1. INTRODUCCIÓN La garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus es el ectoparásito de mayor importancia económica dentro de la explotación pecuaria está ampliamente distribuida por todo el país (Ojeda-Chi et al., 2011) principalmente en zonas tropicales y subtropicales (Soberanes et al., 2002). Este parasito artrópodo hematófago es causante de una enfermedad parasitaria externa que afecta a los bovino en todas su edades (Fernández, 2006). Entre los efectos más importantes en lo económico y productivo que producen las garrapatas al ganado bovino son daños a la piel, disminución en la producción de carne y leche y el costo para su tratamiento de las enfermedades transmitidas. (Baruch, 2012). La perdidas a nivel mundial por garrapatas están cerca de 1.6 billones de dólares al años, Rhipicephalus microplus es la garrapata de mayor importancia en México. (Navas, 2003). La dinámica poblacional de Rhipicephalus (Boophilus) microplus en la región de los Ríos del estado de Tabasco, se presenta durante todo el año pero en invierno se estima que puede vivir hasta 51 días a pesar de las condiciones climáticas. De manera general, el control actual de la garrapata está fundamentado en la aplicación de acaricidas químicos dirigidos a la fase de vida parasitaria de la garrapata. Esta fase representa el 5% de la población y el 95% restante se localiza en los pastos. El uso de estos productos químicos provoca residuos en la carne y daños al medio ambiente. Los consumidores son cada vez más exigentes de la calidad de los alimentos y por eso existe una gran necesidad de direccionar el sistema productivo de bovinos hacia tecnologías viables desde el punto de vista técnico y económico que permitan satisfacer las necesidades del consumidor, tales como un control biológico de la garrapata con el uso hongos entomopatogeno, por lo que el presente estudio consistió en determinar la dosis letal del hongo entomopatogeno Metarhizium anisopliae para el control biológico de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus en laboratorio.

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2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo general Determinar la dosis letal del hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae para el control biológico de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus en laboratorio.

2.2 Objetivos específicos - Evaluar la virulencia del hongo entomopatogeno Metarhizium anisopliae sobre la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus en estado adulto. - Evaluar la viabilidad de las conidias, y el crecimiento radial de Metarhizium anisopliae

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3. REVISIÓN DE LITERATURA

3.1 Generalidades de la garrapata La garrapata de la familia Ixodidae se reportan como parásitos obligados de reptiles desde hace aproximadamente 200 millones de años, en la era Paleozoica tardía o en el Mesozoico temprano, donde el género Ixodes representa a los miembros más primitivos de esta especie. Por su lado, los géneros Aponomma, Amblymma y el Hyalomma, pueden ser miembros del periodo Cretácico, ya que su aparición durante el Mesozoico tardío, correspondió a cambios del medio ambiente. Con la consecuente reducción de reptiles pertenecientes a la línea Rhynchosauria, antecesores de los actuales mamíferos y pájaros. Los géneros Dermacentor y Boophilus, probablemente no aparecieron antes de que los pájaros y los mamíferos reemplacen a los reptiles, durante el periodo terciario, hace aproximadamente de 65 millones a 70 millones de años (Durden et al., 1996). Las garrapatas aun siendo reconocidas como importantes parásitos de los animales (domésticos y silvestres), y de los humanos, tienen más relevancia por las numerosas enfermedades que pueden transmitir. Muchos de los agentes transmitidos por garrapatas tienen una prevalencia, y en otros casos se consideran como re emergentes, aun cuando los avances de la medicina han permitido reducir otras enfermedades transmitidas por artrópodos en diferentes lugares del mundo. Entre las enfermedades transmitidas por garrapatas a las personas destaca la enfermedad de Lyme, causada por una espiroqueta (Borrelia burgdorferi), que es, desde su identificación en 1982, la principal enfermedades transmitida por garrapatas (TBE) es una enfermedad vírica grave, distribuida ampliamente por Europa y Asia que afecta principalmente a personas que están en contacto con la naturaleza (granjeros, montañeros, campistas). (Barandika, 2010).

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3.1.1 Clasificación taxonómica El grupo de estos artrópodos, incluyen cerca de 825 especies divididas en tres familias: la Argasidae (garrapatas blandas), la Ixodidae (garrapata duras) y la Nuttalliellidae (Fr). La familia Ixodidae contiene alrededor de 650 especies, con cuatro subfamilias y trece géneros; la familia Argasidae comprende cinco géneros y alrededor de 170 especies y la Nuttalliellidae, tan solo una especie relativamente incipientem (Bazán, 2002, Santibáñez, 2012). Taxonomía de las garrapatas Phylum

Arhropoda

Subphylum

Chelicerata

Clase

Arachnida

Subclase

Acari

Orden

Parasitiformes

Suborden

Ixodida

Superfamilia

Ixodoidea

Familias: Ixodidae Grupo

Prostriata Subfamilia:

Ixodinae Genero :

Grupo

Ixodes

Metastriata: Subfamilia

Bothriocrotoninae Genero

Subfamilia

Bothriocroton

Amblymminae Genero

Amblymma 4

Subfamilia

Haemaphysalinae Genero

Subfamilia

haemaphysalis

Rhipicephalunae Genero

Anomalohimalaya Cosmiomma Dermacentor Hyalomma Margaropus Nosomma Rhipicentor Rhipicephalus

Argasidae Subfamilia

Argasinae Genero

Subfamilia

Argas

Ornithodorinae Genero

Ornithodoros Otobius Antricola Nothoaspis

Nuttalliellidae Genero

Nuttalliella

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3.1.2 Distribución La garrapata Rhipicephalus microplus, originaria del continente asiático y de la isla de java, pudo ser introducida en la mayoría de los países tropicales y subtropicales a través de la importación de ganado. Su presencia ha sido descrita en varios países del mundo y en la región Neotropical. Esta especie está distribuida desde el norte de Argentina hasta México, incluyendo las islas del Caribe y las Antillas (Cortes, 2010). En Europa, norte de Asia y C hina, Rhipicephalus appendiculatuses importante, mientras que en América, Asia y África, reportan Boophilus microplus, Rhipicephalus appendiculatus y Amblyomma hebream. Por su parte de las 81 especies de garrapatas que se encontraron en EE.UU, las más comunes en pequeños mamíferos fue Dermacentor variabilis. Los animales silvestres han sido factores intermedios que participan en la distribución de especies como Amblyomma variegatum (f), ya que las infestaciones ocurren por la migración de dichas especies (Bazán, 2002).

Figura 1: Ubicación de la cuenca lechera de Catazajá, Chiapas. (INEGI, 2005).

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2.1.3 Morfología Morfológicamente, las especies de la familia Ixodidae se caracteriza por poseer capitulo siempre en posición terminal (visible dorsalmente) y escudo dorsal en todos los estados biológicos. El dimorfismo sexual es acentuado (escudo pequeño y corto en hembras, larvas y ninfas, no sobrepasando la región media del cuerpo; mientras que en machos el escudo es largo y se extiende hasta la margen posterior). En las hembras se observan áreas porosas; hipostoma denticulado en la mayoría de los géneros, en muy pocos casos con crenulaciones. El último artículo o segmento del palpo de la pata IV está en posición ventral, situado en una cavidad en la extremidad distal del artículo III. Las placas espiriculares están situadas posteriormente a la pata IV (García, 2011). Estos ácaros presentan dos partes diferentes visibles, el tronco globoso y extremidades articuladas. La parte anterior, no es una cabeza propiamente dicha, ya que el cuerpo de la garrapata es una sola masa, tiene un conjunto de pies móviles que forman el gathosoma y una base que mide 4 mm de largo por 0.9 mm de ancho, por encima de este, se observan dos depresiones llamadas aéreas porosas de las

cuales sobresalen dos ganchos denominados quelíceros que

ayudan a romper la piel del hospedero (Bazán, 2002).

