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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k kInt. Cl. : A61K 31/12

11 N´ umero de publicaci´on: 7

51

˜ ESPANA

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2 181 806

A61P 35/00

TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 95941665.2 kFecha de presentaci´on: 04.12.1995 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 800 387 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 15.10.1997

T3

86 86 87 87

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54 T´ıtulo: Chalconas y sus ´ eteres con actividad antiproliferativa en los tumores de ´ utero, ovario y

mama.

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73 Titular/es: INDENA S.p.A.

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72 Inventor/es: Bombardelli, Ezio;

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74 Agente: Carpintero L´ opez, Francisco

30 Prioridad: 20.12.1994 IT MI942568

Viale Ortles, 12 20139 Milano, IT

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

01.03.2003

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 181 806 T3

01.03.2003

Aviso:

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Mancuso, Salvatore y Delle Monache, Franco

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 181 806 T3 DESCRIPCION Chalconas y sus ´eteres con actividad antiproliferativa en los tumores de u ´ tero, ovario y mama. 5

10

15

20

25

La presente invenci´on se refiere a los ´esteres de chalconas con ´acido ac´etico, but´ırico, palm´ıtico y ximen´ınico o a los complejos de chalconas con fosfol´ıpidos, relacionados con el tratamiento y prevenci´ on de los tumores de u ´ tero, ovario y mama, as´ı como a las formulaciones que los contienen. Recientemente, se ha demostrado que algunos flavonoides tienen actividad anticancerosa (Cancer Research 48, 5754, 1988) y actividad quimiopreventiva en algunos tumores (J Nat Prod 53, 23; 1990). En particular, se ha demostrado que la quercetina, un flavonoide casi ubicuo en las plantas, tiene una cierta actividad inhibitoria sobre la proliferaci´ on de las c´elulas de leucemia humana (Br J of Haematology 75, 489, 1990) y de otras l´ıneas celulares (Br J of Cancer 62, 942, 1990; Int J Cancer 46, 1112, 1990; Cancer Chemother Pharmacol 28, 255, 1991; Gynecologic Oncology 45, 13, 1991, 1992), adem´as de una acci´on sin´ergica con los productos quimioter´apicos convencionales. Aunque se desconoce el mecanismo de esta acci´on inhibidora sobre la proliferaci´ on, es probable que est´e relacionado con la interacci´on de este flavonoide con los receptores de estr´ ogenos de tipo II (J Steroid Biochem 30, 71, 1988). Clark describi´ o estos loci por primera vez (J Biol. Chem 253, 7630, 1978) en 1978 en el u ´tero de rata, y demostr´ o que, si bien muestran la misma especificidad por los esteroides y tejidos, son distintos de los receptores de estr´ogenos (RE) “verdaderos”, ya que se encuentran en una concentraci´on mayor que ´estos y tienen una constante de afinidad-disociaci´on aparente m´ as baja para el estradiol (KD: 10-20 mM frente a 0,2-1,0 nM para los RE). Los compuestos con estructura chalcona isocordo´ına, 4-hidroxiderricina, 2-hidroxiderricina, 3hidroxiderricina, 2’4’-dihidroxichalcona, 4,2,4’-trihidroxichalcona y cordo´ına tienen una afinidad notable por los receptores estrog´enicos de tipo II, junto a una importante actividad antiproliferativa sobre las l´ıneas tumorales de u ´tero, ovario y mama. Las estructuras de los compuestos citados anteriormente son las siguientes:

30

35

40

45

50

55

60

R1

R2

R3

R4

R5

S1 Isocordo´ına

H

H

Prenilo

H

H

S2 4-hidroxiderricina

Me

OH

Prenilo

H

H

S3 2-hidroxiderricina

Me

H

Prenilo

OH

H

S4 3-hidroxiderricina

Me

H

Prenilo

H

OH

S5 2’,4’-dihidroxichalcona

H

H

H

H

H

S6 4,2’,4’-trihidroxichalcona

H

OH

H

H

H

S7 cordo´ına

Prenilo

H

H

H

H

2

ES 2 181 806 T3 Otras chalconas estrictamente relacionadas con las primeras, en lo que se refiere a la estructura qu´ımica, como 4-hidroxicordo´ına y dihidroxordo´ına, cuyas estructuras se exponen m´as adelante, no muestran afinidad por los receptores mencionados anteriormente. 5

10

15

20

25

Chalconas

R1

R2

R3

S8 4-hidroxicordo´ına

Prenilo

OH

H

S9 dihidrocordo´ına

Prenilo

H

H

Los compuestos (I) se pueden preparar seg´ un los m´etodos convencionales descritos en Il F´armaco 30, 449-55, 1975; Il F´ armaco 32, 261-269, 1977; Il F´armaco 30, 326-42, 1975. 30

La afinidad de los compuestos I por los receptores estrog´enicos de tipo II y la actividad antiproliferativa sobre las c´elulas de tumor ov´arico se resume en la Tabla siguiente. TABLA 35

