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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

A23L 1/305 (2006.01) A23L 1/30 (2006.01) A23L 2/39 (2006.01) A23L 2/52 (2006.01) A61K 31/195 (2006.01) A61K 31/715 (2006.01) A61K 36/00 (2006.01)

ESPAÑA

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11 Número de publicación: 2 276 912

51 Int. Cl.:

TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 02703710 .0

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Fecha de presentación : 28.02.2002 87 Número de publicación de la solicitud: 1363509

87 Fecha de publicación de la solicitud: 26.11.2003

54 Título: Composiciones que contienen creatina y creatinina.

30 Prioridad: 02.03.2001 GB 0105205

23.07.2001 GB 0117868 31.07.2001 US 917634

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

01.07.2007

73 Titular/es: The Howard Foundation

Whitehill House, Granhams Road, Great Shelford Cambridge, Cambridgeshire CB2 5JY, GB

72 Inventor/es: Howard, Alan Norman y

Harris, Roger Charles

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Carvajal y Urquijo, Isabel

ES 2 276 912 T3

01.07.2007

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid

ES 2 276 912 T3 DESCRIPCIÓN Composiciones que contienen creatina y creatinina. 5

Campo de la invención Esta invención se refiere a composiciones para consumo humano que comprenden creatina y creatinina y a un método para proporcionar composiciones que contienen creatina estable.

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Antecedentes de la invención En los últimos años ha existido un considerable interés entre los atletas por la creatina, la cual se encuentra abundantemente en el músculo esquelético. La creatina juega un papel fundamental en la regulación y homeostasis del metabolismo de energía del músculo esquelético y es hasta ahora generalmente aceptado que el mantenimiento de la disponibilidad de fosfocreatina es importante para la continuación de producción de fuerza del músculo. La creatina puede también estar involucrada en otros procesos concernientes con síntesis de proteínas e hipertrofia de fibras musculares durante el entrenamiento. Aunque la síntesis de creatina ocurre en el hígado, riñón y páncreas, se ha conocido durante algún tiempo que la ingestión oral de creatina aumentará las reservas de creatina del cuerpo completo, y se ha demostrado que la ingestión de 20 a 30 g de monohidrato de creatina (Cr.H2 O) por día durante varios días puede conducir a un incremento mayor del 20% en el contenido de creatina total del músculo esquelético humano. Así, WO 94/02127 describe la administración de monohidrato de creatina en cantidades de al menos 15 g (o 0.2-0.4 g/kg del peso corporal) por día, durante al menos 2 días, para incrementar la fuerza muscular. De hecho, se ha encontrado subsecuentemente que después de varios días de complementación (20 g por día) con monohidrato de creatina a fin de lograr elevación inicial de las reservas de tejido, toma a más tardar no más de 2 a 3 g por día mantener la concentración nuevamente elevada. Complementación con cualquier fuente biodisponible de creatina (i. e., complemento de creatina) en una dosis apropiada puede proporcionar mejoras a los atletas involucrados en eventos explosivos, incluyendo todos los eventos constantes de unos pocos segundos a unos pocos minutos (tal como carrera a toda velocidad, natación, levantamiento de pesas, etc). El desempeño de resistencia en eventos constantes mayores que aproximadamente 30 minutos parece ser menos afectado por la complementación de creatina, excepto en donde este involucre periodos cortos de producción de energía incrementada, particularmente cuando las reservas de carbohidrato del músculo local se han llegado a agotar. La creatina es un componente alimenticio normal y no es un fármaco y su uso no es contrario a las regulaciones oficiales. Es posible que los mayores beneficios de la complementación de creatina se experimenten por los ancianos, vegetarianos o aquellos cuya comida no es carne o pescado, puesto que esta gente tiende a tener contenidos bajos de creatina en el músculo. El Aloe Vera (Aloe barbadensis) es un miembro de la familia de la azucena y es una planta carnosa similar al cactus que crece en climas cálidos libres de heladas. Los indios de México de América Central utilizaron el Aloe Vera durante centurias como un remedio para quemaduras, para prevenir ampollas, ulceras pépticas y duodenales, y todo tipo de desórdenes estomacales e intestinales, infecciones de riñón, ulceras tópicas y gástricas así como para promover la longevidad. Actualmente el Aloe Vera se ha vuelto muy popular y sus beneficios son científicamente reconocidos. El principal uso del Aloe Vera en el pasado ha sido para prevenir la inflamación, particularmente de la piel, especialmente después de quemaduras, pero existen muchos otros usos. Experimentos y estudios de investigación han mostrado que después de utilizarse el jugo de Aloe Vera, la producción de las enzimas digestivas y la población bacteriana de los intestinos es mejorada. Por consiguiente, ha existido un incremento por el interés en el extracto de Aloe Vera como un medicamento para ser tomado en forma oral conforme la gente se familiariza más con sus propiedades médicas.

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Entre los diferentes métodos de presentación, existe un crecimiento de uso del extracto de Aloe Vera en bebidas no alcohólicas que se les adiciona un sabor de fruta y éstas son completamente sabrosas. La inclusión de creatina en una bebida no alcohólica es altamente deseable debido a que la bebida de extracto de Aloe Vera es mucho más benéfica para la salud que una bebida de frutas ordinaria sin complementar.

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El jugo de Aloe Vera es acídico (comúnmente con aproximadamente un pH 3). Es bien conocido que la molécula de creatina es inestable en soluciones acuosas en un pH ácido o neutral, y se convierte en el compuesto de creatinina relacionado. Esto es altamente significante ya que la creatinina no tiene efecto en la mejora del rendimiento del músculo y es excretada del cuerpo humano como un producto de desecho en la orina. En vista de lo anterior, EP 0 669 083 enseña de bebidas acuosas para consumo humano que comprenden creatinina deben ser débilmente alcalinas, a fin de limitar la conversión de creatina en creatinina, y esto se ha vuelto la opinión generalmente aceptada.

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Además, la creatina y sus derivados han sido utilizados en el pasado no solamente para la preparación de productos con un sabor carnoso o salado. Por ejemplo, Tonsbeek (US 3, 615, 600) describe y se refiere a saborizantes artificiales, describiendo mezclas que imparten un sabor carnoso a los alimentos. Similarmente, de Rooji (US 4,464,409) se refiere a saborizantes de carne. Yamazaki (JP-A-59035663) prepara un saborizante de carne al calentar una mezcla que comprende creatina a un pH de 5.0-7.0 a una temperatura de 80-130◦ C durante 30-120 minutos. Bajo estas condiciones la mayoría de la creatina se convierte a creatinina. 2

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Los inventores creen que a las personas diestras en la técnica no se les ocurriría adicionar creatinina (utilizada hasta ahora como un agente saborizante de carne o salado) a composiciones que se proponían tener un sabor (especialmente un sabor a fruta) diferente al carnoso o salado. Las personas diestras en el arte podrían haber esperado la adición de creatinina como un resultado de una combinación no sabrosa de sabores de fruta y carne, mientras que de hecho los inventores han encontrado que la combinación resultante no imparte un sabor a carne indeseable.

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WO 97/45026 describe una composición ácida para consumo humano que comprende creatina y sus derivados, la composición se proporciona como un polvo seco o en una forma líquida o semilíquida. Las composiciones descritas allí son estables a temperaturas refrigeradas (4◦ C) durante períodos prolongados pero estables a temperatura ambiente durante periodos relativamente cortos (e.g., hasta, pero que no excediendo, 7 días). WO 00/74500 describe composiciones que comprenden creatina y sus derivados suspendidos en gel de Aloe vera, las cuales composiciones son estables (con respecto a la conversión de creatina a creatinina) a temperatura ambiente durante dos semanas o más, dependiendo de la concentración inicial de creatina en la composición.

