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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 208 632

51 Int. Cl. : C12N 15/82, C12N 15/54

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C12N 15/29, C12N 5/10 A01H 5/00, A23K 1/14 A23L 1/09

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 91250105 .3

86 Fecha de presentación: 17.04.1991

87 Número de publicación de la solicitud: 0455316

87 Fecha de publicación de la solicitud: 06.11.1991

54 Título: Plásmido que contiene secuencias de ADN que provocan cambios en la concentración de hidratos

de carbono y de proteínas y en la composición de hidratos de carbono y proteínas en las plantas; y células de las plantas y plantas que contienen esos plásmidos. 30 Prioridad: 20.04.1990 DE 40 13 144

73 Titular/es: Bayer CropScience GmbH

Bruningstrasse, 50 65929 Frankfurt/Main, DE

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.06.2004

72 Inventor/es: Willmitzer, Lothar;

Sonnewald, Uwe; Höfgen, Rainer; Kossmann, Jens y Müller, Bernd

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Lehmann Novo, María Isabel

ES 2 208 632 T3

16.06.2004

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 208 632 T3 DESCRIPCIÓN

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Plásmido que contiene secuencias de ADN que provocan cambios en la concentración de hidratos de carbono y de proteínas y en la composición de hidratos de carbono y proteínas en las plantas; y células de las plantas y plantas que contienen esos plásmidos.

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La presente invención se refiere a plásmidos cuyas secuencias de ADN, cuando se insertan en el genoma de una planta, provocan cambios en la concentración de hidratos de carbono y proteínas y en la composición de hidratos de carbono y proteínas en plantas regeneradas. La invención se refiere también a células de plantas y a plantas que contienen esos plásmidos. Debido a la necesidad continuamente creciente de alimentos y materias primas, que resultan de una población mundial en constante crecimiento, una de las tareas de la investigación biotecnológica es buscar cómo modificar los contenidos y la producción de plantas productivas. Eso implica modificar el metabolismo de las plantas.

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De especial interés es la posibilidad de usar contenidos de plantas como fuentes renovables de materias primas, por ejemplo, para la industria química. Esto es de una importancia especialmente enorme por dos razones. En primer lugar, los depósitos de petróleo y de carbón son las fuentes principales de materias primas que se han usado hasta ahora por la industria petroquímica. Sin embargo, estas reservas no son indefinidas, y es previsible que se tengan que proporcionar fuentes alternativas, renovables, de materias primas, es decir materias primas que crezcan nuevamente. En segundo lugar, la situación actual en la agricultura es tal que en Europa y en el Norte de América hay un exceso de productos agrícolas tradicionales dirigidos al sector alimentario. Esto conduce a problemas financieros y políticos obvios en la agricultura. Los productos alternativos, de los cuales hay una gran necesidad en términos de cantidad, podrían representar una solución a ese problema.

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Las materias primas que son renovables se pueden dividir en principio en grasas y aceites, proteínas, y compuestos de hidratos de carbono tales como mono-, oligo- y polisacáridos. En el caso de los polisacáridos, los componentes más importantes son con mucho el almidón y la celulosa. En la CEE, la producción total de almidón para el año 1987/1988 se dividió entre las plantas de maíz (60%), trigo (19%) y patatas (21%). En el caso de los oligosacáridos, el disacárido sacarosa es con mucho la sustancia más importante en términos de cantidad. Dentro de la CEE, la remolacha azucarera es con mucho la fuente más importante usada en la producción y extracción de sacarosa. A fin de expandir adicionalmente la explotación industrial de mono- y oligosacáridos como materias primas, y en vista del grado elevado de riesgo ecológico y económico inherente en el cultivo de monocultivos que tienen una tasa baja de rotación de cosechas, tales como, por ejemplo, remolacha azucarera, es deseable adicionalmente usar plantas distintas de la remolacha azucarera en la producción de oligosacáridos. Cuando se usan semillas o tubérculos como la materia prima para la producción de azúcar, un impedimento considerable es la gran cantidad de líquido. En el caso de la patata, el contenido de líquido constituye aproximadamente el 80% del peso fresco del tubérculo. El líquido contiene una gran proporción de nitrógeno reducido, lo que conduce a problemas ecológicos durante el procesamiento. Cuando se usan semillas o tubérculos para la producción de azúcar, sería por tanto ventajoso reducir el contenido de proteínas de las semillas o tubérculos.