Afinidad de uni´ on a los receptores estrog´enicos de tipo II y actividad antiproliferativa sobre c´elulas de c´ ancer OVCA 433 in vitro 40

45

Chalconas

CIoo 50 (µM)

CIooo 50 (µM)

S1

1.2

1.2

S2

17.0

10.6

S3

4.2

18.0

S4

5.0

12.1

S5

2.5

0.6

S6

5.0

3.2

S7

6.0

4.2

50

55

oo

60

Concentraci´on que consigue una inhibici´on del 50 % de la proliferaci´ on celular

ooo

Concentraci´on que consigue un desplazamiento∗ del 50 % del estradiol marcado (40 nM) del re-

ceptor.

3

ES 2 181 806 T3

5

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15

La evaluaci´on de la uni´ on al receptor estrog´enico se ha realizado con c´elulas tumorales de ovario y otros o´rganos. Las c´elulas se hicieron crecer en un cultivo monocapa con el medio esencial m´ınimo al que se a˜ nadi´ o suero bovino y 200 unidades/ml de penicilina para mantener el medio est´eril. Para hacer que las pruebas fueran reproducibles, se a˜ nadi´ o tripsina a las c´elulas cada semana y se colocaron en placas con una densidad de 8 x 10−4 y se incubaron a 37◦ C con una atm´osfera que conten´ıa un 5 % de CO2 y humedad. Para evaluar la actividad de los compuestos, las c´elulas se colocaron en pocillos (Falcon 3046, Becton Dickinson NY) en una concentraci´ on de 1 x 10−5 /ml en la cantidad m´ınima de sustrato. Despu´es de 24 horas se cambi´o el sustrato por sustrato reciente y se a˜ nadieron las chalconas disueltas en etanol absoluto. Los controles se trataron de igual modo con el veh´ıculo en ausencia del principio activo que se estudiaba. El tratamiento descrito se repiti´ o a intervalos de 24 horas durante las 72 que dur´ o la prueba. Despu´es de 24 horas se incubaron las c´elulas con cantidades proporcionales de estradiol marcado (3 H-E2, 40 Ci/mmol, Amersham, Reino Unido) solo o en presencia de una cantidad 100 veces mayor on, las c´elulas se lavaron de dietiletilbestrol a 4◦C durante 2,5 horas. Al final del periodo de incubaci´ r´ apidamente con sustrato fresco y se incubaron durante 30 minutos con NaOH 1 M. La radiactividad se midi´ o con un contador de centelleo y la especificidad de la uni´ on se calcul´ o como la diferencia entre los preparados que conten´ıan o no el dietiletilbestrol. Los resultados se expresan como el n´ umero de loci de uni´ on por c´elula, seg´ un los m´etodos convencionales. La inhibici´on de la proliferaci´ on celular se evalu´o por recuento directo de las c´elulas, comparando el crecimiento de los controles frente al de las c´elulas tratadas.

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Se ha encontrado que los ´esteres de los compuestos de la f´ ormula (I) con a´cido ac´etico, but´ırico, palm´ıtico o ximen´ınico, as´ı como con los complejos de los compuestos (I) con fosfol´ıpidos, poseen una importante actividad antitumoral y son objeto de la presente invenci´ on. 25

30

Adem´as, la invenci´on proporciona el uso de los ´esteres de los compuestos de la f´ormula (I), como se especifica anteriormente, o los complejos de compuestos (I) con fosfol´ıpidos, para preparar medicamentos con actividad anticancerosa, en particular para el tratamiento de tumores que expresan receptores estrog´enicos de tipo II. Los compuestos de la invenci´ on inhib´ıan in vivo la proliferaci´on celular, como se demostr´o por la medici´on del tama˜ no de los tumores implantados en rat´ on at´ımico desnudo, de acuerdo con las condiciones convencionales recogidas en la literatura. El tratamiento de los animales con dosis que oscilaron entre 1 y 100 mg/kg evidenci´ o una importante regresi´ on de los tumores estudiados hasta su desaparici´on en un porcentaje alto de los animales en estudio. En el hombre, los compuestos de la invenci´on mostraron una actividad sobre los tumores de ovario, mama y u ´tero que fue mayor que la de los medicamentos conocidos, como el tamoxifeno.

35

En las pruebas citadas anteriormente, los ´esteres de isocordo´ına, cordo´ına y 2’,4’-dihidroxichalcona, mostraron una actividad particularmente importante.

40

De acuerdo con otro aspecto m´as, la invenci´on proporciona preparados farmac´euticos que contienen los ´esteres o complejos de la invenci´on como principios activos, en una mezcla con los excipientes adecuados.