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Tanto WO 97/45026 como WO 00/74500 precisan el deseo de prevenir la conversión de creatina a creatinina, y ninguno de los documentos sugiere la adición deliberada de creatinina a una composición que contiene creatina propuesta para consumo humano. 20

Sería una gran ventaja presentar una composición para consumo humano, en la cual la creatina en esta fuera sustancialmente estable, aún a un pH ácido y a temperaturas ambiente. La invención

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La presente invención concierne a la provisión de composiciones para consumo humano que comprenden creatina y sus derivados, especialmente composiciones presentadas en un medio acuoso, más especialmente composiciones (tales como bebidas) en las cuales la creatina se proporciona en solución acuosa o en las cuales la creatina este suspendida en una matriz de soporte comestible.

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El término “creatina” como se utiliza en la presente, se propone para que abarque todos los derivados biodisponibles de creatina, tal como monohidrato de creatina, fosfocreatina y otras sales de creatina. El monohidrato de creatina es el particularmente preferido. Por consiguiente, el término “creatina” deberá ser interpretado ampliamente en donde el contexto lo permita.

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Como se explicó anteriormente, es bien conocido que la molécula de creatina en solución acuosa es inestable, especialmente a un pH ácido (i.e., por debajo de un pH 7), siendo convertida a creatinina (Edgar & Shiver, 1925 J. Am. Chem. Soc., 47, p. 1179-1188; Cannan & Shore 1928 Biochem. J. 22, p. 920-929). Esto representa un problema para intentar proporcionar bebidas u otras composiciones que contengan creatina en cantidades fisiológicamente útiles, especialmente las bebidas son usualmente formuladas de modo que tengan un pH inferior a 7.

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Edgar & Shiver realizaron algunas investigaciones en el equilibrio que existe entre creatina y creatinina en solución acuosa y, en particular, el efecto sobre la posición del equilibrio al utilizarse soluciones amortiguadoras de diferente pH. Desafortunadamente el trabajo de Edgar & Shiver no ofrece ninguna guía práctica útil a las personas expertas en la técnica de formular bebidas y otras composiciones nutricionales, por varias razones. Primero, la publicación de Edgar & Shiver es muy vieja y de interés puramente académico, debiendo ser improbable su consulta por una persona diestra en la técnica para formular bebidas, y no tiene un soporte directo en la formulación de bebidas. En segundo lugar, y mas significativamente, Edgar & Shiver realizan sus experimentos utilizando soluciones extremadamente diluidas de creatina/creatinina (0.001 M, equivalente a 0.0149 g de creatina/100 ml, el monohidrato de creatina tiene un peso molecular de 149); mientras estos son apropiados para consideraciones puramente analíticas, ellos no tienen relevancia cualquiera para los sistemas que comprenden concentraciones elevadas (sobre 0.15 g de monohidrato de creatina o equivalente/100 ml) de creatina y son propuestos para proporcionar cantidades fisiológicamente útiles de creatina en una bebida. En tercer lugar, Edgar & Shiver descuidan tomar en cuenta el cambio en el pH, el cual ocurre durante la conversión de creatina a creatinina y viceversa-dicho cambio es probablemente descuidando el uso de mezclas de creatina/creatinina muy diluidas empleadas por Edgar & Shiver, pero deben tener un impacto significante a altas concentraciones, tal como son deseables en una bebida, como los presentes inventores lo han descubierto. Comentarios generalmente similares aplican a la publicación igualmente vieja de Cannan & Shore. La solución obvia a la inestabilidad de creatina podría ser simplemente incrementar la concentración inicial de creatina en la composición, de modo que una cantidad fisiológicamente útil de creatina este presente en la composición durante un largo periodo de tiempo. Sin embargo, este enfoque no previene o inhibe en nada la conversión de creatina a creatinina. Además, la conversión extensa de creatinina a creatinina es probablemente para incrementar el pH de la composición, ya que la reacción involucra la eliminación de un ión de hidrógeno. Esto puede cambiar el sabor sabroso y ser indeseable al consumidor. Además, la creatina no es particularmente soluble en agua (especialmente a bajas temperaturas, e.g., 3-5◦ C, a la cual las bebidas son usualmente almacenadas), de modo que existe una concentración inicial máxima finita de creatina que no puede ser exhibida. Además, la inclusión de exceso de creatina es indeseable, ya que la presencia de creatina sin disolver en formulaciones de bebidas no es atractiva a los consumidores. Iniciando con una solución de creatina el resultado podría ser una bebida con menor cantidad que la cantidad máxima de creatina 3

ES 2 276 912 T3 en solución puesto que algo de la creatina podría convertirse a creatinina. Los inventores han proporcionado un enfoque alternativo explicado enseguida. 5

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En un primer aspecto, la invención proporciona una composición para consumo humano que comprende creatina y una cantidad de creatinina suficiente para producir la creatina allí mismo sustancialmente estable (como se define enseguida) en un medio acuso. El contenido de creatinina de la composición está presente ab initio, (i.e., durante la formación de la composición final), en lugar de surgir durante el almacenamiento de la composición como un resultado de la conversión de creatina en creatinina. Será aparente a partir de las enseñanzas siguientes que, al menos en algunas modalidades, la producción de la composición (i.e, procesamiento previo a la formación de las composiciones finales) puede implicar la conversión deliberada de creatina a creatinina. La estabilidad de la creatina ab initio es comercialmente deseable, debido a que esto permite la caracterización exacta del contenido de creatina de la composición (la cual puede, por ejemplo, ser indicada en el envase y similares) y esto permite al consumidor calcular la dosis exacta de creatina consumida.

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La composición puede ser provista como un líquido, un semilíquido, una matriz comestible o un sólido para solución subsecuente en agua. La creatina puede ser disuelta en agua para proporcionar un líquido. 20

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Para composiciones en las cuales la creatina esta suspendida en un semilíquido o una matriz de soporte, el contenido de creatina para la composición preferiblemente es sometido a un proceso de micronización (e.g., prensado, pulverizado, para obtener un polvo y similares) previo a la incorporación en un semilíquido u otra matriz de soporte de modo que la composición resultante no esté en forma arenosa inaceptable en textura. Convenientemente la matriz de soporte, si esta presente, es un producto alimenticio reconocido, de modo que una composición de acuerdo con la invención puede tomar la forma de un producto alimenticio convencional de otro modo, complementado con creatina y creatinina, tal que la creatina sólida sea suspendida en el producto alimenticio. Ejemplos de productos alimenticios que pueden representar matrices de soporte adecuadas para la composición de la invención incluyen sólidos esparcibles tal como lácteos o pastas de queso, pasta de caviar (principalmente caviar de Cyclopterus lumpus (lump fish-pescado del atlántico norte usualmente verdoso que tiene hileras de nódulos en el cuerpo)), y otras pastas de pescado, pastas de carne y similares. Otras matrices de soporte convenientes son aquellas que comprenden azúcares u otros carbohidratos, tal como miel líquida o sólida, melazas, jarabe (e.g., jarabe de maíz, jarabe de glucosa), melado, glicerol o “Maxim Energy gel”TM . Si se desea, la viscosidad de la solución y/o la composición como un todo se puede incrementar mediante la adición de viscosificadores, agentes de gelación y similares. Tales componentes son bien conocidos en la industria alimenticia e incluyen, por ejemplo, polisacaridos derivados de plantas, gomas, y similares tal como galactomananos, dextranos, goma de guar, goma de algarrobo, goma de xantano y así sucesivamente. Tales viscosificadores, geles y similares pueden tomar la forma de una matriz de soporte, si se desea. Una matriz comestible preferida comprende un gel preparado a partir de extracto de Aloe Vera concentrado: una pasta cremosa sin grumos (adecuada para envasarse en un tubo comprimible) puede ser preparada al mezclar 5 gms de creatina con (por ejemplo) 60 ml de un gel de Aloe Vera concentrado (tal como aquel obtenible de Aloe Commodities Int. Inc., Farmers Branch, TX75234). Además, la matriz de soporte puede comprender un producto alimenticio semilíquido tal como un yogurt u otro producto alimenticio semilíquido.

