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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k 2 182 860 kInt. Cl. : A61K 39/395

11 N´ umero de publicaci´on: 7

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˜ ESPANA

//(A61K 39/395 A61K 38:12)

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 95115210.7 kFecha de presentaci´on: 27.09.1995 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 709 097 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 01.05.1996

T3

86 86 87 87

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54 T´ıtulo: Anticuerpo anti-Fas para el tratamiento de la artritis reumatoide.

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73 Titular/es:

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72 Inventor/es: Nishioka, Kusiki y

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74 Agente: Suarez D´ıaz, Jes´ us

30 Prioridad: 27.09.1994 JP 270134/94

SANTEN PHARMACEUTICAL CO., LTD. 9-19, Shimoshinjo 3-chome Higashiyodogawa-ku, Osaka-shi Osaka 533-8651, JP

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.03.2003

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 182 860 T3

16.03.2003

Aviso:

k k

Yoneyama, Shin

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 182 860 T3 DESCRIPCION Anticuerpo anti-Fas para el tratamiento de la artritis reumatoide. 5

Antecedentes de la invenci´ on La presente invenci´on se refiere al uso de un anticuerpo monoclonal anti-Fas como ingrediente activo para la fabricaci´ on de un agente terap´eutico para el tratamiento de la artritis reumatoide.

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Entre los diversos trastornos reum´ aticos, especialmente la artritis reumatoide (RA) pertenece al grupo de enfermedades en el que la patog´enesis b´asica es una proliferaci´ on anormal de c´elulas sinoviales acompa˜ nada por diversos trastornos inmunol´ ogicos causados por factores internos y externos y desarrollados hasta la erosi´ on de los huesos y las articulaciones. La RA se caracteriza tambi´en por una regresi´ on del sinovio hiperpl´ astico con la subsiguiente sustituci´on por tejido fibr´ otico (Fassbender HG: “Pathology of Rheumatic Diseases”, Berl´ın, Heidelberg, Springer-Verlag, 1975), pero el mecanismo de regresi´ on y sustituci´ on sigue siendo oscuro. Sin embargo, la destrucci´ on de tejido alrededor de una articulaci´ on m´ orbida en RA se considera causada por una producci´ on anormal de citoquinas a partir de c´elulas sinoviales inflamatorias.

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Las c´elulas sinoviales desempe˜ nan de esta manera un importante cometido en la RA. Por ejemplo examinando la localizaci´ on de una lesi´ on articular con RA, se han observado un incremento del vello sinovial y una multiestratificaci´ on de c´elulas sinoviales, y se proliferan las c´elulas sinoviales (Daniel J. McCarty, “Arthritis and Allied Conditions, A Textbook of Rheumatology”, und´ecima edici´on).

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Si la proliferaci´ on de estas c´elulas sinoviales puede ser inhibida por una sustancia m´edica, se piensa que ´esta es un agente terap´eutico para enfermedad reum´ atica.

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En el presente, se han utilizado agentes antiinflamatorios, tales como esteroides, oro, y varios agentes citot´ oxicos para tratar la RA, pero no se conoce a´ un una sustancia m´edica que inhiba la proliferaci´ on de c´elulas sinoviales. Por otra parte, la muerte celular programada llamada “apoptosis” por Kerr et al. es distinta de la nado de necrosis (Br. J. Cancer, 26, 239 (1972)). La necrosis de las c´elulas pasa por un proceso acompa˜ la liberaci´on del contenido citopl´ asmico, etc. debido a hipertermia, respuesta a anticuerpos con complemento o mediadores qu´ımicos. Por otra parte, la muerte celular programada se observa en cierto grupo de c´elulas programadas previamente para morir en vivo, y pasa por un proceso denominado apoptosis, acompa˜ nado por fen´ omenos tales como curvado de la superficie celular, condensaci´ on de cromatina nuclear y formaci´ on de escaleras de ADN cromos´omico. Recientemente, Yonehara et al. han informado de un anticuerpo monoclonal anti-Fas contra un ant´ıgeno Fas, que es una mol´ecula de la membrana celular implicada en la apoptosis de c´elulas inmunocompetentes (J. Exp. Med., 169, 1747 (1989)). Krammer et al. han informado de un anticuerpo antiAPO-1 como un anticuerpo que se combina espec´ıficamente con un ant´ıgeno, acompa˜ nado por apoptosis o despu´es que los ant´ıgenos que reconocen estos anticuerpos (Science, 245, 301 (1989)), pero se confirm´ son los mismos (Cell, 66, 233 (1991)). Se han hecho diversos estudios acerca de aplicaciones del anticuerpo anti-Fas incluyendo un agente ublica; terap´eutico para SIDA y tumores (solicitud de patente japonesa N◦ 2-237935 abierta a inspecci´on p´ WO 91/10448). El documento WO 91/10448 describe composiciones farmac´euticas que comprenden anticuerpos, fragmentos o an´alogos de ellos, que se fijan espec´ıficamente al ant´ıgeno APO-1 (sin´ onimo de Fas) e inducen inhibici´ on del crecimiento celular o la apoptosis celular. Tales anticuerpos o agentes de fijaci´on an´ alogos se utilizan en el tratamiento del c´ ancer. El documento EP 0510691 describe el uso de anticuerpos monoclonales anti-Fas para inducir apoptosis celular en c´elulas que expresan el ant´ıgeno Fas, por ejemplo c´elulas infectadas con VIH y c´elulas tumorales.

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En el documento WO 93/00917 se definen compuestos para el tratamiento de artritis reumatoide. Se describe un m´etodo para preparar un medicamento para tratar a un paciente que tiene artritis inflamatoria, en el que tal medicamento comprende un compuesto que es capaz de fijarse espec´ıficamente a un 2

ES 2 182 860 T3 receptor de crecimiento epid´ermico expresado en c´elulas que contribuye a la artritis inflamatoria, siendo capaz dicho compuesto de disminuir la viabilidad de tales c´elulas.

