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XVII Curso Intensivo de Reumatología y XXI Conferencia “Dr. Pedro M. Catoggio Patrones de inmunofluorescencia en anticuerpos anti‐nucleares Orlando Gabriel Carballo 18 de NOVIEMBRE de 2011, Buenos Aires, Argentina
Malcolm Hargraves describe las células LE en 1948.
Fagocitosis de material nuclear intacto por leucocitos polimorfonucleares
además el fenómeno L. E. desaparece de la sangre durante la remisión y reaparece durante la recidiva de los pacientes con lupus eritematoso sistémico agudo.
Las propiedades físicas del factor sérico L. E. eran similares a las de las gamaglobulinas normales, como bien lo documenta Hargraves, Haserick y Lee.
Henry Kunkel.
En 1957 H. Holman y Henry Kunkel del Rockefeller Institute for Medical Research de Nueva York demostraron la afinidad del factor sérico al núcleo celular a una nucleoproteína o al ADN.
Descubrimiento crucial para el inicio y la utilidad del laboratorio inmunológico para el diagnóstico del lupus.
Inmunofluorescencia Indirecta
Con los estudios de Coons, Godman , Holman y Kunkel, desarrollaron el fundamento de la inmunofluorescencia que George Friou (1957) establece las bases sólidas para el diagnóstico del lupus en el laboratorio, desarrollando la técnica de IFI para FAN en forma semicuantitativa.
Banda Lúpica Burham, Neblett y Fine en 1963 en el departamento de dermatología del Hospital Henry Ford en Detroit demuestran los depósitos de inmunoglobulinas y complemento a nivel de la unión dermo-epidérmica.
Eng Tan. Describió el anti‐Sm en los pacientes con lupus, en 1966
Pintura de Stephanie Smith, paciente a la cual debe el nombre el anticuerpo anti‐Sm.
“Los anticuerpos son los reporteros del sistema inmunitario que permiten al organismo detectar la presencia de autoantígenos inmunogénicos”
SUSTRATOS UTILIZADOS EN LA INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA PARA LA INVESTIGACION DE ANTICUERPOS ANTI-NUCEOCITOPLASMÁTICOS
Cortes criostáticos de hígado de roedores. Cultivos celulares (HEp-2, Wil-2, HeLa).
Patrones por IFI, sustrato Hígado de roedor
Patrones descriptos en HEp-2 Homogéneo Periférico Moteado Nucleolar
Número de patrones acumulados identificados en HEp-2 desde 1957
Patrones descriptos en HEp-2 Nuclear ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾
Homogé Homogéneo Granular Grueso Granular Fino Granular Fino Denso Granular Pleomó Pleomórfico Granular Mú Múltiple Granular Escaso Perifé Periférico Lineal Perifé Periférico Granular
Nucleolares ¾ ¾ ¾
Homogé Homogéneo Granular Aglomerado
Citoplasmáticos ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾
Granular grueso Granular reticular Granular fino denso Granular con puntos aislados Fibrilar lineal Fibrilar filamentar Fibrilar segmentar
Aparato mitótico ¾ ¾ ¾ ¾ ¾
NuMANuMA-1 NuMANuMA-2 Centrí Centríolo Cuerpo medio CENPCENP-F (MSA(MSA-3)
Patrón citoplasmático RR (rings – rods)
Carlos von Mühlen y Eduart Chan
SUSTRATO LINEA CELULAR HEp-2 VENTAJAS
Expresión de antígenos humanos : especificidad Elevada concentración de Ag: sensibilidad Células en todos los estadíos del ciclo celular Relación núcleo-citoplasma en favor del núcleo Presencia de varios nucléolos Citoplasma rico en fibrillas y organelas
REQUISITOS DE CALIDAD PARA IMPRONTAS HEp2
Número de células por campo adecuado, cercano al 100 % de confluencia
Presencia de células mitóticas: 10% Relación núcleo/citoplasma cercana a 1 Núcleo con nucléolos bien diferenciados. Evaluar la presencia de Ag SSA/Ro
Conjugado fluorescente Consideraciones Conjugado anti-Ig G específico o anti-Ig GAM polivalente?
En el LES el 96% de los pacientes producen anticuerpos de clase Ig G (N Engl J Med 1966;274:1333–1338) los anticuerpos de clase Ig M están asociados a AR, drogas y a la edad y tiene menor significancia diagnóstica (Med Clin North Am
1985;69:547–563)
Consideraciones en la elección del conjugado
Evitar la gamma lista para usar. Cc proteica: Razón Ac esp/Pr > 0,1 Razón F/P debe estar entre 2,5 – 4,0 Anticuerpo específico: 30– 60 μg/ml Dilución de trabajo: determinada por la titulación utilizando diluciones seriadas de sueros control negativo y positivo de patrón conocido.