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Por otro lado, un aumento en la concentración de proteína en semillas y tubérculos de una planta sería deseable si se requirieran productos de plantas de calidad mejorada, tales como, por ejemplo, alimentos ricos en proteínas o forraje para el ganado. 50

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Se conocen las rutas bioquímicas implicadas en la síntesis del almidón en plantas superiores. Igualmente, algunas de las proteínas principales del tubérculo de la patata se han investigado bien de forma bioquímica, por ejemplo, la patatina, la principal proteína de almacenamiento del tubérculo de la patata, es una glicoproteína que tiene un peso molecular de 40 kDa. (El clon genómico de la patatina se describe por M. Rocha-Sosa et al., loc. cit.). Se conocen nuevos procesos biotecnológicos para la modificación genética de plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas por medio de la transferencia e incorporación estable de genes aislados individuales o grupos de genes (Gasser y Fraley, Science 244, 1293-1299). También se conocen posibles medios de expresión específica, principalmente en el tubérculo, de genes extraños insertados en la patata por medio de procesos de ingeniería genética (Rocha-Sosa et al., (1989), EMBO J., 8, 23-29; y EP 375.092).

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Un objeto de la presente invención es proporcionar plásmidos cuyas secuencias de ADN, cuando se insertan en el genoma de una planta, provocan cambios en la concentración de hidratos de carbono y de proteínas y en la composición de hidratos de carbono y proteínas en plantas regeneradas. Un problema adicional de la presente invención es proporcionar células de plantas y plantas que contengan esas secuencias de ADN localizadas en los plásmidos.

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La presente invención proporciona un plásmido que comprende una secuencia de ADN que conduce, cuando está presente en una célula de la planta, a tanto una reducción en la concentración de almidón como a un aumento en la concentración de al menos un sacárido seleccionado de monosacáridos y oligosacáridos. 2

ES 2 208 632 T3 La presente invención también proporciona un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína patatina, y también proporciona una planta o una célula de planta que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína patatina, por ejemplo, la secuencia de ADN puede estar en forma de un plásmido según la presente invención. 5

La presente invención también proporciona un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína patatina, estando presente la secuencia de ADN en orientación invertida como se define aquí posteriormente. 10

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La presente invención proporciona además un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína, la ADP-glucosa pirofosforilasa, estando presente la secuencia de ADN en orientación invertida como se define aquí posteriormente. La secuencia de ADN puede codificar una o ambas de las subunidades de una ADPglucosa pirofosforilasa. La secuencia de ADN codifica, por ejemplo, la isoforma I, la isoforma II o ambas isoformas de la ADP-glucosa pirofosforilasa de patata. Una secuencia de ADN en la orientación normal (no invertida) en un plásmido está dispuesta de forma que el extremo 3’ de la secuencia de ADN, según se define por la ventana de lectura abierta, está ligado al extremo 5’ del plásmido, y el extremo 5’ del ADN está ligado al extremo 3’ del plásmido. El ADN se puede leer entonces correctamente, transcribir y traducir. La expresión “orientación invertida” se usa aquí para significar que una secuencia de ADN en un plásmido está dispuesta de forma que el extremo 3’ de la secuencia de ADN, según se define por la ventana de lectura abierta, está ligado al extremo 3’ del plásmido, y el extremo 5’ del ADN está ligado al extremo 5’ del plásmido. Cuando tal construcción invertida se transcribe en la planta hospedadora, el ARNm resultante es “antisentido” con respecto al ARNm “sentido” normal. Una secuencia de ADN en orientación invertida se puede considerar como equivalente a la hebra no codificante de esa secuencia de ADN. En un plásmido de la presente invención, la secuencia de ADN está ligada preferiblemente a secuencias reguladoras que son operativas en sistemas de plantas y que aseguran la expresión de la secuencia de ADN en una planta, por ejemplo, un promotor y una señal de terminación de genes víricos y/o genes de plantas. El promotor es, por ejemplo, el promotor del ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor, y la señal de terminación deriva, por ejemplo, de un gen de octopina sintasa, por ejemplo, del gen de octopina sintasa del ADN T del plásmido Ti pTiACH5.

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En un plásmido de la invención, que comprende una secuencia de ADN en orientación invertida, un promotor y una señal de terminación, preferiblemente el extremo 3’ de la secuencia de ADN está ligado al extremo 3’ del promotor, y el extremo 5’ del ADN está ligado al extremo 5’ de la señal de terminación. 35

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Ejemplos de plásmidos según la presente invención son p35S-anti-ADP-glc1 (DSM 5879), p35S-anti-ADP-glc2 (DSM 5880) y p35S-anti-ADP-glc1+2 (DSM 5881), plásmidos los cuales se describen a continuación junto con su construcción. La presente invención también proporciona una planta o una célula de planta que comprende una secuencia de ADN como se define anteriormente, y proporciona además una planta o una célula de planta que comprende un plásmido según se define anteriormente. La presente invención proporciona además el uso de un plásmido de la presente invención, o de una célula de planta de la presente invención, en la producción de una planta transgénica.