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La exposici´on de Japan Rheumatism Association, Vol. 34 (2), Abril de 1994, p´ agina 487, F438, y de Proceedings of the Japanese Cancer Association, p´agina 336, 1135, 21-09, 1994, puede resumirse como sigue: Se observa apoptosis en el tejido sinovial de los pacientes con artritis reumatoide; se induce apoptosis en las c´elulas sinoviales por medio de un anticuerpo anti-Fas; no se induce apoptosis en osteoartritis; y se observa apoptosis en las c´elulas sinoviales solamente en las membranas sinoviales de RA, y la inducci´ on de apoptosis por un anticuerpo anti-Fas es espec´ıfica tambi´en de las membranas sinoviales. Sin embargo, estas publicaciones no describen qu´e clases de anticuerpos anti-Fas fueron realmente ensayados o utilizados ni ofrecen datos o resultados concretos o m´etodos experimentales utilizados. Como se ha descrito anteriormente, la patog´enesis de la RA se caracteriza por una proliferaci´on anormal de c´elulas sinoviales con infiltraci´ on de c´elulas inflamatorias y erosi´ on o´sea. Sin embargo, la proliferaci´on de c´elulas sinoviales no es ilimitada y se observa una supresi´on espont´ anea de la proliferaci´ on sinovial. Por consiguiente, es necesario estudiar la forma en que se produce la alteraci´on del tejido sinovial reumatoide, si la alteraci´ on es mediada por muerte celular programada (apoptosis) o si existe el ant´ıgeno Fas en c´elulas sinoviales. Estos estudios son necesarios para soportar te´ oricamente esta invenci´on.

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El objeto de esta invenci´on es desarrollar un uso de un anticuerpo monoclonal anti-Fas como un ingrediente activo para la fabricaci´ on de un agente terap´eutico para tratar artritis reumatoide, reaccionando espec´ıficamente dicho anticuerpo monoclonal anti-Fas con un ant´ıgeno Fas humano en c´elulas sinoviales reumatoides e induciendo apoptosis en dichas c´elulas sinoviales.

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Sumario de la invenci´ on

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De acuerdo con un primer aspecto de la presente invenci´on, se proporciona el uso de un anticuerpo monoclonal anti-Fas como ingrediente activo para la fabricaci´on de un agente terap´eutico para tratar artritis reumatoide reaccionado espec´ıficamente dicho anticuerpo monoclonal anti-Fas con un ant´ıgeno Fas humano en c´elulas sinoviales reumatoides e induciendo apoptosis en dichas c´elulas sinoviales, en donde dicho anticuerpo monoclonal anti-Fas se puede obtener inmunizando ratones con fibroblasto diploide humano, fusionando las c´elulas de bazo de rat´ on con c´elulas de mieloma de rat´on, y aislando luego los anticuerpos IgM producidos.

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De acuerdo con una realizaci´ on de la presente invenci´ on, dicho agente terap´eutico comprende una combinaci´on de dicho anticuerpos monoclonal anti-Fas y una sustancia m´edica que tiene un efecto inhibitorio sobre la proliferaci´ on de las c´elulas. La sustancia m´edica preferida que tiene un efecto inhibitorio sobre la proliferaci´on de las c´elulas es la actinomicina D.

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De acuerdo con otra realizaci´ on de la presente invenci´ on, dicho agente terap´eutico est´a en forma de inyecci´on intraarticular.

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Los inventores observaron primero la alteraci´ on del tejido sinovial de pacientes con RA y encontraron que aparece apoptosis en c´elulas sinoviales y que se presenta el ant´ıgeno Fas en c´elulas sinoviales. Los inventores examinaron entonces si se induce apoptosis en las c´elulas sinoviales proliferantes anormales de pacientes con RA a˜ nadiendo el anticuerpo monoclonal anti-Fas. Como resultado, la proporci´ on de apoptosis en las c´elulas sinoviales proliferantes de pacientes con RA fue mucho mayor que en c´elulas sinoviales de pacientes sin RA. Este resultado indica que el anticuerpo monoclonal anti-Fas no act´ ua mucho sobre c´elulas sinoviales normales y que conduce espec´ıficamente a que las c´elulas sinoviales proliferantes desarrollen apoptosis. La presente invenci´on se refiere al uso de un anticuerpo monoclonal anti-Fas que reacciona espec´ıficamente con el ant´ıgeno Fas humano, y es necesario administrarlo a un humano para examinar su efecto cl´ınico, pero es imposible administrarlo f´ acilmente a un humano. Los inventores tuvieron ´exito en la predicci´on de la efectividad del anticuerpo anti-Fas en humanos administrando a ratones un anticuerpo anti-Fas de rat´on inmunizado con un ant´ıgeno Fas de rat´on y examinando su efecto. Adem´ as, examinando si el anticuerpo monoclonal anti-Fas utilizado en esta invenci´ on no produce severos efectos secundarios en otras c´elulas y ´organos, se encontr´ o que este anticuerpo tiene pocos problemas de tales efectos secundarios. Se demostr´ o tambi´en que la proporci´on de apoptosis en c´elulas sinoviales de pacientes con RA au3

ES 2 182 860 T3 menta cuando se a˜ nade actinomicina D (que es una medicina con un efecto inhibitorio de la proliferaci´ on de las c´elulas) al anticuerpo monoclonal anti-Fas. Breve descripci´ on de los dibujos 5

La Figura 1 es una fotograf´ıa de electroforesis que muestra una formaci´on de escalera de ADN t´ıpica en la que el ADN extra´ıdo de c´elulas sinoviales frescas de pacientes con artritis reumatoide (RA) indica apoptosis, y que muestra que el ADN de pacientes con osteoartritis no presenta formaci´ on de escalera. 10

La Figura 2 es una fotograf´ıa de microscopio electr´ onico que muestra una morfolog´ıa t´ıpica de apoptosis en tejido sinovial de pacientes con RA. La Figura 3A es una fotograf´ıa de tejido sinovial de pacientes con RA te˜ nido con hematoxilina-eosina.