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Los presentes inventores habían encontrado previamente que la conversión de creatina a creatinina en soluciones acuosas puede ser marcadamente inhibida por la creatinina misma, tal que una mezcla de creatina y creatinina puede rápidamente alcanzar el equilibrio y la creatina volverse sustancialmente estable. Sin desear estar obligado por ninguna teoría en particular, los inventores creen que la explicación para esta observación es que la conversión de creatina a creatinina es una reacción reversible. Los inventores han encontrado ahora que al proporcionar creatina en solución junto con una cantidad apropiada de creatinina, la conversión de creatina a creatinina (aún en una composición acídica) puede ser grandemente inhibida o aún sustancialmente evitada aún a temperatura ambiente (i.e., 2-39◦ C) o por arriba durante periodos prolongados (de 30 a 95 días o más). Sin embargo, en algunas modalidades, la composición como un todo puede convenientemente ser seleccionada para ser ácida (i.e., tener un pH por abajo de 7.0) o aún alcalina (e.g., 7.0 a 8.5) sin que afecte significativamente en forma adversa la estabilidad del contenido de creatina de la composición. En particular, la composición deseablemente tiene un pH entre 2.5 y 8.5, preferiblemente entre 3.0 y 7.0 y más preferiblemente entre 4.5 y 6.5. Típicamente la composición tiene un pH en el intervalo de 4.5 a 5.5 que, al paladar humano, tiene un sabor refrescantemente marcado sin ser demasiado ácido.

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Las composiciones de acuerdo con la invención son sustancialmente estables de modo que la creatina puede ser presentada aún en formulaciones acídicas, contrario a las enseñanzas del arte, en cantidades fisiológicamente útiles, siguiendo almacenaje durante periodos prolongados a temperatura ambiente. Una cantidad fisiológicamente efectiva de creatina es una cantidad suficiente para causar un incremento medible en el contenido de creatina de los tejidos de un sujeto que sigue consumo repetido de la composición, respecto a un nivel de línea basal inicial. Los métodos para medir el contenido de creatina de los tejidos de un sujeto son conocidos (e.g., Harris, Hultman & Nordesjo (1974) Glycogen, intermediarios glicolíticos y fosfatos de alta energía en muestras de biopsia de musculus quadriceps femoris de un hombre en descanso. Métodos y varianza de valores, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 33, 109-120; Dunnett, Harris 4

ES 2 276 912 T3 & Orme (1991) cromatografía líquida de alto rendimiento de apareamiento iónico de fase inversa de fosfocreatina, creatina y creatinina en músculo equino. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 51, 137-141). 5

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El término “sustancialmente estable” se define en la presente como refiriéndose a una composición de creatina/creatinina en la cual al menos 75% (preferiblemente al menos 80%, y más preferiblemente al menos 85%) de la creatina en la composición inmediatamente después de la formulación del producto final esta sin cambiar, y por lo tanto no se convierte en creatinina, durante un período de al menos (y preferiblemente más de) 7 días de almacenamiento. La estabilidad de la creatinina depende del pH; al final disminuye con el incremento de la temperatura. (El “producto final” es la composición producida después de que todas las etapas de procesamiento y producción han sido complementadas). Los inventores han encontrado que a 20◦ C el incremento en la temperatura puede disminuir el pH por tanto como 0.3 unidades. El intervalo de temperatura al cual la composición será sometida (e. g., en un refrigerador o un almacén) está típicamente entre 2 a 50◦ C punto deseablemente, la composición será lo suficientemente estable tal que el 75% de la creatina permanece sobre el intervalo de temperatura de 2 a 50◦ C siguiendo un período de al menos 30 días, más preferiblemente 60 días, y más preferiblemente al menos 120 días, durante el almacenamiento. A fin de especificar la estabilidad es necesario especificar el pH (el cual debe ser medido a la temperatura a la cual la solución será almacenada) a la cual se requiere la estabilidad. El pH es alterado al calentar o enfriar una solución amortiguada y sobre el intervalo de temperaturas a que una solución puede ser almacenada la proporción de equilibrio de creatina:creatinina puede variar grandemente. Sin embargo, si la composición es estable a 50◦ C entonces su contenido de creatina no disminuirá durante el almacenaje a una temperatura inferior. Como se mencionó anteriormente, la proporción de mol:mol de creatinina a creatina para lograr la estabilidad de la creatina, se encontró que dependía del pH de la solución y los intervalos desde 1:2 para pH 7 a 3.8:1 para un pH 4.25. Se prefiere que la proporción de mol:mol de creatinina a creatina no sea mayor de 10:1. Más preferida es una proporción no mayor de 5:1. Más preferida es una proporción de creatinina a creatina la cual no sea demasiado alta (ya que la creatinina es un ingrediente inactivo) y el pH más preferido es de 5 a 7 cuando la proporción mol:mol de creatinina a creatina está en el intervalo de desde aproximadamente 1.2:1 a 1:2. Para el propósito de la invención, la creatinina puede ser adicionada a la creatina como una sustancia pura o la creatinina puede ser manufacturada in situ al calentar creatina en solución, preferiblemente a un pH bajo, e.g., un pH de 2 a 3. Es más conveniente para la solución ser calentada y mantenida durante al menos 30 minutos a 90◦ C o más debido a que estas son las condiciones frecuentes utilizadas para la esterilización de un líquido para venta comercial. (Alternativamente, una “dosis calentada” de esterilización equivalente se puede proporcionar al calentar a temperaturas mayores durante periodos cortos de tiempo o viceversa.) En otras modalidades, la creatinina puede ser preparada al calentar una solución de creatina durante varias horas a un pH de 2 a 3 y después adicionar esta a una solución de creatina a un pH mayor (e.g., pH 7) y ajustar la mezcla final al pH deseado (e.g., pH 5). Si se requiere la solución puede ser después re-esterilizada bajo las condiciones antes mencionadas. En este método de preparación, puede haber una conversión pequeña o no existe conversión adicional de creatina a creatinina y la estabilidad se asegura inmediatamente después de mezclar las dos soluciones. Este método tiene ventajas debido a que la creatina no es muy soluble en agua cuando es enfriada en un refrigerador, mientras la creatinina es mucho más soluble. Al producir una solución estable de creatina por este método es posible formular una bebida que contiene una cantidad relativamente mayor de creatina estable que podría ser alcanzada de otra manera. Por lo tanto por este medio, es posible producir una bebida adecuada para refrigeración que contiene hasta 1.2 g de creatina/100 ml (o 1.4 g de monohidrato de creatina) o una bebida adecuada para almacenamiento a temperaturas ambiente de 18 a 25◦ C que contiene hasta 1.5 g de creatina/100 ml (o 1.7 g de monohidrato de creatina/100 ml). Una ventaja adicional de la invención es que permite la provisión de una composición que comprende la concentración máxima de creatina disuelta disponible (bajo las condiciones relevantes de pH y temperatura), pero utilizando al menos la cantidad de creatina necesaria, en una formulación estable, y por consiguiente no requiere el uso de creatina en exceso.

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Una modalidad preferida de la invención es una bebida acuosa, especialmente una a un pH ácido (i.e., por debajo de un pH 7), y en particular que tenga un pH en el intervalo de 4-6.5, especialmente de 4.5-5.5, y que comprende al menos 0.15 g de creatina (o monohidrato de creatina y lo similar) por 100 ml. Preferiblemente la bebida comprende al menos 0.3 g de creatina (o monohidrato de creatina y lo similar) por 100 ml, más preferiblemente al menos 0.4 g por 100 ml, y más preferiblemente al menos 0.5 g por 100 ml.

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La composición puede comprender una solución de creatina y creatinina en agua sin componentes adicionales (tal como por ejemplo saborizante) como una solución en agua e.g., agua mineral o carbonatada utilizando procesos que son bien conocidos por aquellos diestros en la técnica.

