PTH: MÉTODOS DE DETERMINACIÓN Eva Márquez Liétor 6 de febrero 2008
PTH
HORMONA PEPTÍDICA
(84 aminoácidos)
MANTENER LA HOMEOSTASIS Ca2+
SÍNTESIS Y SECRECIÓN
CÉLULAS PRINCIPALES
SÍNTESIS Y SECRECIÓN
SÍNTESIS Y SECRECIÓN
PTH
Ca2+
SÍNTESIS Y SECRECIÓN
RECEPTOR ACOPLADO A PROTEÍNAS G
SÍNTESIS Y SECRECIÓN Presecuencia Prosecuencia
PTH
SÍNTESIS Y SECRECIÓN Ca2+ Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+ Ca2+ PTH CPTH
CPTH CPTH E CPTH
PTH
Ca2+ Ca2+ PTH PTH PTH
Vitamina D
PTH
PTH
IP3
Ca2+
TRANSCRIPCIÓN DEL GEN DE LA PTH
Ca2+
SÍNTESIS Y SECRECIÓN Ca2+ Ca2+
Ca2+
PTH CPTH
CPTH CPTH E
Mg2+
C- PTH PTH
PTH PTH PTH PTH
PTH
PTH PTH PTH
TRANSCRIPCIÓN DEL GEN DE LA PTH
METABOLISMO Y EXCRECIÓN N-terminal
t1/2= 2-4’
HÍGADO C-terminal 5 veces PTHintacta
(kupffer)
METABOLISMO Y EXCRECIÓN PTH (1-84) C-terminal
Aclaramiento renal
función renal
N-PTH y PTHi (1-84) C-PTH
PTHi + C-terminal
actividad biológica inactivos
EFECTOS BIOLÓGICOS MANTENER [Ca2+] EN LEC HUESO RIÑÓN INTESTINO
EFECTOS BIOLÓGICOS RECEPTOR DE PTH Activación: residuo 1-6 PTH
ACCIÓN HUESO Y RIÑÓN RECEPTOR TRANSMEMBRANA ACOPLADO A PROTEÍNAS G
EFECTOS BIOLÓGICOS RIÑÓN •Incrementa la reabsorción de Ca2+ en la porción distal del túbulo •Inhibe la reabsorción de fosfato en el túbulo proximal (efecto fosfatúrico) •Estimula la producción de 1,25-(OH)2-vitamina D (forma activa) aumenta la absorción intestinal de Ca2+ (efecto indirecto sobre intestino)
EFECTOS BIOLÓGICOS HUESO •Receptor de PTH en osteoblastos: •Inhibe síntesis de enzimas formadoras de tejido óseo •Induce expresión de citoquinas que promueven la proliferación y diferenciación de osteoclastos (sistema RANKL/OPG) •Acción bimodal: •Temprana: induce resorción ósea (inhibe osteoblastos y activa osteoclastos) Ca2+ sérico •Tardía: remodelación ósea de sitios afectados (estimula proliferación de osteoblastos)
EFECTOS BIOLÓGICOS RECEPTOR DE PTH Activación: residuo 1-6 PTH
RECEPTOR TRANSMEMBRANA ACOPLADO A PROTEÍNAS G
ACCIÓN HUESO Y RIÑÓN
Activación selectiva explicaría los efectos dispares óseos
EFECTOS BIOLÓGICOS RECEPTOR DE C-PTH Activación: residuos C-PTH
Efectos biológicos de fragmentos “inactivos” Osteoblastos y osteocitos
RECEPTOR TRANSMEMBRANA ACOPLADO A PROTEÍNAS G
resorción ósea Contrarrestan efecto del
Ca2+
Pr-PTH Péptido de 141aa con homología estructural en extremo N-terminal con PTH (13aa). Inicialmente descubierto en tumores (pulmón, mama, riñón...) Hipercalcemia grave por activación del receptor de PTH: -Incrementa resorción ósea -Aumenta reabsorción renal de Ca2+ Menor efecto fosfatúrico que PTH
Pr-PTH Producción en tejidos fetales y adultos. Función fisiológica: -Feto: -Regula proliferación y mineralización de cartílago -Regula transporte placentario de calcio -Vida postnatal (acción paracrina): -Regula interacciones entre epitelio y mesénquima (desarrollo de mama, piel y folículo piloso) Elevada en hipercalcemia asociada a malignidad y en carcinomas epidermoides de pulmón, esófago, útero, piel y en otros cánceres sin relación con su localización (feocromocitoma, mielomas, linfomas...)