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La Figura 3B es una fotograf´ıa de tejido sinovial de los mismos pacientes tratado por el m´etodo de marcado de extremos adherentes. La Figura 4 es un gr´ afico de an´ alisis de citometr´ıa de flujo que muestra la expresi´ on del ant´ıgeno Fas en c´elulas sinoviales cultivadas de pacientes con RA.

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Descripci´ on de la realizaci´ on preferida

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El anticuerpo monoclonal anti-Fas utilizado para esta invenci´on se produjo a partir de, por ejemplo, un clon de c´elulas de hibridoma obtenido inmunizando con fibroblasto diploide humano. Este anticuerpo monoclonal anti-Fas puede prepararse de acuerdo con, por ejemplo, el m´etodo de Yonehara et al. (J. Exp. o para ensayos pr´ acticos el anticuerpo monoclonal anti-Fas producido a Med., 169, 1747 (1989)). Se us´ partir del “clon CH-11” hibridoma obtenido fusionando c´elulas de bazo de rat´ on BALB/c inmunizadas con fibroblasto diploide humano FS-7 con c´elulas de mieloma de rat´on (NS-1). Este anticuerpo monoclonal anti-Fas est´ a disponible comercialmente en Medical & Biological Laboratory Co. La propiedad de este ant´ıgeno disponible es el fraccionamiento de IgM de l´ıquidos asc´ıticos. Estos l´ıquidos se obtuvieron inoculando el “clon CH-11” en ratones BALB/c y la fracci´on de IgM se purific´ o mediante cromatograf´ıa de afinidad. Se ha descrito anteriormente el anticuerpo monoclonal anti-Fas utilizado para diversos ensayos de esta invenci´on, pero este anticuerpo puede utilizarse tambi´en en la forma de un anticuerpo quimera en el que se dejan intactas regiones V (variables) derivadas del rat´ on y se sustituyen regiones C (constantes) por regiones C derivadas de humano, y se puede utilizar tambi´en en forma de anticuerpo injertado con CDR (regi´ on determinante de complementariedad), en el que se dejan intactas regiones CDR derivadas de rat´ on y se sustituyen las otras regiones completas por regiones derivadas de humano.

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La conversi´on del anticuerpo derivado de rat´ on en el anticuerpo quimera o en el anticuerpo injertado con CDR puede efectuarse de acuerdo con los m´etodos conocidos (J. Nucl. Med., 31, 1077 (1990); Nature, 349, 293 (1991); etc.). 45

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Esta invenci´ on incluye cualquier anticuerpo convertido en tanto se mantengan regiones activas del anticuerpo. Si una sustancia puede inducir apoptosis en c´elulas sinoviales de articulaciones reumatoides y puede inhibir la proliferaci´on de c´elulas sinoviales, se espera que esta sustancia sea un excelente agente terap´eutico para la RA. Por consiguiente, para detectar la aparici´ on de apoptosis en c´elulas sinoviales reumatoides, los inventores examinaron primero la formaci´ on de escaleras de ADN en muestras de tejidos sinovial obtenidas de pacientes con RA y de pacientes con osteoartritis (OA) como contraste.

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Como resultado, la formaci´ on de escaleras de ADN, que es caracter´ıstica de la apoptosis, se observ´ o s´olo en pacientes con RA y no en pacientes con OA. Las c´elulas que mostraban la formaci´ on de escaleras de ADN en sinovio de pacientes con RA eran las c´elulas sinoviales adherentes de la sinovia y no las c´elulas infiltrantes. Estos hallazgos fueron apoyados por an´ alisis al microscopio electr´onico y el m´etodo de marcado de extremos adherentes, que reconoce las caracter´ısticas de la muerte celular apopt´otica. Observando la alteraci´ on del tejido sinovial de pacientes con RA mediante microscopio electr´ onico, 4

ES 2 182 860 T3 se detectaron c´elulas sinoviales apopt´ oticas t´ıpicas en tejido sinovial de pacientes con RA. Estas c´elulas apopt´ oticas estaban contiguas a c´elulas sinoviales de tipo A. Este fen´omeno es compatible con la patolog´ıa de la apoptosis, en la que las c´elulas apopt´ oticas son reconocidas por macr´ofagos adyacentes, etc. (Savill, Immunol. Today 14, 131 (1993)). 5

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Adem´as, se confirm´ o con el m´etodo de marcado de extremos adherentes que las c´elulas biotiniladas marcadas con dUTP son fibroblastos sinoviales y no c´elulas mononucleares infiltrantes en el sinovio de RA. Estas c´elulas positivas se detectaron principalmente en la capa ´ıntima del tejido sinovial, y estos resultados indican que las c´elulas sinoviales de RA exhiben apoptosis in situ. Por otra parte, no se detectaron c´elulas positivas en pacientes con OA. Realizando an´ alisis citom´etrico de flujo mediante la utilizaci´ on de c´elulas sinoviales reumatoides cultivadas para examinar si se detecta el ant´ıgeno Fas en c´elulas sinoviales, se detect´ o este ant´ıgeno Fas.