Figura 2: Estructura de la Garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus. (Bazán, 2002).

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Por debajo de los quelíceros, que aparecen en número par en forma de hoz y los ocelos a los lados, se observa una prolongación de la base de gathosoma llamado hipostoma, presenta una formula dentaria de 3/3, 4/4 que facilita la acción de perforar la piel del hospedero y además participa como órgano de fijación, consta de un par de pedipalpos conformado por cuatro segmentos. Cada pedipalpo desempeña dos funciones: una ayuda a proteger las partes suaves de la boca, la otra funciona como órgano sensorial (Bazán, 2002). Enseguida aparecen las extremidades con seis artejos: coxa, trocánter, fémur, tibia, pretarso y tarso. Es necesario señalar que los adultos y las ninfas poseen estigmas y se sitúan en el último para de coxas, mientras que las larvas carecen de ellas, además presentan dimorfismo sexual, siendo el macho de menor tamaño que la hembra. Cada extremidad mide en promedio de 10 a 12 mm en las hembras y de 3 a 4 mm en los machos. La parte posterior del acaro se denomina propodosoma (Bazán, 2002). El sistema de protección o cutícula posee tres capas: epicuticula, mesocuticula y endocuticula, en ella se aprecian poros, canales o espiráculos. La primera capa contiene; lípidos, sustancias cementantes, cuticulina y polyfenol que cumplen la alta función de protección al desecarse. Este sistema de protección, tiene la particularidad de sufrir elongaciones de hasta 20 veces su tamaño original cuando esta replete de sangre (Bazán, 2002). 3.1.4 Hospederos de la garrapata La mayoría de las garrapatas muestran preferencia por una especie de hospederos, pero no son totalmente específicas, mucha parasitan una gran variedad de animales. B. microplus muestra preferencia por bovinos, caprinos, equinos y ovinos, además se puede encontrar en porcinos, caninos, rumiantes silvestres y en menor grado humanos (navas, 2003).

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3.1.5 Ciclo biológico de Rhipicephalus Boophilus microplus El ciclo biológico en la garrapata Boophilus microplus ocurre entre el hospedero, la vegetación y el suelo de un sitio específico, comprende cuatro estados biológicos: el de huevo (incuba de 17 a 21 días), larva (7 a 10 días), ninfa (5 a 6 días) y adulto (1 a 3 días) de una fase a otra se lleva a cabo el proceso de ecdisis o desprendimiento del exoesqueleto; la fase parasita se inicia en el suelo (larva), luego trepa a las plantas más cercanas y más tarde al hospedero animal; tanto en los animales como en el suelo, la garrapata está sujeta a cambios ambientales. El adulto se deja caer del hospedero una vez que realiza la copula.

1 a 3 días

5 a 6 días 17 a 21 días 7 a 10 días

Figura 3: Ciclo biológico de la Garrapata Rhipicephalus microplus. (Fernández, 2006).

El género Boophilus oviposita de 2,000 a 5,000 huevos, aunque otros géneros puede ovipositar hasta 20,000 (Krober y Guerin, 2000). La incubación de los huevos ocurre de 17 a 21 días si sin favorables las condiciones ambientales, con una temperatura de 20.6 °C y un 80 % de humedad relativa. Si las condiciones le favorecen, la garrapata puede completar su ciclo de vida en 37 días, pero en la

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adversidad puede hacerlo hasta los 281 días, según el medio en que se encuentren (Bazán, 2002). 3.2 Hongos entomopatógenos Los entomopatógenos son microorganismos que provocan enfermedades en los insectos, y entre los agentes causales se encuentran virus, bacterias, hongos, protozoos y nematodos, entre otros. El uso de métodos biológicos de control representa ciertas ventajas como: especificidad sobre las plagas y enfermedades, bajo riesgo para el ser humano, animales benéficos y el ambiente, bajo costo gracias a su potencial de permanencia por largos periodos de tiempo en los cultivos al tiempo de permanencia ya que su en los cultivos es mayor si se compara con los productos químicos (Arenas, 2009). La patogenicidad, virulencia y agresividad son conceptos comunes en el lenguaje técnico propuesto para los hongos entomopatógenos. La virulencia es el grado de patogenicidad con que un organismo mata a un hospedero específico en condiciones programadas; la patogenicidad se define como la capacidad de un microorganismo para causar enfermedad y la agresividad se le define como la habilidad de un patógeno para invadir a su hospedero. La variación en la virulencia de las especies de hongos y entre cepas de un mismo hongo, debe caracterizarse mediante los métodos de RAPD-PCR la cual es una técnica confiable, ya que existen altos niveles de variación genotípica entre las diversas cepas (Bautista et al., 2013). 3.2.1 Propiedades de los hongos entomopatógenos -

Poseen un alto poder residual.

-

Conservan su virulencia en la preparación y antes de la dispersión del inoculo en el campo.

-

La especificidad

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-

Posibilidades de multiplicación y conservación en condiciones económicas rentables.

-

Alto poder patógeno suficientemente estable.

3.3 Generalidades de Metarhizium anisopliae Metarhizium anisopliae (metschnikoff) sorokin se ha utilizado para el control biológico de insecto plaga, además de otro dos hongos entomopatógenos Beauveria bassiana y Beauveria brongiarti. Metarhizium anisopliae es uno de los hongos más ampliamente utilizado en micoinsecticida a lo largo del mundo, principalmente como un agente de control. (Zimmermann, 2007). 3.3.1 Taxonomía de Metarhizium anisopliae La clasificación taxonómica del género Metarhizium anisopliae ha sufrido cambios de acuerdo a varios autores que clasifican a las especies de este género, con base a sus características morfológicas se reconocen dos especies: M. anisopliae y M. flavovoride. Mediante estudios moleculares se reconocen ambas especies de hongos, que existen cuatro variedades M. anisopliae var, majus. Recientemente se propone la existencia de nueve especies: M. anisopliae, M. guizhouense, M. pingshaense, M. acrium stat. Nov., M. lepidiotae stat. Nov., M. majus stat. Nov., M. globosum, M. robertsii y M. brunneum. También los estudios filogenéticos han permitido reubicar a las especies de Metarhizium al grupo de los Ascomycetes (Hypocreales; Clavicipitaceae) parasitos de insectos, al considerar además el origen e implicaciones evolutivas como reproducción, hábitat, el uso de hospederos vivos y otros invertebrados como fuente de alimento (Ojeda-Chi et al., 2011). Metarhizium anisopliae presenta la habilidad de crecer en forma saprofita, facilidad de diseminación de los conidios, capacidad de sobrevivencia en el suelo y reproducción asexual. Requiere temperatura óptima de 25 a 30 °C y humedad relativa del 100%. Los límites térmicos para la germinación de los conidios y de las 11

hinfas de M. anisopliae se encuentran alrededor de 37 a 40 °C respectivamente. A una humedad por debajo de 53% se reduce la viabilidad de los conidios (OjedaChi et al., 2011). Metarhizium anisopliae (Deuteromycetes: Moniliales), es un hongo imperfecto (Hyphomycete) que se presenta reproducción asexual. Fue uno de los primeros microorganismos que se usaron para el control de los insectos plaga. Primero se aisló por Metschnikoff en 1879, del escarabajo gallo del trigo; dicho aislado fue Anisoplia austriaca (Herbst) (Coleptera: Scarabeidae) descrito por Sorokin. Se le considera un agente de alto potencial en el control biológico de plagas agrícolas. Es una especie de hongo cosmopolita que no infecta animales de sangre caliente y tampoco existen reportes de sensibilidad humana al mismo (Zimmermann, 2007, Bazán, 2002). 3.3.2 Morfología Entre las características morfológicas destacan la coloración de la colonia, generalmente olivácea, amarillenta o verde obscura, dependiendo del aislamiento. El conidióforo es irregular y ramificado con dos a tres ramas en cada septa de 4 a 13.5 µm de longitud x 1.4 a 2.6 µm de diámetro. Fialides cilíndricas en forma de clava, adelgazados en el ápice, miden 6.3 a 13.5 µm de longitud y 1.8 a 3.6 µm de diámetro. Conidios unicelulares, cilíndricos y truncados, formadas en cadenas muy largas, hialinos a verde oliváceo. Miden 3.5 a 9 µm de longitud x 1.5 a 3.5 µm de diámetro (Orduño, 2009). 3.4 Ciclo de vida de Metarhizium anisopliae En general los hongos entomopatogeno desarrollan las siguientes fases sobre su hospedante: germinación, formación de apresorio, formación de estructuras de penetración, colonización y reproducción.