TITULACION DEL CONJUGADO conjugado
1/50
1/100
1/200
rabajo: 30 Dilución de t gG/ml. a 60 μg de I
1/400
1/800
control
c+
c-
c+
c-
c+
c-
c+
c-
c+
c-
1/20
+
+
+
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+
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+
-
+
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1/40
+
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+
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1/80
+
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+
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+
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1/160
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1/320
+
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+
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1/640
+
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+
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+
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1/1280
+
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1/2560
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Título del suero de referencia positivo (control primario)= 1/640
Marcador
Criterios
Siembra:
Dilución de screening: En PBS Adultos:1/80-1/160 Niños:1/40
•Improntas sacarlas del envase inmediatamente antes de la siembra
Incubación 30’
•Sembrar cantidad suficiente de controles y muestras para cubrir cada pocillo •Utilizar tips adecuados •No tocar el pocillo con el tip.
Incubación 30'
•Evitar corrientes de aire.
Anti-γ*
•Siembra cuidadosa según esquema Lavado: Evitar luz directa sobre preparados
Evitar secado de sustrato.
Lavado
•Eliminar exceso de proteínas no fijadas: lavado rápido con piseta o pipeta. • Dos lavados de 5-10 minutos con PBS.
Lavado
Montaje
(Azul de Evans) Líquido de montaje: pH alcalino(>8)
•Preferentemente con agitación suave. •Evitar volcar el buffer sobre los pocillo. Lectura: Cuarto oscuro. Concordancia de lectores. Doble ciego.
Fases de la mitosis Positivo
Negativo
Cultivo de células HEp-2
Debris
A
Principales regiones de las células HEp-2 a ser reconocidas por autoanticuerpos por inmunofluorescencia indirecta
Membrana nuclear Nucleoplasma Nucleolo Aparato mitótico Citoplasma
ANA propiamente dicho
En esta presentación todos los anticuerpos que reaccionan con estructuras de la células HEp-2 son denominadas ANA Anticuerpos que muy probablemente no sean reconocidos por un ensayo de fase sólida
Ac Anti-Histonas o Anti-dsDNA
MITOSIS
Ac. Anticentroméricos
Anti-centríolos
Anti-lámina nuclear
Anti-huso mitótico (NuMA 2)
Anti-huso mitótico (NuMA 1)
Anti-Sm/RNP
Anti-SSA/Ro Anti-SSB/La
Armonización de la determinación
Título del informe . Estandarización de la determinación. Nombre de los patrones. Utilización de controles: primarios o secundarios. Participación de programas de evaluación externa de la calidad. Tipo de informe.
Armonización Primer Consenso Argentino de Patrones de Anticuerpos anti-Nucleares – HEp-2 - noviembre de 2008
OPCIÓN CONSENSUADA DEL INFORME Anticuerpos anti-Nucleocitoplasmáticos (FAN/ANA)
Positivo 1:320 Homogéneo Positivo 1:640 Reticular (tipo mitocondrial) Negativo Se sugiere la determinación de anticuerpos anti-M2.
Primer Consenso HEp-2
Nuclear
– Periférico
Lineal Granular
Fino Fino Denso Grueso Grueso tipo matriz
– Pleomórfico – Puntos aislados – Centromérico
Nucleolar
– Homogéneo – Moteado – Aglomerado
– Reticular – Granular
– Homogéneo – Moteado
Citoplasmático Escaso Fino Fino Denso
– Granular Polar – Fibrilar
Lineal Filamental Segmental
Aparato Mitótico – Centríolo – Huso Mitótico
NuMA1 (MSA1) NuMA2
– Cuerpo Medio (MSA2)
Patrón Nuclear Periférico perinuclear en interface y telofase, placa metafásica negativa, con fluorescencia difusa en el citoplasma.
Lineal LES, Sjs, Poliartritis seronegativa, Hepatitis autoinmune con vasculitis cerebral o cutanea
Granular
CBP
gp210 componente de la membrana interna nuclear, laminina (proteína A de 70 KD, B de 68 KD y C de 60 KD), LAP 1, LAP 2, p58
Patrón Nuclear Homogéneo nuclear homogéneo en interface, telofase y metafase, nucléolos positivos o negativos.
DNA, nucleosomas, cromatina o proteínas relacionadas con DNA (histonas).
