si bien ninguno de ellos ha conseguido mimetizar cada una de las múltiples características de la patología, sí que han logrado representar individualmente alguna de las facetas de la enfermedad en humanos, lo cual ha sido de enorme utilidad en el desarrollo de nuevas terapias. Estos modelos animales pueden ser obtenidos mediante inmunizaciones activas con diversas proteínas o péptidos relacionados con la mielina, inmunizaciones pasivas, por transferencia de linfocitos T CD4+ o CD8+, inoculaciones de virus, o bien tras modificaciones genéticas. Palabras clave: esclerosis múltiple, EAE, modelos animales. SUMMARY. Multiple sclerosis (MS) is a multifactorial inflammatory autoimmune disease of the central nervous system. With the intention of progress in its study numerous animal research models have been developed. However, although none of them mimics each of the multiple characteristics of the pathology, they individually reproduce specific features of the disease in humans and represent valuable tools to develop new therapies. MS animal models can be induced by means of active immunization against different myelin proteins or peptides; passive transfer of CD4+ or CD8+ lymphocytes; viruses inoculation, or genetic manipulation. Key words: multiple sclerosis, EAE, animal models.

L

a esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune crónica y espontánea causada, probablemente, por algún factor ambiental y que se encuentra favorecida por una predisposición genética1. Esta alteración del sistema inmune está caracterizada por múltiples lesiones focales que afectan a las vainas de mielina del sistema nervioso central (SNC) y que acumulan una serie de síntomas clínicos causados, principalmente, por el proceso neuroinflamatorio y subsiguiente proceso desmielinizante que conduce al daño axonal. Entre estos signos se encuentran hiperrreflexia, ataxia, espasticidad y defectos visuales. La EM se detecta en individuos, en su mayoría mujeres, de entre 20 y 30 años, y constituye la enfermedad neurológica más común en adultos jóvenes, afectando al menos a 350.000 individuos en el Norte de América y a 500.000 en Europa2, 3. Aunque la esclerosis múltiple normalmente no conlleva una disminución de la esperanza de vida, su carga socio-económica en la población afectada es superada únicamente por la generada debido a traumatismos graves3. La EM es considerada una enfermedad autoinmune ocasionada por un infiltrado de linfocitos (T y B)4, 5 unido a una susceptibilidad genética en los genes del complejo mayor de histocompatibilidad

Correspondencia: Guillermo Estivill-Torrús – Instituto de Neurociencias Clínicas – Hospital Regional Universitario Carlos Haya Avda. Carlos Haya 82, planta 7ª – 29010 Málaga – Teléfono: 951 290 346 – E-mail: [email protected]

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(CMH) clase II6-8. Debido a esta asociación de la EM con los genes de CMH clase II los estudios encaminados a determinar la patogenia de la enfermedad fueron dirigidos inicialmente a las células T CD4+, considerando que eran éstas las que comenzarían una reacción inflamatoria en el SNC que llevaría en última instancia a la desmielinización y al daño axonal. La activación de las células B y la subsiguiente producción de inmunoglobulinas en el SNC quedaría demostrada por el característico patrón de bandas en el líquido cefalorraquídeo9. Paralelamente, en los pacientes se han podido detectar anticuerpos así como células T autorreactivas activadas para antígenos de mielina tales como la proteína básica de mielínica (MBP, de myelin basic protein), la proteína proteolipídica (PLP, de proteolipid protein) o la glucoproteína oligodendrocítica de mielina (MOG, de myelin oligodendrocyte protein). Sin embargo, el desarrollo de la EM no depende únicamente de la actividad de la población de células colaboradoras CD4+, también se han detectado poblaciones oligoclonales de células T CD8+ en placas desmielinizantes de pacientes con EM10 . Esta enfermedad es extremadamente compleja debido a la variedad de cuadros clínicos que puede REVISTA ESPAÑOLA DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE

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presentar según la zona del sistema nervioso central que se vea afectada, ya sea el cerebro o la médula espinal, y que son específicos de cada paciente, mostrando cada uno, en función de ello, un conjunto particular de desórdenes motores, sensoriales o cognitivos11, 12. Por otro lado, el curso de la enfermedad es, por el momento, impredecible ya que hay diferentes formas clínicas13 caracterizadas por distintos patrones de actividad de la EM no sólo en el espacio, sino en el tiempo, según los episodios de disfunción neurológica. La forma más frecuente, presente en el 85-90% de las presentaciones iniciales en los pacientes con EM, es un patrón recurrente-recurrente-remitente (RR) caracterizado por episodios de manifestaciones clínicas alternados con otros de remisión total o parcial de los mismos. Normalmente, tras varios años, aproximadamente diez, la enfermedad evoluciona hacia su forma progresiva secundaria (PS). Alternativamente, entre el 10 y 15% de los pacientes muestran desde su inicio un curso progresivo primario (PP) caracterizado por episodios severos seguidos de una progresión continuada de los síntomas hasta alcanzar un alto grado de discapacidad. Esta destacada heterogeneidad en el cuadro clínico de la enfermedad es fruto de un complejo abanico de alteraciones inmuno- e histopatológicas, unido a numerosas influencias genéticas y ambientales2, 14-16. A través de estudios anatomopatológicos se pudieron distinguir cuatro variantes inmunológicas de la enfermedad, mostrando la gran variedad que existe entre los distintos pacientes; sin embargo, manteniendo un patrón homogéneo dentro cada uno. Las lesiones caracterizadas por desmielinización mediada por células T y microglía o macrófagos se denominaron “patrón I”, mientras que las mediadas por anticuerpos y sistema del complemento caracterizaban el “patrón II”. También se han observado lesiones con daño tisular similar al ocurrido en casos de hipoxia (“patrón II”) y otras donde hay una gran destrucción de oligodendrocitos (“patrón IV”)17. Esto sugiere que la heterogeneidad en la patología y cuadro clínico de los pacientes de EM es el reflejo de diferentes mecanismos de acción de la enfermedad11. A pesar de su alta prevalencia en la población, aun se conoce poco acerca de la patogenia de la EM. Esto se debe a que sus estudios se ven muy dificultados por su propia complejidad, así como por los distintos aspectos éticos y prácticos que conlleva cualquier enfermedad humana y que impiden llevar a cabo estrategias que permitan la obtención directa de respuestas. Por otro lado, el hecho de que el órgano afectado sea el tejido nervioso lo hace inaccesible a aproximaciones experimentales. Es por todo ello que, incluso en mayor medida que en otras enfermedades humanas, la investigación sobre los mecanismos paREVISTA ESPAÑOLA DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE

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togénicos de la EM depende de la disponibilidad de modelos animales adecuados para poder desarrollar terapias efectivas y específicas. En la actualidad, aunque existe un gran número de modelos animales disponibles para el estudio de la EM, ninguno de ellos consigue aunar todas las características de la enfermedad, sino que cada uno representa aspectos aislados de su patogenia. Muchos modelos producen lesiones en el SNC que causan reacciones inflamatorias y varios grados de destrucción de la mielina. Algunos tienen un episodio agudo autolimitado, presentando síntomas que revierten sin dejar secuelas, mientras que otros se caracterizan por mostrar un curso recurrente-remitente. La mayoría de los modelos actuales de EM consisten en una inducción activa, mediante procesos de inmunización, infecciones virales, o bien transferencia de células patogénicas del sistema inmune. Sin embargo, últimamente, y de manera creciente, se están desarrollando cepas de ratones transgénicos que pueden desarrollar la enfermedad de manera espontánea.

❑ Encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es el modelo animal más usado, en la actualidad, para el estudio de la esclerosis múltiple. Su origen se estima en los años treinta, del siglo pasado, cuando las observaciones de los efectos neurológicos que tenían lugar tras algunas vacunaciones contra la rabia18 llevaron a Koritschoner y Schweinburg19 y, más tarde, a Hurst20, a comprobar experimentalmente el efecto de la inoculación de emulsiones de cerebro o médula espinal en roedores. El modelo fue definitivamente establecido en 1933 por Tomas Rivers quien logró, por primera vez, producir una reacción inflamatoria acompañada de desmielinización mediante repetidas inmunizaciones con tejido nervioso, y demostró que las complicaciones encefálicas eran causadas por contaminantes de este tejido presente en las vacunas21. Una vez extendido a otras especies animales, serían Olitsky y Yager los que en 1949 lograrían inducir EAE en un ratón de manera similar a la que se conoce hoy en día22. Desde entonces, el modelo de EAE ha sido empleado en distintas especies y ha llegado a reproducir muchas de las características clínicas, neuropatológicas e inmunológicas de la esclerosis múltiple23-27. Clínicamente, los animales con EAE presentan afectado el neuroeje y manifiestan una parálisis de los miembros, parcial o total, que asciende, generalmente, en sentido caudorostral. Los primeros signos clínicos, establecidos generalmente en un rango de 5-6 fases28-29, son, secuencialmente, debilidad en la

Beatriz García-Díaz, Guillermo Estivill-Torrús

Figura 1 Inducción de EAE con MOG35-55 en ratones C57Bl/6 × 129SW. (a) Fotomontaje de imágenes de vídeo de ratón con EAE captadas a intervalos de 0,5 seg. Se puede apreciar la dificultad de movimientos en las extremidades traseras y la falta de tono muscular en la cola, que imposibilita su alzada. (b, c) Imágenes de secciones coronales de cerebelo (b) y telencéfalo (c) de ratón con EAE mostrando infiltrado de células T CD3 en el área perivascular (puntas de flecha) y en las proximidades del cuerpo calloso (CC). Barra (b, c): 100 µm.

cola, debilidad de las patas traseras, parálisis de las patas traseras (Figura 1a), y finalmente, parálisis de las cuatro extremidades, tras lo cual suele sobrevenir la muerte del animal. Además, estos síntomas vienen generalmente acompañados por una pérdida de peso causada por una disminución en la ingesta de agua y alimento. Al igual que en la EM la patología de la EAE en el SNC está caracterizada inicialmente por una infiltración de linfocitos y macrófagos en la sustancia blanca (Figura 1b) y una posterior desmielinización30-32. Las lesiones suelen manifestarse en forma de múltiples lesiones del SNC distribuidas en tiempo y espacio, aunque, generalmente, más localizadas en el tronco cerebral y la médula espinal; existe una localización perivascular preferente de las lesiones (Figura 1c); un curso temporal del proceso que parte de la inflamación y desmielinización, un proceso de gliosis y una remielinización parcial; y hay presencia de inmunoglobulinas en el SNC y el líquido cefalorraquídeo27, 33. El curso de la enfermedad puede variar según el caso, pudiendo consistir, bien en una fase aguda de inflamación que revierte totalmente con el tiempo, bien en una alternancia de episodios clínicos intercalando periodos de remisión total o parcial de los síntomas, o bien en una progresión continuada de la sintomatología hasta llegar a una parálisis total del

individuo que conllevaría a la muerte. En cualquier caso, se ha demostrado que, tanto el proceso inflamatorio, como el neurodegenerativo, pueden concurrir a la vez, como sucede en la EM. Cuando se comenzó a desarrollar el modelo, la variabilidad en las respuestas producidas tras protocolos similares de inmunización llevó a considerarlo como una respuesta alérgica a los distintos péptidos más que una respuesta autoinmune. El fundamento de esta hipótesis era debido a que el término “alérgico” está unido a una hiperactividad del sistema inmune ante un antígeno extraño; dicha hiperactividad englobaría la gran variedad de respuestas que se observan tras la inmunización. Esta teoría fue rebatida en favor de la “respuesta autoinmune” con el desarrollo de nuevas técnicas mediante las cuales células T, específicas para un antígeno determinado, se podían propagar in vitro. Así, Ben-Nun et al.34 demostraron, en 1981, que la inoculación intravenosa de células T específicas contra MBP provocaba signos clínicos de parálisis en ratas singénicas. Pocos años después, Schluesener y Wekerle proporcionaron las pruebas definitivas para desestimar el término “alérgico” al demostrar la presencia de clones de linfocitos T autorreactivos en el sistema inmune normal, base de una reacción autoinmune35. Basándose en estos experimentos se estableció el modelo de “transferenREVISTA ESPAÑOLA DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE

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Revisión Tabla I

Ejemplos seleccionados de distintas patologías y progresiones de EAE

Autoantígeno

Especie/cepa

Especie/cepa

MBP

Ratón/SJL/J Rata/Lewis Ratón/B10.PL o PL/J

Recurrente-remitente, con desmielinización44. Aguda, inflamatoria, sin desmielinización45, 46. Aguda/crónica; monofásica y resistente a la reinducción; inflamatoria y con daño axonal47, 48.

MOG

Ratón/C57BL/6, 129/J Ratón/A.SW Rata/Brown Norway

Crónica/recurrente-remitente con desmielinización43. Aguda; progresiva, desmielinización, infiltrado de neutrófilos49. Aguda, inflamatoria, sin desmielinización50.

PLP

Ratón/SJL/J o (SWR x SJL/J)F1 Ratón/129/J, C57BL/6 Rata/Lewis

Recurrente-remitente, desmielinización51, 52. Aguda; inflamatoria53, 54. Aguda, inflamatoria y desmielinizante55.

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cia adoptiva de EAE”, que consistía en provocar los síntomas de la enfermedad a través de la inoculación directa de los línfocitos T reactivos a algún componente de la mielina.