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Sin embargo, preferiblemente la composición puede comprender uno o más componentes adicionales para mejorar su delicia, estabilidad, sabor o calidad nutritiva. Estos componentes adicionales pueden incluir electrolitos o pueden ser seleccionados del grupo que consiste de: vitaminas, lípidos, proteínas, carbohidratos, polioles (tal como etilenglicol, glicerol, sorbitol, etc.), aminoácidos, elementos traza, colorantes, saborizantes, endulzantes artificiales, substancias que mejoran el rendimiento y la salud natural, antioxidantes, estabilizadores, preservativos y agentes amortiguadores. 5

ES 2 276 912 T3 Las vitaminas pueden ser incluidas con ventaja en la composición de la invención. Estas pueden ser adicionadas en cantidades que están en el intervalo de desde 20 a 100% de su cantidad diaria permitida recomendada (RDA) las siguientes son típicas de aquellas que son útiles: vitamina E, vitamina C, tiamina, riboflavina, niacina, vitamina B6, folacina, vitamina B12, biotina y ácido pantoténico. 5

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En algunos casos un componente lípido puede ser deseable. El contenido de proteína (si existe) puede estar presente como soja o proteínas de la leche (e.g., suero o caseina). El contenido de carbohidratos (si existe) o la composición puede estar presente como almidón (particularmente almidón soluble) y/o azúcares. Los azúcares que pueden estar presentes en la composición incluyen glucosa, fructuosa, sacarosa, lactosa y maltosa. Endulzantes artificiales que pueden ser utilizados incluyen Aspartame, Acesulfam K, Sacarina y Ciclamato. Casi cualquier saborizante deseado puede ser adicionado, más preferiblemente sabores de fruta tal como baya, limón, naranja, papaya y toronja. Sin embargo, a menos pH acídicos (e.g., arriba de 5.0) pueden ser utilizados otros sabores tales como chocolate, malta, caramelo y otros sabores adecuados para bebidas “lácteas”. Ácido cítrico puede también ser utilizado como un acidulante y el citrato y fosfato (e.g., fosfato o citrato de sodio) como una gente amortiguador. Otros agentes amortiguadores pueden ser utilizados para regular la acidez de la bebida. También otras sustancias mejoradoras de la salud natural se pueden adicionar en cantidades fisiológicamente activas. Las siguientes son típicas de aquellas que pueden ser útiles: té de Pau D’Arco, Ginseng, té de Suma, Ginkgo, polen de abeja, mirra, hidroxi-metil-butirato, glutamina, di-, tri- y polipétidos que contienen glutamina, ribosa, cafeína y ácido lipoíco. Preservativos pueden ser provistos típicamente por benzoato de potasio y/o sorbato de potasio. Agentes colorantes pueden ser provistos, típicamente al utilizar un colorante soluble en agua fría tal como betacaroteno. Otros colorantes adecuados serán aparentes para aquellos diestros en la técnica.

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Un agente de nebulización puede ser incluido en la composición, si se desea, para mejorar la apariencia de la composición. Los elementos minerales y traza pueden también ser adicionados en cualquier tipo o forma que sea adecuado para el consumo humano. Es conveniente proporcionar el calcio y el potasio en la forma de sus gluconatos, fosfatos o fosfatos de hidrógeno, y magnesio como el óxido o carbonato, cromo como picolinato de cromo, selenio como selenita de sodio o selenato, y zinc como gluconato de zinc. Típicamente las cantidades son: sodio a 400 mg/litro, calcio a 100 mg/litro, cloro a 600 mg/litro, potasio a 200 mg/litro, magnesio a 75 mg/litro y fósforo a 50 mg/litro, cromo a 125 µg/litro, selenio a 125 µg/litro y zinc a 15 mg/litro. Para bebidas líquidas en las cuales la creatina es completamente soluble, la cantidad de creatina (calculada como el monohidrato de la misma) por litro o por Kg de composición preparada puede estar en el intervalo de desde 1.5 g a 24 g con un contenido preferido de aproximadamente 12 g por litro. El tamaño normal de la porción esta en el intervalo de 200-750 ml, proporcionando aproximadamente de 2 a 7 g, preferiblemente de aproximadamente 5 g de creatina. Durante los primeros cuatro días de complementación de creatina el consumo recomendado es de aproximadamente 2.0 litros por día, dividido en 4 o 5 partes por día para lograr la saturación de creatina. Esto es seguido por 1 porción de 250-750 ml por día que contiene aproximadamente de 2-3 g de creatina para proporcionar un nivel suficiente de creatina para mantener la saturación. Para suspensiones de creatina en 100 en semilíquidos u otras matrices de soporte comestibles, la cantidad de creatina por 100 g puede estar en el intervalo de desde 1 a 80 g (calculado como monohidrato de creatina de la misma). El tamaño de la porción preferido esta en el intervalo de 5 a 100 g provista entre 2 a 10 g (preferiblemente 5 g) de creatina. Durante los primeros cuatro días de complementación de creatina el consumo recomendado es una suspensión que contiene de 10 a 25 g por día dividida en 4 o 5 partes por día para lograr la máxima elevación de creatina en los tejidos. Sin embargo, dosis bajas durante un periodo prolongado (e.g., 3 g diarios durante 4 semanas) tendrá el mismo efecto. Esto es seguido alguno por una porción de suspensión diaria que contiene de 3 a 5 g de creatina para proporcionar un mantenimiento del nivel de creatina. La invención también se refiere a un método para manufacturar la composición arriba definida. Por consiguiente, en un segundo aspecto la invención proporciona un método para manufacturar una composición para consumo humano, el método comprende la etapa de proporcionar, en la misma composición, creatina y creatinina suficiente para producir la creatinina substancialmente estable (como está definida en la presente) cuando la composición se mezcla con un medio acuoso. Preferiblemente el medio acuoso es agua o una solución acuosa. El método también incluye normalmente la etapa de proporcionar agua o una solución acuosa, preferiblemente en cantidad suficiente como para substancialmente disolver toda la creatina y creatinina en la composición.

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Será aparente para aquellos diestros en la técnica que en el orden de adición de los componentes a la composición generalmente no es significante, y cualquier secuencia de etapas que proporcione el objeto de la invención será suficiente. Por consiguiente, por ejemplo, la creatina sólida y creatinina sólida pueden ser adicionadas (simultánea o separadamente) al agua o a un medio acuoso; o el agua o un medio acuoso pueden ser adicionados a la creatina y/o creatinina sólidas. Por consiguiente, en una modalidad, el segundo aspecto de la invención proporciona un método para preparar una composición que contiene creatina para consumo humano en la cual la creatina es substancialmente estable (como se 6

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definió en la presente), el método comprende las etapas de: proporcionar una solución de creatina; y someter la solución de creatina a condiciones adecuadas de tal modo que se convierta parcialmente la creatina a creatinina, formando de ese modo creatinina suficiente para producir la creatina en la composición resultante sustancialmente estable (como se define en la presente). Típicamente el método comprenderá la etapa adicional de envasar la composición en recipientes adecuados e.g., botellas de vidrio o plástico, saquitos de hojas de metal, latas de aluminio etc. Preferiblemente el método es tal que el someter la solución de creatina a condiciones adecuadas implica calentar la solución por arriba de la temperatura ambiente promedio. En un método preferido, la solución se calienta a 90◦ C durante 30 minutos.

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15

En un tercer aspecto la invención proporciona un método para preparar una composición que contiene creatina para consumo humano en la cual la creatina esta sustancialmente estable (como se define en la presente), el método comprende las etapas de: proporcionar una solución de creatina; proporcionar una solución de creatinina; y mezclar las soluciones de modo que se forme una composición resultante en la cual existe suficiente creatinina para producir la creatina sustancialmente estable (como se define en la presente). En este método el pH de la solución de creatinina preferiblemente no es menor que el pH de la solución de creatina. En forma deseable el pH de la solución de creatinina esta en el intervalo de 2 a 3, y el pH de la solución de creatina esta preferiblemente en el intervalo de 4.5 a 7 con un ajuste, si es necesario, del pH final al nivel deseado.