LES (>90% LES en actividad) (criterio diagnóstico), LES inducido por drogas, artritis crónica juvenil, hepatopatías, etc.
Anticuerpos anti-dsDNA Método: Inmunofluorescencia Indirecta Peter J. B., Shoenfeld Y. (1996). Sustrato: Crithidia luciliae Arbuckle,M.R.Elsevier and col. Scand. J. Autoantibodies. Science B.V. Amsterdam, Netherlands Immunol. The 54, 211-219, 2001
60 al 80 % de pacientes con LES (elevada sensibilidad) Marcador serológico (elevada especificidad). Marcador precoz. Criterio diagnóstico. Patogenicidad. Monitoreo.
Núcleo
Quinetoplasto
Patrón Nuclear Moteado Grueso motas de tamaños diversos en células en interface, placa metafásica negativa con o sin gránulos citoplasmáticos que la rodean. LES EMTC
Sm (D), U1snRNP (asociado a: Sm B/B´, D y E) (Splaisosoma)
EMTC
Matriz nuclear
hnRNP (gránulos de intercromatina)
Patrón Nuclear Moteado Fino
motas finas de distribución uniforme, nucléolos positivos (SSB/La) o negativos. Metafases negativos con citoplasmas moteado fino condensado alrededor de la placa metafásica.
SSj, LES, LES neonatal, miositis, esclerosis sistémica, hepatopatías autoinmunes.
SSA/Ro (52/60) SSB/La Mi-2.
HEp2000
Anti-Ro52/TRIM21 Sistema antigénico distinto al Ro60 •Codificado en el brazo corto del cromosoma 11. •Pertenece a una familia de proteínas RING/Bbox/coiledcoil (RBCC) tripartite motif protein (TRIM) y como una ubiquitina ligasa que es sobre expresada en células mononucleares de sangre perisférica. •
P. Ghillani et al. Autoimmunity Reviews 10 (2011) 509-513
Aparición de auto-anticuerpos previo al diagnóstico
N Engl J Med 2003;349:1526-33.
Patrón Nuclear Moteado Fino Denso (ANTI-LEDGF)
Descripción: moteado fino denso sin nucleolos, placas metafásicas positivas. Antígeno: factor de crecimiento derivado del cristalino (LEDGF). Asociación clínica: individuos normales.
Patrón Nuclear moteado fino (tipo Scl-70) Nucleoplasma granular fino a homogéneo con nucléolos en interface positivos, placa metafásica positiva.
Topoisomerasa I
Esclerodermia Síndrome de Raynaud Polimiositis o sindrome de superposición PM/Esclerodermia
Patrón Nuclear Centromérico:
Nucleoplasma moteado discreto, las motas tienden al apareamiento, metafase moteada, nucléolos no visibles. No hay razón para utilizar otro método confirmatorio
CREST CBP Fenómeno de Raynaud Telangiectasas
Proteínas centroméricas A (16 kd) B (80 kd) y C (140 kd). Ag localizado en el interior de las láminas del quinetocoro.
¾
Análisis de ANA en relación a la evolución de los pacientes que en la biopsia hepática inicial se encontraban en el estadío temprano de la enfermedad.
M Nakamura. Hepatology Research 2007;37:S412-s419
Patrón Nuclear Moteado Múltiple
Nucleoplasma con puntos fluorescentes brillantes y dispersos, no se distingue el nucléolo, metafases negativas. Sp100 sp140
p80 coilina
CBP Enfermedades reumáticas inmuno-inflamatorias Sjögren primario LES SSc Sind Raynaud
Patrón Nuclear Pleomórfico (PCNA)
los núcleo de células en proliferación (fase S) se tiñen en forma pleomórfica (de moteado fino a grueso), núcleos de células en fase G (G0 o G1) y placa metafásica negativos.
proteína auxiliar de la DNA polimerasa δ, de 34 kDa
3% de pacientes con LES
generalmente acompañado con otros patrones, homogéneo o nucleolar.
Patrón Nucleolar Homogéneo Coloración fluorescente difusa de los nucléolos, metafase negativa
Fosfoproteína de 37 kDa B23 Fosfoproteína nucleolina 110 kDa Complejos proteico PM/Scl Proteínas asociadas a RNA Th/7-2, To/8-2 del complejo RNasa MRP/RNasa P Sindrome de Raynaud, SSc. LES y otras enf reumáticas sistémicas
Patrón Nucleolar Aglomerado (anti-Fibrilarina) Fluorescencia nucleolar muy homogénea y grumosa (en agrupamientos) (clumpy) Células en estadios de metafase y telofase con coloración amorfa característica.