Encefalitis autoinmune experimental inducida de manera activa Tras la descripción inicial del modelo de EAE en primates, éste continuó desarrollándose en otras muchas especies; sin embargo, el modelo no fue establecido de manera consistente hasta la introducción de nuevos inmunopotenciadores o adyuvantes que permitieron obtener respuestas lo suficientemente eficaces y homogéneas. Gracias a la utilización del coadyuvante de Freund se pudo desarrollar la enfermedad tras una única inoculación36, en lugar de emplear las repetidas inoculaciones que se necesitaban hasta entonces, y en una mayor variedad de especies. A pesar de que el modelo murino de EAE fue descrito en 1950, su utilidad estuvo limitada por la baja incidencia de la enfermedad y la gran heterogeneidad del cuadro clínico producido. Estos problemas se vieron resueltos con la introducción de la toxina pertussis37, 38. Dicha toxina permitió aumentar tanto la inducción de la enfermedad como el número de cepas susceptibles a ella; sin embargo, aunque aumentó la eficacia, el progreso de la enfermedad continuó siendo determinado por otros factores, tales como el antígeno utilizado y las características genéticas de la especie. El curso clínico de la enfermedad puede ser muy diferente según la especie o cepa y el péptido utilizado, y un ejemplo de ello es la inmunización con la proteína básica de mielina. Cuando se inmunizan ratones SJL/J con esta proteína se obtiene un modelo que simula la fase inicial de la mayoría de los pacientes de EM, mostrando un curso recurrente-recurrente-remitente o en brotes39; sin embargo, cuando la inmunización se lleva a cabo en una cepa REVISTA ESPAÑOLA DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE

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distinta, PL/J, así como SJL/J x PL/J, no sólo presenta un cuadro clínico monofásico con reversión completa de los síntomas sino que adquiere inmunidad frente a una nueva inoculación, no volviendo a desarrollar la enfermedad40. Las diferencias parecen residir en la capacidad de una y otra cepa para desarrollar poblaciones de células T autorreactivas a uno u otro péptido de la proteína usada como antigeno41. Precisamente, esta línea de investigación en modelos animales, orientada a las modificaciones que tienen lugar en segmentos moleculares de los receptores de superficie de las células T, presenta enorme interés y ha dado lugar a proponer que son ciertas secuencias de dichos receptores las responsables de la enfermedad, con independencia del papel que desempeñen el CMH y los péptidos implicados42. De manera añadida, las secuencias de ambos, péptidos, y receptores, han sido consideradas dianas moleculares para el desarrollo de terapias efectivas y ensayos clínicos27. Otro ejemplo de la relevancia de los factores genéticos lo constituye la inmunización con la glucoproteína MOG. La respuesta de ratones C57Bl/6 (fondo génico B6) ante la inoculación de MOG es de un curso crónico progresivo, mientras que la cepa 129/J (ambos utilizados en la generación de ratones modificados genéticamente y knock-out) muestra la variante recurrente-recurrente-remitente43. La Tabla I muestra ejemplos representativos de las respuestas de inducción activa de la patología en diferentes cepas ante diferentes antígenos. La elección de uno u otro modelo implica que la patología curse o no con procesos de desmielinización. En este sentido, es importante decir que la desmielinización es un proceso mediado por una combinación del sistema de complemento y mecanismos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos56. Este hecho, demostrado por Morris et al.56, corroboraba los datos obtenidos en estudios anatomopatológicos de lesiones en pacientes de EM en las que

Beatriz García-Díaz, Guillermo Estivill-Torrús aparecía desmielinización mediada por anticuerpos y complemento (“patrón II”). En sus estudios demostraron que la inoculación de anticuerpos contra MOG agravaba la clínica y el proceso de desmielinización en ratones ABH y C57BL/6 otorgándoles un papel importante en la patogénesis de la enfermedad. Por otro lado, en algunas especies, como la rata o en pequeños primates, la respuesta mediada por las células T no es suficiente para simular la patología de la EM. En estas especies, como en algunos pacientes de EM, la formación de lesiones desmielinizantes requiere la generación de anticuerpos específicos de mielina por parte de linfocitos B17. De dicha mielina, por otra parte, se desconoce buena parte de sus componentes antigénicos, siendo la galactosil-ceramida, el sulfátido o galactocerebrósido y la glucoproteína MOG los únicos tres antígenos conocidos cuyos anticuerpos son capaces de iniciar una respuesta celular citotóxica proinflamatoria y, a la postre, desmielinizante en la EAE57. Transferencia adoptiva de encefalitis autoinmune experimental (TA-EAE) La transferencia adoptiva de encefalitis autoinmune experimental (TA-EAE) consiste en generar pasivamente la respuesta correspondiente a la EAE mediante la inoculación de células T, CD4+ o CD8+, activadas contra epítopos de la mielina en lugar de inducirla directamente de manera activa a través de la inmunización frente a alguno de sus antígenos. En 1960, Philip Y. Paterson demostró, por primera vez, que la EAE podía ser transferida desde ratas inmunizadas a huéspedes sanos mediante la inoculación de células extraídas de los nodos linfáticos, y no a través del suero58. Estos resultados dieron pie, tras el aislamiento de líneas de células T monoespecíficas, a determinar que este tipo celular, concretamente el linfocito T colaborador CD4+, era el causante de la respuesta inmune presente en la EAE34. Estas células T colaboradoras reconocen los epítopos antigénicos mediante el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) clase II, y responden a la activación secretando las citocinas interferón gamma (IFN-γ) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), por lo que fueron clasificadas como células colaboradoras (Th, de T helper) de tipo 1 (Th1)59. Recientemente se ha puesto de manifiesto, por otro lado, que existe un conjunto de células T CD4+, Th17, que liberan la citocina interleucina-17 (IL-17), en lugar de IFN-γ, y que juegan un papel crítico en el desarrollo de la EAE60. Así, los ratones deficientes genéticamente en IL-17, o aquellos en los que la actividad de ésta se encontraba neutralizaba mediante el tratamiento con anticuerpos anti-IL17, presentaban una menor severidad de síntomas respecto a los ratones controles61, 62. La importan-

cia de las poblaciones celulares Th17 quedó también confirmada por la incapacidad de desarrollar EAE en ratones carentes de IL-23, una citocina esencial en la expansión de células Th1763. La transferencia adoptiva de EAE mantiene ciertas diferencias respecto a la inmunización activa, diferencias que pueden resultar útiles en función de los estudios que se quieran realizar. Datos obtenidos de la comparación de ambos modelos en rata demostraron que la inoculación de las células CD4+ presentaba manifestaciones clínicas en un menor tiempo y con una mayor incidencia. Así, mientras que, tras la inducción activa, el tiempo de latencia era de, aproximadamente, 13 ± 0,1 días, y la incidencia alcanzaba un 53%, la transferencia adoptiva generaba sintomatología clínica a, aproximadamente, 6 ± 0,1 días del procedimiento, y se observaba en el 100% de los individuos analizados64. Otra de las ventajas que presenta es su utilización en estudios farmacológicos65, particularmente en la evaluación de agentes inmunosupresores, ya que muestra síntomas más estables y severos respecto a la inducción activa además de, por otro lado, ser muy útil a la hora de estudiar el papel específico de las células T CD4+ en la inducción de la patología de la enfermedad66. Precisamente, la utilización de esta metodología ha permitido avanzar en el conocimiento del papel que las poblaciones reguladoras CD4+CD25+ juegan en la patogenia de la enfermedad y demostrar, recientemente, que su inoculación contribuye a la eficacia terapéutica del acetato de glatirámero y la remisión de la EAE67. Aunque la mayoría de los modelos de TA-EAE son obtenidos mediante la inoculación de células T CD4+, se ha demostrado que las células T CD8+ específicas de MBP también pueden mediar una severa autoinmunidad en el SNC, presentando similitudes con la EM que no están presentes en la EAE mediada por células T CD4+, tales como ataxia, espasticidad, hiperreflexia y pérdida de la coordinación del movimiento. Histológicamente, el infiltrado inflamatorio se localiza en el cerebro y no en la médula espinal como ocurre con las células CD4+68. Todo ello indicaría que las células T CD8+ podrían inducir autoinmunidad interaccionando con el CMH clase I como presentador de epítopos69. Este papel patogénico de las células T CD8+ contrasta con observaciones anteriores en la EAE que les asignaban un papel regulador o inhibidor de la autoinmunidad en el SNC70. Estos papeles opuestos de las células CD8+ sugieren que existen dos subtipos celulares que influyen en la enfermedad de manera distinta; por un lado, las células CD8+, que expresan el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) y que parecen mantener una función reguladora; por otro, las células CD8+ específicas de neuroantígenos, como por ejemplo REVISTA ESPAÑOLA DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE

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MBP, que producen IFN-γ y, por tanto, agravan la respuesta inmune. Este doble comportamiento es similar al observado en las células CD4+, las cuales inhiben la respuesta autoinmune cuando su especificidad antigénica no está definida y coexpresan CD25, mientras que al mostrarse específicas de un antígeno del SNC, inducen EAE71. La autoinmunidad mediada por células T CD8+ tiene rasgos diferenciales respecto a la mediada por las células CD4+. Una característica principal es que son dependientes de la actividad del IFN-γ, inhibiéndose cuando se neutraliza su acción; mientras que cuando la autoinmunidad está mediada por células T CD4+ este interferón constituye una citocina protectora ante la EAE, disminuyendo su severidad. Hay que tener en cuenta que ambos tipos celulares conviven en la patogenia de la enfermedad, máxime cuando se consideran posibilidades terapéuticas. El papel de las células T CD8+ en la EM adquirió importancia tras ensayos clínicos en los que se administró IFN-γ al paciente. Esto dio como resultado un empeoramiento de los síntomas, a pesar de que experimentos previos con ratones con y sin el gen de IFN-γ parecían indicar lo contrario en la EAE72. Este resultado, unido a la mayor presencia de células T CD8+ respecto a las CD4+ que se observa en tejido cerebral de pacientes73, la alta proporción de CD8+ específicas para neuroantígenos en células mononucleares de sangre periférica de pacientesEM-RR74, así como la mayor susceptibilidad a contraer la enfermedad asociada al antígeno leucocitario humano HLA-A3 del CMH clase I75, parece sugerir que la respuesta mediada por las células T CD8+ tiene una papel relevante en la EM. Por ello, el modelo de TAEAE mediado por células T CD8+ aporta nuevas e importantes herramientas para el estudio de EM así como para el diseño de terapias alternativas contra la enfermedad. Éxitos y limitaciones del modelo EAE No hay duda que los estudios realizados en el modelo de EAE han sido y siguen siendo vitales para comprender conceptos generales y específicos de los mecanismos de autoinmunidad que tienen lugar en la EM. Sin embargo, no siempre han sido capaces de predecir éxitos en los ensayos clínicos. Esto es debido, principalmente, a las diferencias inmunológicas existentes entre humanos y ratones (la especie generalmente más usada para los estudios de EAE). A pesar de que no existe ningún modelo de EAE capaz de mimetizar todas las características inmunopatológicas de la enfermedad humana, sí se disponen, como se ha podido observar, de una gran variedad de alternativas que reflejan cada una de ellas un aspecto concreto de la enfermedad. Junto a los ya mencioREVISTA ESPAÑOLA DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE

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nados, cada uno de ellos ha ayudado a obtener descubrimientos básicos, cambiando los conceptos que se tenían de la autoinmunidad, la respuesta inmune general en el SNC y, en particular, acerca de la patogénesis de la esclerosis múltiple. Uno de los principales descubrimientos obtenido a través de los estudios de EAE ha sido la presencia de células autorreactivas que escapan de la selección negativa en el timo y que pueden encontrarse en individuos sanos76. Estas células tienen la potencialidad de producir EAE cuando son expandidas y transferidas a un nuevo individuo. Usando ratones transgénicos que expresan receptores de células T (TCR, de T cell receptor) autoinmunes, Lafaille et al.77 demostraron que no siempre se desarrollaba EAE de manera espontánea, sino que dependía de una homeostasis mediada por células T reguladoras CD8+ que desencadenaban, igualmente, un sistema de protección dirigido contra las propias células T. Posteriormente se comprobaría que esta autorregulación mediante células T se encontraba alterada en pacientes de EM78. El descubrimiento de esta regulación anti-células T ha supuesto la base de estrategias terapéuticas que utilizan células T inactivadas como vacuna preventiva, estrategia que está siendo evaluada como tratamiento para la EM79. Otro aspecto destacado en el estudio de este modelo animal fue su contribución a rebatir el dogma que consideraba al SNC como un órgano inmunoprivilegiado. Cuando se desarrollaron las técnicas retrovirales que consiguieron introducir la proteína verde fluorescente (GFP, de green fluorescent protein) dentro de células T autoreactivas fue posible seguir su destino durante el periodo de incubación en la TAEAE. Esto permitió demostrar que las células T activadas son capaces de cruzar la barrera hematoencefálica para iniciar los procesos de inflamación. Para llevar a cabo este proceso las células T autorreactivas deben adherirse al endotelio mediante diversos ligandos; entre ellos, la vía de adhesión de la integrina/receptor VLA-4/VCAM-1 (de Integrin alpha4beta1 -Very Late Antigen 4- y Vascular cell adhesion molecule 1) parece jugar un papel importante80. Basándose en estos hallazgos se iniciaron estudios usando anticuerpos humanizados anti-VLA4 (Natalizumab) que han resultado muy efectivos en el tratamiento de la EM81. A pesar de que los ensayos clínicos con este fármaco tuvieron que ser detenidos durante un tiempo por asociarlo en algunos pacientes con un incremento en la infectividad por el poliomavirus humano JCV -un virus patógeno oportunista que puede causar leucoencefalopatía multifocal progresiva-, este prometedor tratamiento se encuentra hoy en día en el mercado. Igualmente, uno de los fármacos más utilizados

Beatriz García-Díaz, Guillermo Estivill-Torrús en la actualidad para el tratamiento de la enfermedad derivó del estudio de la EAE. En 1971, Teitelbaum et al.82, con el fin de desarrollar nuevos modelos de EAE, diseñaron un copolímero sintético de aminoácidos, el acetato de glatirámero, capaz de mimetizar la MBP; sin embargo, y para su sorpresa, este polímero no consiguió desarrollar la enfermedad sino más bien suprimirla en aquellas individuos en los que se trataba de inducir la EAE por otros mecanismos, demostrándose, con el tiempo, que era capaz de disminuir los brotes en la EM-RR en un 30%83. Además de colaborar en el avance del conocimiento de los mecanismos inflamatorios de la enfermedad, el estudio de EAE ha aportado importantes hallazgos sobre el daño axonal, un componente esencial en las lesiones de EM, y la causa de la mayor parte de la invalidez en los pacientes. Estudios experimentales han mostrado anormalidades en la distribución de los canales iónicos de axones crónicos desmielinizados que pueden jugar un papel importante en la patología de la enfermedad84. Por otra parte, también han permitido demostrar que el daño axonal también puede ser producido en ausencia de una pérdida extensiva de mielina, estando su severidad correlacionada con el número de macrófagos infiltrados85. Estudios posteriores demostrarían que las células CD8+ interactuaban con axones desmielinizados, produciendo daño axonal por un mecanismo dependiente de antígeno86. Estas observaciones, basadas en los estudios experimentales, han servido de base para considerar que la neuroprotección es una aproximación terapéutica válida y recomendable en la EM con el fin de disminuir el desarrollo de discapacidades crónicas. Sin embargo, aunque el modelo de EAE imita muchos aspectos de la EM su similitud en origen tampoco es completa. En el modelo animal los componentes de mielina deben ser emulsionados con un adyuvante (adyuvante completo de Freund) para inducir la enfermedad, creando un ambiente artificial durante la inflamación que no se corresponde al medio natural en el que el péptido o la proteína se encuentra en los pacientes. Por otro lado, la mayor crítica a la hipótesis de la autoinmunidad radica en el hecho de que no se ha identificado aun ningún antígeno específico asociado a la EM; y así, también se ha descrito que en ciertos casos la desmielinización puede preceder a la inflamación87. Además, hay trabajos que postulan que la EM no se consideraría una enfermedad autoinmune sino un desorden determinado genéticamente y caracterizado por una neurodegeneración metabólica que ocasionaría posteriormente la reacción inmune característica de la EM88. Otros aspectos de la etiología de la enfermedad también han hecho pensar que ésta pudiera ser debida a una

infección viral crónica más que a una autoinmunidad en el sentido estricto89. Todo ello promueve la necesidad de buscar otros modelos, que si bien no excluyen los presentes, pueden ayudar a completar los estudios sobre la patogénesis y patología de la EM.