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El proceso se inicia cuando la espora o conidias se adhiere a la cutícula del insecto, luego desarrolla un tubo germinativo y un apresorio, con este se fija en la cutícula y con el tubo germinativo o haustorio (hifa de penetración) se da la penetración

al

interior

del

cuerpo

de

insecto.

La

germinación

ocurre

aproximadamente a las 12 horas post-inoculación y la formación de apresorios se presenta de 12 a 18 horas post-inoculación. En la penetración participa un mecanismo físico y uno químico, el primero consiste en la presión ejercida por estructura de la penetración, la cual rompe las áreas esclerosadas y membranosas de la cutícula. El mecanismo químico consiste en la acción enzimática, principalmente proteasa, lipasas y quitinasas, las cuales causan descomposición del tejido en la zona de penetración, lo que facilita el ingreso del hongo. Después de la penetración, la hifa se ensancha y ramifica dentro del tejido del insecto, colonizando completamente la cavidad del cuerpo del insecto, esto sucede en 3 o 4 días después de la inoculación. A partir de la colonización se forman pequeñas colonias y estructuras del hongo, lo que corresponde a la fase final de la enfermedad del insecto, ocurre 4 o 5 días después de la inoculación. (Castillo, 2006). 3.4.1 Adhesión de la espora a la cutícula del insecto. El primer contacto que hace la espora con la superficie del hospedero es por la cutícula. Las características físicas y químicas de las superficies de la cutícula del insecto y la espora son las responsables de esta unión. En algunos hongos la adhesión es un fenómeno no específico, mientras en estas especies es un proceso específico. Algunas glicoproteínas pueden servir como un receptor específico para las esporas (Soto, 2008).

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3.4.2 Germinación de la espora. La germinación es el proceso mediante el cual una espora emite uno o varios pequeños tubos germinales los cuales por el crecimiento y alargamiento dan origen a las hifas. La germinación de las esporas en gran parte depende de la humedad ambiental y temperatura pero en menor grado de las condiciones de luz y nutricionales. El nivel de agua es determinante en el crecimiento de los hongos y pequeñas diferencias en los niveles de humedad relativa después de la aplicación de conidias, pueden determinar de un modo u otro el éxito del hongo en el control de insectos de plagas. El resultado de la germinación y la penetración no depende necesariamente del porcentaje total de germinación sino del tiempo de duración de la germinación, modo de germinación, agresividad del hongo, el tipo de espora y la susceptibilidad del hospedero (Soto, 2008). 3.4.3 Penetración del integumento. La penetración de la cutícula del insecto por conidias geminadas, ocurre como resultado de una combinación entre la degradación enzimática de la cutícula y la presión mecánica por el tubo germinal. El modo de penetración principalmente depende de las propiedades de la cutícula, grosor, esclerotización y la presencia de sustancia anti fúngicas y nutricionales. La fuerza mecánica es notable en el extremo de una hifa invasiva donde la capa cuticular es deformada por presión. Se produce un tubo germinativo y un apresorio, con este se fija en la cutícula y con el tubo germinativo o haustorio (hifa de penetración) se da la penetración al interior del cuerpo del insecto. En la penetración participa un mecanismo físico y un químico, el primero consiste en la presión ejercida por la estructura de penetración, la cual rompe las áreas esclerosadas y membranosas de la cutícula. El mecanismo químico consiste en la acción enzimática, principalmente proteasas 14

y quitinasas, las cuales causan degradación del tejido en la zona de penetración, lo que facilita la penetración física (Soto, 2008). Las enzimas descubiertas en el tubo germinativo son proteasas, aminopeptidasas, lipasas, esterasas, y N-acetil-glucosamidasa (quitinasas). Estudios in vitro indican que en la digestión del integumento sigue una secuencia de lipasa proteasa quitinasa. La producción de proteasa y quitinasa sobre la cutícula del insecto, se ha demostrado con M. anisopliae la enzima principal es una endoproteasa que disuelve la proteína matriz que cubre la quitina cuticular.

Por lo tanto, la

producción de quitinasa ocurre después del proceso de infección y una vez que el hongo atraviesa la cutícula debe vencer el sistema inmunológico del hospedero antes de entrar a la hemolinfa y desarrollarse dentro del insecto. (Soto, 2008). 3.4.4 Replicación en el hemocele. Después de llegar al hemocele, la mayoría de los hongos convierten el crecimiento micelial en una fase de levadura o sea crecimiento por germinación. Se producen toxinas y enzimas. Aunque algunos hongos aparentemente no poseen toxinas, matan el insecto al consumidor todos los nutrientes o por física destrucción. Los hongos pueden evitar la defensa inmune de un insecto por el desarrollo de protoplastos que no son reconocidos por la población de hemocitos del insecto formando cuerpos hifales multiplicándose y dispersándose rápidamente y produciendo micotoxinas. Las toxinas causan la muerte del insecto debido a la degeneración de los tejidos, producto de la perdida de la integridad estructural de las membranas seguido de la deshidratación de las células por perdida de fluido. Posterior al crecimiento del hongo en el hemocele, la micosis induce síntomas fisiológicos anormales en el insecto tales como convulsiones, carencia de coordinación y comportamientos alterados al igual de una competencia entre el hongo y la flora intestinal. En la mayoría de los casos los hongos producen sustancia antibacteriales y cambio de color del cadáver. Después de muerto el insecto, si la disponibilidad de agua es alta los hongos emergen al exterior a través 15

de la cutícula y esporulan sobre el cadáver produciendo inóculo para infectar a otros insectos si las condiciones no son favorables, queda dentro del cadáver del insecto, donde pueden sobrevivir por algunos meses y eventualmente producirá esporas cuando lleguen las condiciones favorables. La

esporulación ocurre

generalmente en cadáveres pero pueden también ocurrir en insectos vivos (Soto, 2008).

Figura 4: Proceso de infección de los hongos entomopatógenos (García ,2012).

3.5 Generalidades de Beauveria bassiana El hongo hyphomycete, Beauveria bassiana (bálsamo) Vuillemin es un patógeno que infecta naturalmente numerosos insectos. Es considerado como una de la especies más promisorias por su potencial como agente biocontrol de insectos (España, 2000).