Proteína básica de 84 kDa componente del U3snRNP
Esclerosis Sistémica (negros) Hipertención pulmonar
Patrón Nucleolar Moteado Nucleolar moteado en células en interface, en placa metafásica 1 a 3 puntos fluorescentes vistos como cuerpos cromatínicos correspondientes a las regiones de organización nucleolar (NOR)
NOR 90 Complejo RNA Pol I, RNA Pol III y RNA Pol II
Esclerodermia (LES, LES juvenil Sind de Sjögren Fenómeno de Raynaud)
Gráfica de supervivencia de pacientes con Esclerodermia Curso benigno
Hipertensión pulmonar Fibrosis intersticial pulmonar Afecciones cardíacas y renales
M. Kuwana. Art & Rheum. 1994;37:75-83
Anticuerpos anti-huso mitótico NuMA1
NuMA2
Centrofilina (240 kDa)
Proteína HsEg5
LES SSc
?
Sindrome de Sjögren Raro en LES y SSc Infecciones por micoplasma
Centro de organización del microtubulo Pericentrina, CEp250, α y γ enolasa
SSc, Sind de Ry, inf por micoplasmas
MSA-2 (Mitotic Spindle Antigen 2)
SSc Fenómeno de Ry
Patrones Citoplasmáticos Sindromes anti-sintetasas:
Jo1 PL7 PL12
EEA1 Fosfatidil serina GWB
Sjögren primario (GWB)
LES Neuropsiquiátrico nefritis
SjS, LES, RA, sindromes de superposición
Ribosomal P P0, P1, P2 Golgina Macrogolgina
Patrones Citoplasmáticos CBP M2 M4, M8 y M9
HCA – tipo I
Actina F (46 kDa)
Especificidad de ANA
Conclusiones • El médico debe solicitar la determinación de AAN sólo si el paciente presenta clínica compatible con una enfermedad autoinmune inflamatoria. • Solicitar ENA aún si el AAN es negativo cuando persistan los síntomas y signos clínicos compatibles con enfermedad autoinmune inflamatoria. • Para la correcta interpretación de una AAN se debe tener en cuenta el título y el patrón. • No siempre un AAN positivo es acompañado por una prueba para anticuerpos específicos positivos.
¿Hacemos un buen uso del ANA/Hep-2?
¿Cómo y que hacer para mejorar la técnica? ¿Es posible mejorar la utilidad clínica? ¿Las nuevas tecnologías ayudan a los diagnósticos? ¿Cuáles son los problemas reales de la economía de la salud: El dinero gastado en el momento del diagnóstico. Costos relacionados con la evolución a largo plazo. Es necesario llegar a un acuerdo entre los médicos y de bioquímicos para encontrar soluciones correctas.!
¿Por qué usar la técnica de ANA/HEp-2 por IFI?
Solamente las células permeables intactas contienen los autoantígenos in situ en el real estado conformacional. (“El chip multiparamétrico ideal”) La mezcla de autoantígenos sobre fase sólida (ELISA, beads, arrays, etc) son muchas veces incapaces de ser reconocidos por los ANA. Un resultado de screening por técnicas automatizadas negativo puede no ser verdadero ( ) Un resultado de ELISA positivo/IFI negativo, por el momento, tiene un dudoso significado clínico. El reconocimiento visual morfológico de los patrones utilizando un sustrato de elección en un talento natural de muchos bioquímicos. (Alan Wiik).
Conclusiones
Los ANA probablemente reflejan los mecanismos de lesión tisular, las influencias genéticas, microambientales y tal vez la etiología. Los ANA están relacionados con el diagnóstico, subsíndrome, manifestaciones clínicas y el pronóstico. Pueden ayudar a la planificación del seguimiento y la terapia. Son de particular valor en las formas tempranas de la enfermedad. Deben ser revelados por IFI/HEp-2. La utilización óptima de los resultados de ANA dependen de una estrecha colaboración médico – bioquímico. Las plataformas modernas de pruebas para ANA pueden ser más fáciles de implementar pero, no mejores! Es necesario organizar reuniones de armonización y estandarización de técnica, informes, nombres de patrones, etc.
Laboratorio de Inmunología
Viviana Novoa Neri Nuñez Mirta Cervellini
Fernanda Ingénito Hernán Coraggio
Área de Inmunología
Leticia Yamamoto Paula Saporiti
Graciela Ramos Romina Guevara Natalia Caba Gabriela Díaz
Muchas Gracias