❑ Modelos de desmielinización inflamatoria mediada por virus La implicación de los virus en la etiología de la esclerosis múltiple es aun controvertida. Los datos que apoyan esta teoría proceden de estudios de migración de poblaciones, los cuales sugieren que existe algún factor o factores ambientales que pueden activar la enfermedad en la adolescencia, permaneciendo silente hasta varios años después. Aunque se conocen factores genéticos que favorecen la EM (el antígeno leucocitario humano HLA, clase I y II, el receptor β de células T, antígeno 4 citotóxico asociado al linfocito T, CTLA4, la molécula de adhesión endotelial soluble ICAM-1, el gen de la proteína adaptadora específica de células T, SH2D2A) los datos obtenidos a partir de gemelos monocigotos en los que existe un 70% de discordancia en la enfermedad lleva a considerar a alguno o más factores exógenos como causa de ésta, alguno de los cuales podría ser de origen vírico90. Aunque en pacientes de EM los niveles de anticuerpos frente a varios virus son elevados, y muchos de ellos se han aislado en autopsias de tejido nervioso, todavía no se ha determinado ninguno como agente causal de la esclerosis múltiple91. Sin embargo, tanto la autoinmunidad como la neurodegeneración pueden ser explicados a través de una infección viral. Paralelamente, numerosos estudios clínicos han asociado un empeoramiento en la patología asociada a infecciones virales o microbianas89. Hay diversos indicios de los posibles mecanismos por los cuales una infección viral podría iniciar o aumentar una enfermedad autoinmune órgano-específica. Entre estos mecanismos, el más destacado es el “mimetismo molecular”, que consiste en activar células T autoreactivas por una reacción cruzada entre epítopos del virus y otros propios del individuo, como por ejemplo los de la MBP, originando una reacción autoinmune, en este caso frente a la vaina de mielina92. La lista de los virus que cumplen el requisito de poseer determinantes antigénicos que pudieran reaccionar de manera cruzada con epítopos presentes en el SNC no es corta; entre ellos, el más destacado es el virus de la encefalitis murina de Theiler (TMEV), que produce anticuerpos capaces de reconocer galactocerebrósido induciendo desmielinización93. Con el fin de buscar otros posibles candidatos se ensayaron péptidos que, si bien no guardaban homología linear con la MBP, componente mayoritario REVISTA ESPAÑOLA DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE

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de la mielina, sí que eran capaces de estimular clones de células T autorreactivas a MBP. Estos péptidos se introdujeron en una base de datos, obteniéndose, así, virus patógenos humanos que, potencialmente, podían generar una respuesta autoinmune, y entre los que se hallaron el virus de Epstein Barr (EBV), el virus de herpes simplex (HSV), el citomegalovirus (CMV), el virus influenza, y el adenovirus94. Otro mecanismo por el cual los virus pueden generar autoinmunidad es mediante la activación inespecífica (efecto bystander en terminología anglosajona), es decir, mediante una activación no específica de células autorreactivas provocada por una inflamación o necrosis del tejido diana tras una infección vírica. Este mecanismo se genera por la liberación de antígenos que no estaban previamente expuestos, debido a la destrucción del tejido, y que pasan a encontrarse en un ambiente de inflamación local. Como consecuencia de ello, las células autorreactivas pueden ser activadas sin necesidad de estar directamente implicadas en la infección viral95. Se ha descrito un tercer mecanismo, llamado “de expansión antigénica”. Este mecanismo consiste en la ampliación de una respuesta inmune que inicialmente estaba enfocada hacia un determinante antigénico para transformarla en una respuesta frente a diferentes epítopos de la misma molécula (intramolecular) o de otra molécula distinta (intermolecular). Este hecho se ha podido observar en infecciones por TMEV, donde se han encontrado células T reactivas contra el epítopo principal de PLP capaces de producir desmielinización en cultivos organotípicos96. Al margen de la posibilidad que presentan los virus de desarrollar una enfermedad autoinmune se encuentra el hecho de que son capaces de producir daño axonal y neurodegeneración independientemente de los procesos inflamatorios. Inicialmente se consideraba que el daño axonal era una consecuencia de la desmielinización durante las fases inflamatorias de la EM. Sin embargo, a veces, este daño axonal existe incluso en sustancia blanca con apariencia normal en la que la inflamación es mínima o esta ausente97. Es más, no existe una correlación clara entre el grado de inflamación y la extensión de la degeneración axonal, la cual puede tener una distribución amplia incluso en estadios muy tempranos de la enfermedad. Estos datos validan la teoría acerca de que el daño neuronal no sea una consecuencia de repetidos procesos inflamatorios sino previos a ellos, tal como ocurre en el modelo animal con TMEV98. Virus de la encefalitis murina de Theiler (TMEV) Se conocen varios virus capaces de inducir desmielinización en animales de laboratorio mediante protocolos de infección y que pueden ser utilizados REVISTA ESPAÑOLA DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE

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para generar modelos útiles en el estudio de enfermedades desmielinizantes, tales como la EM. De entre todos ellos, el modelo más estudiado es el que se lleva a cabo mediante el TMEV. La infección de este picornavirus citolítico en ratones sirve como modelo para explicar los mecanismos infecciosos y parainfecciosos que subyacen en la desmielinización del SNC. Este virus puede desarrollar la infección a través de dos mecanismos distintos según el tipo celular, bien al infectar oligodendrocitos, donde lo hace de una forma productiva, provocando la lisis y liberación de los viriones, bien en los macrófagos, donde la infección es restrictiva, liberando pequeñas cantidades de virus durante el proceso, lo que permite la infección de más macrófagos y oligodendrocitos, aumentando así la destrucción de la mielina99. Cabe destacar que el patrón de destrucción de mielina en esta enfermedad viral es similar al que ocurre en la EAE, es decir, está mediada por linfocitos T CD4+ y CD8+. Se ha demostrado que los linfocitos aislados de nodos linfáticos de ratones inmunizados con TMEV producen IL-2, TNF-α y INFγ pero no IL-4, IL-6 o IL-10, y que pueden liberar anticuerpos de la subclase IgG2a, lo que pertenece a una respuesta característica de las células CD4+ del subtipo Th1. Esto hace pensar que la desmielinización sea dependiente de una respuesta inmune secundaria contra algún componente de la mielina, la cual puede ser mediada por un mimetismo molecular o expansión de epítopos100. Sin embargo, a diferencia de lo que ocurre en la EAE, ni las células ni el suero de animales infectados son capaces de transferir la enfermedad ni producir desmielinización en cultivos organotípicos101. Por tanto, es posible que en las primeras fases de la enfermedad la destrucción de la mielina en este modelo sea causada por el virus y la consiguiente respuesta celular ante el mismo, mientas, en la fase crónica, el causante sea la respuesta inmune secundaria ante la mielina. Otros modelos animales mediados por virus Aunque el modelo animal producido por TMEV es el más utilizado de entre aquellos que son mediados por virus, existen otros modelos víricos capaces de representar características específicas de la EM. Por ejemplo, la cepa JHM del virus de la hepatitis murina (coronavirus) es capaz de producir encefalomielitis en la cepa de ratones BALB/c generando numerosas placas desmielinizantes dispersas en el cerebro y en la medula espinal102. Este virus infecta predominantemente oligodendrocitos, lo que produce una desmielinización que no se encuentra precedida ni por inflamación ni por ningún otro mecanismo del sistema inmune. Por tanto, este modelo puede ser considerado como un caso de desmielinización por

Beatriz García-Díaz, Guillermo Estivill-Torrús citopatología de oligodendrocitos inducida directamente por el virus103. Por otro lado, todos aquellos virus neuropatogénicos capaces de establecer infecciones persistentes en el huésped que permitan una replicación continuada del virión durante un largo periodo de tiempo sin causarle la muerte, pueden constituir buenos modelos animales de desmielinización, como así ocurre con el virus Semliki Forest104. En este caso, también, la desmielinización mediada por el sistema inmune sería debida al ataque citotóxico de células T a oligodendrocitos infectados. Éxitos y limitaciones del modelo viral Hay múltiples evidencias que indican que alguna infección viral juega un papel importante en la patogénesis inicial de la EM, ocasionando eventualmente agresiones a la mielina mediadas por el sistema inmune. Aunque varios virus, tales como el virus del sarampión, el virus del herpes simplex y varios coronavirus, se han considerado como buenos candidatos, hoy en día parece más posible que haya más de un tipo de virus, los cuales, sobre un fondo genético adecuado, podrían iniciar una reacción inmune en el huésped que causara la desmielinización inflamatoria. La importancia de los modelos animales con virus radica en poner de manifiesto cómo la mielina puede ser destruida por una respuesta inmune antiviral en ausencia de antígenos específicos de mielina. Debido a la imposibilidad de seguir en humanos la patología de la lesiones desmielinizantes, los modelos virales nos ofrecen una visión muy útil de la destrucción dinámica y consiguiente reparación de las mismas, tanto respecto al grado como a la duración de la inflamación e infiltración de macrófagos105. Por otro lado, uno de los tratamientos más utilizados actualmente en pacientes de EM, el basado en la acción del INF-β, fue propuesto originariamente basándose en la teoría de la infección viral como agente causal de la enfermedad. La propuesta de este fármaco surgió por considerar que era capaz de incrementar la resistencia a virus en el huésped. Sin embargo, aún no hay datos que apoyen que el IFNβ actúe sobre la inhibición viral aunque ofrece muy buenos resultados al utilizarlo como terapia. A pesar de que TMEV, así como otros virus neurotróficos, imitan claramente las características esenciales de las enfermedades desmielinizantes en humanos, ninguno de ellos se ha aislado en pacientes con EM. Otro inconveniente de la utilización de los modelos virales es la dificultad técnica que conlleva la inducción de la encefalimielitis así como la variabilidad de los signos clínicos producidos. Por otro lado, estos modelos están sujetos a un estricto control genético por lo que se encuentra limitado a

muy pocas cepas de ratones susceptibles que se puedan utilizar en el estudio de la enfermedad a través de éste. Finalmente, también hay que tener en cuenta a la hora de interpretar lo resultados obtenidos que la infección propia del virus genera un ambiente inflamatorio que es poco probable que refleje los procesos típicos en las lesiones de los pacientes106.

❑ Modelos espontáneos o transgénicos La EM, como la mayoría de las enfermedades autoinmunes humanas, ocurre espontáneamente sin ninguna causa específica conocida. Esta espontaneidad de la autoinmunidad parece requerir de una serie de condiciones genéticas que determinen su susceptibilidad así como de algún factor exógeno que la active. Para estudiar la activación de las enfermedades autoinmunes se pueden estudiar modelos experimentales de autoinmunidad espontánea; sin embargo, aunque dichos modelos existen para otras enfermedades desde hace tiempo (diabetes, lupus eritomatoso y artritis reumatoide), los modelos que representan la EM son aun muy recientes. En un primer intento para lograr la autoinmunidad se optó por la manipulación genética de la inmunidad global (timectomía, delección de IL-2, IL-2R, CD25, receptor TGFβ) sin conseguir provocar una autoinmunidad específica del SNC107-110. Sin embargo, ésta sí que pudo lograrse por manipulación de alguna de las citocinas que se encuentran en el tejido nervioso central. Así, la sobreexpresión del factor de necrosis tumoral (TNF-α) en el SNC es capaz de provocar un infiltrado de macrófagos y células T CD4+ y CD8+ tanto en las meninges como en el parénquima nervioso111. Además de la infiltración celular, la microglía presente en el tejido se activa produciendo una desmielinización focal. Clínica e histológicamente este síndrome neurológico mantiene ciertas similitudes con alguna de las variantes de la EAE, aunque en este caso parece que el TNF-α actúa directamente en las células gliales y neuronas en lugar de hacerlo a través de mediadores liberados por las células inflamatorias infiltradas112. Un modelo similar se obtuvo induciendo la expresión de IL-12 bajo el control del promotor de la proteína fibrilar ácida de la glía (GFAP). Los ratones que contenían esta construcción génica presentaban un infiltrado de células T CD4+, CD8+ y natural killer (NK) (célula asesina natural) especialmente en el cerebelo113. Alternativamente, la expresión de IFN-γ bajo el control del promotor de MBP en oligodendrocitos producía cambios similares con demielinización e invasión de células inmunes114. Los efectores patogénicos de la EAE han sido aislados, clonados y caracterizados como células T CD4+ que reconocen péptidos de las proteínas de REVISTA ESPAÑOLA DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE

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mielina presentadas en el contexto de CMH clase II. Sin embargo, a pesar de ello, se ha demostrado que ratones transgénicos que presentan en sus células T CD4+ receptores TCR específicos de antígenos de mielina crecen y se reproducen adecuadamente, y tan sólo unos pocos de ellos desarrollan EAE de manera espontánea a lo largo de su vida adulta. Inicialmente, se llevaron a cabo estudios con ratones transgénicos que presentaban TCR reactivos a MBP, aunque, inesperadamente, la presentación de síntomas fue escasa115. Por otro lado, la localización de las lesiones en el SNC y el curso clínico de la enfermedad difiere según el péptido al cual sea específico el TCR transgénico. Se ha observado, así, que los casos de modelos espontáneos con especificidad de TCR para MBP y PLP generan lesiones preferentemente en la médula espinal, mientras que, cuando esta especificidad se desarrolla frente a MOG, la lesión afecta mayoritariamente al nervio óptico116. En todos los casos, para conseguir que al introducir el gen TCR específico de mielina se desarrolle una EAE fulminante, se requiere que los ratones transgénicos carezcan de la enzima recombinasa RAG-1, es decir, que sean inmunodeficientes; sólo en este caso aparecen síntomas en el 100% de los animales, mientras que, sobre un fondo genético normal, la frecuencia de aparición de la enfermedad se encuentra fuertemente disminuida77. No obstante, no siempre basta con ello. Así, aunque se ha demostrado por transferencia pasiva que las células T CD8+ reactivas a antígenos de mielina también son capaces de generar EAE, el uso de ratones inmunodeficientes carentes de RAG no ha conseguido que ratones transgénicos con células CD8+ que expresan TCR específicos para MBP desarrollen EAE espontáneamente117. Además de la presencia o no de RAG-1 parece claro que la afinidad del receptor de células T con el complejo formado por CMH y el péptido presentado correlaciona con la frecuencia de aparición de la enfermedad118. Esta observación concuerda con la influencia genética en la susceptibilidad a la EM. Es ampliamente conocido en la actualidad que

tanto los pacientes de EM como los individuos sanos poseen un repertorio considerable de células T autorreactivas para mielina. Con el fin de establecer el potencial patogénico de estos linfocitos varios grupos han producido ratones transgénicos “humanizados”. Estos ratones presentan receptores TCR capaces de reconocer epítopos de mielina asociados a EM en el contexto del CMH clase II como DR15 o DR4. Sin embargo, aunque el primero de ellos ha logrado desarrollar EAE espontáneamente en una pequeña proporción de individuos, el número de ratones “humanizados” aun es muy limitado para extraer conclusiones de la relación entre el potencial patogénico y la estructura individual de los TCR humanos119.