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3.5.1 Taxonomía. Es un hongo imperfecto de la división Ascomycota, clase Sordariomycetes, orden Hypocreales, y familia Clavicipitaceae. Este hongo, tanto en cultivo puro como en insectos, presenta un micelio algodonoso de color blanco y tiene una esporulación abundante de color crema con apariencia polvorienta, lo que le da el nombre con el que se le conoce comúnmente “muscardina blanca” (Pozo, 2012) 3.5.2 Morfología. Tiene el micelio hialino y septado que se ramifica formando conidióforos que crecen en forma de racimos. Cada conidióforo está compuesto por una célula conidiógena cuya base es abultada y conforme se aleja de la base se produce un adelgazamiento (forma de cuello de botella) del cual surge otra estructura llamada esterigma en forma de zigzag. En ésta se insertan los conidios (uno por cada quiebre del zigzag), que son globosos a subglobosos de 2 a 3 x 2 a 2.3 μm. (Pozo, 2012). 3.6 Dosis letales 3.6.1 Bioensayo con entomopatógenos Es cualquier método que permita medir la respuesta biológica que produce un material o substancia con base al estímulo generado. En toxicología

y más

específicamente en patología de insectos, constituyen una herramienta de vital importancia para la evaluación de los niveles de resistencia o susceptibilidad de las plagas. El análisis de Probit (nacido del análisis toxicológico), ha sido una herramienta muy valiosa para analizar datos de dosis-respuesta de microorganismos patogénicos de insectos. Salvo algunas consideraciones de criterios de evaluación, el análisis de Probit no tiene modificaciones para su aplicación en organismos entomopatógenos. 17

Es bueno mencionar que antes de llevar a cabo un bioensayo se debe investigar cual es el método internacionalmente recomendado para la especie en cuestión. En caso de que no exista, se sugiere utilizar aquel método recomendado para otra especie emparentado taxonómicamente. El hecho de no apegarse a las normas establecidas trae problemas tales como la imposibilidad de que los resultados puedan ser comparables con otros estudios similares y por lo tanto no se podría afirmar que la población estudiada sea susceptibles o resistente. 3.6.2 Tipos de bioensayo En entomopatógenos se conoce como burdos y finos de acuerdo a Goettel y Inglis, (1997): Burdos: se utiliza para aquellos caso en los cuales se tiene un gran número de cepas de algún entomopatogeno en particular, (p,e varias cepas de Bacilus thuringesis). Con este tipo de bioensayo solo se busca determinar aquellas cepas que tiene un potencial toxico alto: de un total (p,e) de 100 cepas evaluadas, 10 presentaron alta actividad toxica. Hay que mencionar que “alta” es referida en términos relativos, es decir seleccionando aquellas cepas que a dosis bajas genera una mortalidad del 100%. Fino: se realizan como segunda etapa y donde se determina la ventana de respuesta biológica y dosis intermedias, la actividad registrada es expresada como la Dosis Letal Media (CL50) y esta es comparada con alguna cepa estándar. Para que sea considerada con potencial toxico debe tener una CL 50 menor o igual a la cepa estándar. 3.6.3 Ventana de respuesta biológica Para encontrar la DL50 a cualquier entomopatogeno en una especie dada, el primer paso consiste en determinar la dosis máxima cuyo efecto se refleja en una mortalidad de 0% o un valor cercano a este y la dosis más baja capaz de matar al

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100% de los especímenes bajo prueba. A dicho intervalo de respuesta se le conoce como venta de respuestas biológicas. Se sugiere experimentar con las siguientes dosis 1, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5. De no contener estas dosis el 0 y 100%, se añadirán dosis superiores o inferiores, según sea el caso. Los datos se grafican como logaritmo de a dosis en contra del porcentaje de mortalidad convertido a su valor probit. 3.6.4 Preparación de diluciones intermedias Una vez determinada la ventana de respuestas biológicas, el siguiente paso consiste en preparar diluciones intermedias para determinar la línea de respuestas dosis-mortalidad. La metodología para preparar cada una de las concentraciones se necesitan en un bioensayo es útil hacer uso del siguiente sistema de ecuaciones:

(A) x (B) = C +

+

(D) x (E) = F ----------------(G) x (H) = I Donde: A. Es la cantidad en ml o gr. De la solución porcentual que se va utilizar como base para preparar la disolución que se desea. B. Concentración de la solución parental. C. Es el producto de A x B. D. Es la cantidad en ml del solvente. En forma general será agua destilada.

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E. Concentración toxica del solvente. Dicho valor tendrá siempre un valor de 0 ya que carece de actividad insecticida. F. Es el producto de la multiplicación de D x E (siempre será o). G. Es la suma de A + D y representa la cantidad total en ml de la solución que se desea preparar. H. Es la concentración final de la solución que se quiere preparar. I. Es la suma de C + F. 3.6.5 Preparación de dosis intermedias. Una vez determinada VRB se procede a la preparación de dosis intermedias entre 0 y el 100% de mortalidad. Utilizando la formula anterior. 3.7 Valores obtenidos a través del análisis Probit El análisis probit nos permite obtener los siguientes parámetros biológicos. Dosis Letal Media (DL50): Dosis a la cual se produce la muerte en la mitad de los individuos evaluados. Dosis Efectiva Media (DE50): Dosis a la cual se produce una respuesta en la mitad de los individuos evaluados. Una característica de esta dosis es que esta es una media indirecta de la tolerancia media de un lote de individuos. La DL 50 es un caso especial en el cual la muerte es la respuesta. Tiempo de Supervivencia Medio (TS50): Tiempo en el cual se produce la muerte en la mitad de los individuos evaluados. Tiempo Efectivo Medio (TE50): Es el tiempo en el cual una respuesta ocurre en la mitad de los individuos probados después de exponer a un patógeno. La supervivencia media (TS50) es un caso especial en el cual la muerte es la respuesta.

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Tiempo Letal Media (TL50): Periodo de tiempo en el cual un grupo de individuos son expuestos a un patógeno antes de producir una respuesta. No confundir con TS50. 3.8 Criterios metodológicos para un buen bioensayo. Para que los resultados de un bioensayo sean confiables deben reunir una serie de requisitos indispensables como son: a) La respuesta debe ser lineal. Es decir que se observa una relación lineal entre el logaritmo de la dosis y las unidades Probits. b) Las dosis que se aplique o pruebe, debe ser precisa. c) La respuesta debe ser determinante: vivo o muerto. No pueden considerarse los puntos intermedios. Dependiendo del patógeno, el criterio para tomar un organismo vivo o muerto depende del modo de acción del mismo. d) Cuando el testigo exista mortalidad, esta se debe corregir con la ecuación de Abbott*, pues de otro modo no se podría inferir si la mortalidad en los tratamientos se debe al efecto del patógeno, o a otros factores tales como: contaminación o mala nutrición. e) La temperatura debe ser constante y adecuada con la finalidad de evitar riesgos en la mortalidad. f) El método debe ser sensible para poder captar las diferencias en mortalidad como una respuesta al cambio de dosis. g) El método debe ser reproducible. h) La nutrición de los insectos debe ser uniforme. i) El lugar de aplicación debe ser constante. j) Las repeticiones del experimento se deberán hacer a la misma hora pero en diferentes días. 3.9 Criterios estadísticos para validar un bioensayo 1. La mortalidad natural en los individuos testigo debe ser igual o menor al 10%. 21

2. El valor de ji-cuadrada, en un bioensayo de seis dosis, debe ser menor o igual a 5. 3. En una serie de 6 dosis probadas, por lo menos 2 deben ser mayores o menores a la CL50 estimada. 4. Por lo menos 4 de una serie de 6 dosis probadas deben causar una mortalidad entre 10 y 90%. 5. El valor de la pendiente de la línea de regresión debe estar entre 1.5 y 6.0. 6. El cociente entre el limite fiducial mayor (p=0.95) y el menor debe ser menor o igual a 2. 7. Deben hacerse por lo menos 3 repeticiones validas, por separado. 8. El coeficiente de variación de la CL50 media (de las repeticiones) debe ser igual o menor a 20%. Para tener una mejor “perspectiva estadística” se recomienda llenar la siguiente tabla, observar el ejemplo dado. 3.10 Métodos para la obtención de la línea L-D-M Existen por lo menos cuatro métodos para obtener la línea de respuesta logaritmo dosis-mortalidad. La relación entre las dosis y la mortalidad está representada por una línea sigmoide, la cual es difícil de comparar e interpretar, por lo que es deseable transformarla para poder ajustar un modelo de línea recta. Para realizar esto es necesario usar el logaritmo de la dosis y cambiar el porcentaje de mortalidad a unidades probit. 3.11 Transformación del porciento de mortalidad a unidades probit. Existen unas tablas que nos permiten hacer directamente el valor de probit para cierta mortalidad.

22

3.11.1 Transformación de la dosis a su logaritmo. Cada dosis utilizada debe transformarse a su correspondiente logaritmo. Pueden utilizarse indistintamente los logaritmos naturales o neperianos siempre y cuando se mantenga constante el elegido. 3.11.2 Obtención de la ecuación de regresión. Como se trata de una regresión lineal simple su ecuación es la siguiente: Y = bo + b1X Donde Y = valor de probit. bo= ordenada al origen. b1= pendiente de la línea. X= logaritmo de la dosis. 3.12 Pruebas microbiológicas Los micos insecticidas son productos biológicos que se utilizan en forma comercial para el control de plagas y con un alto potencial como controladores de insectos plagas en cultivos agrícolas, forestales así como de insectos vectores de importancia para la salud pública. Cabe mencionar que los productos formulados a base de hongos entomopatógenos han tenido una mayor demanda a nivel mundial; en México se observó un incremento de 22 laboratorios de producción masiva existen en 1999 a 60 laboratorios para el 2003 (CNRF, 2004). Los principales

hongos entomopatógenos

propagados masivamente

en

estos

laboratorios son: Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Paecilomyces fumosoroseus y Lecanicillium (Verticillium) lecanii.

23

Por otra parte, los micos insecticidas son productos que pueden integrarse a las estrategias de manejo integrado de plagas debido a que son seguros para protección ambiental y por lo tanto son usados en la agricultura extensiva, invernaderos, ambientes protegidos, jardines, etc. Estos deben de cumplir las siguientes características: ser productos formulados, estandarizados, tener alta persistencia en almacén, alta eficacia, bajos costos y fáciles de usar, características que los ponen en desventaja con los insecticidas órgano sintéticos. Las principales diferencias entre los mico insecticidas y los insecticidas químicos es que los primeros están formulados con organismos vivos, por lo que deben extremarse las precauciones en su producción, formulación y almacenaje, además como agentes de control biológico su efecto no es inmediato ya que requieren de condiciones ambientales favorables, como es alta humedad para iniciar el proceso infectivo y expresar su efectividad biológica en campo. Unos de los aspectos importantes en la producción de mico insecticidas lo constituye el control de calidad dentro del proceso de producción. El cual debe ser un proceso estandarizado que incluya desde la selección y conservación del asilamiento, el proceso de producción, formulación hasta la determinación de su efectividad en campo. La estabilidad patogénica de la raza después de varios pasos debe ser revisada. El medio de cultivo durante las transferencias y el proceso de producción y escalamiento deben ser seleccionados ya que esto puede influir en la viabilidad y producción de los conidios o sea en la calidad de estas unidades infectivas. El control de calidad en la producción es esencial para cubrir estándares predeterminados de seguridad. El registro de la información de todos los procesos de producción y formulación es crucial por lo que se deberá contar con una manual de procedimiento (Burges, 1981). Así mismo es básico, la identificación del patógeno, el mantenimiento del aislamiento y el reconocimiento de contaminantes. La estandarización puede ser definida como la adopción de técnicas y procesos que permitan la obtención de las unidades más apropiadas 24

para determinar la capacidad patogénica (virulencia) del producto es deseable producir un patógeno con la efectividad biológica constante y que esta pueda ser comparada con la capacidad de otros biopreparados. En relación a la estandarización de hongos entomopatógenos existen pocos problemas ya que la unidad de referencia para determinar la virulencia es e conidio o espora. Para ello en el control de calidad de los hongos entomopatógenos se llevan a cabo las siguientes pruebas microbiológicas: concentraciones de conidios, viabilidad de conidios, pureza y virulencia. En otros casos se considera necesario llevar a cabo pruebas fisicoquímicas: pH, % de humedad, humectabilidad, suspensibilidad y tamaño de las partículas del formulario. Es fundamental en un proceso de producción contar con un control de calidad que garantice los estándares preestablecidos; por lo que se realizan una serie de evaluaciones las cuales garantizarán que el producto salga al mercado con las características y efectividad establecida por el fabricante.

En el producto comercializable los parámetros de calidad son los siguientes: 1- Concentración de esporas/gr 2- Viabilidad de esporas 3- Contenido de humedad 4- Pureza (contaminación microbiológica) 3.13 Concentración de esporas Concentración de esporas o unidades infectivas (UI): Esta prueba se realiza para conocer la cantidad de esporas que contiene un producto, el método convencional para conteo de unidades infectivas es mediante la cámara de Neubauer o hematocímetro. El conteo se realiza tomando un lote al azar, se pesa 1 gr del producto y se disuelve en 9 ml de tween (80 0 20) al 0.03 %, se agita. Se realiza

25

varias diluciones 1/10 hasta que las esporas puedan observarse que están separadas. Posteriormente se realiza el conteo en la cámara de Neubauer, bajo el microscopio óptico (40 X), se deben realizar diez conteos, se promedian los conteos resultantes, es importante que los conteos sean más o menos similares para obtener datos más confiables. La concentración se calcula mediante la siguiente fórmula propuesta por Lipa y Sliznski (1973). No. De UI/ml = ∑X (4 x 106) (FD) /80 Donde: ∑x = sumatoria del promedio de todos los conteos (4x106) / 80 = Es una constante que es = 50 000 (FD) = Factor dilución y puede ser 10, 100, 1000 dependiendo del número de dilución que se hayan realizado.

3.14 Conteo de esporas

Ejemplo: para el cálculo de la concentración en 100 g de producto:

1 ml = 9. 195 x 105 -------------------- 0.01 10 ml = 9.195 x 107 -------------------- 0.1 g 26

100 ml = 9.195 x 108 ------------------ 1 g 1000 ml = 9.195 x 109 ---------------- 10 g 100 g = 9.195 x 1010 Ejemplo 2: (438.3) (50,000) (10) = 2.19 x 108 esporas/ml en 100 g = 2.19 x 1012 se requiere tan solo 45.66 o 46 g de producto para una dosis. 3.15 Pureza La prueba de pureza se realiza para establecer la proporción de microorganismos contaminantes con relación al agente biológico en la formulación. Los niveles de contaminación aceptables son < 0.002 % (Jenkins 1998). Por otra parte dentro del proceso de producción es necesario llevar a cabo un control de calidad y evitar la contaminación del producto final es importante cuidar que no haya contaminación durante todo el proceso de producción, la cosecha y la formulación. Los contaminantes durante el periodo activo de la producción pueden crecer más rápido que el hongo en producción. La presencia de microorganismos diferentes al organismo en producción se cuantifica utilizando la técnica de unidades formadoras de colonias (UFC) o por diluciones de conidios. (Alatorre, 2009)

27

4. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1. Localización del área experimental. Este proyecto se llevó a cabo en el Laboratorio de Biotecnología del Centro Maya de Estudios Agropecuarios de la Universidad Autónoma de Chiapas, localizado en el kilómetro 4 carretera Catazajá – Palenque, Chiapas,

con coordenadas de

17°40’39.77” N 92°01’34.18” O. altitud y latitud. 4.2 Caracterización de la región XIII Maya del estado de Chiapas y región Ríos del estado de Tabasco. Estas regiones se caracterizan por presentar clima cálido-húmedo casi todo el año con lluvias periódicas (de mayo a diciembre), en invierno la temperatura alcanza hasta los 10º C. Presenta una temperatura que fluctúa entre los 22º C a 36º C, siendo 25º C la temperatura media anual. Tiene una temperatura media anual de 26.4º C y una precipitación pluvial de 2,322 milímetros al año. 4.3 Reactivación de las cepa de Metarhizium anisopliae. En este proyecto primero se trabajó con la reactivación de las cepas Metarhizium anisopliae, posteriormente se trabajó con el aislamiento, virulencia, caracterización fisiológica y morfológica como se muestra a continuación en la figura 5, de acuerdo a la metodología González (1993) y Bautista et al., (2012).

28

Conservación en glicerol al 10%

Reactivación

Selección de aislamientos de Metarhizium anisopliae

Virulencia (determinación de la dosis letal)

Caracterización

Caracterización fisiológica

Germinación

Crecimiento radial

Caracterización morfológica

Color

Aspecto

Figura 5: Etapas para el aislamiento y determinación de dosis letal de Metarhizium anisopliae

29

Se reactivó la cepa de Metarhizium anisopliae sobre Hypothenemus hampei 1.- Se limpió el área de trabajó con hipoclorito de sodio (NaClO), posteriormente se secó con alcohol antiséptico (90°). Inmediatamente se prendieron

los

mecheros que se utilizó. 2.- para la inoculación del hongo se seleccionó broca de café (Hypothenemus hampei) de cafetales y estas se transportaron en cajas plásticas al laboratorio. 3.-Los materiales que se utilizaron tales como: los vasos, cajas Petri, el ADE (agua destilada estéril), papel se esterilizaron en un autoclave a 121 °C a 15 libras de presión durante 15 minutos. El medio utilizado fue PDA (papa dextrosa agar) este se preparó usando 39 g en 1 L de agua y disolviéndolo en calor. Posteriormente se realizó el vaciado de medio de cultivo en cajas Petri estéril, adicionando a cada caja petri 15 ml del medio. 4.- Las brocas del café (Hypothenemus hampei) se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 0.5 %, que se preparó tomando 10 ml del producto comercial de una concentración del 4 % y se diluyo con ADE (Agua Destilada Estéril) hasta alcanzar un volumen de 100 ml. 5.- Las brocas del café (Hypothenemus hampei) se sumergieron durante 1 minuto en la solución de hipoclorito de sodio, se pasó a una gasa estéril, se lavó tres veces con abundante agua ADE, luego se colocó en papel o toalla estéril, para eliminar el exceso de agua, con la ayuda de un pincel se escogieron las Hypothenemus hampei y se pasaron a cajas Petri estéril. 6.- Posteriormente, las brocas del café (Hypothenemus hampei) se inocularon por inmersión durante 1 minutos en 10 ml con la suspensión del hongo Metarhizium anisopliae a una concentración de 1x108 conidios/ml. Posteriormente las Hypothenemus hampei se pasaron a cajas Petri, con papel filtro esterilizado la cual permaneció húmedo para facilitar el desarrollo del hongo sobre el insecto.

30

7.- Después de 6 a 10 días de haber inoculado, el hongo se desarrolló completamente en el cuerpo de Hypothenemus hampei, se tomó individualmente cada broca con un pincel desinfectado con alcohol antiséptico y posteriormente se realizó una nueva desinfección superficial con hipoclorito de sodio comercial al 5.25 % por 1 minuto y sin lavar se colocó inmediatamente en papel filtro o toalla previamente estéril para retirar el exceso de hipoclorito de sodio. 8.- Posteriormente las Hypothenemus hampei se colocaron en cajas Petri con medio de cultivo para el aislamiento del hongo y poder iniciar el experimento probado en este estudio. 4.4 Prueba de susceptibilidad en laboratorio 4.4.1 Preparación del inoculo Se prepararon cinco dosis a partir de conidias puras de Metarhizium anisopliae de las cepas MM0801 y CD0804 mas un testigo absoluto que consistió de Agua Destilada Estéril más Tween 80– 20 al 0.03 %, al igual un testigo relativo que fue evaluar un producto químico (Amitraz), comúnmente utilizado por los productores ganaderos (Balladarez et al., 2014). Las dosis evaluadas fueron: 3.0x104, 3.0x105, 3.0x106, 3.0x107, 2.6x108conidios/ml para cada cepa., como se observa en el Cuadro 1.

31

Cuadro 1: Diseño experimental completamente al azar para evaluar la virulencia de Metarhizium anisopliae para el control de la garrapata en laboratorio para la cepa MM0801 y CD0804. Dosis

No. Repeticiones

No. Garrapatas vivas

3X104

6

120

3X105

6

120

3X106

6

120

3X107

6

120

2.6X108

6

120

Testigo relativo (amitraz)

6

120

Testigo absoluto (Agua Destilada Estéril

6

120

+ Tween 20 al 0.03%) Total

840

T1= 3X104, T2= 3X105, T3= 3X106, T4= 3X107 T5= 2.6X108 + Testigo absoluto (Agua Destilada Estéril + Tween 20 al 0.03 %) + Testigo relativo (amitraz).

4.4.2 Garrapatas Las garrapatas fueron colectadas en ranchos ganaderos de la región de los Ríos del estado de Tabasco y la cuenca Lechera de Catazajá, Chiapas. Se utilizaron 60 garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus en estado adulto por tratamiento con 6 repeticiones cada una, obteniendo así 420 garrapatas evaluadas por cepa, dando un total de 840 garrapatas expuestas en este estudio. 4.4.3 Inoculación Se realizó por inmersión las garrapatas durante 1 minuto en solución de esporas. Se colocaron 10 garrapatas en un vaso de precipitado de 100ml, se le adiciono una cantidad de la solución de esporas. Al cabo de 1 minuto se vació el inoculo junto con las garrapatas en un vaso vacío con una gasa estéril de modo que escurriera el agua, seguidamente las garrapatas se colocaron en papel estéril para absorber la humedad y posteriormente puestas en frascos de vidrio, en cada 32

frasco fueron colocadas 10 garrapatas, con seis repeticiones cada uno de las dosis más los testigos por cepa. 4.4.4 Toma de datos Se realizó la toma de datos donde se evaluó la mortalidad de garrapatas cada 24 horas después de la inoculación. Se contaron las garrapatas muertas y fueron expuestas en cámara húmeda, posteriormente se tomaron datos de virulencia. (Se anexa formato de toma de datos). La cámara húmeda consistió en preparar cajas Petri de plástico con un trocito de algodón húmedo y sellado con parafilm previamente esterilizado.

a) a)

b) b)

Figura 6: a) Garrapatas inoculadas con la cepa MM0801 y CD0804 de Metarhizium anisopliae. b) garrapatas en cámara húmeda.

4.4.5 Establecimiento de línea base De las cepas aisladas MM0801 y CD0804 de Metarhizium anisopliae se realizaron cinco concentraciones de esporas para evaluar la virulencia de la garrapata, para ello se realizó una solución de esporas, se pasó al conteo de conidios en la cámara de Neubauer (Goetell, 1997) donde se obtuvo una concentración de 2.685X108 conidios/ml a partir de esta concentración obtenida, se realizó las 33

diluciones de esporas en ADE + Tween 20 al 0.03 %, donde se obtuvo las concentraciones de: 3X104, 3X105, 3X106, y 3X107. Se prepararon cinco dosis diferentes de cada cepa de Metarhizium anisopliae en escala logarítmica, de 2685 ppm (ppm=mg/L) hasta 3050 ppm y dos testigos que consistieron en agua destilada estéril más Tween 20 al 0.03% y un testigo que con sitio en evaluar el químico (amitraz). Las conidias/ml, que se evaluaron por cepa de acuerdo al conteo realizado a las soluciones fueron: 3.0X104, 3.0X105, 3.0X106, 3.0X107, 2.6X108. Para la obtención de las dosis anteriormente mencionadas se prepararon 300 ml de la solución madre; se tomaron 33 ml de la solución de hongo que se mesclaron con 300 ml de agua estéril para obtener 350 ml de solución con una concentración de 2685 ppm y se procedió de la misma manera hasta obtener la solución de 3050 ppm. Con cada una de las dosis se procedió a inocular las garrapatas. 4.5 Caracterización fisiológica 4.5.1 Germinación Se evaluó la capacidad germinativa de las cepas MM0801 y CD0804, cabe mencionar que estas cepas fueron aislados de Aeneolamia postica y Gallería melonella (Bautista et al., 2012), simultáneamente a la prueba de virulencia utilizando suspensiones de esporas con concentraciones de 3.5X104, 3.5X105, 3.5X106, 3.5X107, 2.6X108 esporas/ml. El procedimiento consistió en inocular alícuotas de 5 µl en cajas Petri con 10 ml de medio de cultivo PDA. Se marcó la cara posterior externa de las cajas Petri con 7 puntos correspondientes a los lugares donde se depositaron las alícuotas; posteriormente, se incubaron durante 24 horas a temperatura ambiente (30±), tiempo después del cual se adicionó una gota de azul de lacto fenol con el fin de suspender el proceso de germinación y teñir las esporas. Los puntos de inoculación se contaron en cuadrados, se transfirieron a laminas portaobjetos y se cubrió con un laminilla para proceder al

34

recuento. La observación microscópica se realizó con un aumento de 40X, determinando la germinación en cinco campos microscópicos/alícuota, totalizando las esporas germinadas y no germinadas; los resultados se expresaron en porcentaje de esporas germinadas/repetición. Para cada cepa se utilizaron cinco cajas Petri por repetición. 4.5.2 Viabilidad de las esporas La viabilidad de un producto es la medida de la cantidad de unidades infectivas (conidios o esporas) que tiene la capacidad de germinar y se expresa en porcentajes y el estándar recomendado para la utilización de hongos entomopatógenos como agentes de control microbiano es una viabilidad > 90%. Las esporas o conidios de los hongos entomopatógenos son entidades vivas, por lo que su viabilidad o proporción de conidios vivos disminuye con el tiempo, dependiendo de las condiciones en las cuales son almacenados lo cual se recomienda sea a 4 °C, esta prueba debe realizarse a diferentes intervalos de tiempo durante el periodo de almacenamiento (Alatorre, 2009). Para evaluar la viabilidad de las esporas o el porcentaje de germinación se siguió la siguiente metodología: -

Se prepararon cajas Petri de 60 mm de diámetro con medio de cultivo Agar Dextrosa Sabouraud (ADS), se agregó 12 a 15 ml del medio de cultivo.

-

Se preparó una suspensión de esporas de 2.6X108 conidios/ml se agito hasta obtener una suspensión homogénea. Se realizaron diluciones, tomando 1 ml de la solución de esporas y fue colocado en un frasco con 9 ml Tween 20 al 0.03 %.

-

Se colocaron 50 µl de la solución de esporas en cinco puntos de la caja de Petri con ADS, evitar que queden cerca de los bordes.

-

Se Incubo la caja petri previamente inoculada con el hongo a 27 ± 1 °C por 12 a 24 h. Posteriormente se observó con el microscopio óptico en el

35

objetivo 40X. Se agregó una gota de lactofenol azul con un algodón para parar el desarrollo de las conidas y contar 300 conidias y registrar las esporas germinadas y no germinadas; el criterio a considerar un conidio como germinado es que su tubo germinativo sea igual o mayor que el tamaño del conidio (Alatorre, 2009). Se contó un total de 8 cajas por aislamiento dando un total 16 cajas evaluadas. Posteriormente se realizó un promedio y se calculó el porcentaje de germinación con la siguiente formula. Se realizó esta prueba a los 6, 12, 18 y 24 horas. Formula: a/ (a+b) x 100 = %germinación Dónde: a = conidios germinados B = conidios no germinados

4.5.3 Crecimiento radial. Se tomaron fragmentos del hongo Metarhizium anisopliae

crecidos 8 días en

medio de cultivo PDA. El tamaño del fragmento fue de 0.5 X 0.5 cm y estos aislamientos fueron colocados en el centro de la caja petri con medidas de 15 x 60 mm. El material se incubo a temperatura ambiente (30°) y se midió el crecimiento radial con un nanómetro cada 24 horas a partir de la inoculación. El diámetro de la colonia se expresó en milímetros. Para la evaluación de esta variable, se usó un diseño completamente aleatorio con cinco repeticiones para cada cepa, dando un total de 10 cajas Petri. Como repetición se tomó la caja Petri con el cultivo del hongo y para la comparación de promedios se usó la prueba de Duncan al 5 %.

36

4.6 Caracterización morfológica La determinación de las características morfológicas como color, aspecto de la colonia, formación de cinemas, producción y difusión de pigmento de las cepas seleccionadas se basó en la observación macroscópica de las colonias. El procedimiento consistió en inocular alícuotas de 5 µl en el centro de 10 cajas Petri con 10ml de PDA sin acidificar, incubando a temperatura ambiente por 30 días.

37

5. RESULTADOS Y DISCUSION

5.1 Reactivación de Metarhizium anisopliae En la reactivación de Metarhizium anisopliae de la cepa MM0801 y CD0804 sobre la broca de café hypothenemus hampei a los cinco días después de la inoculación se obtuvo resultados de esporulación del hongo en el cuerpo del insecto, con un 80 % de germinación.

a)

c)

b)

d) Figura 7: Reactivación del hongo M. anisopliae MM0801 Y CD0804 a). Broca del café previamente inoculadas con el hongo colocadas en caja Petri con papel filtro húmedo b) Esporulación del hongo en el cuerpo de la broca de café a los 4 días de la inoculación. c) Broca del café a los 6 días cubierto un 50 % del hongo M. anisopliae. d) la broca de café cubierto el 80% del hongo en 8 días.

38

5.2 Selección de aislamiento de Metarhizium anisopliae. De las dos cepas de Metarhizium anisopliae MM0801 y CD0804 de la Región, fueron reactivadas en broca de café (Hypothenemus hampei), las cepas presentaron buen crecimiento a los 8 días de haber inoculado en medios de cultivo PDA (Agar Dextrosa Papa).

Figura 8: Hongo Metarhizium anisopliae aislados en tubos de ensaye con medio de cultivo PDA.

5.3 Determinación de la DL50. Los resultados que se obtuvieron en la toma de datos del experimento de la virulencia de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus con el hongo Metarhizium anisopliae fueron analizados con Probit (SPSS Products: statistics, 20.0.0.0.155, 2011) la determinación de la DL50 fue calculada con una solución de 2.6X108. En la figura 9 se observa garrapatas micosadas con dosis obtenidas del hongo Metarhizium anisopliae. La varianza de DL50 corresponde a un valor de 6.482 X 106, mientras que la línea de regresión se observa en la Figura 10.

39

a)

b)

c)

Figura 9: Garrapatas micosadas con Dosis obtenidas 3X104, 3X105, 3X106, 3X107 y 2.6X108 de Metarhizium anisopliae. a) Garrapata micosada con la dosis 3x104 conidios/ml. b) dosis micosada con dosis 3x105 conidios/ml. c) garrapata micosada con la dosis 2.6x108

Figura 10: Línea de regresión obtenida en la prueba de estimación de la DL50 de Metarhizium anisopliae de la cepa MM0801 sobre garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

40

Cuadro 2: Línea base de DL50 sobre garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

Mortalidad (N° de garrapatas)1

Mortalidad % Dosis

Obtenida

Corregida2

38.33

54.17

23

24.41

48.33

29.17

29

27.39

53.33

16.67

32

30.45

51.66

20.85

31

33.53

61.66

4.15

37

36.40

3.0500 3.05000 3.050000 3.0500000 2.68500000

Obtenida

Esperada3

Chi2

1Garrapata

muertas de un total de 60. por mortalidad natural, de acuerdo a la fórmula de Abbott (1925). Mcorre = ((Mobt-Mcontrol) / (100-Mcontrol)) X 100. Donde Mcorre= Mortalidad corregida, Mobt=Mortalidad obtenida y Mcontrol=Mortalidad en el testigo 3Mortalidad esperada de acuerdo al trazo de la línea de regresión a partir de la mortalidad corregida. 2Corrección

Cuadro 3: Porcentaje de mortalidad de la

garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus y

esporulación de Metarhizium anisopliae con la cepa MM0801 a los 7 días después de la inoculación obteniendo la dosis diagnostica de la DL50.

Mortalidad (%)

Infección (%)

Tratamiento

60

30.45

6.48 X 106 M. anisopliae

41

5.4 CARACTERIZACION FISIOLOGICA 5.4.1 Germinación Las cepas MM0801 y CD0804 presentaron un porcentaje arriba del 80% a las 18 y las 24 horas tuvo un porcentaje arriba de 90%, como se muestra en los cuadros 4 y 5.

Cuadro 4: Porcentaje de germinación de conidios de las cepas MM0801 Y CD0804 a las 18 horas después de la inoculación.

Cepas

Porcentaje de germinación de conidios de Metarhizium anisopliae a las 18 horas

MM0801

87.84 %

CD0804

74.56 %

Cuadro 5: Porcentaje de germinación de conidios de las cepas MM0801 Y CD0804 a las 24 horas después de la inoculación.

Cepas

Porcentaje de germinación de conidios de Metarhizium anisopliae a las 24 horas

MM0801

100 %

CD0804

80.54 %

En los cuadros 4 y 5 se observa el porcentaje de germinación de conidios de las cepas MM0801 y CD0804 de Metarhizium anisopliae. En el cuadro 4, se observa que la cepa MM0801 presenta una germinación 87.84% a las 18 horas en comparación a la cepa CD0801 que tuvo una germinación del 74.56. a las 24 horas se observa en el cuadro 5, que la cepa MM0801 presenta un 100% de germinación en comparación con la cepa CD0804 que presento un 80.54%. En

42

otros estudios por Bautista et al., (2012), obtuvieron un porcentaje de germinación de conidias del 92% de la cepa MM0801 a las 24 horas en comparación con este trabajo que se obtuvo un 100% de germinación, posiblemente se deba a que esta cepa fue reactivada. 5.4.2 Crecimiento radial Se evaluó el crecimiento radial de las cepas MM0801 y CD0804 en cajas petri con medidas de 60 x 15 mm con medio de cultivo PDA (Agar Dextrosa y Papa), el crecimiento radial se midió con el apoyo de un nanómetro cada 24 horas a partir de la inoculación hasta las 120 horas (momento donde la caja queda totalmente cubierta del hongo). El crecimiento radial se expresó en milímetros y fue graficada por cada 24 horas.

48 Horas 0.9 0.8

CRECIMIENTO (CM)

0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 MM0801

CD0804

CEPAS

Figura 11: Crecimiento radial de Metarhizium anisopliae en 48 horas a partir de la inoculación.

43

En la figura 11. Se observa que el crecimiento radial para la cepa MM0801 fue de 0.6 cm a las 48 horas en comparación a la cepa CD0804 que tuvo un crecimiento de 0.7 cm. Por lo que la diferencia entre cepa fue de 0.1 cm. Elósegui et al., (2003), evaluaron crecimiento radial de cepas de Metarhizium anisopliae en medio de cultivo ADS lo cual encontraron diferencias significativas fluctuando entre 31 y 37 mm en comparación a este trabajo que vario muy poco.

72 Horas 1.36 1.34

CRECIMIENTO (CM)

1.32 1.3 1.28 1.26 1.24 1.22 1.2 1.18 MM0801

CD0804

CEPAS

Figura 12: Crecimiento radial de Metarhizium anisopliae en 72 horas a partir de la inoculación.

En la figura 12. Se observa que el crecimiento radial para la cepa MM0801 fue de 1.2 cm a las 72 horas en comparación a la cepa CD0804 que tuvo un crecimiento de 1.3 cm. Por lo que la diferencia fue de 0.1 cm. En comparación al trabajo realizado por Elósegui et al., (2003), donde estos autores evaluaron crecimiento radial de hongos entomopatógenos y no mostraron diferencia significativa entre las

44

cepas con el medio ADS, cabe mencionar que en este trabajo de investigación solo se evaluó con PDA.

96 Horas 2

CRECIMIENTO (CM)

1.95 1.9 1.85 1.8 1.75 1.7 MM0801

CD0804

CEPAS

Figura 13: Crecimiento radial de Metarhizium anisopliae en 96 horas a partir de la inoculación.

En la figura 13. Se observa que el crecimiento radial para la cepa MM0801 fue de 1.7 cm a las 96 horas en comparación a la cepa CD0804 que tuvo un crecimiento de 1.9 cm. Por lo que la diferencia entre cepa fue de 0.2 cm. En comparación al trabajo de Ruiz-Sánchez et al., (2011) que evaluaron crecimiento radial obteniendo resultados que variaron de 0.31 a 0.37 cm.

45

120 Horas

CRECIMIENTO (CM)

2.5 2 1.5 1 0.5 0 MM0801

CD0804

CEPAS

Figura 14: Crecimiento radial de Metarhizium anisopliae en 120 horas a partir de la inoculación.

En la figura 13. Se observa que el crecimiento radial fue de 2.1 cm en 120 horas para ambas cepa MM0801 y CD0804, sin embargo la cepa MM0801 en las primeras 96 horas mostro un crecimiento lento con un promedio de crecimiento por día de 1.4 cm, esta diferencia numérica no impacto en la pruebas de virulencia ya que la cepa MM0801 fue la más agresiva.

5.5 CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA 5.5.1 Color El medio de cultivo ADS (Agar Dextrosa Saboraud) a los tres días de haber inoculado las cepas de Metarhizium anisopliae, presentaron una coloración rosada, en esto posiblemente se debe al contenido de metabolitos extracelulares y actividad enzimática que se lleva a cabo durante el desarrollo del micelio (García Gutiérrez et al., 2006).

Sin embargo, estas cepas al momento de inocular,

46

presentaron una coloración para la cepa MM0801 verde oscuro y para la cepa CD0804 presento una coloración oliva-amarillo, esto coincide a Bautista et al., (2012).

Figura 15: Hongo Metarhizium anisopliae en tubos de ensaye presenta una coloración rosada de acuerdo a Munsell (1974).

47

6. CONCLUSIONES

Metarhizium anisopliae infecta las poblaciones de garrapatas Rhipicephalus microplus con la cepa MM0801 con una DL50 de 6.48X106 conidios/ml. El crecimiento radial de las cepas MM0801 y CD0804 con el medio de cultivo PDA (Agar Destroza y Papa). Fueron similar para ambas cepas de Metarhizium anisopliae. La viabilidad de conidias con la cepa MM0801 influyo en el grado de virulencia con la garrapata Rhipicephalus microplus.

48

7. LITERATURA CITADA Alatorre, R. R. 2009. XXXI congreso nacional de control biológico, Villahermosa. Tabasco. Manual de control de calidad de microorganismos patógenos. Arenas, Y. B. 2009. Utilización de hongos entomopatógenos para el control del salivazo

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(Hemiptera:

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Hyphomycetes),

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52

8. ANEXOS

DOSIS-------- 1X105

Nombre:

Metarhizium anisopliae

Fecha:

Hora: CEPA 1

T2

Horas/Garrapatas Muertas fechas Repeticiones

24

48

72

96

120

132

144

168

192

216

240

R1 R2 R3 R4 R5 R6 Total Observaciones:

T2

1 X 105 Hora/Garrapatas Muertas 53

Fechas Repeticiones

264

288

312

336

360

384

408

432

456

480

504

720

744

768

R1 R2 R3 R4 R5 R6 Total Observaciones

Dosis 1 x105 CEPA 1

T2

Horas/Garrapatas Muertas Repeticiones

528

552

576

600

624

648

672

696

R1 R2 54

R3 R4 R5 R6 Total Observaciones:

Figura 15: Formato de toma de datos de la mortalidad de la garrapata que se utilizó en este trabajo.

55