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Se ha encontrado que en plantas transgénicas que comprenden una secuencia de ADN que codifica una proteína ADP-glucosa pirofosforilasa, secuencia de ADN la cual está presente en orientación invertida, estando la secuencia de ADN, por ejemplo, en un plásmido de la presente invención, se reduce la actividad de ADP-glucosa fosforilasa y la concentración de almidón en comparación con las de las plantas no transformadas, y al mismo tiempo se aumentan las concentraciones de mono- y oligosacáridos, es decir, se aumenta el contenido de azúcares. Una planta transgénica comprende preferiblemente el gen 35S-anti-glc1, 35S-anti-glc2 o 35S-anti-glc1+2, localizado en plásmidos p35S-antiADP-glc1 (DSM 5879), p35S-anti-ADP-glc2 (DSM 5880) y p35S-anti-ADP-glc1+2 (DSM 5881), respectivamente. Tales plantas transgénicas se pueden usar como una materia prima en la extracción de mono- y oligosacáridos, especialmente sacarosa. Tales plantas son, por ejemplo, plantas de patata, puesto que los tubérculos de patata transgénicos resultantes son particularmente útiles como una materia prima para la extracción de mono- y oligosacáridos, especialmente sacarosa, que entonces se pueden usar en la producción de otras sustancias. Puesto que se reduce la concentración de proteína, y por tanto la cantidad de nitrógeno indeseable en el líquido de procesamiento, tales plantas transgénicas se pueden usar como una materia prima en la producción de sacarosa. Tales plantas son, por ejemplo, plantas de patata, puesto que los tubérculos de patata transgénicos resultantes son particularmente útiles como una materia prima para la producción de sacarosa. Puede ser particularmente ventajoso construir plantas transgénicas que comprendan tanto una secuencia de ADN que codifique una proteína ADP-glucosa pirofosforiasa como una secuencia de ADN que codifique una proteína patatina, estando cada una de las secuencias de ADN presentes en orientación invertida. Las plantas resultantes tienen un contenido reducido de almidón, un contenido aumentado de azúcares, y un nivel reducido de proteína. Tales plantas, por ejemplo, plantas de patata, y especialmente tubérculos de patata, son particularmente útiles como una materia 3

ES 2 208 632 T3 prima para la producción de sacarosa.

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Hay disponible un gran número de vectores de clonación, que comprenden un sistema de replicación en E. coli y un marcador que permite la selección de las células transformadas, para la preparación para la inserción de genes extraños en plantas superiores. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, la serie pUC, la serie M13mp, pACYC184, etc. En consecuencia, la secuencia se puede insertar en el vector en un sitio adecuado de restricción. El plásmido resultante se usa para la transformación en E. coli. Las células de E. coli se cultivan en un medio nutriente adecuado, entonces se cosechan y se destruyen. Se recupera el plásmido. Generalmente se llevan a cabo análisis de secuencias, análisis de restricción, electroforesis y otros métodos biológicos bioquímico-moleculares como los métodos de análisis. Tras cada manipulación, la secuencia de ADN usada se puede romper y unir a la siguiente secuencia de ADN. Cada secuencia del plásmido se puede clonar en el mismo plásmido o en otros plásmidos. Dependiendo del método de inserción de los genes deseados en la planta, pueden ser necesarias otras secuencias de ADN. Por ejemplo, si se usa el plásmido Ti o Ri para la transformación de la célula de la planta, entonces se ha de unir al menos el borde derecho, pero a menudo el borde derecho y el borde izquierdo del ADN T del plásmido Ti o Ri, como la región de flanqueo de los genes a insertar.

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El uso de ADN T para la transformación de células de planta se ha investigado de forma intensa y se ha descrito suficientemente en los documentos EP 120.516; Hoekema, en: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, 1985, Capítulo V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4: 1-46 y An et al., EMBO J. (1985) 4: 277-287.

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Una vez el ADN insertado se ha integrado en el genoma, es relativamente estable allí y, como regla, ya no sale nuevamente. Normalmente contiene un marcador de selección que confiere, en las células de la planta transformada, resistencia a un biocida o a un antibiótico, tal como canamicina, G 418, bleomicina, higromicina o cloranfenicol, entre otros. El marcador empleado individualmente debe permitir en consecuencia la selección de células transformadas en vez de células que no contengan el ADN insertado. Hay disponible un gran número de técnicas para insertar ADN en una célula hospedante de planta. Esas técnicas incluyen la transformación con ADN T usando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación, la fusión, la inyección o la electroporación, así como otros métodos posibles. Si se usan agrobacterias para la transformación, el ADN a insertar ha de ser clonado en plásmidos especiales, principalmente en un vector intermedio o en un vector binario. Los vectores intermedios se pueden integrar en el plásmido Ti o Ri por recombinación homóloga gracias a las secuencias que son homólogas a las secuencias en el ADN-T. El plásmido Ti o Ri también comprende la región vir necesaria para la transferencia del ADN-T. Los vectores intermedios no se pueden replicar ellos mismos en agrobacterias. El vector intermedio se puede transferir a Agrobacterium tumefaciens por medio de un plásmido auxiliar (conjugación). Los vectores binarios se pueden replicar ellos mismos tanto en E. coli como en agrobacterias. Comprenden un gen marcador de selección y un ligador o poliligador que están enmarcados por las regiones de los bordes derecho e izquierdo de ADN-T. Se pueden transformar directamente en agrobacterias (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. (1978), 163: 181-187). La agrobacteria usada como célula hospedante comprende un plásmido que tiene una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del ADN-T en la célula de la planta. Puede haber más ADN-T. La bacteria así transformada se usa para la transformación de células de plantas. Los explantes de las plantas se pueden cultivar ventajosamente con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN en la célula de la planta. Entonces se pueden regenerar plantas completas a partir del material de planta infectado (por ejemplo, trozos de hojas, segmentos de pedúnculo, raíces, pero también protoplastos o células cultivadas en suspensión) en un medio adecuado, que puede contener antibióticos o biocidas para la selección. Las plantas así obtenidas se pueden ensayar entonces para determinar la presencia del ADN insertado. No se piden requisitos especiales de los plásmidos en el caso de inyección y electroporación. Es posible usar plásmidos normales, tales como, por ejemplo, derivados de pUC. Las células transformadas crecen en el interior de las plantas de la manera habitual. Las plantas se pueden hacer crecer de la manera normal, y se pueden cruzar con plantas que tengan los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos resultantes tienen las propiedades fenotípicas correspondientes. Abreviaturas