❑ Conclusión La EM es una enfermedad terriblemente compleja en la cual interviene una enorme cantidad de factores, tanto exógenos como endógenos. Este hecho, junto a la dificultad de estudiar directamente el órgano en el que se desarrolla, el sistema nervioso central, han hecho que, durante muchos años, los estudios acerca de su patogénesis fueran escasos. Sin embargo, aunque aun se desconoce en profundidad muchos de los posibles agentes causantes y elementos que intervienen en el desarrollo de la enfermedad, la utilización de modelos animales ha proporcionado herramientas poderosas para el conocimiento de ellos. No obstante, a pesar de los numerosos modelos animales disponibles hasta la fecha ninguno ha conseguido abarcar todas las características de esta compleja enfermedad, lo cual no los convierte en modelos menos válidos, sino que hace necesario tener en cuenta tanto sus ventajas como sus limitaciones, e integrar el conocimiento que se puede extraer de cada uno de ellos. El estudio exhaustivo de las similitudes y diferencias entre los posibles modelos animales con la enfermedad humana nos permitirá avanzar con éxito en el desarrollo de posibles agentes terapéuticos tanto para detener como para prevenir el desarrollo de la enfermedad.

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Revisión Correspondence: Joost JFM Smolders, MD – School for Mental Health and Neuroscience − Maastricht University Medical Center − PO Box 616, 6200 MD Maastricht − The Netherlands − E-mail: [email protected]

Vitamin D and autoimmune diseases: observations in multiple sclerosis

13

20

Joost Smolders1, 2, Jan Damoiseaux2, Raymond Hupperts1

School for Mental Health and Neuroscience. Department of Internal Medicine, division of Clinical and Experimental Immunology. Maastricht University Medical Center. Maastricht. The Netherlands. 1 2

ABSTRACT. Vitamin D is most well known for its role in calcium metabolism. However, it also has immune modulating properties which are held responsible for the association of low vitamin D levels with multiple sclerosis (MS) and several other autoimmune diseases. In this concise review, we present an overview of the clinical and epidemiological observations supporting the association of vitamin D status with MS, and consider possible underlying immunological mechanisms. Experimental studies suggest a vital role for regulatory T cells, but further experiments are needed to address this hypothesis in human MS populations. Vitamin D supplementation, preferably physiologically induced by controlled sun exposure, might be a feasible way to put a halt to the ever increasing incidence of autoimmune diseases in the western society. Key words: vitamin D, 25-hydroxyvitamin D, 1,25-dihydroxyvitamin D, autoimmune diseases, experimental allergic encephalomyelitis, multiple sclerosis. RESUMEN. La vitamina D es conocida, especialmente, por su papel en el metabolismo del calcio. Sin embargo, también tiene propiedades inmunomoduladoras, que se piensa son responsables de la asociación de los niveles bajos de vitamina D con la esclerosis múltiple (EM) y otras enfermedades autoinmunes. En esta revisión, presentamos un resumen de las observaciones clínicas y epidemiológicas que apoyan la asociación de los niveles de vitamina D con la EM y consideramos los posibles mecanismos inmunológicos subyacentes. Hay estudios experimentales que sugieren un papel vital para las células T reguladoras, pero se precisan más experimentos para evaluar esta hipótesis en las poblaciones de EM. El suplemento de vitamina D, preferiblemente inducido por la exposición solar controlada, podría ser una vía factible para detener el aumento de incidencia de las enfermedades autoinmunes en la sociedad occidental. Palabras clave: vitamina D, 25-hidroxivitamina D, 1,25-dihidroxivitamina D, enfermedades autoinmunes, encefalomielitis alérgica experimental, esclerosis múltiple.

A

t the beginning of the 20th century, vitamin D was discovered to be the therapeutic agent in the treatment of rickets. Its role in calcium metabolism is therefore very well known. Vitamin D status is best reflected by the plasma concentration of its principal metabolite 25-hydroxyvitamin D (25(OH)D). A Vitamin D deficiency is most commonly defined as 25(OH)D levels below the point at which calcium metabolism starts to be impaired. Usually, the minimum level required for an adequate fracture prevention or the point below which the parathyroid hormone (PTH) concentration just starts to rise are taken1. In an elderly population in Barcelona, secondary hyperparathyroidism was seen at 25(OH)D levels below 62,5 nmol/L2. However, a study in Madrid reported lower 25(OH)D levels despite similar PTH levels in patients with a hip fracture compared to matched healthy controls3. In an international consensus meeting, a 25(OH)D level of 70-80 nmol/L has been suggested as adequate for a healthy calcium metabolism.1 However, evidence is emerging that other

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biological functions of vitamin D start to be impaired at much higher 25(OH)D levels. These biological functions include roles in carcinogenesis and in the immune response, which is particularly relevant for multiple sclerosis (MS). The biologically active metabolite of vitamin D, 1,25-dihydroxyvitamin D (1,25(OH)2D), has major immune modulating propertiesreviewed in 4. It acts in vitro on antigen presenting cells, most importantly dendritic cells, bringing them to a more immature and less pro-inflammatory phenotype. By this, but also directly, 1,25(OH)2D modulates the T-cell compartment, leading to inhibition of T helper type 1 lymphocytes (Th1) and a promotion of Th2 lymphocytes and, probably more important, regulatory T lymphocytes (Treg). These effects on the immune system are hallmarks of a less pro-inflammatory and more tolerant immune system. This could imply that people with relatively low vitamin D levels have an immune system that is more prone to inflammation and autoimmune disease. Indeed, epidemiolog-

Joost Smolders, Jan Damoiseaux, Raymond Hupperts

Figure 1 Sufficiency of UV radiation for an adequate vitamin D synthesis in lightly pigmented human skin. In equatorial regions, UV-radiation is adequate throughout the year. In the lightly dotted zone, there is not enough UV radiation during at least 1 month per year. In the heavily dotted zone, UV-radiation is insufficient during the whole year (Reprinted from Jablonski NG and Chaplin G. The evolution of human skin coloration. J Hum Evol 2000; 39 (1): 57-106, with permission from Elsevier).

ical observations show that a poor vitamin D status is associated with an increased risk of developing several autoimmune diseases such as MS, type I diabetes, systemic lupus erythematosus, inflammatory bowel disease, and rheumatoid arthritis5. In this concise review, we will discuss clinical and epidemiological observations in MS, which support the view that vitamin D is a protector against, but is also a modulator of autoimmune diseases. Furthermore we will try to cast more light on the possible immunological mechanism behind this protection. In conclusion, the implications of these findings for the public will be discussed.

❑ MS Prevalence and sun exposure Only a small fraction of the vitamin D intake is acquired by diet; the largest part is photosynthesised in the skin by sunlight. The efficacy of this process depends on the amount of solar UV-radiation to which the skin is exposed. In equatorial areas, there is a lot of UV-exposure. However, this exposure declines dramatically with increasing latitude, leading to a less efficient photosynthesis of vitamin D (Figure 1). Interestingly, MS prevalence has a inverse

geographical distribution, with a low prevalence around the equator which increases with increasing latitude. The observed higher mortality from MS in the northern compared to the southern districts might also reflect a north-south gradient of MS prevalence in Spain6. Not only latitude, but also altitude is associated with MS prevalence. In Switzerland, a lower MS prevalence is found at high altitudes, where sunexposure is more optimal, compared with low altitudes7. Indeed, a high MS prevalence is associated with low levels of average annual UV-radiation8. The lower incidence of non-melanoma skin cancer and actinic damage in MS patients compared to healthy controls, might also reflect a history of limited sun exposure9, 10. In North-American, Norwegian and Tasmanian populations, increased outdoor activities during childhood and adolescence corresponded with a decreased susceptibility for developing MS9, 11, 12 . In brief, sun-exposure seems to protect against the development of MS. The mechanism behind this protection might be its correlation with vitamin D photosynthesis. Indeed, Munger et al. observed a protective effect of high 25(OH)D levels against developing MS in adolescents in a white American population13. In various MS populations, lower REVISTA ESPAÑOLA DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE

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Revisión Table I

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Association and transmission studies on vitamin D receptor gene polymorphisms and multiple sclerosis

Study

Location

Design

Polymorphism

Significant association/ transmission

Fukazawa30 1999

Sapporo (Japan)

Association

Bsm-I

Yes

Niino31 2000

Sapporo (Japan)

Association

Apa-I

Yes

Steckley32 2000

Vancouver (Canada)

Transmission

Apa-I Taq-I

No No

Partridge33 2004

Staffordshire (UK)

Association

Fok-I Taq-I

No No

Yeo34 2004

Cambridge (UK)

Transmission

4 SNP’s*

No

Tajouri35 2005

Southport (Australia)

Association

Taq-I Apa-I Fok-I

Yes Yes No

*Single nucleotide polymorphisms (SNP’s) marked with primer ID number.

25(OH)D levels than in healthy controls have been shown14. In newly diagnosed Scandinavian MS patients, this was only observed for the summer 25(OH)D-levels15.

❑ MS severity and vitamin D status

22

Not only MS incidence, but also MS severity is associated with sun-exposure and vitamin D status. As a result of seasonal fluctuations of daily sun hours, photosynthesis of vitamin D and thus also circulating 25(OH)D levels have a seasonal fluctuation, with a peak in late summer and a nadir in early spring. In MS patients, a similar fluctuation has been described in exacerbation rate and in proinflammatory (IFN-γ and TNF-α) and anti-inflammatory (IL-10) cytokine levels16, 17. One German study reported a seasonal fluctuation in the number of gadolinium enhancing lesions on MRI-scan, which interestingly correlated negatively with the serum 25(OH)D-levels of healthy controls at the same geographical location18. Low 25(OH)D levels are associated with more severe clinical events of MS, such as relapse in relapsing remitting MS or a high EDSS-score14, 19, 20. We did not observe an independent association of low 1,25(OH)2D levels with high disability scores20. It is yet to be defined whether disability due to MS limits sunexposure and thereby lowers vitamin D status, or whether vitamin D status modulates MS disability, or a combination of both. In our relapsing remitting MS population, patients with a disease course REVISTA ESPAÑOLA DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE

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≤ 5 years and a favourable vitamin D status had a higher chance of remaining relapse free in a two year period20. This is suggestive of a modulation of disease activity by vitamin D, but further trials are needed before conclusions can be drawn.

❑ Vitamin D effects during pregnancy In 1984 Korn-Lubetzki et al. described the beneficial effect of pregnancy on MS patients21. Often a remission of disease is observed in the third trimester of pregnancy, with an abrupt relapse postpartum. Probably, the immunological adaptation of the pregnant woman leading to an increased materno-fetal tolerance also modulates the disease activity of MS. It was suggested by Schwartz that this amelioration might be mediated by the physiologically increased serum 1,25(OH)2D levels during the third trimester of pregnancy22. Besides a less pro-inflammatory cytokine profile in pregnant MS patients, elevated levels of regulatory T lymphocytes have been found in the blood of healthy pregnant women23. These adaptations of the immune system are compatible with the effects of 1,25(OH)2D in vitro, but are hard to distinguish from the numerous other immune modulating changes in the pregnant woman.24 Not only the vitamin D status of pregnant MS patients, but also of their mothers has been suggested to be related to MS. In Sweden, Denmark, Great Britain and Canada, a significant numbers of patients appear to be born in May and relatively few in November25. Some studies also reported prognostic consequences on disease-progres-

Joost Smolders, Jan Damoiseaux, Raymond Hupperts sion and MS-phenotype development26. An increased risk of developing MS by prenatal exposure to insufficient vitamin D levels has been suggested as a mechanism behind this fluctuation. Indeed, intra-uterine vitamin D depletion in animal studies led to structural changes in the CNS and reduced expression of MSrelated proteins27. This supports the importance of vitamin D in the developing CNS. However, the question whether in humans specifically reduced maternal vitamin D levels during winter can be held responsible for the increased risk of developing MS still needs to be answered.

❑ Genetic polymorphisms in the vitamin D receptor gene Genetic susceptibility for MS is well known. Vitamin D acts exclusively via the vitamin D receptor. Several genetic polymorphisms have been described in the vitamin D receptor gene (VDRG). These polymorphisms are named according to the restriction enzymes used for genotyping them. Only the Fok-I polymorphism is located in an exon of the gene and has direct effects on the immune system. Both stimulation of IL-12 transcription and proliferation of monocytes, as well as a less efficient 1,25(OH)2Dmediated inhibition of T-cell proliferation have been described28, 29. The other polymorphisms, Apa-I, BsmI and Taq-I, are located in an intron of the gene, but may have biological consequences by linkage to other functional genes. Several groups have investigated an association of MS with these polymorphisms with variable results (Table I)30-35. In a recent large genome wide screen, the VDRG was not revealed as a locus associated with an increased susceptibility for developing MS36. However, this does not exclude associations in certain defined subpopulations. In populations with a poor vitamin D status, a potentially beneficial VDR genotype might not affect MS incidence as a result of limited exposure to its ligand. In our MS population, we observed an association of the Fok-I genotype with susceptibility for developing MS, but only in patients with a favourable vitamin D status (Smolders et al, submitted for publication). Further studies taking vitamin D status into account as well as VDRG polymorphisms should further define the role of this gene in both MS incidence and MS severity.

❑ Vitamin D and immune regulation in MS The observations in MS support the idea that vitamin D is an immune regulating agent, modulating the immune system to be less susceptible to MS. The precise immunological mechanism underlying this modulation is not yet known. However, observa-

Figure 2 Model of T cell response regulation in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) by 1,25dihydroxyvitamin D. Promotion of regulatory T cells (Treg) stabilises the T helper cell compartment and thereby brings EAE in remission (Reprinted from Smolders J, et al. Vitamin D as an immune modulator in multiple sclerosis, a review. 2008; 194 (1-2): 7-17, with permission from Elsevier).

tions in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), which is considered an animal model for MS, provide a direction for further research. Lemire et al. and Cantorna et al. showed, in the 1990’s, that oral or intra-peritoneal 1,25(OH)2D supplementation prevented clinical symptoms and neuro-inflammation of EAE37, 38. Since these studies, several research groups have investigated possible underlying immunological mechanisms. In 2001, Nashold et al. supplemented 1,25(OH)2D in a recombinant activating genes (RAG-)knockout EAE model. RAG are genes which encode core enzymes for B and T cell maturation; i.e. RAG knockout mice cannot produce mature B and T cells. Nashold et al. showed that remission of disease could only be achieved in mice that were able to transcribe RAG39. This suggests that 1,25(OH)2D-mediated differentiation of a specific B or T cell population is responsible for the remission of disease. Furthermore, an essential role of IL-10, an important immune regulatory cytokine, was demonstrated by Spach et al. They showed in an IL-10/ IL10 receptor knockout EAE model that remission by vitamin D or 1,25(OH)2D therapy was only achieved in mice that were able to express IL-10 and the IL-10 receptor40. Therefore, an IL-10/IL-10R dependent B or T cell should play an essential role in the amelioration of EAE by vitamin D. This clearly points in the direction of regulatory T lymphocytes (Figure 2), albeit that recent studies in EAE also described IL-10 producing B cells with regulatory properties41. The direct translation of these observations from the mouse model to human MS is uncertain. However, several studies have shown a decreased number and functionality of the Treg compartment in relapsing remitting MS patients42. This indicates REVISTA ESPAÑOLA DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE

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Revisión failure of the Treg compartment to regulate autoimmune diseases as an important process in MS pathogenesis. Supplementation of 25μg vitamin D in MSpatients led to a significant rise of both the plasma 25(OH)D concentration and the TGF-β production, another important though not exclusive Treg cytokine43. Therefore, the association of vitamin D deficiency with multiple sclerosis might be the result of a vitamin D mediated impairment of the Treg compartment, leading to a failure of T cell regulation and an increased susceptibility for developing autoimmune diseases. Further research should address this hypothesis.