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En un cuarto aspecto la invención proporciona un método para preparar una composición que contiene creatina para consumo humano en la cual la creatina esta sustancialmente estable (como se define la presente), el método comprende las etapas de: proporcionar creatina sólida; proporcionar creatinina sólida; y mezclar los dos sólidos de tal manera que se proporcione una composición resultante que, cuando se disuelve en solución acuosa, proporciona una composición en la cual existe suficiente creatinina para producir la creatina sustancialmente estable (como se define en la presente). Típicamente este método comprenderá además la etapa de adicionar agua o solvente acuoso suficiente para disolver sustancialmente la composición resultante. Si se desea, el agua o solvente acuoso puede ser pre-esterilizado mediante tratamiento con calor y/o filtración. En un quinto aspecto, la invención proporciona un método para preparar una composición que contiene creatina para consumo humano en la cual la creatina es substancialmente estable (como se define en la presente), el método comprende las etapas de: proporcionar creatina sólida y creatinina sólida, o una solución acuosa de creatinina, la creatinina esta en cantidad suficiente para producir la creatina sustancialmente estable (como se define en la presente); mezclar la creatina sólida con la creatinina sólida o solución acuosa de creatinina; y adicionar a la mezcla una matriz de soporte comestible. Ventajosamente, el funcionamiento de los métodos del segundo, tercero, cuarto o quinto aspectos resultará en una composición de acuerdo con el primer aspecto antes definido.

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Breve descripción de las figuras Las figuras 1 y 2 son gráficas de la concentración de creatina (g por 100 ml, y como un porcentaje de la concentración inicial, respectivamente) en soluciones de diferente pH contra el tiempo (como se describe en el ejemplo 2);

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La figura 3 es una gráfica de la proporción mol:mol de creatinina (Cn) a creatina (Cr) en soluciones de diferentes pHs después de 124 días de incubación (como se describe en el ejemplo 2); 50

Las figuras 4 y 5 son gráficas de una concentración de creatina (g por 100 ml, y como un porcentaje de la concentración inicial, respectivamente) contra el tiempo, en donde una mezcla de creatina y creatinina en soluciones de diferentes pHs se incubo hasta 95 días (como se describe en el ejemplo 3); La figura 6 es una gráfica de la proporción mol:mol de creatinina a creatina contra pH para soluciones estable después de 6 semanas de incubación a 39◦ C (como se describe en el ejemplo 5);

55

La figura 7 es una gráfica de la proporción de mol:mol de creatinina a creatina contra pH para soluciones estables después de 6 semanas de incubación a 2◦ C, 22◦ C y 39◦ C (como se describe en el ejemplo 5); 60

La figura 8 es una gráfica de la proporción mol:mol de creatinina a creatina contra pH para soluciones estables después de 6 semanas de incubación a 22◦ C (como se describe en el ejemplo 5), también muestra esta una línea polinomial de mejor ajuste: y = -0.001x7 + 0.077x6 – 1.693x5 + 20.594x4 - 149.615x3 + 649.397x2 – 1560.343x + 1603.236

65

r = 1.000

7

ES 2 276 912 T3 Ejemplos Ejemplo 1 5

Este ejemplo se refiere a un método de ensayo in vitro conveniente para determinar la concentración de creatina en una solución. 1. Se determinó el pH de cada solución con un medidor de pH.

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2. Las mezclas se almacenaron en un gabinete obscuro a temperatura ambiente (circa 22◦ C) en un laboratorio. 3. Se muestrearon 2-3 ml de solución después de períodos de tiempo entre 0 y 124 días y se congelaron almacenadas a -30◦ C hasta inmediatamente ser analizadas o dentro de uno a dos días.

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4. Las muestras descongeladas fueron disueltas en agua destilada para dar una dilución adecuada y la concentración de creatina de cada una se determinó por el método de Harris et al, (Scand. J. Clin. Lab. Invest. 33, 1974, 109-120). Brevemente, el ensayo se realizó en presencia de (concentración final) 100 mM de amortiguador de trietanolamina pH 8. 5; 10 mM de acetato de magnesio; 1 mM EDTA; 30 mM de KCl; 1 mM de fosfoenolpiruvato; 2 mM de adenosinetrifosfato (ATP); 0.18 mM de nicotinamida-adenina-dinucleótido/forma reducida (NADH); creatina cinasa (CK); piruvato cinasa (PK), y deshidrogenasa de lactato (LDH). La concentración de creatina se determinó a partir de la oxidación de NADH medida fotométricamente a 340 nm. CK:

Cr + ATP

→ PCr + ADP

PK:

ADP + PEP

→ ATP + Piruvato

25

LDH: Piruvato + NADH → Lactato + NAD 30

Ejemplo 2 35

40

El objeto de esta prueba fue determinar la estabilidad de creatina cuando se calentó a 90◦ C a diferentes pHs y las soluciones se dejaron a temperatura ambiente durante hasta 124 días. A 90◦ C la conversión de creatina a creatinina generalmente ocurrió muy rápidamente. Soluciones en agua de 2 g de monohidrato de creatina en 100 ml de ácido cítrico 0.1 M - amortiguadores de fosfato de sodio 0.1 M a pHs de 3, 4, 5, 6 y 7 se calentaron a 90◦ C durante 30 minutos. Las soluciones fueron rápidamente enfriadas, el pH (el cual había cambiado) se volvió a medir nuevamente y después se dejó a temperatura ambiente como se describe en el ejemplo 1. Se tomaron alícuotas después de 7, 15, 29, 43, 57, 89 y 124 días y se almacenaron a -30◦ C y subsecuentemente se analizaron para creatina. Se midió el pH de cada muestra. La concentración de creatinina se estimó a partir de la diferencia entre el nivel de partida (2 g de monohidrato de creatina) y el nivel medido de creatina (calculado como el monohidrato).

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Resultados 50

55

Como se muestra en las figuras 1 y 2, se efectuó una rápida conversión de creatina a creatinina después de 30 minutos de calentamiento. Sin embargo, la extensión de la conversión dependió del pH de la solución, siendo progresivamente mayor con el pH inferior. En almacenaje durante 30 días ocurrió un declive adicional en la concentración de creatina. Entre 30 y 124 días el nivel de creatina alcanzó la estabilidad en todos los pHs. La figura 3 muestra la proporción mol:mol de creatina y creatinina en el día 124 (17.7 semanas) a diferentes pHs a partir de lo cual fue posible estimar la cantidad de creatinina requerida para producir la creatina en forma máxima estable. Conclusión

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65

Iniciando con una composición que comprende creatina y sin creatinina tomó 4 semanas o más para las soluciones incubadas a 22◦ C alcanzar la estabilidad. El tiempo tomado para alcanzar la estabilidad se incrementa en el nivel inferior del pH ya que más creatina debe ser convertida a creatinina. La cantidad de creatinina requerida para producir una solución de creatina estable depende del pH de la solución. Generalmente, la cantidad de creatinina requerida se incrementa con la disminución del pH. Sin embargo, en cada pH es posible predecir la proporción de creatinina a creatina que se puede alcanzar en la estabilidad máxima.

8

ES 2 276 912 T3 Ejemplo 3

5

El objeto de este ensayo fue determinar el efecto de creatinina en la proporción de 1:1 (p/p) a monohidrato de creatina en la estabilidad de creatina a diferentes pHs después de calentar la mezcla durante 30 minutos a 90◦ C. Cantidades de 1.5 g de monohidrato de creatina y 1.5 g de creatinina se disolvieron en 100 ml de amortiguadores de citrato 0.2 M - fosfato de potasio 0.2 M a pHs de 3, 4, 5, 6 y 7. Las soluciones se calentaron a 90◦ C durante 30 minutos, se enfriaron, el pH se volvió a medir y se dejó a temperatura ambiente (22◦ C) durante hasta 95 días.

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Resultados 15

Como se muestra en las figuras 4 y 5, a pHs de 6 y 7 no existió pérdida de creatina durante el periodo de calentamiento. Pequeñas pero pérdidas progresivamente mayores ocurrieron a pH de 5, 4 y 3 con el tiempo. La estabilidad de la creatina ocurrió en todos los pHs. A pHs de 5, 6 y 7 existió aún una tendencia a que la concentración de creatina se incrementará.