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bp, kb D, kDa ADN ARN SDS tris EDTA

= = = = = = =

pares de bases, kilobases dalton, kilodalton ácido desoxirribonucleico, portador de la información genética ácido ribonucleico dodecilsulfato de sodio tris(2-aminoetil)amina ácido etilendiamintetraacético

Se depositaron los siguientes plásmidos en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) en Brunswick,

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ES 2 208 632 T3 Alemania el 18.04.1990 (número de depósito):

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plásmido plásmido plásmido

p35S-anti-ADP-glc1 p35S-anti-ADP-glc2 p35S-anti-ADP-glc1+2

(DSM 5879) (DSM 5880) (DSM 5881)

Descripción de las figuras 10

La Fig. 1 muestra la estructura del plásmido de 5,0 kb p35S-anti-ADP-glc1. El gen 35S-anti-ADP-glc1 localizado en el plásmido contiene los siguientes fragmentos: A = Fragmento A (529 pb) contiene el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). Ese fragmento incluye los nucleótidos 6909 a 7437 de CaMV.

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B = Fragmento B (191 pb) contiene la señal de poliadenilación del gen 3 del ADN-T del plásmido Ti pTiACH5. Este fragmento incluye los nucleótidos 11749-11939. 20

C = Fragmento C (1589 pb) contiene el fragmento Eco RI que codifica la isoforma I de las dos isoformas de la ADPglucosa pirofosforilasa de patata. El gen 35S-anti-ADP-glc1 se clona en el poliligador del plásmido pUC18. También se muestran los sitios de ruptura descritos en el Ejemplo 3.

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La Fig. 2 muestra la estructura del plásmido de 5,1 kb p35S-anti-ADP-glc2. El gen 35S-anti-ADP-glc2 localizado en el plásmido contiene los siguientes fragmentos: A = Fragmento A (529 pb) contiene el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). Ese fragmento incluye los nucleótidos 6909 a 7437 de CaMV.

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B = Fragmento B (191 pb) contiene la señal de poliadenilación del gen 3 del ADN-T del plásmido Ti pTiACH5. Este fragmento incluye los nucleótidos 11749-11939. 35

C = Fragmento C (1700 pb) contiene el fragmento Eco RI que codifica la isoforma II de las dos isoformas de la ADP-glucosa pirofosforilasa de patata. El gen 35S-anti-ADP-glc2 se clona en el poliligador del plásmido pUC18. También se muestran los sitios de ruptura descritos en el Ejemplo 4.

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La Fig. 3 muestra la estructura del plásmido de 6,6 kb p35S-anti-ADP-glc1+2. El gen 35S-anti-ADP-glc1+2 localizado en el plásmido contiene los siguientes fragmentos: A = Fragmento A (529 pb) contiene el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). Ese fragmento incluye los nucleótidos 6909 a 7437 de CaMV.

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B = Fragmento B (191 pb) contiene la señal de poliadenilación del gen 3 del ADN-T del plásmido Ti pTiACH5. Este fragmento incluye los nucleótidos 11749-11939. 50

C1 = Fragmento C1 (1700 pb) contiene el fragmento Eco RI que codifica el ADNc de la isoforma II de la ADPglucosa pirofosforilasa de patata. C2 = Fragmento C2 (1500 pb) que contiene el fragmento Xba I/Xba I de p35S-anti-ADP-glc1 que codifica el ADNc de isoforma I de la ADP-glucosa pirofosforilasa de patata.

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El gen 35S-anti-ADP-glc1+2 se clona en el poliligador del plásmido pUC18. También se muestran los sitios de ruptura descritos en el Ejemplo 5.