DETERMINACIÓN DE PTH Gran controversia en varios puntos: 1.Denominación de los distintos tipos de ensayos Radioinmunoanálisis
Análisis inmunométricos
1ªgeneración
PTHintacta
1ªgeneración 2ªgeneración
2ªgeneración PTHbiointacta 3ªgeneración
DETERMINACIÓN DE PTH 2. Uso de diferentes unidades de medida. La adopción de unidades molares es difícil por la heterogenicidad de especies moleculares de PTH. Se acepta la conversión, en ensayos de PTH intacta, de unidades de masa a unidades molares utilizando un factor de conversión. 3. En un mismo tipo de ensayo no hay estandarización para armonizar resultados entre distintos métodos. Estudio de comparación entre 15 métodos encontró una diferencia de PTH comprendida (-44%- +123%)
DETERMINACIÓN DE PTH Laboratorios dependen de los intervalos de referencia aportados por los fabricantes que no son comparables entre sí FABRICANTE
MÉTODO
INTERVALO REFERENCIA (pmol/L)
BMC Elecsys (Roche)
Electroquimioluminiscencia
1.6-6.9
Modular (Roche)
Electroquimioluminiscencia
1.4-7.6
Immulite 2000 (DPC)
Quimioluminiscencia
1.0-7.0
Immulite (DPC)
Quimioluminiscencia
1.1-7.3
Advia Centaur (Bayer)
Inmunoquimioluminiscencia
1.2-8.5
N-tact PTH (Diasorin)
Inmunoradiometría
1.2-4.9
DETERMINACIÓN DE PTH Intervalos de referencias se basan en adultos jóvenes y de mediana edad, pero sus límites varían en ciertos grupos: -Ancianos: elevación edad-dependiente relacionada con la disminución de función renal. -Embarazadas: disminución en el primer trimestre seguido por un aumento hasta valores normales a término del embarazo -Recién nacidos: presentan hipocalcemia porque su glándula ha estado suprimida durante el embarazo y tarda en responder
DETERMINACIÓN DE PTH Mejora de sensibilidad clínica: Uso de intervalos de referencia dinámicos (rangos de valores de PTH en suero obtenidos a partir de modificaciones extremas de las [Ca2+] en individuos sanos) mejor que intervalos gaussianos (valores de PTH en individuos con valores de Ca2+ normales)
DETERMINACIÓN DE PTH RADIOINMUNOANÁLISIS Inmunoanálisis competitivos con Ac dirigidos hacia porciones más antigénicas (región media o C-terminal)
Limitaciones
Detectan péptidos PTH amino terminal truncados y PTH (1-84). IR avanzada
resultados anormalmente elevados
DETERMINACIÓN DE PTH ANÁLISIS INMUNOMÉTRICOS -Inmunorradiometría (IRMA) M= radiación (I125) -Inmunoquimioluminiscencia (ICMA) M= enzima o sonda quimioluminiscente
SS= soporte sólido M
SS
DETERMINACIÓN DE PTH SS
E
+
+ SS
E
+
SS
S
SS
DETERMINACIÓN DE PTH 1.Gran sensibilidad y especificidad por uso de Ac de secuencia específica 2.Rango de concentración más amplio 3.Menos tiempo de incubación
DETERMINACIÓN DE PTH
Capaces de realizar diagnóstico diferencial de hipercalcemia: -Niveles elevados de PTH en trastornos hiperparatiroideos -Niveles deprimidos de PTH en hipercalcemia con base no paratiroidea Resultados reproducibles en pacientes con diálisis (gran retención de fragmentos C-PTH)
DETERMINACIÓN DE PTH Análisis inmunométricos
PTH intacta (1-84)
PTH (7-84) Ensayos de PTHintacta: - Detectan formas moleculares con efecto biológico opuesto - Sobreestiman la concentración de PTH
Nuevos inmunoanálisis
DETERMINACIÓN DE PTH Detectan exclusivamente PTH (1-84), no reaccionan con fragmentos grandes N-terminales truncados detección 1
7
captura 34
PTH bio-intacta
84
DETERMINACIÓN DE PTH No se ha determinado qué inmunoanálisis es superior: -Los resultados de ambos se correlacionan tanto en sujetos normales como en pacientes con IR, aunque los valores obtenidos con los primeros son ~ 50% superiores -Punto de vista científico: medir la verdadera concentración de PTH (1-84) haría posible entender mejor la fisiología de la glándula paratiroides y el metabolismo fosfocálcico -Punto de vista clínico: valores con PTH bio-intacta no son mejores para discriminar enfermedades óseas asociadas a fallo renal y tienen igual sensibilidad diagnóstica en hiperparatiroidismo primario
DETERMINACIÓN DE PTH Muestra de elección: SUERO PTH es inestable Retraso 2-4h en
separación y congelación rápida Separar Congelar
descenso de 6% descenso de 8%
Extracción en ayunas y por la mañana incremento bifásico (18:00 y 02:00) Podría utilizarse plasma con EDTA que estabiliza la muestra pero es incompatible con algunas técnicas analíticas