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❑ Conclusion

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It can be concluded that an association of vitamin D status with MS incidence and severity is obvious and that a lack of vitamin D probably results in impaired immune regulation, leading to increased MS prevalence and severity. The optimal level of vitamin D for unimpaired immune regulation is not clear. With regard to the prevalence of autoimmune diseases in populations with an adequate bone mineral density, it is likely to be higher than the 7080 nmol/L suggested for an optimal calcium metabolism1. Vitamin D toxicity has only been described at 25(OH)D levels exceeding 220 nmol/L44. Therefore, the most optimal vitamin D level is likely to be somewhere in between. However, in a recent study conducted in Lleida, the mean 25(OH)Dlevel of a cohort of 590 healthy people (mean age of 36.1 years) was only 57 nmol/L (95% CI 5559 nmol/L)45. It is remarkable that this vitamin D level is much lower than the expected window for an optimal immune regulation. Somehow, western society seems to have developed a common vitamin

D deficiency over the centuries. Our present life style and habits may contribute to this, since we are used to spending most of the time indoors and cover up to 90 percent of our skin in clothing. Maybe, our immune system requires the levels of vitamin D that may have been customary when humans lived naked in the Horn of Africa, approximately 100.000 years ago. It has been argued by anthropologists, based on plasma 25(OH)D measurements in primates, that these levels would probably have been around 150 nmol/L without a seasonal fluctuation46. Interestingly, mean serum 25(OH)D levels of 148 nmol/L have been measured in 34 Israeli lifeguards47. In contrast, since we are nowadays living in areas remote from the equator, the general population experiences fluctuating and much lower 25(OH)D levels. Bearing this in mind, a link between various health problems and vitamin D status makes sense. In western society, there is an increasing incidence of autoimmune diseases48. Although an excess of sun exposure should be prevented due to the associated higher risk of developing non-melanoma skin cancer, a (governmental) stimulus to spend more time in the open air would be certainly beneficial to the general public. This would not only assure a healthy calcium metabolism, but might also contribute to a more tolerant immune system and thereby a reduction in the incidence of MS and other autoimmune diseases. The ability of vitamin D supplementation to restore immune regulation and thereby treat MS and other autoimmune diseases is the subject of present research. Future trials assessing not only the clinical effects of vitamin D supplementation, but also its effects on immune regulation, would ultimately be helpful to further define the precise role of vitamin D in the treatment and pathogenesis of MS as well as in other autoimmune diseases.

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La hipótesis higiénica en la esclerosis múltiple Jorge Correale

Instituto de Investigaciones Neurológicas Dr. Raúl Carrea, FLENI. Buenos Aires. Argentina.

RESUMEN. De acuerdo a la hipótesis higiénica, el incremento en la incidencia de enfermedades alérgicas y autoinmunes en países industrializados es explicada por un decremento en la incidencia y prevalencia de infecciones. En este artículo se exponen diferentes evidencias que sugieren la relevancia de esta hipótesis en el desarrollo de esclerosis múltiple (EM), y se discuten diferencias entre infecciones capaces de desencadenar la enfermedad, y aquellas capaces de ejercer un efecto protector. Los mecanismos involucrados en la hipótesis higiénica son sólo parcialmente conocidos y representan un importante área de investigación destinada a comprender mejor la etiología de EM y desarrollar nuevas estrategias de tratamiento. Palabras clave: esclerosis múltiple, autoinmunidad, hipótesis higiénica, infecciones, parásitos, helmintos, células T reguladoras, células B reguladoras, EBV. SUMMARY. According to the hygiene hypothesis, increased incidence of allergic and autoimmune diseases in developed countries is explained by decreased prevalence of infections. In this article we review evidence suggesting the relevance of this hypothesis in the development of multiple sclerosis (MS), as well as differences between infections generating triggering or protective effects. Mechanisms underlying this hypothesis are not entirely clear, yet represent an important area of research that may generate new clues on MS etiology, as well as for novel treatment strategy development. Key words: multiple sclerosis, autoimmunity, hygiene hypothesis, infections, parasites, helminths, regulatory T cells, regulatory B cells, EBV.

❑ Infecciones y autoinmunidad Las enfermedades autoinmunes ocurren cuando el sistema inmune pierde su capacidad de ������������ mantener la tolerancia hacia auto-antígenos. Se estima que en países occidentales, aproximadamente, 5% de la población presenta una o varias enfermedades autoinmunes1. La existencia de una considerable discordancia en la incidencia de enfermedades autoinmunes entre gemelos idénticos2-4 sugiere que factores adicionales, probablemente de origen ambiental, se encuentran involucrados en la génesis de este grupo de enfermedades5. La relación entre infecciones y autoinmunidad es compleja. Evidencias actuales indican que diferentes microorganismos pueden iniciar, incrementar o, por el contrario, inhibir el desarrollo de enfermedades autoinmunes. Infecciones por diferentes agentes patógenos tales como bacterias o virus han sido propuestas como candidatos para incrementar la respuesta inmune en individuos susceptibles. El virus de la hepatitis C ha sido asociado con la etiología de diferentes enfermedades tales como miastenia gravis, hepatitis autoinmune y enfermedades reumáticas6-8. De manera similar el virus Epstein-Barr (EBV) ha sido asociado con esclerosis múltiple (EM) y lupus eritematoso sistémico (LES)9. La ocurrencia de LES ha sido también asociada con infección por parvovirus

B-1910, y EM ha sido observada en infecciones con virus del grupo herpes11-12. Las infecciones por virus coxsackie B3 y B4 han sido propuestas como causa de inicio de miocarditis autoinmune13 y asociaciones entre infecciones por herpes simplex tipo 1 y queratitis autoinmune han sido reportadas14. Diferentes virus tales como rotavirus15-16, coxsackie B17 y el virus de la rubéola18-19 han sido asociados al desarrollo de diabetes tipo 1. Distintos mecanismos, no mutuamente excluyentes, han sido propuestos para explicar la asociación entre infecciones y enfermedades autoinmunes: a) La presentación de epítopes patógenos similares estructuralmente a epítopes del huésped puede activar células autoreactivas, un concepto conocido como mímica molecular20. b) La infección directa del órgano blanco puede producir la liberación de antígenos secuestrados, incrementando también la activación de células autorreactivas por nuevos epítopes. c) En ocasiones, el fenómeno infeccioso actúa de manera antígeno-no específico. En estos casos, estímulos microbianos de la inmunidad innata a través de moléculas tales como lipoproteínas bacterianas, lipopolisacáridos, ARNs de doble cadena, o motivos CpG, activan el sistema inmune innato, resultando en un incremento de la expresión de moléculas co-estimulatorias, diferentes citocinas pro-inflamatorias y quimioquinas, cuyas actividades incluyen activación de REVISTA ESPAÑOLA DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE

Correspondencia: Jorge Correale – Instituto de Investigaciones Neurológicas Dr. Raúl Carrea, FLENI – Montañeses 2325 (1428). Buenos Aires, Argentina – Teléfono: 54 11 5777 3200, interno: 2704/2706 – Fax: 54 11 5777 3209 – E-mail: [email protected]; [email protected]

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las células presentadoras de antígenos y modificación de los patrones de migración de los linfocitos21-23. La clásica explicación de que este fenómeno resulta sólo como consecuencia de una activación inespecífica mediada por citocinas, ha sido recientemente revisado. En algunos casos, de manera adicional a la acción de las citocinas, es necesario el contacto directo del antígeno específico con el receptor de células T (RCT)24-25, sugiriendo que los mecanismos de mímica molecular y activación inespecífica pueden interactuar entre sí. A pesar de décadas de investigación no ha sido posible establecer una relación causal entre un agente infeccioso particular y una determinada enfermedad autoinmune. Diferentes factores permiten explicar esta situación: a) Las infecciones pueden inducir células autorreactivas, pero los agentes responsables son eliminados en semanas, y al momento del diagnóstico de la enfermedad (meses o años) no se los puede identificar. Durante los períodos de latencia viral en el sistema nervioso, partículas virales no son producidas y la expresión de material genético viral es limitada; b) Si bien se pueden identificar anticuerpos o células T autorreactivas contra estructuras de agentes infecciosos, los mismos también se encuentran en individuos que no desarrollan enfermedades autoinmunes; c) En algunas circunstancias el fenómeno de mímica molecular puede determinar un proceso de protección contra el desarrollo subsecuente de enfermedades autoinmunes. De manera similar, el tiempo de exposición al agente infeccioso puede determinar que un mismo agente patógeno exacerbe una determinada enfermedad o ejerza una acción protectora contra la misma. El concepto de EM como una enfermedad infecciosa fue postulado inicialmente en 1868 por Pierre Marie26. La idea de que una infección viral persistente pueda causar EM fue alentada posteriormente por el descubrimiento de los virus lentos e infecciones latentes, como causa de otras afecciones del SNC27-28. De manera similar, datos epidemiológicos relacionados con la distribución geográfica de la enfermedad, así como los datos migratorios obtenidos en diferentes estudios fueron también compatibles con la posibilidad de un agente infeccioso como causa de la enfermedad. Existen claras diferencias en la distribución geográfica de la EM. La enfermedad es de rara incidencia en regiones tropicales y aumenta su incidencia en latitudes altas al norte del Ecuador. En los Estados Unidos, la prevalencia por debajo del paralelo 37 es informada como de 35,5/100.000 habitantes y por encima del mismo 68,8/100.000 habitantes. Un gradiente similar norte-sur se ha informado en países europeos occidentales. Una serie de estudios ha REVISTA ESPAÑOLA DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE

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demostrado que pacientes de raza negra en los Estados Unidos desarrollan con menor frecuencia EM comparados con individuos de raza blanca. Sin embargo, ambas razas muestran un similar gradiente norte-sur, lo cual indica la importancia de factores ambientales 29. Estas observaciones llevaron a investigar si el desarrollo de EM es afectado por migraciones entre regiones de alta y baja prevalencia. Estudios migratorios iniciales han establecido que probablemente el riesgo de adquirir EM se establece alrededor de los 15 años30. Individuos que migran de áreas de alto riesgo a áreas de bajo riesgo presentan una disminución en el riesgo de desarrollar EM cuando se los compara con el riesgo de contraer la enfermedad en su lugar de nacimiento. Por el contrario, migraciones de áreas de bajo riesgo a áreas de alto riesgo resultan en un incremento en el riesgo de adquirir EM. Sin embargo, estudios más recientes sugieren que variaciones en el riesgo de desarrollar la enfermedad no se encuentran restringidos a la pubertad o edad adulta temprana, y contrariamente pueden observarse también en períodos más tardíos31-32. Dos hipótesis fueron propuestas para explicar estos hallazgos epidemiológicos. La primera de ella, la hipótesis “polio”, postula que existe un agente viral que incrementa el riesgo de EM si es adquirido en la adolescencia o juventud, mientras que confiere protección si es adquirido durante la infancia33. La segunda hipótesis, liderada por Kurtzke, es la hipótesis de “prevalencia”. Kurtzke y Hyllested hallaron en las islas Faroe una incidencia de EM mucho mayor que la esperada en la región, que se manifestó como brotes de extensión decreciente entre 1943 y 1973. Un análisis de estos hallazgos permitió postular que EM es producida por un agente infeccioso más frecuente en áreas de mayor prevalencia de la enfermedad. Este agente podría causar una infección asintomática persistente, la cual, años más tarde, podría determinar síntomas neurológicos34-35. En el caso de las epidemias de las islas Faroes dicho agente infeccioso podría haber sido introducido por las tropas británicas que ocuparon las islas, causando un incremento en la incidencia de EM. De manera adicional a los datos epidemiológicos, varios agentes infecciosos pueden producir desmielinización en modelos animales. Diferentes virus son capaces de establecer infecciones persistentes, con una replicación constante del agente infeccioso por un período de tiempo prolongado, sin causar la muerte del huésped. Las infecciones por virus Theiler y coronavirus (JHM o MHV-4) en ratones son los dos modelos animales más ampliamente estudiados36-37. Sin embargo, la presencia de desmielinización del sistema nervioso central (SNC) ha sido observada también