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La Fig. 4 muestra las bandas de ARN de ADP-glc1 hechas visibles por autorradiografía. La intensidad de las bandas es una medida de la concentración del ARN particular en cuestión. Las posiciones K1-K4 contienen ARN de tubérculos de plantas no transformadas, las posiciones 93, 89, 62, 52, 53, 23, 61, 85, 36, 37, 54 y 82 contienen ARN de tubérculos de plantas transformadas. No se detecta ARN de ADP-glc1 en posiciones 93, 89, 62, 52, 53, 23, 61 y 85.

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La Fig. 5 muestra la cantidad de proteína ADP-glucosa pirofosforilasa I en tubérculos de plantas de control no transformadas (posiciones K1-K4), y la reducción en la cantidad, o la desaparición, de esa proteína en tubérculos de plantas de patata transformadas con el gen 35S-anti-ADP-glc1 (posiciones 93, 89, 62, 52, 53, 23, 61, 85, 36, 37, 54 y 82). 5

ES 2 208 632 T3 En las posiciones 93, 89, 62, 52, 53, 23, 61 y 85 hay notablemente menos proteína ADP-glucosa pirofosforilasa I. A fin de proporcionar una mejor comprensión de los Ejemplos que forman la base de esta invención, se enumerarán en primer lugar todos los procesos que son necesarios para estos ensayos y que son conocidos per se: 5

Métodos 1. Proceso de clonación 10

Para la clonación se usaron los vectores pUC18/19 y pUC118, y la serie M13mp10 (Yanisch-Perron et al., Gene (1985), 33, 103-1019). Para la transformación de plantas, se clonaron las construcciones génicas en el vector binario BIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984), 12, 8711-8720).

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2. Cepas bacterianas Se usó la cepa BMH71-18 de E. coli (Messing et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977), 24, 6342-6346) o TB1 para los vectores pUC y M13mp. 20

Para el vector BIN19, se usó exclusivamente la cepa TB1 de E. coli. El TB1 es un derivado resistente a tetraciclina, de recombinación negativa, de la cepa JM101 (Yanisch-Perron et al., Gene (1985), 33, 103-119). El genotipo de la cepa TB1 es (Bart Barrel, comunicación personal): F’ (traD36, proAB, lacI, lacZ, M15), (lac, pro), SupE, thiS, recA, sr1::Tn10(TCR). 25

La transformación de los plásmidos en las plantas de patatas se llevó a cabo por medio de la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens (Bevan, M., Nucl. Acids Res. 12, 8711-8721, (1984); derivado BIN19). 3. Transformación de Agrobacterium tumefaciens 30

En el caso de derivados BIN19, la inserción del ADN en las agrobacterias se efectuó por transformación directa según el método desarrollado por Holsters et al., (Mol. Gen. Genet. (1978), 163, 181-187). El ADN del plásmido de las agrobacterias transformadas se aisló según el método desarrollado por Birnboim y Doly (Nucl. Acids. Res. (1979), 7, 1513-1523) y se separó mediante electroforesis en gel tras ruptura adecuada de restricción. 35

4. Transformación de plantas

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Se colocaron 10 hojas pequeñas, dañadas con un escalpelo, de un cultivo de patata estéril, en 10 ml de medio MS con sacarosa al 2% que contiene de 30 hasta 50 µl de un cultivo durante toda la noche de Agrobacterium tumefaciens hecho crecer en selección. Tras agitar suavemente de 3 a 5 minutos, se incubaron las cápsulas de Petri en la oscuridad a 25ºC. Tras 2 días, las hojas se extendieron en medio MS con 1,6% de glucosa, 2 mg/l de zeatina-ribosa, 0,02 mg/l de ácido naftilacético, 0,02 mg/l de ácido giberélico, 500 m/l de claforano, 50 mg/l de canamicina y 0,8% de agar Bacto. Tras incubar durante una semana a 25ºC y 3000 lux, la concentración de claforano en el medio se redujo a la mitad. El cultivo subsiguiente se efectuó según un método conocido (Rocha-Sosa et al. EMBO J., 8, 29 (1989)).

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5. Análisis de ADN genómico a partir de plantas de patata transgénicas El aislamiento del ADN de plantas genómicas se efectuó según Rogers y Bendich (Plant Mol. Biol. (1985), 5, 6976). 50

Para el análisis del ADN, tras ruptura de restricción adecuada, se analizaron de 10 a 20 µg de ADN por medio de transferencia Southern para determinar la integración de las secuencias de ADN a investigar. 6. Análisis del ARN total a partir de plantas de patata transgénicas

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El aislamiento del ARN total de las plantas se llevó a cabo según Logemann et al. (Analytical Biochem. (1987), 163, 16-20). 60

Para el análisis, se investigaron porciones de 50 µg de ARN total por medio de transferencia Northern para determinar la presencia de los transcriptos buscados. 7. Extracción de la proteína

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Para la extracción de proteína total a partir del tejido de las plantas, se homogeneizaron piezas de tejido en tampón de extracción de proteínas (25 mM de fosfato sódico pH 7,0, 2 mM de hidrogenosulfito de sodio), con adición de 0,1% (p/v) de polivinilpirrolidona (PVP) insoluble. Tras la filtración a través de celulosa, el detritus celular se separó por centrifugación durante 20 minutos a 10.000 6