20

Conclusiones

25

En presencia de una cantidad suficiente de creatina (la cual para pHs 5, 6 y 7 fue igual a o menor que una proporción en peso de creatinina: monohidrato de creatina de 1:1), la creatina es excepcionalmente estable, aún cuando se calentó durante 30 minutos a 90◦ C. Con una cantidad insuficiente de creatinina (para muestras a pHs de 3 y 4) el calentamiento durante 30 minutos a 90◦ C dio como resultado la producción de suficiente creatinina también para producir la creatina remanente estable durante al menos 95 días posteriores.

30

Ejemplo 4

35

Este ejemplo ilustra un método de calentamiento de una solución de creatina para formar creatinina y después adicionar esta a una bebida con sabor que contiene creatina para dar una concentración la cual es sustancialmente estable. Simultáneamente, se desea que la concentración de creatina remanente se acerque a su solubilidad máxima tal que no precipitará en el refrigerador a 3◦ C. Este es un requisito para la mayoría de las bebidas ya que estas pueden ser enfriadas en un refrigerador antes de su consumo. Etapa 1

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5 g de monohidrato de creatina se disolvieron en 100 ml de ácido cítrico 0.1 M (pH 3) y se calentaron a 90◦ C durante dos horas. Esto convirtió más de la creatina a creatinina. La solución se enfrió a temperatura ambiente. 45

Etapa 2 Se preparó una solución que contenía 5 g de monohidrato de creatina en 650 ml de amortiguador de citrato 0.1 M a pH 5 a temperatura ambiente, sin calentar. Además, la solución contenía 15% de jugo de Aloe Vera, saborizantes y dextrosa para endulzar.

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Etapa 3 55

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Soluciones de las etapas 1 y 2 fueron después mezcladas juntas y calentadas a 90◦ C durante 30 minutos para esterilizar la mezcla y después se colocaron en una botella de vidrio o plástico y se almacenaron a 22◦ C. Los 5 g de monohidrato de creatina adicionados en la etapa 2 permanecieron sustancialmente estables en la formulación del producto final. La anterior bebida cuando se colocó en el refrigerador a 3◦ C no precipitó creatina. En presencia de creatinina se encontró que la solubilidad máxima de creatina en un refrigerador a 3◦ C es de aproximadamente 1.2 g/100 ml (equivalente a circa 1.4 g de monohidrato de creatina). Ejemplo 5

65

Es bien conocido por aquellos diestros en la técnica que cuando soluciones amortiguadas se calientan el pH disminuye. Por consiguiente, un amortiguador de citrato-fosfato 0.1 a 0.2 M con un pH de 4.75 a 20◦ C a calentar a 40◦ C cambia a pH 4.5. En forma inversa, al enfriar una solución amortiguada se incrementará su pH. Estos cambios en 9

ES 2 276 912 T3

5

el pH afectarán la proporción mol:mol de creatina: creatinina necesaria para lograr la estabilidad de acuerdo con la interrelación ilustrada en forma gráfica en la figura 3. Por consiguiente, la proporción cambiará de desde aproximadamente 1.7:1 a pH 4.75 a 2.5:1 a pH 4.5. Por consiguiente, una composición la cual es estable a 20◦ C se cambiará a una nueva composición estable cuando se almacena a 40◦ C. El objeto de este ejemplo es establecer y comparar las proporciones requeridas para estabilidad a 2◦ C, 22◦ C y 39◦ C sobre un intervalo de pH que abarca de 3.8 a 8.25. Protocolo

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1. Se prepararon amortiguadores de ácido cítrico 0.2 M - fosfato de potasio 0.2 M a pHs 3.8 y 8.25. 2. Utilizando soluciones del punto 1 anterior se prepararon las siguientes soluciones a temperatura ambiente: 15

a) 67.06 mM de monohidrato de creatina en amortiguador a pH 3.8 (1 g en 100 ml) b) 67.06 mM de creatinina en amortiguador a pH 3.8 (0.758 g en 100 ml) c) 67.06 mM de monohidrato de creatina en amortiguador a pH 8.25 (1 g en 100 ml)

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d) 67.06 mM de creatinina en amortiguador a pH 8.25 (0.758 g en 100 ml) 3. Las soluciones 2a y 2c se mezclaron en diferentes proporciones para obtener soluciones de 67.06 mM de monohidrato de creatina con valores de pH como sigue: 25

3.8, 4.0, 4.2, 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.25, 6.5, 6.75, 7.0, 7.25, 7.5, 7.75, 8.0, 8.25 30

35

4. Similarmente, las soluciones 2b y 2d se mezclaron en diferentes proporciones para tener soluciones de 67.06 mM de creatinina a los mismos valores de pH identificados en el punto 3 anterior. 5. Soluciones de monohidrato de creatina y creatinina de las etapas 3 y 4 se mezclaron, para formar soluciones de los valores de pH correctos necesarios para producir las proporciones mol:mol de creatinina a creatina mostradas en la tabla 1 (inicialmente derivada de la figura 3), en un volumen final de 10 ml en un tubo de vidrio con tapa de vuelta. Se prepararon muestras por triplicado. 6. Las muestras se taparon y se esterilizaron con calor durante 30 minutos a 90◦ C.

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7. Un juego de muestras se almacenó a 2◦ C, otro juego a 22◦ C y el juego final se almacenó a 39◦ C. 8. Se tomaron alícuotas después de 5 y 6 semanas para medir el pH y análisis de creatina mediante el método enzimico descrito en el ejemplo 1 y en la sexta semana muestras para creatinina mediante el método de picrato alcalino (utilizando el método de punto final “Creatinine Diagnostic Kit”; kit o equipo suministrado por Sigma-Aldrich Company Limited, Poole, Dorset, UK). A pesar de la similitud química de creatina y creatinina, lo anterior no dio ninguna reacción con el método de picatro alcalino.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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ES 2 276 912 T3 TABLA 1 Proporciones mol:mol de creatinina a creatina inicialmente adicionadas en el ejemplo 5 (en todos los casos la concentración total final de creatinina + creatina es 67.06 mM) 5

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Resultados 65

Los análisis del contenido de creatina de muestras de las soluciones incubadas a 39◦ C no mostraron cambios significativos entre las semanas 5 y 6. El cambio medio en concentración fue de + 0.76 (SD 1.3)mmol/l que corresponde a un incremento de sólo 0.113 g de monohidrato de creatina por litro. El cambio en porcentaje de las semanas 5 y 6 en estas muestras fue de 3.1 (3.8) % que es del mismo orden del error analítico del método. 11

ES 2 276 912 T3 Como se muestra en la figura 6, a 39◦ C la proporción de creatinina a creatina se incrementa rápidamente en las muestras en donde el pH final está entre 4.6 (circa 2.1:1) y 3.7 (circa 10.0:1). Entre pH 5.2 y 8.8 la proporción es igual o menor a 1.0. A pHs mayores que 6.0 la proporción disminuyó aproximadamente en forma lineal desde 0.9 a una proporción en pH 8.8 de 0.6. 5

A pesar de inicio en el mismo pH y con concentraciones iguales de creatina y creatinina, existieron claras diferencias en pH al final de las 6 semanas de incubación a 2, 22 y 39◦ C (tabla 2). En todos los casos, las soluciones incubadas a 39◦ C tenían el pH más bajo y aquellas a 2◦ C el pH mas alto. El pH final alcanzado es el resultado directo de: 10

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20

a) el efecto inmediato de temperatura en la actividad del ión de hidrógeno de la soluciones, puesto que al incrementar la temperatura se provoca una disminución en el pH; y b) el efecto de conversión de creatina a creatinina, un proceso que renueva iones de hidrógeno incrementa el pH, o, conversión de creatinina a creatina, la cual libera iones de hidrógeno y provoca una disminución en el pH, hasta que se alcanza el equilibrio entre las concentraciones de creatina y creatinina. La extensión de cualquier cambio dependerá de que tan lejos las concentraciones iniciales de creatina y creatinina están de aquellas en el equilibrio y serán más grandes cuando se inicie con ya sea sólo creatina o creatinina (como en el ejemplo 2). Éste puede ser un proceso lento y, como se muestra en la figura 2, puede tomar hasta ocho semanas con una solución de pH bajo, inicialmente compuestas de sólo creatina. (Como la temperatura de incubación en el ejemplo 2 fue de 22◦ C, entonces un tiempo ligeramente más corto para alcanzar el equilibrio deberá de esperarse a 39◦ C). La magnitud del cambio en el pH causado por la interconversión de creatina y creatinina depende de las concentraciones absolutas de creatina y creatinina, así como de la capacidad de amortiguamiento del medio utilizado. Sin embargo, un conocimiento de estos factores permite soluciones de composiciones finales conocidas de creatina y creatinina y pH a ser preparadas.