Jorge Correale luego de infecciones en perros con el virus distémper canino38, y en ovejas y cabras luego de infecciones con el virus Visna y el virus caprino de la artritis-encefalitis39-40. Uno de los agentes más recientemente implicados en la génesis de la EM es Chlamydia pneumoniae, una bacteria gram negativa. Investigaciones iniciales han identificado ADN de C. Pneumoniae y anticuerpos contra esta bacteria en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes con EM41. Sin embargo, estudios posteriores no han podido reproducir estos hallazgos42-43. De manera similar, en la última década, el estudio de herpes virus tipo 6 (HHV-6) en pacientes con EM ha generado resultados controversiales. Evidencias involucrando HHV-6 en la patogénesis de EM incluyen: a) la presencia de ADN viral en lesiones post-morten sugiriendo replicación activa del virus44-45; b) el hallazgo de ADN viral en sangre periférica durante las exacerbaciones de la enfermedad46; y c) la presencia de concentraciones mayores de IgG e IgM contra HHV-6 en el suero y LCR de pacientes con EM en comparación con individuos controles47-48. Sin embargo, estos hallazgos no permiten explicar los datos migratorios referidos en pacientes con EM. Por otra parte, la presencia de ADN viral y anticuerpos contra HHV-6 ocurre también en pacientes con otras enfermedades neurológicas, sugiriendo que la detección de ADN o antígenos virales en tejido encefálico puede reflejar la reactivación de HHV-6 latente en células T periféricas que han migrado al cerebro de pacientes con afecciones inflamatorias del SNC. Un meta-análisis de las infecciones por EBV en pacientes con EM permite sustentar un rol de EBV en la génesis de EM49. Como en la mayoría de las infecciones por virus del grupo herpes EBV determina una estimulación continua del sistema inmune. Utilizando individuos infectados con EBV en la infancia temprana como referencia, el riesgo de desarrollar EM es 10 veces menor entre individuos EBV negativos, y existe un riesgo 20 veces mayor en aquellos pacientes con historia de mononucleosis infecciosa en comparación con sujetos EBV negativos50. Asimismo, una importante contribución para comprender la relación entre EBV y EM ha sido brindada por la realización de estudios longitudinales de anticuerpos en individuos sanos quienes luego desarrollaron EM. En EM, un incremento de anticuerpos contra EBV, pero no contra otros herpes virus, ha sido evidente 5 o más años antes del inicio de la enfermedad. Este incremento ha sido caracterizado por un sustancial incremento de anticuerpos contra los antígenos nucleares de EBV tipo-1 (EBNA-1) y EBNA-2, los cuales se expresan en células infectadas de forma latente. Estos hallazgos sugieren una primo-infección

más severa o reactivación de la enfermedad, acompañada por una marcada estimulación de la inmunidad celular51-53. Asimismo, células T específicas para EBNA-1 son más frecuentes en pacientes con EM que en sujetos normales54, indicando una correlación entre la respuesta celular inmune contra EBV y EM. Tanto en EM como en el hallazgo de anticuerpos contra EBV existe una importante interacción con la edad. En muestras recolectadas antes de los 20 años los títulos de niveles de anticuerpos contra EBV son similares en pacientes que luego desarrollan EM y en sujetos controles. De manera interesante estos valores en individuos controles persisten estables por décadas. Por el contrario, en pacientes que desarrollan EM, los valores se incrementan sustancialmente entre los 20 y 30 años para alcanzar luego una meseta55. Así, un incremento de 4 veces en los títulos de anticuerpos anti-EBV entre una muestra de sangre obtenida antes de los 20 años y una muestra subsiguiente, predice un incremento de 15 veces en el riesgo de desarrollar EM55. Si bien existen marcadas similitudes entre la epidemiología de EM y mononucleosis infecciosa56, la ausencia de EBV en las lesiones de EM representa un obstáculo para interpretar la infección por EBV como causa de EM. Sin embargo, es posible que EBV actúe como un factor de iniciación del proceso patológico, y otros eventos posteriores desencadenen la expresión de la enfermedad57. De manera alternativa es posible que EBV active diferentes superantígenos o bien células B autoreactivas9, 58-59. Ambos fenómenos pueden precipitar el desarrollo de EM en individuos genéticamente predispuestos.

❑ La hipótesis higiénica La prevalencia de afecciones tales como asma alérgica, dermatitis atópica y fiebre del heno se han incrementado sustancialmente en países industrializados en los últimos 40 años60. En los Estados Unidos la prevalencia de asma ha aumentado un 75%, en el período comprendido entre 1980 y 199461. Contrariamente, la prevalencia de enfermedades alérgicas es significativamente más baja en países en vías de desarrollo62. Existen también claras diferencias en la prevalencia de este grupo de afecciones entre individuos que viven en áreas urbanas versus aquellos que residen en áreas rurales dentro de un mismo país63-64. Estos hallazgos han sido claramente correlacionados con un decremento en la incidencia y prevalencia de infecciones bacterianas y virales durante el mismo período de tiempo65, un hecho alcanzado gracias a mejoría en los programas de vacunación, uso más extendido y racional de los antibióticos, así como la implementación de mejores condiciones de higiene. Por el contrario, la exposición a agentes patógenos REVISTA ESPAÑOLA DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE

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oro-fecales, como el virus de la hepatitis B, Toxoplasma gondii y Helicobacter pilori, reduce el riesgo de enfermedades alérgicas en un 60%66. Esta correlación inversa entre mejores condiciones de higiene y el desarrollo de afecciones alérgicas ha llevado a la formulación de la “hipótesis higiénica” originalmente propuesta por Strachan en 198967. Un fenómeno similar al observado en afecciones alérgicas se presenta también en diferentes enfermedades autoinmunes, tales como diabetes tipo 1, enfermedad de Crohn y EM. Así, la incidencia de enfermedad de Crohn en Europa se ha triplicado entre los años 1950 y 199068, y diferentes estudios han encontrado baja incidencia de enfermedades autoinmunes en poblaciones con bajos niveles socio-económicos. En poblaciones inglesas e irlandesas existe una correlación positiva entre la baja incidencia de diabetes tipo 1 y diversos indicadores socio-económicos tales como falta de empleo, nivel de pobreza y convivencia de múltiples personas en una única habitación69-70. Datos similares han sido reportados para enfermedad de Crohn en Canadá71. La presencia de infecciones en la infancia temprana ha sido incriminada como un factor determinante de la baja prevalencia de enfermedades autoinmunes. Un estudio en la localidad inglesa de Yorkshire ha demostrado una correlación inversa entre el desarrollo de diabetes tipo 1 y el número de infecciones que ocurren antes del año de vida72. Pacientes que no asisten a guarderías durante los primeros 6 meses de vida, pertenecen a pequeñas familias, o poseen mejor cuidado médico, presentan mayor incidencia de enfermedades atópicas o diabetes tipo 172-76. Estas observaciones demuestran que mientras ciertas infecciones pueden inducir el desarrollo de enfermedades autoinmunes, paradójicamente otros agentes infecciosos pueden también suprimir estas afecciones. La idea de que algunos componentes de diferentes micro-organismos presentes en el ambiente son responsables del fenómeno de protección observado en sujetos con alergias o enfermedades autoinmunes ha sido sustentada por observaciones en poblaciones vacunadas o infectadas con micobacterias. Por ejemplo, la vacunación con el bacilo de Calmet-Guerin (BCG) que contiene micobacteria atenuada ha sido asociada con un riesgo reducido para el desarrollo de desórdenes alérgicos, con una mayor protección entre aquellos niños vacunados durante la primera semana de vida77. De manera similar, estudios recientes han demostrado una correlación inversa entre infecciones por helmintos intestinales y el desarrollo de reacciones alérgicas o asma78-79. Asimismo, el tratamiento anti-helmíntico en niños de áreas endémicas, y la vacunación contra Streptococcus pneumoniaea han sido asociados con un incremento importante en la incidencia de enfermedades alérgicas79-80. REVISTA ESPAÑOLA DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE

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En su conjunto, estas observaciones soportan la idea de que diferentes infecciones protegen contra el desarrollo de afecciones alérgicas. Sin embargo, la mejor evidencia para sustentar esta hipótesis surge de modelos animales. El desarrollo, tanto de diabetes como de artritis inducida por colágeno o adyuvante, en cepas susceptibles de ratones o ratas, es más temprano y de mayor agresividad cuando los animales son mantenidos en un ambiente libre de agentes patógenos81-83. Asimismo, es posible prevenir el desarrollo de diabetes en ratones NOD infectando los animales en edades tempranas con micobacterias84, el virus de la hepatitis murine85, esquistosomas86, o extractos bacterianos de Streptococos o Klebsiellas87-88. De manera similar, la infección de ratones NZB con Plasmodium berghei previene el desarrollo de LES89. Los mecanismos por los cuales diferentes microorganismos protegen contra enfermedades alérgicas y autoinmunes no son conocidos totalmente. El desarrollo de enfermedades autoinmunes depende en gran parte de la acción de citocinas Th1 y Th17, mientras que el desarrollo de enfermedades alérgicas requiere la producción de IL-4 e IL-5, ambas producidas por células Th2. Una inhibición recíproca de células Th1 por citocinas Th2, y de células Th2 por citocinas Th1, fue propuesta como primera explicación del fenómeno de protección contra enfermedades autoinmunes y alérgicas mediado por diferentes infecciones. Sin embargo, recientes observaciones han demostrado que la frecuencia de afecciones atópicas está incrementada en pacientes con diabetes y artritis reumatoidea90-91, por lo cual es esperable que los mecanismos responsables del incremento de enfermedades alérgicas sean los mismos que determinan el aumento de enfermedades autoinmunes. Por lo tanto, estos cambios no pueden ser solamente atribuidos a un disbalance entre células Th1 y Th2, requiriendo un denominador inmunológico común. Estudios recientes han demostrado que células T reguladoras (Treg) pueden jugar un importante rol en el control de enfermedades mediadas tanto por células Th1 como Th2. Dentro de los diferentes grupos de células Treg el subgrupo CD4+CD25+ Foxp3+ es uno de los más extensamente estudiados92. Este grupo de células son generadas en el timo y representan 510% del total de células CD4+, y ejercen su actividad inmunosupresora sobre células Th1 y Th2 a través de la producción de citocinas inhibitorias tales como IL10 y TGF-β. Un déficit en la supresión de células Th2 mediado por células Treg ha sido postulado como responsable del desarrollo de enfermedades alérgicas93. De manera similar, alteraciones en los mecanismos mediados por células Treg han sido descriptas en diferentes enfermedades autoinmunes94-95. Diversos estudios han demostrado que diferentes agentes infec-

Jorge Correale ciosos, y particularmente helmintos, son capaces de generar células Treg, las cuales producen elevados niveles de IL-1096-102. No obstante, es posible que IL-10 no sea el único factor responsable de estos mecanismos regulatorios, ya que la administración de micobacterias muertas protege contra el desarrollo de diabetes en ratones NOD, incluso en animales KO para IL-10103. Un mecanismo alternativo para explicar el fenómeno de protección inducido por agentes infecciosos en alergia y enfermedades autoinmunes es el proceso de competencia homeostática, en el cual la respuesta inmune contra un determinado antígeno está disminuida por la respuesta concomitante a un segundo antígeno no relacionado104-105. Este mecanismo puede influenciar respuestas tanto humorales como celulares y, por lo tanto, modificar enfermedades alérgicas o autoinmunes. El fenómeno de competencia homeostática debe ser considerado a diferentes niveles tales como: a) competencia por el procesamiento antigénico realizado por células fagocíticas; b) competencia por la unión al complejo mayor de histocompatibilidad; y c) competencia por factores de crecimiento y diferenciación106. Otro mecanismo por el cual bacterias, virus o parásitos pueden proteger contra enfermedades alérgicas o autoinmunes está relacionado con la ocupación de receptores Toll-like (TLR), los cuales son receptores para diversos componentes de diferentes micro-organismos. TLR2 es un receptor para peptidoglicanos y lipoproteínas bacterianas y TLR4 sirve como receptor de lipopolisacáridos de bacterias gram-negativas. TLR5 es un receptor de flagelina y TLR9 es un receptor de motivos CpG correspondientes a ADN bacterianos107. Cuando estos receptores unen componentes de diferentes micro-organismos, células mononucleares son estimuladas a producir diferentes citocinas capaces de inhibir respuestas alérgicas o autoinmunes. Así, por ejemplo, el inicio de diabetes se previene en ratones NOD a través del uso de agonistas para receptores TLR4 y TLR9108-109. Un efecto similar ha sido demostrado en colitis experimental autoinmune110. Finalmente, los superantígenos pueden también ejercer propiedades inmunsupresoras, no relacionadas con respuestas inmunes dirigidas contra antígenos específicos. Los superantígenos forman parte de diferentes estructuras bacterianas o virales, pudiendo inducir deleción o, en ocasiones, activaciones de diferentes poblaciones de células T, las cuales expresan una región variable particular en el receptor de células T. Una evidencia de este mecanismo se encuentra representada por la inhibición de la encefalitis alérgica experimental (EAE) a través del uso de enterotoxina B111. De manera similar, la enterotoxina B de

estafilococos inhibe el desarrollo de nefritis lúpica en ratones MRL/lpr112.

❑ La hipótesis higiénica en la esclerosis múltiple En 1966, Leibowitz y colaboradores113 sugirieron que la prevalencia de EM correlacionaba con un ambiente durante la infancia caracterizado por un elevado nivel de saneamiento. Éste fue tal vez el primer trabajo en proponer de alguna manera la hipótesis higiénica. Posteriormente, diferentes estudios epidemiológicos han demostrado un incremento en la prevalencia e incidencia de EM en las últimas décadas. Estos cambios han sido vistos en asociación con el mejoramiento sanitario de las diferentes poblaciones consideradas. Por ejemplo, en la baja Sajonia, Alemania, la incidencia de EM se ha duplicado entre los años 1969 y 1986114, y estudios mexicanos han demostrado un incremento de 29 veces en la frecuencia de la enfermedad en un periodo de solo 20 años115. De manera similar, en la región de Sassari, Cerdeña, la incidencia de EM ha crecido de 1,1/100.000 habitantes en el periodo 1965-1969 a 5,8/100.000 entre los años 19951999116. Si bien este incremento podría ser atribuido a la mejoría en los métodos diagnósticos, estudios recientes han demostrado que utilizando similares metodologías durante periodos de tiempo comparables, la incidencia de EM no se ha modificado en otras regiones como Ferrara, en el norte de Italia, o Islandia, excluyendo así la posibilidad que un diagnóstico más certero resulte en estas zonas en cambios en la prevalencia o incidencia de la enfermedad117. Por otra parte, dado el corto período de tiempo transcurrido resulta difícil atribuir estos cambios a modificaciones genéticas, por lo cual los mismos deben ser atribuidos a cambios ambientales. Sustentando el fenómeno ambiental, recientes investigaciones han demostrado una relación dicotómica entre la distribución global de EM y la del parásito Trichuris Trichura, un helminto de distribución mundial118. La prevalencia de EM cae significativamente cuando un umbral crítico de prevalencia de T. Trichura (alrededor del 10%) es excedido. Estudios longitudinales evaluando la prevalencia de EM en respuesta a cambios sanitarios de una determinada región pueden resultar de suma utilidad en la confirmación de esta hipótesis. Investigaciones en las Indias occidentales francesas entre 1878 y 1994 han demostrado que la prevalencia de EM se ha incrementado sustancialmente en esta región en asociación con una significativa reducción del parasitismo intestinal durante el mismo período119. Diferentes investigaciones en modelos animales sustentan también la hipótesis higiénica en EM. Ratas Lewis, altamente susceptibles al desarrollo de REVISTA ESPAÑOLA DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE

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EAE, cuando son criadas en un ambiente con pobre saneamiento, desarrollan scores de discapacidad muy bajos caracterizados tan sólo por pérdida del tono muscular en la cola. De forma contraria, la misma cepa de ratas criada en un ambiente libre de agentes patógenos desarrollan scores de discapacidad elevados, con significativa pérdida de peso120. Estas observaciones clínicas presentaron un claro correlato histológico, caracterizado por un marcado infiltrado inflamatorio perivascular en los animales con máximo grado de afectación, el cual contrastó con la presencia de focos inflamatorios aislados en los animales con pobre manifestación de la enfermedad. De manera interesante, los animales “protegidos”, contra el desarrollo de EAE, demostraron una importante contaminación parasitaria. De manera similar, ratones previamente infectados con S. mansoni o expuestos a huevos del parásito han demostrado una significativa reducción en la incidencia y severidad del curso clínico de EAE121-122. Esta alteración en la progresión de la enfermedad se ha visto asociada a un decremento en la producción de IL-12 e IFN-γ, así como con un incremento en la producción de IL-10 y TGF-β, indicando que infecciones parasitarias pueden influenciar el curso de afecciones autoinmunes en el SNC. Recientemente hemos tenido la oportunidad de estudiar en nuestro centro longitudinalmente un grupo de pacientes con EM que presentaron parasitosis intestinales asintomáticas, durante un período de 4,6 años. Este grupo de enfermos presentó una significativa reducción en el número de exacerbaciones, mínimos cambios en el grado de su discapacidad, y una significativamente menor actividad radiológica en estudios de resonancia magnética, en comparación con enfermos con EM no infectados y con similares características clínicas en los dos años previos a su incorporación en el estudio. Estudios inmunológicos en los pacientes parasitados demostraron la inducción de células T reguladoras capaces de producir IL-10 y TGF-β, así como un incremento en la función supresora mediada por células T CD4+ CD25+ FoxP3+123. Estudios previos han demostrado que diferentes parásitos son capaces de incrementar el número de células T reguladoras o su actividad, ya sea generando nuevas poblaciones celulares, o bien activando o expandiendo células existentes124-125. En la misma población de pacientes, las infecciones pa-

rasitarias fueron también capaces de inducir una población de células B regulatorias, capaces de inhibir la respuesta autoinmune a través de la producción de IL-10126. Estos hallazgos proveen evidencias que sustentan inhibición de la respuesta autoinmune en pacientes con EM a través de la acción de diferentes poblaciones de células reguladoras cuyos efectos exceden la respuesta específica dirigida contra el agente parasitario. Esta serie de observaciones epidemiológicas, inmunológicas y en modelos animales de EAE sugieren que la hipótesis higiénica es relevante para explicar algunos de los factores ambientales involucrados en la patogénesis de la EM. Sin embargo, el estudio de infecciones por EBV plantea una paradoja a la hipótesis higiénica: el riesgo de desarrollar EM es extremadamente bajo en pacientes seronegativos para EBV. De acuerdo a la hipótesis higiénica este grupo de enfermos deberían presentar un alto riesgo de desarrollar EM. Por el contrario, el riesgo de desarrollar la enfermedad es significativamente más bajo que en aquellos individuos que son seropositivos para este virus127-128. Diferentes explicaciones para estos hallazgos han sido planteadas: a) Individuos que son EBV-seronegativos en la vida adulta son genéticamente resistentes tanto al desarrollo de EM como a la infección por EBV; b) Contrariamente, existe un genotipo particular que en la infancia incrementa tanto el riesgo de desarrollar EM como la susceptibilidad a contraer infecciones por EBV129. Ninguna de estas dos posibilidades ha podido probarse ciertamente y requieren, sin duda, futuras investigaciones. Colectivamente, esta serie de observaciones demuestran que ciertas infecciones pueden jugar un rol importante causando o exacerbando EM. De manera opuesta, en otras circunstancias, moléculas inmunomoduladoras producidas por agentes infecciosos pueden ser benéficas para prevenir o atenuar enfermedades autoinmunes. Un futuro desafío está destinado a evaluar el beneficio de las interacciones entre el agente patógeno y el huésped e identificar moléculas derivadas de agentes infecciosos con potencial efecto terapéutico. Asimismo, la evidencia de que las infecciones parasitarias crónicas pueden inducir diferentes sistemas regulatorios anti-inflamatorios puede ofrecer una potencial explicación para los mecanismos ambientales capaces de suprimir el desarrollo de EM en zonas de baja prevalencia de la enfermedad.

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Revisión

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REVISTA ESPAÑOLA DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE

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Novedades Bibliográficas Dra. Ana Mª Alonso Torres

Unidad de Neuroinmunología. Hospital Regional Universitario Carlos Haya. Málaga.

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Etiopatogenia ■› Interferon regulatory factor 5 (IRF5) gene

variants are associated with multiple sclerosis in three distinct populations Kristjansdottir G, Sandling JK, Bonetti A, Roos IM, Milani L, Wang C, Gustafsdottir SM, Sigurdsson S, Lundmark A, Tienari PJ, Koivisto K, Elovaara I, Pirttilä T, Reunanen M, Peltonen L, Saarela J, Hillert J, Olsson T, Landegren U, Alcina A, Fernández O, Leyva L, Guerrero M, Lucas M, Izquierdo G, Matesanz F, Syvänen AC.

Journal of Medical Genetics 2008 June; 45: 362-369.

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El factor regulador número cinco del interferón ha sido relacionado con varias enfermedades autoinmunes como el lupus eritematoso, la artritis reumatoide y la enfermedad inflamatoria intestinal. Se trata de un factor de transcripción implicado tanto con el interferón tipo I como con las vías de señalización de un receptor tipo peaje. En este trabajo los autores tratan de demostrar la asociación de los polimorfismos en el IRF5 con la esclerosis múltiple. Se genotipan nueve polimorfismos de un solo nucleótido y uno de inserción-delección en el gen del IRF5 en 2.337 pacientes con EM y 2.813 controles, procedentes de tres poblaciones distintas. Se encuentra asociación significativa con la inserción-delección y con dos polimorfismos de un solo nucleótido. Estos hallazgos añaden el gen del IRF5 a la lista de genes que han demostrado estar asociados a la EM. Además, se añade la evidencia de que hay genes que están implicados en el desarrollo de múltiples enfermedades autoinmunes, y que el sistema del interferón tipo I está implicado en la aparición de éstas.

■› Multiple sclerosis in gypsies from southern Spain: prevalence, mitochondrial DNA haplogroups and HLA class II association Fernández O, Fernández V, Martínez-Cabrera V, Mayorga C, Alonso A, León A, Arnal C, Hens M, Luque G, de Ramón E, Caballero A, Leyva L. Tissue Antigens 2008 May; 71 (5): 426-433.

Se estudia la prevalencia de la esclerosis múltiple junto con el DNA mitocondrial y la distribución del HLA clase II en la población gitana del sur de REVISTA ESPAÑOLA DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE

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España. Se seleccionan pacientes de etnia gitana con EM y se estudian los alelos de HLA clase II mediante PCR. Además, se realizó un estudio adicional de los haplogrupos de DNA mitocondrial para proporcionar detalles del origen étnico. La prevalencia estimada de la EM en la población gitana de Málaga es de 52/100.000 habitantes. No se encontraron diferencias significativas en el DNA mitocondrial entre los pacientes de etnia gitana con EM y controles. Los únicos alelos de HLA asociados con la EM fueron DRB1*1501, DQB1*0602 y DQB1*0608. El origen antropológico de los individuos de etnia gitana de nuestra serie fue similar al de otros grupos europeos, según los haplogrupos de DNA mitocondrial. Aunque el tamaño de la muestra es pequeño, la prevalencia encontrada no es tan baja como en la población gitana de Europa Central, aunque es significativamente menor que la encontrada en los caucásicos en España. El alelo DQB1*0602 fue la asociación más intensa encontrada en los pacientes con EM de etnia gitana. DRB1*1501-DQB1*0602 es el haplotipo más frecuente en este grupo.

Clínica ■› Natural history of secondary-progressive

multiple sclerosis Tremlett H, Zhao Y, Devonshire V. Multiple Sclerosis 2008 April; 14 (3): 314-324.

Se trata de un trabajo retrospectivo para analizar los factores de riesgo y la evolución de la forma secundaria progresiva de la esclerosis múltiple. Se seleccionan pacientes con EMRR de inicio anterior a 1988, en revisiones desde antes de 1998. Se recoge el tiempo hasta la evolución a EMSP, hasta la EDSS 8 y los factores de riesgo implicados. La media para progresar hasta EMSP es de 18,9 años. Los pacientes con edad de inicio menor tardan más en alcanzar la forma progresiva, pero lo hacen a una edad menor. Los varones alcanzan la forma progresiva significativamente más rápido desde el inicio, y a una edad menor, pero la edad para EDSS 8 es similar que en mujeres. Las características asociadas con mayor tiempo entre el paso a la progresión y la EDSS 8, y una mayor edad al alcanzar la EDSS 8 fueron una duración mayor de la

enfermedad, una edad mayor y una EDSS menor. Como conclusión, la fase RR dura unas dos décadas, siendo más corta en varones y en aquellos con una edad mayor al inicio. Una fase RR más larga es un factor favorable para la progresión de la enfermedad durante la forma SP.

pacientes presentaron uno o más brotes, y el 32,7% alcanzaron un aumento de la discapacidad. Tras el análisis de los datos se encontró una alta probabilidad de progresión de la EDSS en los pacientes que tuvieron brotes durante este periodo, sin que hubiera diferencias en cuanto al número de brotes.

■› Clinical characteristics of patients with

■› Pregnancy, delivery and birth outcome in different

Los autores realizan una revisión retrospectiva de la presentación clínica y las características de LCR y RMN en pacientes con EM de inicio tardío. Se revisan datos de 52 pacientes con inicio de la enfermedad con más de cincuenta años, junto a un grupo control de pacientes con inicio a menor edad, pareados por sexo y tiempo de evolución de la enfermedad. La edad media de inicio fue de 57 años (el paciente más viejo tenía 82 años) en el grupo de mayores y 29 en el de jóvenes. Los síntomas motores fueron significativamente más frecuentes en los de mayor edad. Los síntomas visuales, la disartria y las secuelas de neuritis óptica fueron menos frecuentes. La mayoría (83%) de los pacientes de inicio tardío tuvieron un curso progresivo desde el inicio. En cuanto a la RMN, las lesiones espinales fueron más frecuentes en los mayores, y las cerebelosas menos. Las lesiones captantes fueron más frecuentes al inicio en los jóvenes. El análisis de LCR muestra pleocitosis con menos frecuencia en los de inicio tardío, pero la presencia de BOC no muestra diferencias. Como conclusión de estos datos, para los pacientes que presentan una EM de inicio con más de 50 años, son más frecuentes los síntomas motores.

Se recogen los datos de embarazos en pacientes con esclerosis múltiple antes del diagnóstico, entre el inicio y el diagnóstico, y tras el diagnóstico. Se recogen datos de 35 años (1967-2002), en total 2.773 embarazos. La tasa de complicaciones e intervenciones en el parto no se diferencian entre los tres grupos. En el grupo de pacientes con esclerosis múltiple instaurada, el peso del recién nacido fue significativamente menor que en las que presentaron el embarazo antes del diagnóstico, ajustado por semanas de gestación, edad materna y cesárea.

late-onset multiple sclerosis Kis B, Rumberg B, Berlit P. Journal of Neurology 2008 May; 255 (5): 697-702.

■› Effect of relapses over early progression of

disability in multiple sclerosis patients treated with beta-interferon Bosca I, Coret F, Valero C, Pascual A, Magraner M, Landete L, Casanova B. Multiple Sclerosis 2008 June; 14 (5): 636-639.

En este artículo se presenta un trabajo observacional para determinar el efecto de las variables demográficas y el número de brotes en la progresión de la discapacidad en los dos primeros años de tratamiento con interferón beta en los pacientes con esclerosis múltiple. Se incluyeron 162 pacientes tratados con interferón beta al menos por dos años. Como end-point primario se tomó el aumento mantenido de la EDSS. El 62,3% de los

stages of maternal multiple sclerosis Dahl J, Myhr KM, Daltveit AK, Gilhus NE. Journal of Neurology 2008 May; 255 (5): 623-627.

Diagnóstico ■› Retinal nerve fiber layer thickness is associated with brain MRI outcomes in multiple sclerosis Grazioli E, Zivadinov R, Weinstock-Guttman B, Lincoff N, Baier M, Wong JR, Hussein S, Cox JL, Hojnacki D, Ramanathan M. Journal of Neurological Sciences 2008 May; 268 (1-2): 12-17.

La esclerosis múltiple es una enfermedad caracterizada por el doble proceso de inflamación y neurodegeneración. La RMN cráneo convencional es la mejor herramienta para detectar y monitorizar la carga lesional y la inflamación, pero tiene una capacidad limitada para determinar la pérdida axonal. La tomografía de coherencia óptica es una técnica simple de alta resolución que emplea luz cercana al infrarrojo para cuantificar el adelgazamiento de la capa de fibras nerviosas de la retina, donde solo se encuentran axones no mielinizados. Se valora en este trabajo el adelgazamiento de la capa de fibras nerviosas de la retina (RNFL) en 30 pacientes de EM consecutivos. En 18 se realizó, además, una RMN cráneo valorando volumen lesional en T1 y T2, volumen cerebral normalizado, volumen de sustancia gris y blanca y difusividad media cerebral. Se encontró una fuerte asociación entre el grosor de RNFL y el volumen cerebral normalizaREVISTA ESPAÑOLA DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE

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Novedades Bibliográficas

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do. Además, también se asoció con el volumen lesional en T2 y con el volumen de sustancia blanca de forma significativa. Existía una correlación negativa entre el tamaño de RNFL y la discapacidad valorada mediante EDSS. Los resultados apoyan la utilidad de esta técnica para monitorizar el daño axonal en los pacientes con EM.

presentan un deterioro más intenso de los potenciales evocados que los pacientes estables. Estos datos sugieren que los potenciales evocados seriados miden y ayudan parcialmente a predecir la actividad clínica relevante en un momento de gran importancia terapéutica como es la fase inicial de la EMRR.

■› Relationship between MRI lesion activity and

Tratamiento ■› Rituximab in a patient with multiple sclerosis-effect

response to IFN-β in relapsing-remitting multiple sclerosis patients Río J, Rovira A, Tintoré M, Huerga E, Nos C, Téllez N, Tur C, Comabella M, Montalbán X. Multiple Sclerosis 2008 May; 14 (4): 479-484.

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El objetivo de este trabajo es evaluar la capacidad de la RMN craneal realizada al inicio y al año, para valorar la progresión de la discapacidad en pacientes con EMRR en los dos primeros años de terapia con interferón beta. Se realiza un estudio prospectivo y longitudinal realizando a los pacientes una RMN previa al inicio del tratamiento y otra al año, determinando la carga lesional en T2, en T1 sin contraste y en T1 con contraste y la fracción parenquimatosa cerebral. Además, en la RMN a los 12 meses se valoran las lesiones activas (nuevas o aumentadas en T2 o con captación de contraste). La EDSS se determina cada tres meses, definiendo como progresión de la discapacidad como el aumento de al menos un punto en la EDSS confirmado y mantenido durante al menos los dos años de terapia con interferón beta. Se realiza un análisis de regresión para identificar las variables de RMN que mejor puedan predecir el aumento en la discapacidad. El dato que mejor se relaciona con el aumento de la discapacidad durante los primeros dos años de tratamiento con interferón beta es la presencia de lesiones activas en la RMN realizada a los pacientes al año de iniciar el tratamiento.

on B cells, plasma cells and intrathecal IgG synthesis Petereit HF, Moeller-Hartmann W, Reske D, Rubbert A. Acta Neurologica Scandinavica 2008 June; 117 (6): 399-403.