ES 2 208 632 T3 revoluciones por minuto, y se determinó la concentración de proteína del sobrenadante según el método desarrollado por Bradford (Anal. Biochem. (1976)/72, 248-254). 8. Detección de proteínas extrañas por medio de procedimientos inmunológicos (transferencia Western) 5

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Los extractos proteínicos se separaron según el peso molecular por medio de electroforesis en gel en geles de SDSPAGE (dodecilsulfato de sodio/poliacrilamida). Tras SDS-PAGE, los geles de proteínas se equilibraron durante 15 a 30 minutos en tampón de transferencia para electrodos de grafito (48 g/l de tris, 39 g/l de glicina, 0,0375% de SDS, 20% de metanol), y entonces se transfirieron en una cámara de refrigeración a un filtro de nitrocelulosa y se separaron a 1,3 mA/cm2 durante 1 a 2 horas. El filtro se saturó durante 30 minutos con 3% de gelatina en tampón de TBS (20 mM tris/HCl pH 7,5, 500 mM NaCl), y el filtro se incubó entonces durante 2 horas con el antisuero apropiado en una dilución adecuada (1:1000-10000 en tampón de TBS) a temperatura ambiente. El filtro se lavó entonces durante 15 minutos cada vez con tampón de TBS, TTBS (tampón de TBS con 0,1% de monolaurato de polioxietilen-(20)sorbitán) y TBS. Después de lavarlo, el filtro se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos antiratón de cabra (GAR) conjugados con fosfatasa alcalina (1:7500 en TBS). El filtro se lavó entonces como se describe anteriormente, y se equilibró en tampón de AP (100 mM tris/HCl pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2 ). La reacción con fosfatasa alcalina se comenzó por medio de la adición de sustrato de 70 µl de disolución de 4-nitrotetrazolio (NBT) (50 mg/ml de NBT en 70% de dimetilformamida) y 35 µl de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) (50 mg/ml de BCIP en dimetilformamida) en 50 ml de tampón de AP. Como regla, se observaron las primeras señales tras 5 minutos. La reacción se puede terminar transfiriendo el filtro en disolución de parada (20 mM tris/HCl pH 8,0 con 5 mM de EDTA). La reacción se llevó a cabo en la oscuridad. 9. Ensayo de esterasa

25

30

La actividad de esterasa de la proteína patatina se detectó in situ en geles de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) seminativos por incubación de los geles en 100 ml de tampón de incubación (50 mM tris/HCl, pH 7,0, 200 mM de cloruro de sodio, 0,1% de SDS), a los que, como sustratos, se añadieron 500 µl de 1% de disolución de acetato de αnaftilo (1 g de acetato de α-naftilo/100 ml de etanol) y 5 ml de disolución al 2% de Fast Blue RR. Como resultado de la actividad de esterasa, precipitó una mancha insoluble marrón oscura, que tiñe específicamente las bandas de proteína de esterasa nativa en el gel. La separación de la mezcla de proteína que no se desnaturalizó por calentamiento (seminativa) se efectuó en 12% de SDS-PAGE según Laemli (1970, Nature, 227, 680-685). 10. Tinción de proteínas en gel de poliacrilamida

35

Tras la finalización de la electroforesis, el gel se agitó durante 2 horas en disolución de fijación (50% de metanol, 10% de ácido acético, 40% de agua), y entonces se dejó durante 4 horas en disolución de tinción (0,05% de Azul Brillante de Coomassie R en disolución de fijación) y subsiguientemente se decoloró varias veces en disolución decolorante (5% de metanol, 7% de ácido acético, 88% de agua) hasta que aparecieron unas bandas claras de proteína.

40

11. Determinación de glucosa, fructosa, sacarosa y almidón a) Extracción

45

50

Se extrajeron pequeñas porciones de tubérculo (diámetro de 10 mm), congelado en nitrógeno líquido, durante 30 minutos a 80ºC en 0,5 ml de tampón (80% (v/v) de etanol; 10 mM de HEPES pH 7,5) en un baño de agua. El sobrenadante que contiene los componentes solubles se separó por vertido, y se determinó el volumen. El sobrenadante se usó para determinar azúcares solubles. El material insoluble que quedó se enjuagó con agua y se trituró finamente en un mortero. El extracto se puso a hervir entonces durante 1 hora a 95ºC en disolución de hidróxido potásico 0,2 M, el pH se ajustó hasta 5,5 con 70 µl de ácido acético 1 N, y el conjunto se centrifugó entonces. Se usaron partes alícuotas de la disolución de almidón resultante para determinar el almidón. b) Determinación cuantitativa de glucosa, fructosa y sacarosa solubles

55

La determinación cuantitativa de glucosa, fructosa y sacarosa solubles se llevó a cabo en la siguiente mezcla de ensayo: 60

65

100,0 1,5 0,5 1,3 10-50,0 1,0

mM mM mM mM µl U

imidazol-HCl, pH 6,9 MgCl2 NADP+ ATP de muestra de glucosa 6-fosfato deshidrogenasa procedente de levadura.

La mezcla se incubó durante 5 minutos. La determinación de los azúcares se llevó a cabo entonces fotométrica7

ES 2 208 632 T3 mente por adición sucesiva de:

5

1,0 1,0 20,0

U U U

de hexoquinasa procedente de levadura (para la determinación de glucosa) de fosfoglucosaisomerasa procedente de levadura (para la determinación de fructosa) de invertasa procedente de levadura (para la determinación de sacarosa).

c) Determinación de almidón 10

15

Se añadieron enzimas hidrolíticas a 55ºC a la disolución de almidón obtenida tras la extracción etanólica en el apartado a), y el conjunto se incubó durante doce horas en la siguiente mezcla: 50,0 1,4 2,0

mM U U

de acetato de sodio, pH 4,8 de amiloglucosidasa procedente de Aspergillus niger de α-amilasa procedente de páncreas porcino.

Tras incubación, los constituyentes insolubles se eliminaron mediante centrifugación de 4 minutos a 16.000 g. En el sobrenadante, la glucosa resultante se determinó entonces enzimáticamente, como se describe en el apartado b). 20

12. Determinación de actividad de ADP-glucosa pirofosforilasa La actividad de ADP-glucosa pirofosforilasa se determinó usando métodos estándar (Lin et al., 1988, Plant Physiology 86, 1131-1135).

25

Los siguientes Ejemplos ilustran la preparación de los plásmidos según la invención, la inserción de esos plásmidos en la planta, y la función de los plásmidos en esas plantas transgénicas. Ejemplo 1

30

35

40

Preparación del plásmido p35S-anti-ADP-glc1 e inserción del gen 35S-anti-ADP-glc1, localizado en el plásmido, en el genoma de la planta Usando una muestra heteróloga de maíz, se identificaron diversos clones que se hibridaron de forma cruzada con esa muestra a partir de un banco de ADNc desarrollado en el vector de expresión xgt11. Esos clones se subclonaron a partir del vector xgt11 en el vector pUC18. La determinación de la secuencia nucleótida identificó claramente aquellos clones que son clones de ADNc que codifican una de las dos isoformas (isoforma I) de la ADP-glucosa pirofosforilasa de la patata. Este ADNc se proporcionó con el promotor del ARN-35S del virus del mosaico de la coliflor y la señal de poliadenilación de octopina sintasa del plásmido de Ti pTiACH5. En el proceso, la orientación del segmento que codifica el ADNc de ADP-glucosa pirofosforilasa se seleccionó de manera que se lea la hebra no codificante del ADNc. El gen 35S-anti-ADP-glc1 comprende los tres fragmentos A, B y C, y se preparó según lo siguiente:

45

50

55

60

El fragmento A (529 pb) contiene el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). Ese fragmento incluye los nucleótidos 6909 a 7437 de CaMV (Franck et al., Cell 21, 285-294), y está localizado entre el sitio de ruptura de Eco RI/Kpn I. El fragmento B (191 pb) contiene la señal de poliadenilación de gen 3 del ADN-T del plásmido de Ti pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J., 3, 835-846), nucleótidos 11749-11939, que se aisló como un fragmento Pvu II a partir del plásmido pAGV 40 (Herrera-Estrella et al., (1983) Nature 303, 209-213) y, tras adición de ligadores Sph I al sitio de ruptura de Pvu II, se clonó entre los sitios de ruptura Sph I/Hind III del poliligador de pUC 18. El fragmento C contiene un fragmento de Eco RI de 1589 nucleótidos que codifica la isoforma I de las dos isoformas de la ADP-glucosa pirofosforilasa de la patata. La secuencia de los 1589 nucleótidos de ese clon se muestra en Müller-Röber et al., Mol. Gen. Genetics 224, 136-146 (1990) como una secuencia del clon B22-1. La orientación de ese clon de ADNc se selecciona de forma que se lea la hebra no codificante, que en una planta de patata transgénica conduce a la formación de un denominado ARN “anti-sentido”. La presencia del ARN anti-sentido conduce a una reducción en el ARN “sentido”-ADP-glucosa pirofosforilasa I formado en la patata y por tanto a una reducción en la biosíntesis del almidón. El gen 35S-anti-ADP-glc1 está en forma de un fragmento Eco RI/Hind III en el poliligador del vector pUC18. El plásmido p35S-anti-ADP-glc1 tiene un tamaño de 5,0 kb (véase Fig. 3).