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TABLA 2 30

El efecto de temperatura sobre pH de una solución de creatina y creatinina de 67 mmol/l (concentración combinada) hecha en amortiguador de ácido cítrico - fosfato de potasio 0.2 M, después de 6 semanas de incubación permite alcanzar el equilibrio

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(El valor de inicio de pH fue esencialmente como aquel que se indica para los ejemplos incubados a 22◦ C). 60

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Las proporciones finales de mol:mol creatinina a creatina de la soluciones preparadas con los mismos pHs iniciales no fue idéntica en los tres juegos de incubación. Sin embargo, como se muestra en la figura 7, las proporciones mol:mol de creatinina a creatina durante las 3 temperaturas estuvieron muy cercanas entre sí cuando estas se compararon con el pH final de cada solución. Por consiguiente, la proporción mol:mol en equilibrio de soluciones de creatina y creatinina de diferente pH, principalmente están influenciadas por el pH y no por la temperatura.

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ES 2 276 912 T3

5

La figura 8 muestra las proporciones mol:mol de creatinina a creatina de la soluciones en los diferentes pHs al final de 6 semanas de incubación a 22◦ C junto con la ecuación lineal polinomial de 7◦ orden, la cual optimizó este dato (coeficiente de regresión, r = 1.00). Las proporciones predecidas por esta línea son idénticas a aquellas mostradas en la figura 3 obtenidas después de 17.7 semanas de incubación a 22◦ C, pero en donde las soluciones estaban inicialmente compuestas solamente de creatina y no de creatinina. Esto confirma los datos en el presente ejemplo. Discusión y Conclusiones

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15

Al iniciar con soluciones compuestas de creatina a creatinina en proporciones de mol:mol cercanas a aquellas de la figura 3 que están en equilibrio, se alcanzó la estabilidad dentro de la 6 semanas cuando se incubó entre 2 y 39◦ C, después de 5 semanas cuando se incubó a 39◦ C. El equilibrio probablemente mayor se alcanzó mucho más temprano en todas las tres temperaturas. Los resultados mostrados en las figuras 6 a 8 se refieren a creatina y creatinina cuando están en equilibrio estable entre sí y pueden ser utilizados para construir proporciones mol:mol de creatinina a creatina en cualquier pH desde 3.8 a 8.8 que cuando se mezclan inmediatamente podrían estar en equilibrio estable.

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A temperatura ambiente (22◦ C) a un pH final de 4.6, la proporción de creatinina a creatina fue de 2.1:1. Este es el límite superior considerado como práctico para una bebida estable que contiene creatina. Por debajo de un pH final de 4.6, la cantidad de creatinina para mantener la estabilidad de creatina es de excesivo desperdicio de material e impráctica. A un pH final de 5.2 la proporción es de aproximadamente 1.0:1 lo cual es un nivel práctico y proporciona una bebida sabrosa con un pH acídico. Composiciones con pH en donde la proporción es menor de 1.0: 1 son también prácticas y tienen la ventaja de economía de materiales, sin tener la desventaja de no ser acídicas y menos sabrosas.

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Con refrigeración (e.g., 2◦ C) las composiciones recomendadas como útiles para bebidas son similares a aquellas descritas anteriormente para temperatura ambiente. A 39◦ C (considerado como el extremo de una temperatura ambiente elevada) el pH más bajo que soporta una proporción de mol:mol de creatinina a creatina de 1.0:1, es 5.2-5.5 y define el pH más bajo para el intervalo práctico de composiciones para bebidas.

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El factor más importante que influencia la proporción de creatina a creatinina en el equilibrio es el pH. Si la creatina y la creatinina son mezcladas en las proporciones a las cuales ocurre el equilibrio a un pH especificado, entonces estas composiciones serán inmediatamente estables, como también lo será el pH. Cuando la composición inicial esta a cada del lado de aquel en equilibrio, entonces concentraciones de cada una se moverán hacia aquellas al equilibrio. Si esto implica formación de creatinina, entonces el pH de la composición se incrementará, mientras si esto implica formación de creatina, entonces el pH disminuirá. La extensión o punto al cual el pH se cambia dependerá del cambio absoluto en creatina o creatinina que debe ocurrir para alcanzar el equilibrio y la capacidad de amortiguamiento del medio. El tiempo tomado para alcanzar el equilibrio será determinado porque tanto difiere la proporción mol:mol inicial de aquella en equilibrio. Calentamiento o enfriamiento produce un efecto inmediato sobre el pH el cual si no se invierte impulsará la interconversión de creatina/creatinina a un nuevo estado de equilibrio. Si enfriamiento (e.g., refrigeración a 2◦ C) se aplica a una solución ya en equilibrio, entonces el efecto será el de incrementar el contenido de creatina a expensas de la creatinina. Esto “tirará hacia atrás” algo de la extensión o punto del incremento inicial (inmediato) en el pH con enfriamiento antes de establecerse en un valor todavía por arriba del inicial, soportando una proporción menor mol:mol de creatinina a creatina. El tiempo tomado para alcanzar un nuevo equilibrio será mayor a pHs bajos. Con calentamiento se esperará lo opuesto con una disminución inicial en el pH que, si las composiciones de creatina y creatinina estaban inicialmente en equilibrio, será “tirado hacia atrás” hasta un cierto grado hacia el pH inicial. Eventualmente, el pH se fijará a un pH inferior que aquel antes del calentamiento, y la composición tendrá una proporción mayor mol:mol de creatinina a creatina. La disminución del pH al incrementar la temperatura siempre provocará un cambio mayor en la proporción mol:mol creatinina a creatina que incrementará el pH (por la misma magnitud) al disminuir la temperatura. Sin embargo, el lograr el equilibrio generalmente todavía será más rápido cuando las soluciones sean calentadas en lugar de enfriadas. Para soluciones con pH bajo el tiempo para alcanzar un nuevo equilibrio será bastante largo. En donde composiciones son preparadas en las cuales las concentraciones de creatina y de creatinina sean significantemente eliminadas de aquellas en equilibrio, y, en donde estas soluciones son después calentadas o enfriadas durante periodos prolongados, entonces ambos factores descritos anteriormente se aplicarán. En todos estos casos, sin embargo, la extensión del cambio puede minimizarse si la influencia inmediata en el pH de calentamiento o enfriamiento de la solución base (i.e., la solución en ausencia de creatina y creatinina adicionadas) es conocida y al aplicar las proporciones mol:mol de creatinina a creatina descritas en la figura 6 a 8 cuando se prepara la composición. Basado en estos datos obtenidos anteriormente, la tabla 3 muestra las proporciones mol:mol de creatinina a creatina de soluciones de diferente pH en equilibrio y las correspondientes concentraciones de creatina (calculada como el monohidrato) y creatinina en una bebida de 500 ml. Por conveniencia, la concentración de creatina por sí misma se ha 13

ES 2 276 912 T3 fijado en todos los casos a 5 g de monohidrato de creatina, y la concentración de creatinina permitida para que varíe de acuerdo al caso. TABLA 3

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Contenidos de creatina y creatinina estimados de una bebida de 500 ml de diferentes pHs almacenada a 22◦ C durante 6 o más semanas 10

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Ejemplo 6 55

Este ejemplo describe la formulación detallada de una composición acídica de acuerdo con la invención. La composición toman la forma de un polvo seco, el cual es adicionado al agua para constituir un producto alimenticio que comprende creatina, creatinina y Aloe Vera en la cual la creatina está sustancialmente estable.