Se pretende en este trabajo estudiar la evolución de los niveles de inmunoglobulinas, células B y células plasmáticas en sangre y líquido cefalorraquídeo antes y durante el tratamiento con rituximab en pacientes con esclerosis múltiple recurrente remitente agresiva. El tratamiento con rituximab produce una mejoría clínica y en RMN muy intensa y mantenida durante un seguimiento de 20 meses. Por el contrario, las células B y plasmáticas en sangre y LCR, que se suprimen al iniciar el tratamiento, reaparecen tras 5-10 meses, siendo el LCR el primer sitio donde vuelven a detectarse. Además, la síntesis intratecal de IgG persiste a lo largo de todo el periodo de tratamiento. Pese a la elevada eficacia clínica demostrada por el rituximab, el mecanismo de acción y la eficacia en series clínicas mayores precisa de posteriores estudios.

■› MRI activity and neutralizing antibody as predictors

■› Multimodal evoked potentials measure

of response to IFN-β treatment in MS Durelli L, Barbero P, Bergui M, Versino E, Bassano MA, Verdun E, Rivoiro C, Ferrero C, Picco E, Ripellino P, Giuliani G, Montanari E, Clerico M. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry 2008 June; 79: 646-651.

En 37 pacientes con formas iniciales de esclerosis múltiple recurrente remitente se obtuvieron de forma periódica potenciales evocados multimodales, datos clínicos (EDSS) y Multiple Sclerosis Functional Composite durante 24 meses. Los cambios en los potenciales evocados se correlacionan significativamente con la EDSS y con el MSFC. Los pacientes con una progresión relevante de la EDSS

No todos los pacientes con esclerosis múltiple presentan una respuesta satisfactoria al tratamiento, y pueden requerir ajustes. Es necesario encontrar indicadores que nos puedan permitir predecir esta respuesta. En este estudio se recogen de forma prospectiva los datos de actividad en RMN y la presencia de anticuerpos neutralizantes frente al interferón durante los primeros seis meses de tratamiento con interferón beta. A los pacientes, además, se les realiza seguimiento clínico durante 18 meses más, hasta completar los primeros dos años de tratamiento. Se analiza la sensibilidad y especi-

and predict disability progression in early relapsing-remitting multiple sclerosis Jung P, Beyerle A, Ziemann U. Multiple Sclerosis 2008 May; 14 (4): 553-556.

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ficidad de la actividad en RMN, de la presencia de Ac neutralizantes o de ambos en los primeros seis meses de tratamiento para predecir la actividad clínica (brotes o progresión de la discapacidad) en los siguientes 18 meses. Se recogieron los datos de 147 pacientes, en 16 centros. Los parámetros predictivos fueron: Actividad en RMN: sensibilidad 52%, especificidad 80%; Ac. positivos: S 71%, E 66%; Ambos datos: S 71%, E 86%. Como conclusión, la actividad en RMN y la presencia de anticuerpos neutralizantes en los primeros seis meses de tratamiento con interferón beta son útiles para predecir la respuesta clínica a largo plazo, especialmente si se combinan ambos datos.

■› Glatiramer acetate after induction therapy with

mitoxantrone in relapsing multiple sclerosis Vollmer T, Panitch H, Bar-Or A, Dunn J, Freedman M, Gazda S, Campagnolo D, Deutsch F, Arnold D. Multiple Sclerosis 2008 June; 14 (5): 663-670.

Se compara en un estudio randomizado la eficacia del tratamiento con acetato de glatirámero sólo o precedido de una pauta corta de mitoxantrona. Participaron en el estudio 40 pacientes con lesiones captantes de gadolinio en RMN, que recibieron durante tres meses, o bien una dosis mensual de 12 mg/m2 de mitoxantrona, o una dosis diaria de 20 mg/día de acetato de glatirámero SC. Después, los dos grupos continuaron con AG diario durante 12 meses. Se realizaron RMN a los 6, 9, 12 y 15 meses de tratamiento. El objetivo primario era la incidencia de efectos adversos, y los secundarios la presencia de lesiones con captación de contraste, los brotes y la variación en la EDSS. Los dos tratamientos fueron bien tolerados, sin efectos adversos. El grupo que recibió mitoxantrona presentó una disminución significativamente mayor en el número de lesiones con captación de contraste. La inmunosupresión breve con mitoxantrona, seguida del tratamiento con AG, resulta ser segura y efectiva, con una disminución de la actividad en RMN precoz y mantenida.

■› Effect of intravenous methylprednisolone

on the number, size and confluence of plaques in relapsing-remitting multiple sclerosis Zivadinov R, Zorzon M, De Masi R, Nasuelli D, Cazzato G. Journal of Neurological Sciences 2008 April; 267 (1-2): 28-35.

El objetivo del estudio que se presenta es valorar el efecto de los pulsos intravenosos de metil-

prednisolona (IVMP) a largo plazo sobre el crecimiento y la confluencia de las lesiones en T2 en pacientes con esclerosis múltiple recurrente remitente. 88 pacientes fueron asignados aleatoriamente a recibir pulsos regulares de IVMP más pauta descendente oral, o bien a recibir únicamente este tratamiento en caso de brote. Se completó el seguimiento sin otro tratamiento modificador de la enfermedad por cinco años en 81 pacientes. Los pulsos de IVMP fueron cada 4 meses los primeros 3 años y después cada 6 meses. Tras terminar el estudio, los pacientes que recibieron pulsos periódicos de IVMP presentaban menos lesiones confluentes en T2 y menos lesiones grandes en T2, aunque presentaban más lesiones pequeñas en T2. El tratamiento con pulsos de IVMP previene la confluencia de lesiones en T2, que podría estar implicado en el acúmulo de discapacidad, pero no enlentece la acumulación de volumen lesional en T2, y aparecen más lesiones pequeñas en el brazo tratado.

■› Therapeutic plasma exchange combined with

immunomodulating agents in secondary progressive multiple sclerosis patients Grapsa E, Triantafyllou N, Rombos A, Lagouranis A, Dimopoulos MA. Therapeutic Apheresis and Dialysis 2008 April; 12 (2): 105-108.

En este trabajo se presentan los datos de 10 pacientes con esclerosis múltiple secundaria progresiva que habían sido tratados con agentes inmunomoduladores, en los que además se añadió tratamiento mediante plasmaféresis. Los pacientes incluidos habían sufrido un deterioro importante en su enfermedad en el año previo. Se realizó la plasmaféresis tres veces por semana durante dos semanas, y después una vez por semana, o bien una vez al mes en los pacientes estables. Tras 18 meses, los pacientes abandonaron el tratamiento inmunomodulador, quedando sólo con la plasmaféresis. No aparecieron efectos adversos, ni se registró ningún brote. Después de 36 meses de tratamiento, en cinco de los pacientes se estabilizó la evolución de la discapacidad, y en dos, ésta se enlenteció. Tres de los pacientes abandonaron el tratamiento, uno por náuseas que no cedían y dos por causas no relacionadas con el tratamiento. En nuestra serie, la plasmaféresis periódica se asoció con un menor acúmulo de déficit neurológico valorado mediante EDSS sin efectos adversos en los pacientes con esclerosis múltiple progresiva secundaria. REVISTA ESPAÑOLA DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE

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Agenda ■› 26th Annual BEBRF International Conference

jUlio

■› 18th Meeting of the European Neurological Society Ciudad: Niza (Francia). Fecha: 7-11 julio 2008. Más información: www.akm.ch/ens2008

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■› Distrofias musculares por déficit de calpaína 3: una visión general. Cursos de verano de la Universidad de El País Vasco.

Ciudad: San Sebastián (España). Fecha: 14-15 julio 2008. Más información: www.sen.es/pdf/2008/calpaina2008.pdf

■› Medical Management of Pediatric Neurotransmitter Disease

Ciudad: Herndon (USA). Fecha: 18-19 julio 2008. Más información: http://www.pndassoc.org/site/ c.iuLWJdMRKpH/b.593219

■› International Conference on Alzheimer’s Disease (ICAD)

■› 12th Congress of the European Federation of Neurological Societies (EFNS)

Ciudad: Madrid (España). Fecha: 23-26 agosto 2008. Más información: www.kenes.com/efns

■› Primer Congreso Mundial Científico-Práctico de Inteligencia Emocional

Ciudad: Córdoba (Argentina). Fecha: 28-30 agosto 2008. Más información: www.america-ie.org/index.html

■› 21st European College of Neuropsychopharmacology Congress

Ciudad: Barcelona (España). Fecha: 30 agosto-3 septiembre 2008. Más información: www.ecnp.eu/emc. asp?pageId=963

Ciudad: Chicago (USA). Fecha: 26-31 julio 2008. Más información: www.alz.org/icad/overview.asp

septiembre

■› A Comprehensive Review of Movement disorders

Frontotemporal Dementia

for the Clinical Practitioner

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Ciudad: Minneapolis (USA). Fecha: 15-17 agosto 2008. Más información: www.blepharospasm.org

Ciudad: Aspen, Colorado (USA). Fecha: 28-31 julio 2008. Más información: www.ColumbiaCME.org.

■› Curso de Verano 2008 “Avances en Neurología y Ciencias de la Conducta”

Ciudad: El Escorial, Madrid (España). Fecha: 28 julio - 1 agosto 2008. Más información: www.ucm.es/info/cv/subweb/prog/ programas/75107.html

Ciudad: Rotterdam (Países Bajos). Fecha: 3-5 septiembre 2008. Más información: www.ftd2008.org/site

■› European Headache and Migraine Trust International Congress 2008

Congress 2008 Ciudad: Londres (Reino Unido). Fecha: 4-7 septiembre 2008. Más información: www.ehmticongress2008.com

■› Reunión Extraordinaria del Grupo de Estudio de Epilepsia de la SEN

Agosto

■› 6th Annual Young-Onset Parkinson Network Conference Ciudad: Atlanta (USA). Fecha: 7-9 agosto 2008. Más información: www.parkinson.org

■› 12th World Congress on Pain

Ciudad: Londres (Reino Unido). Fecha: 13-15 agosto 2008. Más información: www.kenes.com/neuropathic2008 REVISTA ESPAÑOLA DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE

■› 6th International Conference on

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Ciudad: Zaragoza (España). Fecha: 5-6 septiembre 2008. Más información: www.sen.es/pdf/2008/reunion_ge_ epilepsia_2008.pdf

■› 12ª Reunión de la Asociación Europea de Huntington (EHA)

Ciudad: Lisboa (Portugal). Fecha: 5-8 septiembre 2008. Más información: www.euro-hd.net/html/ehdn2008WDM 2008

Normas de publicación Envío de manuscritos

Presentación y estructura de los trabajos

1.- Los trabajos deberán ser enviados para su publicación a Revista Española de Esclerosis Múltiple. Editorial Línea de Comunicación, calle Concha Espina, 8º, 1º derecha, 28036 Madrid. Los trabajos se remitirán por correo electrónico ([email protected]) o en soporte digital junto con una copia impresa, indicando el procesador de textos utilizado. 2.- Los trabajos serán evaluados para su publicación siempre en el supuesto de no haber sido ya publicados, aceptados para publicación o simultáneamente sometidos para su evaluación en otra revista. Los originales aceptados quedarán en propiedad de la revista y no podrán ser reimpresos sin permiso de Revista Española de Esclerosis Múltiple. 3.- La Secretaría acusará recibo de los originales e informará de su aceptación. Asimismo, y cuando lo estime oportuno el Consejo Editorial, serán propuestas modificaciones, debiendo los autores remitir el original corregido en un plazo de 15 días a partir de la recepción del citado informe.

Los originales deberán ser mecanografiados a doble espacio (30 líneas, 60 pulsaciones), en DIN-A4 por una sola cara, con un margen no inferior a 25 mm, y con las páginas numeradas correlativamente.

Secciones de la revista Revisiones: trabajos amplios sobre un tema de actualidad, donde el autor estudia el tema y revisa la bibliografía escrita hasta la fecha sobre éste. Originales: trabajos de tipo prospectivo, de investigación clínica, farmacológica o microbiológica, y las contribuciones originales sobre etiología, fisiopatología, anatomía patológica, epidemiología, diagnóstico y tratamiento de las enfermedades. La extensión máxima del texto será de 15 folios y se admitirán 8 figuras y/o tablas, equivalente a 6 páginas de revista incluyendo figuras, tablas, fotos y bibliografía. Originales breves (notas clínicas): trabajos originales de experiencias o estudios clínicos, ensayos terapéuticos o casos clínicos de particular interés, cuya extensión no debe superar 5 folios y 4 figuras y/o tablas. Cartas al director: comentarios relativos a artículos recientes de la revista, así como observaciones o experiencias que, por su extensión o características, puedan ser resumidas en un texto breve; se admite una tabla y/ o figura y un máximo de 10 citas bibliográficas. Otras secciones: crítica de libros: textos breves (una página de 2.000 espacios) de críticas de libros para su publicación. Asimismo, se publicarán en la sección agenda los congresos, cursos y reuniones relacionados que se remitan.

Estructura: el trabajo, en general, deberá estar estructurado en diversos apartados: Introducción, Material y métodos, Resultados y Discusión. En trabajos especialmente complejos podrán existir subapartados que ayuden a la comprensión del estudio. Primera página: en la primera página figurarán en el orden que se citan: 1.- Título: debe ser conciso e informativo. 2.- Nombre completo -sin abreviaturas- y apellidos del autor o autores. 3.- Centro y Departamento en que se realizó el trabajo. 4.- Dirección de correspondencia, teléfono, e-mail. 5.- Título corto, inferior a 40 caracteres. Resumen con palabras clave: se acompañará un resumen en castellano de unas cuatro líneas y el mismo traducido al inglés, con palabras clave (10 máximo) también en ambos idiomas. Bibliografía: las citas se presentarán según el orden de aparición en el texto, con numeración correlativa en superíndices, vaya o no acompañada del nombre de los autores en el texto. Las citas se comprobarán sobre los originales y se ordenarán según las normas de Vancouver disponibles en http://www.icmje.org Ilustraciones: se podrán publicar en blanco y negro, o a dos colores; si se utilizan fotografías de personas identificables, es necesario tener la autorización para su publicación. Las microfotografías deben incluir escala de medidas. Si las ilustraciones son originales sobre papel o transparencia, las fotos han de ser de buena calidad, bien contrastadas. No remita fotocopias. Ilustraciones digitales: si puede aportar las ilustraciones en formato digital, es recomendable utilizar formato bmp, jpg o tiff, con un mínimo de 300 puntos por pulgada. Si las figuras no son originales, aun cuando cite la procedencia o las modifique, debe obtener permiso de reproducción del autor o de la editorial donde se publicó originalmente.

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Con la colaboración de: