k

˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

19

k kInt. Cl. : A01H 1/04

11 N´ umero de publicaci´on: 6

51

˜ ESPANA

k

2 132 583

A23L 1/221

TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

12

kN´umero de solicitud europea: 95810790.6 kFecha de presentaci´on : 13.12.95 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 717 925 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 26.06.96

T3

86 86 87 87

k

54 T´ıtulo: Materia vegetal seca obtenida de especias con un alto contenido de antioxidantes y aceites

esenciales.

k

73 Titular/es:

k

72 Inventor/es: Aeschbach, Robert y

k

74 Agente: Isern Jara, Jorge

30 Prioridad: 20.12.94 FR 94 15343

SOCIETE DES PRODUITS NESTLE S.A. Case Postale 353 1800 Vevey, CH

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.08.99

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 132 583 T3

16.08.99

Aviso:

k k

Masseret, Bernard

k

En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 132 583 T3 DESCRIPCION Materia vegetal seca obtenida de especias con un alto contenido de antioxidantes y aceites esenciales. 5

10

15

La presente invenci´on se refiere a una materia vegetal secada de plantones de especias, especialmente de salvia o de romero, que presenta simult´ aneamente un contenido elevado en antioxidantes y en aceite vol´atil, y a su utilizaci´on como materia prima, a la vez para la obtenci´ on de antioxidantes especialmente para aditivos alimenticios y tambi´en como fuente de aceite vol´atil para la perfumer´ıa. El conocimiento y el empleo de las especias se remonta a los per´ıodos m´ as antiguos de nuestra civilizaci´on; no s´ olo por su utilizaci´on como plantas arom´ aticas y de condimentos o por sus propiedades medicamentosas, pero tambi´en por su funci´ on pr´ actica importante para la preservaci´on de los alimentos; este efecto es debido no solamente a un efecto de disimulaci´on de los olores que resultan de la deterioraci´on del alimento, sino sobre todo a una acci´ on protectora antooxidante y muy especialmente un efecto bactericida y bacteriost´atico que permite aplazar la deterioraci´on de los alimentos por los mocroorganismos; este efecto ha sido descrito por Pruthi (1980)(1)y Shelef (1983)(2). Los n´ umeros entre par´entesis remiten a las referencias bibliogr´ aficas al final de la descripci´ on.

20

25

30

35

40

45

50

La puesta en evidencia de las propiedades antioxidantes de ciertas especias se remontan a unos cuarenta a˜ nos, cuando JR Chipault (1952, 1955, 1956) (3,4,5) empez´ o el estudio de dichas especias. Los trabajos de Chipault han vuelto ha suscitar inter´es hace unos veinte a˜ nos, cuando unas dudas, confirmadas despu´es, se emitieron sobre la innocuidad del butil-hidroxi-tolueno (BHT), antioxidante de s´ıntesis muy o´ptimo y ampliamente utilizado con el butil-hidroxi-anisol (BHA) para la protecci´on de los alimentos. El inter´es para la funci´ on antioxidante de ciertas especias se ha desarrollado hace poco, con el entusiasmo de los consumidores occidentales para los productos alimenticios naturales, y varias oleorresinas de especias, especialmente el romero, se proponen actualmente en el mercado para prevenir la oxidaci´on de los alimentos. Entre estas especias y hierbas arom´aticas que tienen una actividad antioxidante, la salvia y el romero est´an entre los m´as prometedores. Su poder antioxidante es debido a la presencia en estas plantas de compuestos tales como el ´acido carn´ osico y el a´cido rosmar´ınico, que act´ uan en sinerg´ıa con un conjunto de flavonoides seg´ un unos mecanismos complejos que no han sido completamente elucidados. Durante los quince u ´ltimos a˜ nos, varios tipos de oleorresinas, de romero se han puesto a punto, ofrecidos en el mercado y utilizados por la industria alimenticia. Su actividad antioxidante en las materias grasas y los productos alimenticios ha sido demostrada. Estas oleorresinas se utilizan generalmente con una dosificaci´ on de 500 ppm calculada sobre la materia grasa de los alimentos, dosificaci´on pr´ oxima a la de las materias aromatizantes naturales y empleadas para mejorar la apetencia de los productos alimenticios. Diferentes procedimientos se han propuesto para extraer la oleorresina de las especias y muy especialmente del romero. La extracci´on puede realizarse en varias etapas utilizando unos disolventes polares o no, as´ı como sus mezclas: aceite vegetale o grasa animal (6), el hexano, el benceno, el ´eter et´ılico, el cloroformo, el dicloruro de etileno, el dioxano o el metanol (7,8), el etanol o el benceno (9), el hexano o el etanol (10,11), el Co2 supercr´ıtico(12, 13, 14); se pueden citar igualmente la patente EP 307 626 y la solicitud de patente EP 507 064. El conjunto del estado de la t´ecnica descrito en estas solicitudes de patente y en los art´ıculos arriba mencionados est´a incorporado aqu´ı por referencia, en particular por lo que se refiere a los procedimientos de extracci´on de los antioxidantes de las plantas, procedimientos que pueden aplicarse tambi´en a los plantones de la invenci´on. La extracci´on se acompa˜ na a menudo de una desodorizaci´on y/o de una decoloraci´ on de la oleorresina: ciertos tratamientos permiten tratar la oleorresina para eliminar los insolubles en los cuerpos grasos (patente US 4.877.635, patente EP 0.009.661 y referencias 14, 15, 16).

55

60

Aeschbach (Patentes Europeas 0.307.626 y 0.507.064) ha desarrollado unos procedimientos para obtener unos extractos antioxidantes de romero o de salvia en forma de polvo o de l´ıquido transl´ ucido. Estos extractos son ricos en antioxidantes, muy especialmente en ´acido carn´ osico y carnosol, los dos oxidantes principales del romero y de la salvia. El a´cido carn´ osico ha sido aislado e identificado por Aeschbach et Philipposian (Solicitud de Patente Europeo EP 0.480.077). La oxidaci´ on del a´cido carn´ osico conduce al carnosol que, ´el mismo, es dotado de propiedades antioxidantes; la presencia de un grupo isopropilo en estos dos compuestos juega un papel importante en la estabilizaci´on de los radicales formados durante la oxidaci´on. 2

ES 2 132 583 T3

Aeschbach (17) a puesto en evidencia la existencia de 13 heter´osidos en el romero, contribuyendo de modo menor (sinergismo), como el a´cido rosmar´ınico, al efecto antioxidante. 5

10

Varios trabajos han sido publicados sobre el efecto antioxidante de las oleorresinas de romero en los alimentos (8, 14, 15). En los tres casos y aunque las oleorresinas utilizadas sean de origen diferente ejercitan en los sistemas estudiados un efecto protector similar al aportado por el BHT solo o con el BHA y el galato de propilo, utiliz´ andose, sin embargo, estos u ´ltimos en dosis m´ as baja. La calidad de las oleorresinas obtenidas y muy concretamente su efecto antioxidante depender´ a no solamente de los par´ ametros de extracci´on (tipo de disolvente, temperatura, duraci´ on) sino tambi´en de la calidad del vegetal puesto en pr´ actica, de su origen, de las condiciones clim´ aticas, de las condiciones de cultivo y de cosecha as´ı como lo indica el estudio de Granger (18) sobre la esencia de romero. En este contexto, los plantones de romero o de salvia utilizados habitualmente tienen una aplicaci´ on orientada hacia la extracci´ on de los aceites vol´atiles.

15

As´ı las materias vegetales obtenidas despu´es de una destilaci´ on acuosa para obtener el aceite vol´atil tienen una composici´ on en antioxidantes eminentemente variable haci´endolas impropias para una utilizaci´on industrial como materias primas para la obtenci´ on de antioxidantes o especias utilizables a t´ıtulo de aditivos alimenticios, y siempre se han echado. 20

Resumen de la invenci´ on

25

La invenci´on resulta del descubrimiento seg´ un el cual se pod´ıa obtener, a partir de ciertas especias, una materia vegetal teniendo a la vez unos contenidos elevados y estables en antioxidantes y en aceites vol´atiles. La obtenci´on de plantones de dichas especias, y de materias vegetales obtenidas de dichos plantones ofrece un nuevo inter´es econ´omico que es su valorizaci´on a la vez en la industria agro-alimenticia y en la perfumer´ıa.

30

Ninguna selecci´on de especias, en lo que se refiere a su contenido en antioxidantes, jam´as ha sido efectuada y las populaciones naturales de plantas que les contienen presentan una gran variabilidad en cuanto a este contenido y la actividad antioxidante asociada. 35

40

45

50

55

60

En el objetivo de obtenci´ on de los plantones que presentan la caracter´ıstica de un alto contenido en antioxidante, era en un primer tiempo importante saber si tal caracter´ıstica era ligada o no a su contenido en aceite vol´atil. Para efectuar la clasificaci´ on de plantones de romero presentando las caracter´ısticas requeridas, era preciso poner a punto previamente una metodolog´ıa. Esta consiste en un primer tiempo a seleccionar una colecci´on de plantones de romero presentando unos genotipos diferentes, despu´es efectuar una propagaci´ on vegetativa de cada uno de los plantones recolectados y esto, en campo, a raz´on de cinco replicas de cinco plantones por genotipo sea 25 plantones por genotipo. En el presente texto se utilizar´ an indistintamente los t´erminos de genotipo, o de clon para designar unos individuos id´enticos geneticamente y propagados por v´ıa vegetativa. El plant´ on se define como la planta seleccionada antes de su colocaci´on en tierra, en otras palabras un plant´ on dado corresponde necesariamente a un clon dado; en cambio a un clon pueden corresponderle varios plantones; este conjunto de plantones geneticamente id´enticos se define como un criadero. Materia vegetal significa cualquier materia prima obtenida de un plant´ on o de un criadero destinada a ser transformada para extraer una substancia; en el caso de la presente invenci´ on, puede tratarse de la planta entera seca o de hojas secadas. En la metodolog´ıa de clasificaci´on de los clones que responden a los criterios elegidos, es preciso utilizar varios lugares de ensayos en campos con la misma colecci´on seleccionada al inicio, haci´endose los an´ alisis de las muestras recolectadas despu´es en paralelo y a ciegas. El otro par´ ametro esencial de la metodolog´ıa de clasificaci´on es la definici´on de un procedimiento de extracci´on y o de purificaci´ on com´ un para todos los laboratorios trabajando en el proyecto y para los diferentes lugares de ensayos en campos. Un tercer par´ ametro esencial en la presente metedolog´ıa es la puesta a punto de procedimientos 3

ES 2 132 583 T3

5

10

15

20

25

anal´ıticos comunes y la evaluaci´ on de la desviaci´on standard obtenida a partir de la cosecha de los 25 plantones de los clones considerados: la metodolog´ıa implica finalmente la puesta en evidencia de eventuales modificaciones fisiol´ ogicas en funci´ on sea del ritmo diario sea del ritmo mensual; es evidente que el ritmo estacional conduce a unas modificaciones concretamente en el contenido en aceite vol´ atil, estando la producci´ on m´ as importante durante los meses de verano (de calor) que en los meses de invierno. Despu´es de haber calculado la desviaci´on estandar de los par´ametros que son: el contenido en aceite vil´atil sea despu´es de decantaci´ on sea despu´es extracci´on, el tiempo de inducci´ on del extracto etan´ olico medido por el test Rancimat (19, 20), el contenido en carnosol, en a´cido carn´ osico, en verbenona as´ı como su rendimiento de extracci´ on respectivo, cada par´ ametro est´ a medido y los diferentes criaderos procediendo de una colecci´ on de 44 clones de cultivos efectuados en dos lugares diferentes, en Francia (Francereco) o en Espa˜ na (Hispareco) han sido clasificados respecto a estos diferentes par´ ametros y los resultados son los siguientes: 1) las variaciones diarias del contenido en aceite vol´atil, as´ı como en carnosol + ´acido carn´ osico (antioxidantes) son insignificantes cualquiera que sea el lugar de cultivo. A pesar de todo para mejor homogeneizaci´on todas las cosechas se hacen a principio de la tarde; 2) en lo que se refiere a las variaciones bimensuales en aceite vol´atil y en a´cido carn´ osico + carnosol (antioxidantes) se ha observado una buena estabilidad entre agosto y octubre en Francia y entre julio y septiembre en Espa˜ na. Unos ejemplos y curvas detallados se presentan m´ as abajo de los cuales se puede concluir que el mejor per´ıodo de cosecha es el mes de agosto en Espa˜ na y el mes de septiembre u octubre en Francia. La figura 1 es un esquema representando el procedimiento de destilaci´on por vapor de agua de los clones de romero para obtener el aceite vol´atil por una parte y los residuos de romero por otra parte. Los residuos obtenidos despu´es de destilaci´on acuosa de la materia vegetal se llaman “drˆeche”, y se tratan luego para extraer los antioxidantes, como esquematizado en la figura 2.

30

35

40

45

50

55

60

El conjunto del procedimiento de selecci´ on de criaderos de romero por la metodolog´ıa descrita m´as arriba as´ı como las diferentes etapas de dicho procedimiento forman parte de la invenci´on, el objetivo del trabajo mencionado al principio es obtener una materia prima que sirva para la industria y permita extraer unos antioxidantes utilizables especialmente en agro-alimenticio; si, adem´ as, el contenido en aceite vol´atil es relativamente importante, la materia prima puede entonces por una clase de “cracking” utilizarse a la vez en la industria de la perfumer´ıa y la industria agro-alimenticia. Gracias a los diferentes par´ametros calibrados de la manera descrita m´ as arriba, se han podido seleccionar unos plantones de especias, caracterizados porque la materia vegetal que se obtiene de ellos presenta simult´aneamente un contenido elevado en antioxidantes y en aceite vol´ atil. Esta materia vegetal, objeto de la invenci´ on, es adem´as caracterizada por su contenido en antioxidantes que es superior a 1 % en peso del vegetal fresco o superior a 3,5 % en peso de materias secas, y por su contenido en aceite vol´atil que es superior a 0,3 % en peso sobre vegetal fresco o superior a 1,5 % en peso de materias secas. Los plantones de especias tienendo estas caracter´ısticas dorman parte de la invenci´ on. El romero y la salvia son dos especias particularmente propicias a la obtenci´ on de la materia vegetal de la invenci´on. La descripci´on detallada a continuaci´ on pone en evidencia que dos clones de romero son particularmente interesantes de este punto de vista: los clones 28 y 39. Los contenidos en aceite vol´atil (EO) y en antioxidantes (AO) en la materia vegetal permite calcular la cantidad total de EO y AO que pueden obtenerse por plant´ on (EOP y AOP) sea el producto: contenido (en porcentaje) x por materia seca (gramo por plant´ on). Las plantaciones de especias y especialmente de romero presentan un rendimiento por hect´ area eminentemente variable especialmente para lo que se refiere al rendimiento en peso de hojas secadas, fuente tanto de los antioxidantes como del aceite vol´atil. Los plantones de romero de la invenci´ on, seleccionado por la metodolog´ıa de la invenci´on presentan el inter´es de tener un rendimiento por hect´ area superior a 7000 Kg/Ha, permitiendo obtener un rendimiento por hect´ area de antioxidantes de por lo menos 270 Kg/Ha y un rendimiento por hect´ area de aceite vol´atil de por lo menos 120 Kg/Ha. Los plantones de romero de la invenci´ on, seleccionados por la metodolog´ıa arriba descrita, presentan una variaci´ on diaria o bimensual de su contenido en antioxidantes y/o en aceites vol´ atiles inferior a 20 %. Los clones as´ı seleccionados pueden caracterizarse en el plan molecular por una huella molecular (finger print) la t´ecnica utilizada es la descrita en (22) y despu´es en el ejemplo sobre las huellas moleculares. 4

ES 2 132 583 T3

5

10

15

20

La presente invenci´on se refiere tambi´en a la utilizaci´on de la materia vegetal secada de los plantones de especias seg´ un la reivindicaci´ on 4. La utilizaci´ on de estos plantones de romero permite adem´ as, por una destilaci´ on acuosa de las hojas secadas la obtenci´ on del aceite vil´atil utilizable en perfumer´ıa de manera muy ventajosa en la medida en que su porcentaje es igual o superior al porcentaje de las plantas silvestres habitualmente utilizadas en perfumer´ıa. La metodolog´ıa utilizada se ha aplicado de manera sistem´atica sobre unos plantones de romero y descrita a continuaci´ on. La transposici´ on a otros tipos de especias especialmente la salvia, el tomillo, el oregano o el clavo es f´ acilmente traspasable por el especialista, conoci´endose los diferentes procedimientos de extracci´on utilizables (6 a 13). La selecci´on de los nuevos plantones de romero seg´ un un criterio antioxidante definido m´as arriba permite adem´as la obtenci´ on de plantones que presentan una DHS (diferencia, homogeneidad, estabilidad) que permite, por multiplicaci´ on vegetativa, de tener una materia prima constante y variable pues, con fines de utilizaci´ on industrial. En la presente descripci´ on, la metodolog´ıa empleada para la selecci´on de los clones de especias presentando las caracter´ısticas deseadas y los ejemplos dados de esta metodolog´ıa est´an presentados para unos plantones de romero. Est´ a claro que a partir del momento en que se buscan unas especias que presentan a la vez las caracter´ısticas de ser una materia prima para unos aditivos alimenticios y para la obtenci´on de aceites vol´atiles utilizables en perfumer´ıa, la metodolog´ıa observada y descrita en detalle mas abajo puede transponerse para la obtenci´ on de nuevos clones presentando estas caracter´ısticas ; por esto todo lo que en este texto es relativo al romero, puede aplicarse igualmente a otros tipos de plantas arom´ aticas.

25

Descripci´ on detallada de la invenci´ on

30

La descripci´on detallada m´ as abajo y las figuras que la acompa˜ nan ponen en evidencia la metodolog´ıa utilizada en el procedimiento de selecci´on de clones que tienen a la vez un alto contenido en aceite vol´ atil y en antioxidantes, y las caracter´ısticas de estas plantas seleccionadas. En un primer tiempo los detalles sobre las diferentes etapas del procedimiento especialmente: la metodolog´ıa de clasificaci´on, la realizaci´on de los ensayos en los campos, el m´etodo de destilaci´on, los procedimientos anal´ıticos, los resultados de dosificaci´on en aceite vol´atil obtenidos en los clones seleccionados as´ı como unas dosificaciones en antioxidantes, finalmente los rendimientos por hect´ area obtenidos tanto para el aceite vol´ atil como para los antioxidantes han sido calculados.

35

Las leyendas de las figuras citadas m´ as abajo son las siguientes:

40

La figura 1 es un ejemplo de esquema que muestra el “cracking” o la destilaci´on del romero conduciendo a la obtenci´ on del aceite vol´atil por una parte por destilaci´ on acuosa y de residuos de romero llamados “drˆeches”. La figura 2 describe el procedimiento de obtenci´ on de un extracto de antioxidante a partir de las “drˆeches”(residuos). RE-S significa el extracto sec.

45

La figura 3 representa las variaciones diarias del contenido en EO y AO de dos clones cogidos al hazard: los clones 28 y 30. HE = aceites vol´atiles (equivalente a EO)

50

AO = antioxidantes. La figura 4 representa las variaciones bimensuales en EO (HE) y en AO en funci´ on de la fecha de cosecha;

55

La figura 4a muestra los resultados obtenido en Francia (Francereco) y la figura 4b los obtenidos en Espa˜ na (Hispareco). La figura 5 representa el contenido en aceite vil´atil de los 44 clones expresados en porcentaje de peso (en g por 100 gr) de materia seca, obtenidos en Espa˜ na y (EOH) y en Francia (EOF).

60

La figura 6 representa el contenido en antioxidantes, en g por 100 gr de materia seca, en Francia (AOF) y en Espa˜ na (AOH) para los 44 clones analizados. 5

ES 2 132 583 T3

La figura 7 representa la evaluaci´ on del contenido en aceite vol´atil de 44 clones sometidos a un test, expresados sea en porcentaje de materias secas, sea en gramo por planta. 5

La figura 8 representa la evaluaci´ on del contenido en antioxidantes de estos mismos clones, expresados sea en porcentaje de materias secas, sea en gramo por planta. 1) M´ etodos y procedimientos

10

1.1. Metodolog´ıa de clasificaci´ on Hasta ahora los plantones de romero no han sido considerados en cuanto a su actividad antioxidante. Esto significa que en la populaci´ on natural este criterio es eminentemente variable por lo tanto la metodolog´ıa utilizada ha sido:

15

- realizar una prospecci´on bot´ anica, - realizar una propagaci´ on vegetativa de cada uno de los plantones recolectados, 20

- realizar una clasificaci´on de la colecci´on de clones por un ensayo “randomis´e” (ensayo en el cual se introduce un elemento aleatorio en el calculo) en dos lugares distintos.

25

Previamente a estos ensayos, es preciso definir un procedimiento de destilaci´on y de extracci´ on com´ un para todos los lugares de experimentaci´ on, luego evaluar la desviaci´on con relaci´on al standard de los procedimientos anal´ıticos puesto a punto, y poner en evidencia, si existe, un efecto posible del per´ıodo de cosecha sea en un d´ıa dado sea en un mes dado, y finalmente una evaluaci´ on de un efecto posible de la fecha de cosecha durante la estaci´on de crecimiento activo.

30

Con vistas a limitar el n´ umero de an´ alisis, se ha recogido una muestra de cada clon replicado en el seno del criadero y se les ha mezclado antes del an´alisis. Esto permite dividir por 5 el n´ umero de an´ alisis por clone. Esto permite observar el a˜ no siguiente cada replica de cada mejor clon seleccionado y de los 5 entre los peores tales como determinados durante el a˜ no anterior. 1.2. Ensayos en campos.

35

Se ha establecido una colecci´on de aproximadamente cien plantones de romero; un primer grupo de 44 genotipos ha sido agrupado.

40

Cada uno de estos genotipos ha sido despu´es propagado en campos; los ensayos “randomis´es” en campos incluyen 5 replicas de 5 plantones por genotipo lo que da 25 plantones por clon, el conjunto de estos 25 plantones representando un criadero. 1.3. Procedimientos de destilaci´ on y de extracci´ on.

45

Las figuras 1 y 2 son un ejemplo de procedimiento utilizado para la obtenci´ on del aceite vol´ atil y de los antioxidantes.

50

En la figura 2 los residuos de romero se extren dos veces al hexano (en proporci´ on 1:4) seguido de dos extracciones al etanol (1:4). El extracto al hexano se contralava con etanol 80 % (p/p) y la fase etan´ olica se a˜ nadide al extracto al etanol. Este extracto despu´es se descolora con 3 % de carb´on activo, concentrado, precipitado al agua, filtrado y secado. El procedimiento utilizado se describe en detalle en la patente EP 307 626 y en la solicitud de patente EP 507 064 cuando se desea obtener un extracto l´ıquido de antioxidante.

55

Otras variantes de extracci´ on de antioxidantes se describen igualmente en la solicitud de patente EP 480 077 e incorporadas aqu´ı por referencia.

60

Los procedimientos utilizados en los diferentes lugares de ensayos en campos son los mismos de un sitio a otro. Los residuos obtenidos despu´es de destilaci´on el polvo de romero y reextra´ıdo con dietileno; ulteriormente, esta segunda extracci´on fue suprimida por su inutilidad: se han obtenido muy pocos aceites vol´atiles por destilaci´ on al dietileno, la clasificaci´on de los clones era similar que sea u ´ nicamente por destilaci´on simple o por las dos destilaciones sucesivas, por consiguiente unas consideraciones sencillas de 6

ES 2 132 583 T3 mejora del rendimiento conducen a eliminar esta segunda destilaci´on.

5

Los aceites vol´atiles se obtienen por trituraci´ on de las partes terminales de tallos secados luego extracci´on por hidro-destilaci´ on a raz´ on de 15 ml/gr de polvo despu´es el aceite vol´atil se extrae por ´eter, se filtra despu´es de enfriamiento y se aclara con 50 ml de agua, seguido por dos extracciones en fase acuosa volumen a volumen con dietil´eter. 1.4 Procedimientos anal´ıticos

10

a) Evaluaci´ on de la actividad antioxidante La concentraci´on de los compuestos implicados en la actividad antioxidante se eval´ ua por unos an´ alisis realizados sobre un extracto etan´ olico del polvo bruto de romero.

15

La actividad antioxidante resulta esencialmente del ´acido carn´ osico y del carnosol; la cantidad de cada una de estas dos substancias en el extracto se eval´ ua por HPLC (21). La actividad antioxidante del extracto se mide por el m´etodo Rancimat (19,20) sobre una grasa de gallina.

20

Test Rancimat

25

30

un unos m´etodos publicados en Woestenburg (20). Una El test Rancimat se ha utilizado a 100◦C seg´ parte de extracto, correspondiendo a 500 ppm de materia seca, se ha a˜ nadido a una grasa de gallina desodorizada y se ha determinado el tiempo de inducci´ on de esta grasa “estabilizada”. La grasa de gallina desodorizada se ha preparado seg´ un un m´etodo publicado (19); se ha verificado que el etanol introducido en la grasa durante la preparaci´ on de las muestras no influencia los resultados obtenidos.Las medidas de Rancimat obtenidas sobre los 36 clones sometidos a prueba est´an resumidas en la tabla abajo, que adem´ as da los valores obtenidos para el contenido en a´cido carn´ osico + carnosol expresado en porcentaje de materia seca. TABLA 1

35

40

45

50

Clones

20 44 29 33 43 40 12 30 8 2 32 26 35 4 5

E.O.Decantados mg/100g DM

Rancimat (h)

253 356 536 770 781 794 796 1027 1040 1065 1142 1178 1186 1213 1265

17.2 22.5 19.8 24.5 19.8 22.3 20.6 24.2 31.1 38.3 25.6 32.5 29.1 39.1 36.0

55

60

7

´ Acido carnosico + Carnosol (Peso %) 0.85 1.06 2.26 2.01 1.76 1.85 2.09 1.7 1.75 2.46 1.79 2.57 2.46 2.75 2.90

ES 2 132 583 T3 TABLA 1 (continuaci´on) Clones 5

E.O.Decantados mg/100g DM

Rancimat (h)

´ Acido carnosico + Carnosol (Peso %)

41 9 21 25 10 31 13 22 42 28 37 38 19 24 34 23 14 17 27 18 39

1295 1355 1363 1482 1486 1745 1758 1833 1852 2002 2019 2084 2085 2196 2325 2335 2365 2383 2396 2397 2641

25.6 31.6 37.2 33.5 38.4 40.9 30.6 30.8 34.3 40.2 34.1 33.2 39.8 53.3 32.1 43.0 38.4 40.0 34.1 33.4 31.1

2.89 3.09 2.31 3.54 3.65 3.74 3.87 3.2 3.25 3.80 3.29 2.65 3.07 4.86 3.26 4.74 3.24 3.91 3.76 3.73 3.78

Valor medio

1522

32.1

2.82

SD

651

7.7

0.97

SD/Valor medio ( %)

43

24

34

10

15

20

25

30

35

40

Esta tabla deja ver claramente una correlaci´on entre la cantidad de aceite vol´ atil decantado y el valor Rancimat aunque existan variaciones. 45

SD significa “desviaci´ on standard”. Evaluaci´ on de carnosol y de a ´cido carn´ osico por HPLC.

50

Esta t´ecnica est´a bien conocida del especialista; un ejemplo de realizaci´on se describe en (21), y los resultados obtenidos se presentan en la table 1 arriba. b) An´ alisis de desviaci´ on standard de los diferentes par´ ametros.

55

La desviaci´on standard ha sido evaluada para los par´ ametros siguientes: - el contenido en materia seca del polvo, - el volumen y el peso de los aceites vol´atiles extra´ıdos por destilaci´ on vapor,

60

- el peso de aceites vol´atiles extra´ıdos de un residuo dietil´eter, - el test Rancimat, 8

ES 2 132 583 T3

- y la concentraci´on de algunos de los compuestos implicados en las actividades antioxidantes.

5

10

La tabla 2 abajo indica los valores medios obtenidos sobre los par´ametros, la desviaci´on standard y el porcentaje de la desviaci´on standard sobre el valor medio y esto para el porcentaje de materias secas, los aceites vol´atiles decantados expresados en ml por 100 gr de materia seca, los aceites vol´atiles extra´ıdos expresados em mg por 100 gr de materia seca, el test Rancimat realizado en Espa˜ na, el test Rancimat realizado en Francia y para lo que se refiere a los extractos de actividad antioxidante se miden el contenido en carnosol, el contenido en ´acido carn´ osico, la suma de los dos, la verbenona y el rendimiento (igualmente en porcentaje); en lo que se refiere a la actividad antioxidante, ES significa los valores obtenidos con los ensayos en Espa˜ na y (FR) significa los resultados obtenidos a partir de ensayos en Francia. TABLA 2

15

20

EO

Valor Medio

SD.

SD/val.medio ( %)

Materia seca % DEC EO ml/100g MS DEC EO mg/100g MS Rancimat Espa˜ na Rancimat Francia

91.1 0.39 374 13.18 23.20

0.27 0.046 33 3.30 6.06

0.29 11.79 8.82 25.10 26.12

Carnosol ES (FR) ´ Acido carn´ osico ES (FR) Suma AO: ES (FR) Verbenona ES (FR) Rendimiento( %) ES (FR)

0.574(0.433) 2.3522(3.71) 2.93 (4.14) 0.308 (0.173) 21.15 (14.89)

0.046(0.025) 0.133(0.0624) 0.123(0.051) 0.082(0.004) 0.453 (0.754)

8.18(6.10) 5.56(1.66) 4.23(1.23) 2.67(2.15) 2.14(5.07)

25

30

35

40

AO

El coeficiente de variaci´ on m´ as importante se observa para la evaluaci´on del Rancimat para la cual alcanza 25 %. Al contrario las medidas anal´ıticas obtenidas a partir de un extracto bruto, o sobre un compuesto definido presenta siempre un coeficiente de variaci´on inferior a 9 % excepto para el volumen de aceite vol´atil obtenido para 100 gr de materia seca que es de 11,8 %; este u ´ltimo par´ ametro no es probablemente tan fiable como los dem´ as dado las dificultades de medidas sobre un peque˜ no volumen; as´ı la medida del peso/peso m´ as bien que la de volume/peso es mucho m´as fiable y debe adoptarse. Estos resultados indican pues que los par´ ametros medidos y los procedimientos puestos en pr´actica son fiables y aptos a utilizarse en un proceso de selecci´on de clones de alto contenido en EO y en AO. 1.5. Variaciones clim´ aticas

45

A parte de las variaciones inherentes a los procedimientos anal´ıticos, es preciso estudiar las variaciones diarias por una parte y las variaciones bimensuales por otra parte. a) Evaluaci´ on de las variaciones diarias

50

55

Dos clones elegidos al azar (28, 30) han sido recogidos cada dos horas entre las 6 hores y las 18 horas en Francia y en Espa˜ na; los par´ ametros analizados han sido el contenido en aceite vol´atil destilado o extra´ıdo por una parte y en carnosol + a´cido carn´ osico por ora parte; la figura 3 representa los resultados obtenidos e indica que las variaciones diarias no son significativas y esto para ninguno de los par´ametros medidos. b) Evaluaci´ on de variaciones bimensuales

60

Se han recolectados los mismos clones cada dos semanas entre mediados de juin y el final del mes de octubre (en Francia) y entre mediados de julio y el final del mes de octubre en Espa˜ na. Se han utilizados los mismos par´ametros para evaluar una eventual variaci´ on. Las figuras 4a y 4b representan estas variaciones bi-mensuales. Resulta:

9

ES 2 132 583 T3

5

- unas variaciones importantes en el contenido en aceite vol´ atil seg´ un el per´ıodo de cosecha, este contenido es relativamente estable del final de agosto al final de octubre en Francia y del final de julio hasta el final de agosto en Espa˜ na;esto es perfectamente l´ogico teniendo en cuenta unas diferencias clim´aticas entre Francia y Espa˜ na. El contenido en actividad antioxidante es estable en el per´ıodo utilizado. Estos resultados indican que el per´ıodo de cosecha ´optimo es agosto en Espa˜ na, septiembre u octubre en Francia 2) Clasificaci´ on de los clones

10

Estando el conjunto de estos par´ ametros calibrado, la clasificaci´ on de los clones entre los 44 plantones estudiados ha podido realizarse sobre todos los genotipos. La figura 5 indica el contenido en aceite vol´ atil de los 44 clones expresado en porcentaje de peso (materia seca) obtenido en Espa˜ na y (EOH) y en Francia (EOF).

15

20

La figura 6 representa el contenido en antioxidantes en g por 100 gr de materia seca en Francia (AOF) y en Espa˜ na (AOH) para los 44 clones analizados. La figura 7 representa el contenido en aceite vol´ atil y la cantidad de aceite vol´ atil obtenida por planones (EOP) ; de manera paralela la figura 8 representa la proporci´ on en antioxidantes (en porcentaje) y el contenido de antioxidantes por planta (AOP). Se observa claramente en estas figuras que los dos par´ ametros no son correlativos y que algunos plantones pueden tener una fuerte proporci´ on en antioxidantes (figura 8) y en cambio presentar un contenido relativamente bajo (caso de los clones 1, 23 o 37 por ejemplo). En cambio, los clones interesantes seg´ un la invenci´ on son los que tienen a la vez una buena proporci´ on en antioxidantes y un contenido por planta elevado lo que se observa en los clones 28 y 39.

25

Del mismo modo se observa que no hay mucha correlaci´ on entre la proporci´on de aceite vol´ atil y el contenido por plantas; los clones 11,19, 27, 28, 34 y 39 son particularmente interesantes en cuanto al valor de los dos criterios reunidos. 30

Las conclusiones que se pueden sacar de la observaci´ on de las figuras 5 a 8 son las siguientes: Una gran variabilidad se observa en la colecci´on de los 44 clones en la medida en que el contenido en aceite vol´atil varia entre 253 a 3130 mg por 100 gr de materia seca para una cosecha en Francia en el mes de agosto. Esta varibilidad se representa en la tabla 3 a continuaci´on.

35

TABLA 3 An´ alisis de la variabilidad 44 clones de romero

40

45

HE( %) AO ( %) HE(g/planta) AO(g/planta)

MED

MIN

MAX

Porcentaje de variaci´on

1.48 2.66 4.93 9.32

0.253 0.85 0.19 0.3

3.13 4.08 13.65 23.71

1 1 1 1

→ → → →

12.37 4.8 72 79

50

Se observa claramente en las figuras 7 y 8 as´ı como en la tabla 1 que los clones 28 y 39 presentan el contenido m´ as ventajoso en EO y en AO. Por consiguiente estos dos clones se han estudiado de manera m´as detenida para su contenido en aceites vol´ atiles, en antioxidantes y para el rendimiento por hect´area de uno y de otro.

55

3) Contenido en aceites vol´ atiles de los clones 28 y 39

60

1660 kg del clon 28 y 312 kg del clon 39 se han destilado utilizando las t´ecnicas habituales. La carga es de aproximadamente 300 kg de vegetal fresco (50 % aprox. de humedad) al cual se a˜ nade 200 l de agua. El calentamiento se realiza por vapor directo (introducci´ on por el fondo del aparato) et circuito en forma de concha (“coquill´e”). Es importante, antes de cualquier operaci´ on, vaciar totalmente el circuit de vapor para eliminar las part´ıculas de hierro que se encuentran en la canalizaci´ on.

10

ES 2 132 583 T3 El calentamiento es de 30 mn aproximadamente para llegar a principio de la colada. La destilaci´on tiene una duraci´ on de 2h30 a partir del principio de la colada despu´es el agua se vacia por abertura de la v´ alvula de fondo del aparato. 5

10

El conjunto se seca por puesta bajo vac´ıo del aparato y calentamiento en el circuito en forma de concha “coquill´e”; la duraci´ on de estas operaciones de vaciado, secado y calentamiento es de 45 mn a 1 h y el proceso se para cuando ya no destila agua. El aparato luego se descarga por abertura de fondo basculante. Las ramas se secan sobre una superficie cimentada esparci´endoles sobre una altura de aproximadamente 10 cm y d´andoles la vuelta con frecuencia. Por clasificaci´on manual se separan despu´es las espigas de romero de las ramas. Los resultados de las destilaciones para los clones 28 y 39 se dan en las tablas 4a y 4b a continuaci´ on. Resultados de las destilaciones:

15

1) TABLA 4a Clon 28 20

Carga

Esencia obtenida

Rendimiento % sobre vegetal fresco

25

30

293 305 299 304 295 164

kg kg kg kg kg kg

1660 kg

sobre vegetal seco (Calculado)

1,020 kg 2,580 kg

0,35 0,43

0,65 0,79

2,725 kg

0,45

0,84

0,735 kg

0,45 kg

0,83

7,060 kg

0,425

0,92

35

1) TABLA 4b Clon 39 40

Carga

Esencia obtenida

Rendimiento % sobre vegetal fresco

45

50

312 kg

1,830 Kg

0,58

sobre vegetal seco (Calculado) 1,15

Los aceites vol´atiles se evaluan despu´es en cuanto a su calidad olfativa por una parte y en cuanto a su constituyente por otra parte. Los aceites vol´atiles se han evaluado sobre mojaduras “mouilletes” recientemente mojadas y secadas, en comparaci´on con una muestra comercial standard de origen espa˜ nola.

55

60

Los constituyentes de los aceites vol´atiles de los clones 28 y 39 se determinan por cromatograf´ıa en fase gaseosa; el aceite vol´atil obtenido del clon 28 tiene una composici´ on cercana a la del aceite vol´atil experimental. Sin embargo la proporci´ on en alcanfor s´ olo es de 28 % en vez de 43,4 %. Las proporciones en terpenos (α y β pineno y canfeno) son en cambio m´ as elevadas (22 % aproximadamente, entre 6 % para la muestra experimental). El aceite vol´ atil del clon 39 se caracteriza por una proporci´ on elevada en cineol (22 %) casi id´entico a la de la muestra experimental de Francereco.

11

ES 2 132 583 T3 3.1. Medidas de los antioxidantes en los clones 28 y 39

5

Despu´es de la destilaci´on vapor que permite obtener los aceites vol´ atiles como descrito m´as arriba, los residuos de la destilaci´on (los “drˆeches”) se extraen en un reactor con 200 l de etanol, durante 4 horas y a 25◦ . El resultado de esta extracci´on, llamado AR (para “antioxidante romero”) luego se filtra y se concentra para dar un producto marr´ on verde que se dosificar´a. Los resultados del contenido en antioxidante se representan en la tabla 5 abajo; se observa que tanto el contenido en oxidante en la materia prima como en el extracto es por lo menos dos veces superior al de los extractos corrientes. TABLA 5

10

Extracto AR: comparaci´ on entre los extractos brutos y los ensayos exprimentales

15

20

25

30

Contenido en AO(∗) de la Materia Prima

Rendimiento del extracto ( %)

Contenido en AO del extracto ( %)

Recuperaci´on del AO ( %)

1.5

8,6

7.80 (min.6.7 max 10.1)

44.7

2.3 2.5

11.0 12.3

15.6 16.2

74.6 79.7

Extracto bruto (media) Ensayos experimentales - clon 28 - clon 39 ¨ (∗)Acido carn´ osico + Carnosol

En otro ensayo, unas muestras diferentes de hojas de romero se han analizado por HPLC. Se trata de dos muestras cl´asicas: Murcia y Nogales, los clones 28 y 39 y el clon 28 despu´es de hidrodestilaci´ on. 35

TABLA 6 Contenido en antioxidantes

40

45

50

Muestra

Contenido en ´cido carn´ a osico

Contenido en Carnosol

Contenido en ∗ antioxidantes

1.8 1.7 4.5 4.9 2.3

0.4 0.5 0.3 0.3 1.1

2.2 2.2 4.8 5.2 3.4

Murcia dest. Nogales dest. Clon 39 Clon 28 Clon 28 dest. Contenidos en % peso ∗ Suma de a´cido carn´ osico + carnosol

55

60

La tabla 6 arriba muestra que el contenido en antioxidante medido por la suma de a´cido carn´ osico y de carnosol es dos a tres veces m´as fuerte que en las muestras corrientes, este contenido disminuye ligeramente despu´es de hidrodestilaci´ on pero queda sin embargo bien superior a la normal. El an´ alisis del contenido en carnosol y a´cido carn´ osico por HPLC de las hojas muestra que la hidrodestilaci´on con el vapor directo trata con cuidado a los antioxidantes. El tratamiento t´ermico (3 horas de destilaci´ on) seguido de secado destruye un tercio de los antioxidantes. La comparaci´ on de clones de romero silvestre y de romero seleccionado tratados y clasificados de la misma manera muestra que los clones tienen claramente unas cualidades superiores en cuanto al contenido en AO

12

ES 2 132 583 T3 En una experiencia ulterior el contenido en oxidante de seis muestras diferentes de romero se han estudiado de nuevo por HPLC sobre hojas secadas despu´es de extracci´on Soxtec. Adem´ as del contenido en carnosol y a´cido carn´ osico, el contenido en ´acido rosmar´ınico, antioxidante hidrosoluble del romero, han sido medidos. 5

La tabla a continuaci´ on muestra los resultados obtenidos para los clones 28 y 39 TABLA 7 10

C´ odigo

Edad de las plantas (a˜ nos)

Contenido en antioxidantes ( % peso)

15

Acide rosmar´ınico

Carnosol (C)

Acide carn´osico (CA)

Suma C+CA

20

25

H28 AM 28 AM 28.1 CM 28

3 2 2 1

0.8 0.25 0.95 0.2

0.35 0.4 0.35 0.5

4.65 5.2 5.45 5.4

5.0 5.6 5.8 5.9

H 39 AM 39

3 2

1.1 0.5

0.35 0.3

4.9 5.3

5.25 5.6

30

Los t´erminos H 28 y H39 significan que los clones hab sido cultivados sobre un terreno Hispareco. Las otras muestras representan unos clones que han sido cultivados sobre varios hect´ ares en dos otros sitios AM y CM; la muestra AM 28.1 proviene de un peque˜ no lote que ha sido cosechado un mes despu´es de los clones codif´ıcados AM 28. 35

3.2. Rendimiento de los criaderos 28 y 39 Los criaderos 28 y 39 de romero tienen 2 a 2,5 veces m´as de actividad antioxidante comparados a las cepas silvestres. 40

Este aumento del contenido en estos compuestos de actividad oxidante est´ a acompa˜ nado por un aumento del contenido en aceite vol´atil (ver tabla 1). 45

50

Dos ensayos en campos en Espa˜ na sobre dos veces 2500 m2 con cada uno de los clones 28 y 39 se han realizado. Los rendimientos de estos clones es de 5,6 toneladas de hojas de romero secadas por hect´area conteniento 4 % de la materia seca en compuestos activos antioxidantes. La tabla 8 a continuaci´ on muestra los resultados obtenidos con los clones 28 y 39, comparados a unos clones silvestres (Nogales y Murcia) en t´erminos de rendimiento obtenido para los aceites vol´ atiles y por los A.R. (extractos antioxidantes obtenidos a partir de los “drˆeches” residuos).

55

60

13

ES 2 132 583 T3 TABLA 8 (1) Ensayo industrial de romero 5

Variedad

Cosecha fecha

10

15

20

25

30

35

Peso Fresco Total (T.F.W) kg

Peso Seco Total

D.L.W T.D.W (D.L.W)

Materia Seca

kg

Peso Hoja Seca (T.D.W) kg %

Farm 39 destil. 1780 m2

24/09/91

791

266

172

64.7

92.0

Farm 28 destil. 5300 m2

25/09/91 y 26/09/91

4013

1346

772

57.4

94.0

Hispareco 28. destil. 1700 m2

19/8/91 al 21/8/91

2300

898

482

53.6

94.6

Nogales Murcia Hispareco no destil. 396 m2

22/07/91 30/07/91 28/08/91

460 2070 795

290 931 332

130 416 183

44.8 44.6 55.1

94.0 94.0 94.0

Hispareco 39. No destil. 320m2

28/08/91

787

327

223

67.9

94.0

40

45

50

55

60

14

ES 2 132 583 T3 TABLA 8 (2) Ensayo industrial de romero 5

Variedad

cosecha fecha

10

Farm 39 destil. 1780 m2

24/09/91

4.500

966

21.74

4.82

0.60

1.8

2.80

3.0

Farm 28 destil. 5200 m2

25/09/91+ 26/09/91

7572

1456

19.23

18.43

0.46

1.36

2.38

3.6

Hispareco destil. 1700 m2

18/8/91 al21/8/91

13529

2835

21.00

11.96

0.52

1.33

2.48

3.4

Nogales 22/07/91 Murcia 30/07/91 Hispareco. 28/08/91 destil. 396 m2

— — 20080

— — 4624

28.26 20.11 23.00

3.10 9.93 —

0.67 0.47 —

1.06 1.06 —

2.38 2.38 —

2.2 2.3 5.2

Hipareco. No destil. 320 m2

24590

6983

28.40

—

—

—

—

4.8

15

20

25

30

28/08/91

Rendim. Hojas D.L.W Aceite EO/ EO/ EO/ AR/ aprox. Secas T.F.W vol´atil T.F.W T.D.W D.L.W D.L.W kg/Ha kg/Ha % % % % %

4. Huellas moleculares 35

40

45

Unas huellas moleculares (o “Finger Prints” en ingl´es) se han realizado en una populaci´ on de 50 clones de romero conteniendo especialmente los clones 28 y 39. Los resultados muestran que es posible diferenciar sin ambig¨ uedad los clones 28 y 39. El m´etodo utilizado es la t´ecnica AFLP (que es la abreviaci´on inglesa de “Amplified Fragment Lengh Polymorphism”) descrita en EP534858 (Keygene). El principio del m´etodo se basa sobre la amplificaci´ on selectiva de fragmentos de restricci´on gracias a unos cebadores nucleot´ıdicos espec´ıficos. Para cada combinaci´on “enzima de restricci´on y cebadores”(EA) un polimorfismo espec´ıfico se revela en gel de acrilamida. Una sola combinaci´on EA permite la lectura de varias decenas de bandas, que son cada una asimilables a un alelo. Referencias

50

(1) PRUTHI J.S. (1980) - “Spices and Condiments : Chemistry, Microbiology, Technology”, Academic Press, London. (2) SHELEF L.A. (1983) - J. Food Safety 6, 29. (3) CHIPAULT. J.R. et al (1952) - Food Res. 17, 46.

55

(4) CHIPAULT. J.R. et al (1955) - Food Res. 20, 443. (5) CHIPAULT. J.R. et al (1956) - Food Tech. 10, 209. (6) BERNER D.L. et al (1985) - Brevet EI 3’732’111.

60

(7) CHANG S.S. et al (1973) - Brevet. EU 3’950’266. (8) CHANG S.S. et al (1977) - J. Food Sci. 42, 1102. 15

ES 2 132 583 T3 (9) HARTMANN V.E. et al (1980) - Parfums, cosm´etiques, arˆ omes No 36, 33. (10) KIMURA Y. et al (1981) - Brevet Europ´een 0’038’959. 5

(11) CALAME J.P. (1985) - Brevet Europ´een 0’154’258 (12) TATEO F. et al (1988) Perfumer & Flavorist 13 (10/11), 27. (13) CUVELIER M.E. et al (1991) - dans “9e Journ´ ees Internationales Huilis essentielles - 1990” Rivista Italiana EPPOS 2(3), 374.

10

(14) BERSET C. et al (1989) - Lebensm. Wiss u. Technol. 22, 15. (15) BARBUT S. et al (1985), J. Food Sci. 50, 1356. (16) BRACCO U. et al (1981) - JAOCS 58, 686.

15

(17) AESCHBACH R. et al (1986) - Bull. Liaison Groupe Polyph´enol 13, 56. (18) GRANGER R. (1973) - Parf. Cosm. Sav. France 3, 133, 307. 20

(19) LAMBELET P., SAUCY F., LOLIGER J., (1985) - Chemical Evidence for interactions between Vitamin E and C.; Experientia 41, 1384-88. (20) WOESTENBURG W.J., ZAALBERG J., - Determination of Stability of Edible Oils - Inerlaboratory test with the Automated Rancimat Method; Fette, Seifen, Anstrichmittel 88, 53-6 (1986).

25

(21) Aruoma O.J. et al., (1992) Xenobiotica 22, 257. (22) William J.G.K. et al (1990), Nucleic Acids Research 18, 6531.

30

35

40

45

50

55

60

16

ES 2 132 583 T3 REIVINDICACIONES

5

1. Materia vegetal secada de plantones de especias, susceptible obtenerse depu´es de la cosecha de una variedad de plantones de especia y secado de esta variedad, caracterizada porque su contenido en antioxidantes es superior a 3,5 % en peso de materia seca, y su contenido en aceites vol´atiles es superior a 1,5 % en peso de materia seca. 2. Materia vegetal seg´ un la reivindicaci´ on 1, caracterizada porque los antioxidantes contienen por lo menos carnosol y ´acido carn´ odico.

10

15

3. Materia vegetal seg´ un las reivindicaciones 1 ´o 2, caracterizada porque se obtiene de plantones de romero. 4. Utilizaci´on de una materia vegetal secada de plantones de especias, cuyo contenido en antioxidantes es superior a 3,5 % en peso de materia seca, y el contenido en aceites vol´atiles es superior a 1,5 % en peso de materia seca, para extraer unos aceites vol´ atiles y unos antioxidantes que tienen valor a la vez para la industria agroalimenticia y para la perfumer´ıa.

20

25

30

35

40

45

50

55

60

NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

17

ES 2 132 583 T3

18

ES 2 132 583 T3

19

ES 2 132 583 T3

20

ES 2 132 583 T3

21

ES 2 132 583 T3

22

ES 2 132 583 T3

23

ES 2 132 583 T3

24

ES 2 132 583 T3

25

ES 2 132 583 T3

26