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Estos resultados sugieren que se produce apoptosis en c´elulas sinoviales de pacientes con RA y que el ant´ıgeno Fas participa en la apoptosis. Se realiz´ o despu´es un experimento para examinar si se produce apoptosis en c´elulas sinoviales a˜ nadiendo el anticuerpo monoclonal anti-Fas a c´elulas sinoviales de articulaciones de pacientes con RA. Aunque se muestran datos detallados en el art´ıculo de los ensayos mencionados m´ as adelante, apenas se produjo apoptosis en c´elulas sinoviales humanas que no fueran de pacientes con RA, mientras que la proporci´ on de apoptosis aument´ o con la concentraci´on del anticuerpo monoclonal anti-Fas a˜ nadido en c´elulas sinoviales de pacientes con RA. Este resultado indica que el anticuerpo monoclonal anti-Fas no act´ ua esencialmente sobre c´elulas normales y que ´este puede conducir espec´ıficamente a que las c´elulas sinoviales proliferantes desarrollen apoptosis. Se espera que el efecto del anticuerpo monoclonal anti-Fas aumente en combinaci´ on con medicinas que tengan efectos inhibitorios de la proliferaci´ on celular. La actinomicina D, la mitomicina C, la cicloheximida, el interfer´on gamma, etc. se consideran como sustancias m´edicas que tienen efectos inhibitorios de la proliferaci´ on celular. Como ejemplo t´ıpico, se a˜ nadi´ o actinomicina D al anticuerpo anti-Fas. A˜ nadiendo la mezcla obtenida a c´elulas sinoviales de pacientes con RA, se encontr´ o que la proporci´ on de apoptosis aumenta notablemente. Para predecir el efecto cl´ınico del anticuerpo monoclonal anti-Fas de esta invenci´ on en humanos, se administr´o un anticuerpo monoclonal Fas anti-rat´ on (Medical & Biological Laboratory Co.) a modelos de enfermedades de rat´ on. Se produjo el anticuerpo a partir del “clon RK-8” obtenido fusionando c´elulas de bazo de h´ amsters - inmunizados con un ant´ıgeno Fas de rat´on - con c´elulas de mieloma de rat´on. Como resultado, se obtuvo un claro efecto de curado. Este hallazgo puede predecir suficientemente el efecto cl´ınico del anticuerpo monoclonal anti-Fas de esta invenci´ on en humanos.

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Se inyect´o este anticuerpo monoclonal Fas anti-rat´ on (5 µg/rat´ on) en la cavidad articular de la zarpa del rat´ on y se examin´o la expresi´on de la toxicidad. Sin embargo, no se observ´ o trastorno en el timo, ri˜ no´n, pulm´ on, bazo y coraz´ on. Se encontr´ o que el anticuerpo monoclonal anti-Fas utilizado en esta invenci´on pr´ acticamente no produce efectos secundarios severos en otras c´elulas y ´organos. 45

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El requisito indispensable del anticuerpo monoclonal anti-Fas de esta invenci´on es el de tener la propiedad de reaccionar espec´ıficamente con el ant´ıgeno Fas en c´elulas sinoviales de pacientes con RA e inducir apoptosis en c´elulas sinoviales. Los inventores encontraron que, entre los anticuerpos monoclonales anti-Fas, hay anticuerpos que satisfacen y anticuerpos que no satisfacen el requisito indispensable antes mencionado de esta invenci´on. Por ejemplo, despu´es de que se inmunizaron ratones con un anticuerpo Fas recombinante obtenido de c´elulas de rat´on transformadas con cADN de ant´ıgeno Fas humano, el anticuerpo monoclonal anti-Fas se obtuvo del “clon ZB4” hibridoma obtenido fusionando c´elulas de bazo de rat´ on con c´elulas de mieloma de rat´on. Examinando si este anticuerpo induce apoptosis en c´elulas sinoviales de pacientes con RA, se encontr´ o que este anticuerpo pr´acticamente no induce apoptosis. Adem´as, no se encontr´ o que este anticuerpo induzca apoptosis, pero s´ı se encontr´ o que contrarresta el efecto del anticuerpo monoclonal anti-Fas que induce apoptosis. Este resultado apoya la consideraci´on de que la definici´on antes mencionada es correcta y adecuada como definici´on del anticuerpo monoclonal anti-Fas de esta invenci´ on. Como ejemplos de anticuerpos que inducen apoptosis se citan un anticuerpo (Medical & Biological Laboratory Co.) preparado a partir del “clon CH-11”, un anticuerpo (Bender+Co Ges mbH) llamado anti-APO-1/Fas (inductor), etc. Sin embargo, el anticuerpo monoclonal anti-Fas de esta invenci´ on solamente ha de tener la propiedad ante5

ES 2 182 860 T3 riormente descrita y no se limita a estos ejemplos.

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El anticuerpo monoclonal anti-Fas se administra usualmente por inyecci´ on en la articulaci´ on de la rodilla, la articulaci´ on del hombro, etc. en forma de una inyecci´ on intraarticular, pero puede administrarse por v´ıa oral o rectal. La dosis del anticuerpo monoclonal anti-Fas se ajusta dependiendo de los s´ıntomas, la forma de dosificaci´ on, etc. Puede ser de 0,1 a 10 ml con una concentraci´ on de 0,0001 a 1,0 % en peso en el caso de inyecci´on y la dosis diaria usual puede ser de 0,001 a 10 mg en una o unas pocas dosis divididas en el caso de un agente oral. La dosificaci´on de la medicina con un efecto inhibitorio de la proliferaci´ on de c´elulas que ha de a˜ nadirse al anticuerpo monoclonal anti-Fas puede ser de 0,00001 a 0,1 % en peso en el caso de inyecci´on, y la dosificaci´ on diaria usual puede ser de 0,0001 a 1 mg en el caso de agente oral. Las formulaciones del anticuerpo monoclonal anti-Fas pueden prepararse de la manera usual. En el caso de inyecci´on, se pueden a˜ nadir opcionalmente al anticuerpo monoclonal anti-Fas excipientes utilizados habitualmente tales como ajustador de presi´ on osm´otica, por ejemplo cloruro s´odico, ajustador de pH, por ejemplo fosfato s´ odico, tensioactivo, por ejemplo polisorbato 80, y agente espesante, por ejemplo metil-celulosa, y ´estos pueden disolverse en agua destilada para inyecci´ on. La formulaci´ on puede prepararse tambi´en en forma de disoluci´ on justo antes de su utilizaci´ on. En el caso de una pastilla, pueden a˜ nadirse al anticuerpo monoclonal anti-Fas excipientes utilizados habitualmente, tales como un agente extendedor, por ejemplo lactosa, un aglutinante, por ejemplo celulosa cristalina, polivinil-pirrolidona, o un lubricante, por ejemplo estearato de magnesio. Se pueden utilizar tambi´en preparaciones de liposomas que pueden transferir eficazmente medicinas a lesiones enfermas, concretamente formulaciones incluidas en una emulsi´ on grasa, tal como se describe en las publicaciones de patente japonesas N◦ 60-51105, 58201712, etc. abiertas a inspecci´on p´ ublica. Se muestran en lo que sigue ejemplos de formulaciones. Ejemplos Se exponen algunos ejemplos de formulaciones que contienen anticuerpo monoclonal anti-Fas de esta invenci´on.

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1) Inyecci´ on Formulaci´on 1 (en 100 ml)

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Anticuerpo monoclonal anti-Fas Cloruro s´ odico Agua destilada para inyecci´ on

0,01 g 0,9 g c.s.

Formulaci´ on 2 (en 100 ml) 40

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Anticuerpo monoclonal anti-Fas Cloruro s´ odico Metil-celulosa Agua destilada para inyecci´ on

0,001 g 0,9 g 0,5 g c.s.

Formulaci´on 3 (en 100 ml) Anticuerpo monoclonal anti-Fas Actinomicina D Cloruro s´ odico Agua destilada para inyecci´ on

0,01 g 0,005 g 0,9 g c.s.

2) Pastilla 55

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Formulaci´ on 1 Anticuerpo monoclonal anti-Fas Lactosa Celulosa cristalina Polivinil-pirrolidona K30 Estearato magn´esico Total

1 133 30 5 1 170

mg mg mg mg mg mg 6

ES 2 182 860 T3 Formulaci´on 2

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Anticuerpo monoclonal anti-Fas Actinomicina D Lactosa Celulosa cristalina Polivinil-pirrolidona K30 Estearato magn´esico Total

0,1 mg 0,02 mg 133,88 mg 30 mg 5 mg 1 mg 170 mg

Se presentan en lo que sigue los resultados de diversos ensayos para demostrar el efecto de esta invenci´on. 15

Ensayos 1. Detecci´ on de la aparici´ on de apoptosis en c´elulas sinoviales reumatoides M´etodo de experimentaci´ on

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Se obtuvieron tejidos sinoviales de pacientes diagnosticados con RA de acuerdo con los criterios del American College of Rheumatology y se recogieron c´elulas sinoviales de acuerdo con el m´etodo de Goto o en peque˜ nos trozos et al. (J. Clin. Invest., 80, 786 (1987)). Espec´ıficamente, el tejido sinovial se pic´ y se digiri´ o con colagenasa (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Se incub´o la suspensi´ on u ´ nica de c´elulas durante la noche y luego se separaron las c´elulas flotantes como c´elulas infiltrantes no adherentes del sinovio. Por otra parte, se cultivaron c´elulas adherentes, concretamente c´elulas sinoviales, en platos hasta su examen. Como contraste se utilizaron c´elulas sinoviales de pacientes con osteoartritis (OA). En segundo lugar, se realizaron una extracci´ on de ADN de c´elulas y una electroforesis para detectar formaci´ on de escaleras de ADN de acuerdo con la literatura (Science, 257, 217 (1992); Nucleic Acids Res., 3, 2303 (1976)) para confirmar si se produce apoptosis en estas c´elulas. Espec´ıficamente, se encubaron c´elulas en una soluci´on de 0,5 mg/ml de protinasa K (Sigma Chemical Co.)-TNE (Tris 10 mM, pH 7,5, cloruro s´ odico 0,1 M, EDTA 1 mM)-SDS a 50◦C durante una hora, y luego se trataron con 0,1 mg/ml de RNasa A (Nippongene, Tokio, Jap´ on) durante una hora m´ as. Seguidamente, se sometieron a alectroforesis 10 µl de ADN en un gel de agarosa al 1,5 %, se ti˜ no´ el conjunto con bromuro de etidio y se observ´ o el resultado. Resultado

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Todas las muestras de ADN extra´ıdo de c´elulas sinoviales de pacientes con RA exhibieron una formaci´on de escaleras de ADN t´ıpica de la apoptosis. Se trat´ o despu´es con colagenasa tejido sinovial de pacientes con RA dando los dos tipos de c´elulas siguientes: C´elulas infiltrantes no adherentes y c´elulas adherentes (c´elulas sinoviales). Observando estos dos tipos de c´elulas, se reconoci´o formaci´ on de escaleras de ADN u ´ nicamente en las c´elulas adherentes. El resultado de la electroforesis de ADN en gel de agarosa anteriormente descrita se muestra en la Figura 1.

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Por otra parte, no se observ´ o formaci´on de escaleras de ADN en c´elulas sinoviales de pacientes con OA. En la Figura 1, OA1 y OA2 indican ADN de pacientes con OA, y RA1-RA6 indican ADN de pacientes con RA, respectivamente. En las calles numeradas, las calles 2 y 4 indican ADN de c´elulas sinoviales de las articulaciones de la rodillo de pacientes con OA, las calles 9, 11, 21 y 26 indican ADN de c´elulas sinoviales de las articulaciones de la rodilla de pacientes con RA, las calles 10, 14, 25 y 27 indican ADN de c´elulas sinoviales de articulaciones del codo, las calles 12 y 15 indican ADN de c´elulas sinoviales de articulaciones de la mu˜ neca, las calles 16, 20, 23 y 24 indican ADN de c´elulas sinoviales de articulaciones de los dedos, y las calles 18 y 19 indican ADN de c´elulas sinoviales de articulaciones del tobillo. Dado que las dem´ as calles no se refieren a este art´ıculo directamente, se omite la asignaci´on de ellas. Se observ´ o la formaci´ on de escaleras en ADN de articulaciones de pacientes con RA descritas anteriormente, mientras que no se observ´ o la formaci´on de escaleras en ADN de articulaciones de pacientes con OA.

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2. Detecci´ on de apoptosis por an´ alisis microsc´ opico electr´ onico y m´etodo de marcaci´ on de extremos adherentes de ADN 5

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M´etodo de experimentaci´ on Tejidos sinoviales obtenidos de pacientes con RA y de pacientes con OA fueron fijados con glutaraldeh´ıdo al 2,5 % y evaluados para an´ alisis con microscopio electr´onico. El marcado de secciones del tejido con extremos adherentes de ADN se realiz´o de acuerdo con el m´etodo de Gavrieli et al. (J. Cell. Biology, 119, 493 (1992)). Espec´ıficamente, se fijaron tejidos sinoviales en formaldeh´ıdo tamponado al 4 % y se incrustaron en parafina. Se aplicaron secciones de parafina (4-6 µm) a portaobjetos previamente tratados con una soluci´on acuosa de polilisina al 0,01 % (300.000 de peso molecular, Sigma Chemical Co.). Se desparafinaron despu´es los portaobjetos y se hidrataron los tejidos. Se desprendieron las prote´ınas de los n´ ucleos incubando el tejido con 20 µg/ml de proteinasa K a temperatura ambiente. Se enfri´ o bruscamente la peroxidasa end´ ogena con per´oxido de hidr´ ogeno al 2 %. Se sumergieron estas muestras en un tamp´ on de desoxinucleotidil-transferasa terminal (TDT) (base de Trizma 30 mM, pH 7,2, cacodilato s´odico 140 mM, cloruro de cobalto 1 mM). Seguidamente, se a˜ nadieron TDT (0,3 u/µl) y dUTP biotinilado en tamp´ on de TDT. Se termin´ o la reacci´on colocando los portaobjetos en tamp´ on de TB (cloruro s´ odico 300 mM, citrato s´ odico 30 mM) y se cubrieron muestras con una soluci´on acuosa al 2 % de alb´ umina de suero humano (HSA) o alb´ umina de suero bovino (BSA), seguido por extra-avidinperoxidasa. Finalmente, se ti˜ neron las muestras con AEC. Resultado La fotograf´ıa del microscopio electr´onico se muestra en la Figura 2.

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Como se desprende de la Figura 2, la morfolog´ıa t´ıpica de la apoptosis, es decir, org´ anulos citopl´ asmicos densamente empaquetados y cromatina densa fijada a lo largo de la envoltura nuclear, fue observada en tejidos sinoviales de pacientes con RA mediante microscop´ıa electr´onica. Adem´ as, se encontraron c´elulas sinoviales de tipo A (c´elulas semejantes a macr´ofagos tisulares) junto a estas c´elulas apopt´ oticas. Por otra parte, no se observ´ o ning´ un cambio por apoptosis t´ıpica en tejidos sinoviales de pacientes con OA. En la Figura 3A se muestra la fotograf´ıa de tejido sinovial de pacientes con RA te˜ nido con hematoxilineosina, y en la Figura 3B se muestra la fotograf´ıa de tejido sinovial de los mismos pacientes tratado con el m´etodo de marcado de extremos adherentes y te˜ nido.

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Como se muestra con una flecha en la Figura 3B, se ti˜ neron n´ ucleos de c´elulas fibroblastoides en los tejidos sinoviales mientras que no se ti˜ neron las c´elulas mononucleares no infiltrantes. 3. An´ alisis citom´etrico de flujo de ant´ıgeno Fas 45

M´etodo de experimentaci´ on

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Se detect´ o ant´ıgeno Fas en la superficie de las c´elulas en la forma siguiente. C´elulas sinoviales (5 x on salina isot´ onica tamponada con 105 ) de pacientes con RA y pacientes con OA fueron lavadas con soluci´ fosfato (PBS) y luego se suspendieron en 0,1 ml de PBS conteniendo 1 % de alb´ umina de suero bovino, 0,02 % de azida de sodio y 20 µl/ml de anticuerpo monoclonal anti-Fas (Medical & Biological Laboratory Co., Nagoya, Jap´ on, producida a partir del “clon CH-11”), y se coloc´ o el conjunto en hielo durante 30 minutos. Despu´es de lavar dos veces con PBS, se incubaron c´elulas durante 30 minutos con 0,1 ml de PBS conteniendo 1 % de alb´ umina de suero bovino, 0,02 % de azida de sodio y 10 µg/ml de IgM anti-rat´on de cabra marcado con FITC y purificado en cuanto a afinidad. Se lavaron las c´elulas despu´es tres veces con PBS y se analizaron con un cit´ ometro de flujo. Se realiz´ o un experimento similar con una muestra a la que se a˜ nadi´ o, como control de comparaci´ on, IgM de rat´ on en lugar del anticuerpo monoclonal anti-Fas.

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ES 2 182 860 T3 Resultado

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En la Figura 4 se muestra el resultado obtenido. Como se desprende de la Figura 4, la muestra a la que se a˜ nadi´ o el anticuerpo monoclonal anti-Fas ten´ıa un revelado de color m´ as intenso que el control, y se demostr´ o que el ant´ıgeno Fas se expresa en c´elulas sinoviales de pacientes con RA. Se obtuvo un resultado similar en el caso de pacientes con OA. 4. Inducci´ on de apoptosis en c´elulas sinoviales a˜ nadiendo anticuerpo monoclonal anti-Fas

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M´etodo del experimentaci´ on Una soluci´on D-MEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) y luego el anticuerpo monoclonal anti-Fas (Medical & Biological Laboratory Co., producido a partir del “clon CH-11”, PBS conteniendo 50 % de glicerol) fueron a˜ nadidos a c´elulas sinoviales (1 x 106 ) de pacientes con RA obtenidas por el ensayo 1 antes mencionado hasta que la concentraci´on alcanz´o finalmente 0,01-1,0 µg/ml, y se incubaron neron despu´es estas c´elulas con azul trip´ an, se cuantificaron estas c´elulas a 37◦C durante 24 horas. Se ti˜ las c´elulas viables mediante microscop´ıa de contraste de fase, y se determin´ o la proporci´ on de apoptosis sobre la base del n´ umero de c´elulas muertas. Se realizaron experimentos similares utilizando como contrastes c´elulas sinoviales de pacientes con OA y de humanos normales (pacientes con meniscitis).

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Se realizaron despu´es la extracci´on de ADN de c´elulas y la electroforesis para detectar la formaci´ on de escaleras de ADN por el mismo m´etodo que el utilizado para el ensayo 2 antes mencionado a fin de confirmar si se produce apoptosis en las c´elulas muertas de la muestra a la que se a˜ nadi´ o el anticuerpo monoclonal anti-Fas. 25

Se a˜ nadi´ o una cantidad constante de actinomicina D (50 ng/ml) al anticuerpo monoclonal anti-Fas, se a˜ nadi´ o esta muestra a las c´elulas sinoviales de pacientes con RA y se realiz´o un experimento de la misma manera que antes. 30

Resultado En la Tabla 1 se muestra la proporci´ on de apoptosis en las c´elulas sinoviales con adici´on de solamente anticuerpo monoclonal anti-Fas. TABLA 1

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Anticuerpo monoclonal anti-Fas

Adici´ on de anticuerpo monoclonal anti-Fas (µg/ml)

Proporci´ on de apoptosis Pacientes con RA

Pacientes con OA

Normal

0,01 0,1 1,0

5,5 % 25,8 % 45,2 %

1,7 % 2,2 % 3,2 %

1,1 % 0,9 % 2,9 %

Como se muestra en la Tabla 1, se encontr´o que las c´elulas sinoviales, excepto las de pacientes con RA, apenas est´ an sometidas a la acci´ on del anticuerpo monoclonal anti-Fas, mientras que aumenta la muerte de c´elulas con la concentraci´on del anticuerpo monoclonal anti-Fas en las c´elulas sinoviales de pacientes con RA. Se confirm´ o tambi´en que la muerte de las c´elulas es causada por apoptosis debido a que se detect´o la formaci´on de escaleras de ADN en el experimento utilizando electroforesis. En la Tabla 2 se muestran los resultados con adici´ on de actinomicina D al anticuerpo monoclonal anti-Fas.

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ES 2 182 860 T3 TABLA 2

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Proporci´ on de apoptosis Pacientes con RA

0,01 0,1 1,0

60,4 % 83,0 % 93,7 %

Anticuerpo monoclonal anti-Fas + actinomicina D

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Adici´on de anticuerpo monoclonal anti-Fas (µg/ml)

Como se desprende de la Tabla 2, se increment´ o notablemente la proporci´ on de muerte de c´elulas en el caso del uso combinado del anticuerpo monoclonal anti-Fas y la actinomicina D en comparaci´on con la del caso del anticuerpo monoclonal anti-Fas solo. Estos resultados demuestran que el anticuerpo monoclonal anti-Fas induce apoptosis en las c´elulas sinoviales proliferantes, y se demostr´ o que el anticuerpo anti-Fas es un excelente agente terap´eutico para la RA debido a que el anticuerpo anti-Fas apenas act´ ua, o bien act´ ua muy d´ebilmente sobre las c´elulas, excepto las de pacientes con RA. 5. Ensayo en vivo utilizando modelos de ratones

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Para predecir el efecto cl´ınico del anticuerpo monoclonal anti-Fas en humanos, se administr´o este anticuerpo a modelos de enfermedades de ratones y se examin´o el efecto. Anticuerpo

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Se prepar´o de la manera siguiente el anticuerpo monoclonal Fas anti-rat´on utilizado (Medical & Biological Laboratory Co.). Se inmunizaron h´amsters armenios con un ant´ıgeno Fas de rat´on soluble recombinante y se fusionaron las c´elulas de bazo de h´ amsters inmunizados con la c´elulas de mieloma de rat´ on (NS-1) para proporcionar el “clon RK-8” hibridoma. El anticuerpo monoclonal Fas anti-rat´ on es un anticuerpo IgG monoclonal que se obtuvo del hibridoma y que se purific´ o.

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Modelos de enfermedades

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Se utilizaron modelos de artritis aproximados a la RA humana procedentes de ratones transg´enicos BALB/CAnN Px (de 10-20 semanas de edad, cuyo linaje se mantiene en el Nippon Institute for Biological Science). M´etodo de experimentaci´ on

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Se inyectaron 5 µl de anticuerpo monoclonal Fas anti-rat´ on (1 mg/ml, soluci´ on salina tamponada con fosfato) en la cavidad articular de la zarpa de los ratones y se midi´ o la cantidad de hinchaz´ on de la zarpa. Se midieron la anchura de la articulaci´ on y la altura del empeine con calibres de cursor y se defini´ o el producto de la anchura y la altura como la cantidad de hinchaz´ on de la zarpa. Como control se utiliz´o IgG de h´ amster purificado (UCX8-4B3, Pharmingen). Resultado Los resultados se muestran en la Tabla 3. Los valores de la Tabla 3 indican promedios de porcentajes de hinchaz´ on de la zarpa con respecto al control antes de la administraci´ on.

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ES 2 182 860 T3 TABLA 3

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D´ıas despu´es de administraci´on

Grupo administrado con anticuerpo (n = 5)

Grupo de control (n = 4)

0 1 2 3 4

100 87 79 75 74

100 98 101 100 98

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Como se muestra en la Tabla 3, el grupo administrado con anticuerpo disminuy´ o significativamente la hinchaz´ on de la zarpa. 6. Ensayo de inducci´ on de apoptosis

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Para investigar la especificidad de la inducci´on de apoptosis por el anticuerpo monoclonal anti-Fas, se examin´o el efecto de dos tipos de anticuerpos monoclonales anti-Fas en c´elulas sinoviales de pacientes con RA. Anticuerpo

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Se utilizaron el mismo anticuerpo monoclonal anti-Fas (el mismo anticuerpo que el utilizado para el ensayo 4 antes mencionado, denominado “anticuerpo A” en lo que sigue) producido a partir del “clon CH-11”, y otro anticuerpo monoclonal anti-Fas (Medical & Biological Laboratory Co., denominado “anticuerpo B” en lo que sigue). Este u ´ ltimo se produjo a partir del “clon ZB4” obtenido por el m´etodo que incluye los dos pasos siguientes: inmunizar ratones BALB/C con un ant´ıgeno Fas recombinante obtenido de c´elulas de rat´ on transformadas con cADN de ant´ıgeno Fas humano, y fusionar luego las c´elulas de bazo de rat´ on con c´elulas de mieloma de rat´on (NS-1). M´etodo de experimentaci´ on

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Se incubaron en una placa de cultivo celular c´elulas sinoviales (1 x 105 ) de pacientes con RA obtenidas por el mismo m´etodo que el utilizado para el ensayo 1 antes mencionado. Despu´es de la adherencia de las c´elulas, se a˜ nadi´ o a ellas el anticuerpo A (0,1 µg/ml, 1 µg/ml) o el anticuerpo B (0,5 µg/ml) y se determinaron las tasas de supervivencia de las c´elulas despu´es de cierto per´ıodo de tiempo. Adem´as, se a˜ nadi´ o primero el anticuerpo B (0,5 µg/ml) y luego se a˜ nadi´ o el anticuerpo A (0,1 µg/ml, 1 µg/ml) una hora despu´es, y se determinaron las tasas de supervivencia de las c´elulas despu´es de cierto per´ıodo de tiempo (representado en per´ıodo de tiempo despu´es de la adici´on del anticuerpo A). Resultado

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Los resultados se muestran en la Tabla 4.

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ES 2 182 860 T3 TABLA 4 Anticuerpo 5

Tasa de supervivencia de c´elulas (%) Despu´es de 6 h

Despu´es de 24 h

Despu´es de 48 h

A (0,1 µg/ml)

85

69

77

A (1,0 µg/ml)

71

54

59

B (0,5 µg/ml)

98

98

99

A (0,1 µg/ml) + B (0,5 µg/ml)

98

97

98

A (1,0 µg/ml) + B (0,5 µg/ml)

98

98

97

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Como se muestra en la Tabla 4, el anticuerpo A induce apoptosis en c´elulas sinoviales dependiendo de la concentraci´on (tiende a recuperarse despu´es de 48 horas), mientras que el anticuerpo B apenas induce apoptosis. Adem´ as, el anticuerpo B indica antagonismo contra el anticuerpo A y contrarresta el efecto de este anticuerpo A.

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ES 2 182 860 T3 REIVINDICACIONES

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1. Uso de un anticuerpo monoclonal anti-Fas como ingrediente activo para la fabricaci´ on de un agente terap´eutico para tratar la artritis reumatoide, reaccionando espec´ıficamente dicho anticuerpo monoclonal anti-Fas con un ant´ıgeno Fas humano en c´elulas sinoviales reumatoides e induciendo apoptosis en dichas c´elulas sinoviales, obtenible inmunizando ratones con fibroblasto diploide humano, fusionando las c´elulas de bazo de rat´ on con c´elulas de mieloma de rat´on y aislando luego los anticuerpos IgM producidos.

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2. Uso del anticuerpo monoclonal anti-Fas seg´ un la reivindicaci´ on 1, en el que dicho agente terap´eutico comprende una combinaci´ on de dicho anticuerpo monoclonal anti-Fas y una sustancia m´edica que tiene un efecto inhibitorio sobre la proliferaci´ on de las c´elulas. 3. Uso del anticuerpo monoclonal anti-Fas seg´ un la reivindicaci´ on 1 ´o 2, en el que dicha sustancia m´edica que tiene un efecto inhibitorio sobre la proliferaci´ on de las c´elulas es la actinomicina D.

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4. Uso del anticuerpo monoclonal anti-Fas seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho agente terap´eutico est´a en forma de inyecci´on intraarticular.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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