45

Los ´esteres de la invenci´on se pueden administrar favorablemente por v´ıa oral o por infusi´ on. Para la administraci´on oral, se demostr´ o que son particularmente u ´tiles los complejos de los compuestos (I) con fosfol´ıpidos naturales o sint´eticos, ya que forman complejos liposolubles estables con las chalconas; los triglic´eridos de cadena media y los excipientes relacionados tambi´en demostraron su utilidad. La posolog´ıa de los compuestos de la invenci´ on puede ser muy amplia, por ejemplo, entre 10 y 300 mg/d´ıa, administrada principalmente por v´ıa oral.

50

Los siguientes ejemplos ilustran mejor la invenci´ on. Ejemplo I Preparaci´ on de ximeninato de cordo´ına

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60

Se hace reaccionar 7 g de 4-O-prenil-2-hidroxiacetofenona con 7 g de benzaldeh´ıdo en 10 g de piperidina y 70 ml de etanol a 60-70◦C. Despu´es de 36 horas, el disolvente se elimina bajo vac´ıo y el residuo se suspende con 100 ml de benceno que se hab´ıa lavado abundantemente con HCl 2N. Despu´es de eliminar el benceno, se purifica el residuo en una columna de gel de s´ılice obteni´endose 3,5 g de cordo´ına. La cordo´ına resultante se hace reaccionar en 20 ml de piridina anhidra con 3 g de cloruro de a´cido ximen´ınico. La mezcla de reacci´on se viere en agua y el producto se extrae con cloruro de metileno. Despu´es de la cristalizaci´on en metanol, se obtienen 4,2 g de ximeninato de cordo´ına con un punto de fusi´ on de 164-166◦C. 4

ES 2 181 806 T3

Ejemplo II Preparaci´ on de palmitato de cordo´ına 5

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Se disuelven 10 g de 3-C-prenilresacetofenona y 10 g de p-hidroxibenzaldeh´ıdo en 15 g de piperidina y 200 ml de etanol absoluto y se mantienen durante 4 horas a 60◦ C. Despu´es de eliminar el disolvente, el residuo se suspende en 50 ml de HCl 2N y el producto se extrae con cloruro de metileno. Despu´es de eliminar el disolvente clorado, el residuo se purifica en gel de s´ılice obteni´endose 4,1 g de isocordo´ına con un punto de fusi´ on de 160-161◦C. Este producto se hace reaccionar con 8 g de cloruro de palmitoilo en 30 ml de piridina anhidra. Despu´es de diluir la mezcla de reacci´on con agua y posterior purificaci´ on en gel de s´ılice, se obtienen 6,2 g de dipalmitoilisocordo´ına, con un punto de fusi´ on de 131-132◦C. Ejemplo III

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Preparaci´ on de acetatos y butiratos de cordo´ına e isocordo´ına

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Estos productos se prepararon de acuerdo con los ejemplos I y II, usando respectivamente los cloruros o anh´ıdridos de los a´cidos correspondientes (punto de fusi´ on: acetato de cordo´ına, 131-133◦C; butirato ◦ de cordo´ına, 124-126 C. Ejemplo IV Preparaci´ on del complejo de isocordo´ına con dipalmitoilfosfatidilcolina

25

30

Se suspenden 3,08 g de isocordo´ına en 30 ml de cloruro de metileno y se a˜ naden 7,9 g de dipalmitoilfosfatidilcolina, y se deja reaccionar 1 hora con agitaci´ on. Cuando los reactivos se han disuelto completamente, la mezcla de reacci´on se concentra hasta un peque˜ no volumen y el concentrado se vierte en 50 ml de n-hexano. El material s´ olido que precipita se filtra y se seca a 40◦C durante toda la noche al vac´ıo, obteni´endose 7,2 g del complejo fosfol´ıpido-isocordo´ına con un punto de fusi´ on de 70◦ C.

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ES 2 181 806 T3 REIVINDICACIONES 1. Los ´esteres de isocordo´ına, cordo´ına, 4-hidroxiderricina, 2-hidroxiderricina, 3-hidroxiderricina, 2’,4’dihidroxichalcona, 4,2’,4’-trihidroxichalcona con a´cido ac´etico, but´ırico, palm´ıtico y ximen´ınico. 5

2. Los ´esteres de cordo´ına o isocordo´ına de acuerdo con la reivindicaci´on 1. 3. Complejos de isocordo´ına, cordo´ına, 4-hidroxiderricina, 2-hidroxiderricina, 3-hidroxiderricina, 2’,4’dihidroxichalcona, 4,2’,4’-trihidroxichalcona con fosfol´ıpidos naturales o sint´eticos.

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4. Composiciones farmac´euticas que contienen como principios activos los ´esteres de las reivindicaciones 1-2 o los complejos de la reivindicaci´on 3 en una mezcla con los excipientes adecuados. 5. El uso de los ´esteres de la reivindicaci´on 1 o de los complejos de la reivindicaci´ on 3 para la preparaci´ on de medicamentos con actividades anticancerosas y antagonistas sobre los receptores de los estr´ogenos de tipo II.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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