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ES 2 276 912 T3 Ingredientes

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Monohidrato de dextrosa Ácido cíclico (monohidrato) Pectina (estabilizador) Sal Citrato de trisodio (dihidrato) Polvo de beta-caroteno Cloruro de potasio Sabor toronja Fosfato tricalcico Carbonato de magnesio pesado Premezcla de vitamina Sabor limón Sabor naranja Aspartame Monohidrato de creatina Creatinina Extracto de Aloe Vera liofilizado

300.0 g 50.0 g 6.0 g 5.0 g 130.0 g 3.0 g 2.9 g 2.9 g 2.1 g 2.1 g 1.8 g 1.4 g 1.4 g 1.0 g 149.0 g 113.0 g 44.0 g

Total

815.6 g

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Aproximadamente 75 gramos de la mezcla anterior, cuando se suspendió en un litro de matriz o se disolvió en un litro de agua proporciona, por 330 ml de porción, aproximadamente 4.4 g de creatina, 8.5 g de carbohidrato, 1.25 g de extracto de Aloe Vera, (equivalente a 250 ml de jugo), energía 34 kcal (suponiendo un contenido cero en calorías para la matriz de soporte), calcio, potasio, magnesio y vitaminas (vitamina E 3.4 mg, vitamina C 16.2 mg, tiamina 0.3 mg, riboflavina 0.4 mg, niacina 5 mg, vitamina B6 0.4 mg, folacin 85 µg, vitamina B12 0.9 µg, Biotina 0.08 mg y ácido pantoténico 2.2 mg) y trazas de proteína, grasa y fibra. La solución tenía un pH de aproximadamente 5.0. La creatina es sustancialmente estable durante al menos siete días a temperatura ambiente.

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Ejemplo 7 Este ejemplo ilustra el método para proporcionar una suspensión de creatina y una cantidad suficiente de creatinina en una matriz de soporte comestible para producir la creatina sustancialmente estable a temperatura ambiente.

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El monohidrato de creatina (1.7 g) se disolvió en 100 ml de ácido cítrico 0.1 M (para dar un pH 2.5-3) y se calentó la solución durante cinco horas a 90◦ C. Esto convirtió de 75 a 100% de la creatina en creatinina y el pH entonces se incrementó a 5.0 por la adición de 100 ml de una solución de fosfato de potasio 0.1 M. Cuatro gramos de goma de xantano entonces se adicionaron y se siguió calentando hasta que la goma se disolvió. La mezcla fue entonces enfriada a 40◦ C. Una lechada de 22 g de creatina micronizada en 20 ml de agua se adicionó, y la mezcla bien agitada durante tres minutos utilizando un mezclador de vortex para dar un gel en el cual la creatina micronizada se suspendió uniformemente. La mezcla completa se enfrió subsecuentemente en forma rápida a temperatura ambiente en el cual punto la suspensión formó un gel sólido o semisólido con un contenido de creatina de 10 g por 100 ml, la cual es sustancialmente estable a 22◦ C durante al menos 30 días.

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ES 2 276 912 T3 REIVINDICACIONES

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1. Composición líquida acuosa para consumo humano, que comprende creatina disuelta y una cantidad de creatinina suficiente para producir la creatina disuelta allí mismo sustancialmente estable tal que al menos 75% de la creatina en la composición inmediatamente después de la formulación, permanece sin cambiar durante el almacenamiento sobre el intervalo de temperatura de 2 a 50 º C durante un período al menos 30 días, la composición tiene un pH entre 2.5 y 8.5, en donde la cantidad de creatinina está presente ab initio es decir, sobre la formación de la composición final. 2. Composición según la reivindicación 1, en la cual la proporción de creatinina con respecto a creatina (mol :mol) no es menor que 1:10 y no más de 10:1. 3. Composición según la reivindicicación 2, en la cual la proporción de creatinina con respecto a creatina (mol: mol) no es menor que 1:8 y no mayor que 5:1.

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4. Composición según alguna de las reivindicaciones precedentes, que tiene un pH en el intervalo de 3.0 a 7.0. 5. Composición según la reivindicación 4, que tiene un pH en el intervalo de 4.0-6.5. 6. Composición según la reivindicación 4, que tiene un Ph en el intervalo de 4.5 a 5.5.

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7. Composición según alguna de las reivindicaciones precedentes, que comprende uno o más componentes adicionales seleccionados del grupo que consiste de: vitaminas, lípidos, proteínas, carbohidratos, polioles, aminoácidos, elementos traza, colorantes, saborizantes, endulzantes artificiales, sustancias que mejoran el rendimiento y la salud natural, antioxidantes, estabilizadores, preservativos y amortiguadores. 8. Composición según alguna de las reivindicaciones precedentes, que comprende extracto de Aloe Vera.

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9. Composición según alguna de las reivindicaciones precedentes, en la cual la composición es una bebida adecuada para consumo humano. 10. Composición según alguna de las reivindicaciones precedentes, que comprende una concentración de creatina de al menos 0.15 g/100 ml.

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11. Composición según la reivindicación 10, que comprende una concentración de cretina de al menos 0.3 g/100 ml. 12. Composición según la reivindicación 10, que comprende una concentración de creatina de al menos 0.4 g/100 ml.

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13. Composición según la reivindicación 10, que comprende una concentración de creatina de al menos 0.5 g/100 ml.

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14. Composición según alguna de las reivindicaciones precedentes, en donde la creatina está presente en la forma de monohidrato de creatina o fosfato de creatina. 15. Composición según alguna de las reivindicaciones precedentes, en donde una porción normal de la misma proporciona una dosis fisiológicamente efectiva de creatina.

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16. Composición según la reivindicación 1, en donde el procesamiento previo a la formación de la composición final involucra la conversión deliberada de creatina a creatinina. 17. Método para preparar una composición que contiene creatina líquida acuosa según la reivindicación 1, el método comprende las etapas de: proporcionar, en la misma composición, creatina disuelta y creatinina ab initio para producir la creatina suficientemente estable tal que al menos 75% de la creatina en la composición inmediatamente después de la formulación, permanezca sin cambiar durante el almacenamiento sobre el intervalo de temperatura de 2 a 50ºC durante un período de al menos 30 días. 18. Método según la reivindicación 17, que comprende la etapa de mezclar un medio acuoso con creatina y creatinina. 19. Método según la reivindicación 18, que comprende las etapas de: proporcionar una solución de creatina; someter la solución de creatina a condiciones adecuadas de modo que el menos parcialmente se convierta la creatina a creatinina, por lo cual se forma suficiente creatinina ab initio para producir la creatina en la composición resultante sustancialmente estable de modo que forme una composición de acuerdo con la reivindicación 1. 20. Método según la reivindicación 19, en donde la etapa de someter la solución de creatina a condiciones adecuadas implica el calentar la solución por arriba de la temperatura ambiente. 16

ES 2 276 912 T3 21. Método según la reivindicación 19, en donde la solución de creatina se calienta a por lo menos 90ºC durante al menos 30 minutos. 5

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22. Método según la reivindicación 18, que comprende las etapas de: proporcionar un solución de creatina; proporcionar una solución de creatinina; y mezclar las soluciones de modo que se forme una composición resultante en la cual existe suficiente creatinina ab initio para producir la creatina sustancialmente estable de modo que se forme una composición de acuerdo con la reivindicación 1. 23. Método según la reivindicación 22, en donde el pH de la solución de creatinina es más bajo que el pH de la solución de la composición resultante que comprende creatina. 24. Método según la reivindicación 23, en donde pH de la solución de creatinina está en el intervalo de 2.5 a 3.5, y el pH de la solución de la composición resultante que comprende creatina está en el intervalo de 4.0 a 6.5.

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25. Método según la reivindicación 17, que comprende las etapas de: proporcionar creatina sólida; proporcionar creatinina sólido; mezclar los dos sólidos para proporcionar una composición resultante que, cuando se disuelve en solución acuosa, proporciona una composición de acuerdo con la reivindicación 1.

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