65

El gen 35S-anti-ADP-glc1, localizado en el plásmido p35S-anti-ADP-glc1, se insertó en vectores binarios y, por medio del sistema de agrobacterias descrito anteriormente, se transfirió a las plantas de la patata. A partir de las células transformadas se regeneraron plantas intactas y fértiles. Los tubérculos de esas plantas se investigaron para determinar la presencia de ARN de ADP-glucosa pirofosforilasa glc1 por medio de un análisis de transferencia Northern (véase 8

ES 2 208 632 T3

5

el punto 6, métodos). En algunas plantas que se habían transformado con el gen 35S-anti-ADP-glc1, no se puede detectar ARN celular endógeno de ese gen (véase Fig. 9). Igualmente, no se puede detectar proteína por medio de transferencia Western (véase Fig. 10). La reducción asociada en la concentración de almidón y en la actividad de ADP-glucosa pirofosforilasa se determina enzimáticamente usando métodos estándar (Plaxton, W. L. y Preiss, J. (1987) Plant Physiology 83, 105-112, Lin et al. (1988) Plant Physiology 86, 1131-1135). La actividad de ADP-glucosa pirofosforilasa, medida en extractos de tubérculo de plantas de patata no transformadas y transgénicas (35S-anti-ADP-glc1) es la siguiente:

10

15

20

25

30

35

Planta

Actividad de ADP-glucosa pirofosforilasa (%)

K1 K2 K3 K4

101,5 92,0 97,2 109,3

T 89 T 93 T 62 T 52 T 53 T 23 T 61 T 85

1,5 2,1 3,1 3,2 4,4 5,2 8,1 17,2

T 36 T 37 T 54 T 82

92,6 56,4 110,2 82,4

Los porcentajes se refieren a la actividad medida en plantas no transformadas, correspondiendo el valor del 100% al valor medio de la actividad medida en las plantas no transformadas. El contenido de almidón en los tubérculos de plantas de patata no transformadas y transgénicas (35S-anti-ADPglc1) es el siguiente:

40

Planta

45

50

55

60

Contenido de almidón (%)

K1 K2 K3 K4

87,2 100,9 103,4 108,5

T 89 T 93 T 62 T 52 T 53 T 23 T 61 T 85

1,8 1,4 3,9 7,0 7,2 8,9 24,4 29,0

T 36 T 37 T 54 T 82

90,6 75,6 96,1 89,4

65

El porcentaje se refiere al contenido de almidón medido en plantas no transformadas, correspondiendo el valor del 100% al valor medio de los contenidos medidos en las plantas no transformadas. 9

ES 2 208 632 T3 El contenido de sacarosa en los tubérculos de plantas de patata no transformadas y transgénicas (35S-anti-ADPglc1) es el siguiente: 5

10

15

20

25

30

35

40

45

Planta

Contenido de sacarosa (%)

K1 K2 K3 K4

1,8 1,8 2,2 2,6

T 89 T 93 T 62 T 52 T 53 T 23 T 61 T 85

31,0 31,6 27,8 21,5 24,9 20,5 17,5 10,9

T 36 T 37 T 54 T 82

2,4 4,6 2,6 2,6

El porcentaje representa el contenido de sacarosa medido en los tubérculos, basado en el peso seco. K representa plantas sin transformar, T representa plantas transgénicas. Se puede observar a partir de esos resultados que la inserción del gen 35S-anti-ADP-glc1, localizado en el plásmido p35S-anti-ADP-glc1, en la planta, ha conducido a una reducción drástica en la actividad de ADP-glucosa pirofosforilasa en un factor de hasta 50 en comparación con plantas de control sin transformar. En los tubérculos de aquellas plantas de patata transgénicas que muestran una gran reducción en la actividad de ADP-glucosa pirofosforilasa, una consecuencia adicional que se observa es una reducción drástica en la cantidad de almidón contenido en ellos, en comparación con la cantidad contenida en plantas de control sin transformar. Un hallazgo adicional sorprendente es que los tubérculos en los que se reduce drásticamente el contenido de almidón contienen concentraciones elevadas de disacáridos. Esas concentraciones son principalmente de sacarosa, que constituye hasta el 30% de la masa seca de los tubérculos. Eso significa que, como resultado de la transferencia del gen 35S-anti-ADP-glc1 localizado en el plásmido p35S-anti-ADP-glc1, el tubérculo de la patata almacena, en vez de almidón, grandes cantidades de disacáridos. De este modo, a partir de una planta que almacena almidón, se ha producido una planta que almacena azúcar. Además, por medio de la inserción del gen 35S-anti-ADP-glc1, localizado en el plásmido p35S-anti-ADP-glc1, en plantas transgénicas cuya biosíntesis del almidón se ha inhibido, se obtiene un número considerablemente mayor de tubérculos (aproximadamente tanto como 4 a 5 veces) que en el caso de las plantas de control. Ejemplo 2

50

55

60

Preparación del plásmido p35S-anti-ADP-glc2 e inserción del gen 35S-anti-ADP-glc2, localizado en el plásmido, en el genoma de la planta Usando una muestra heteróloga de maíz, se identificaron diversos clones que se hibridaron de forma cruzada con esa muestra a partir de un banco de ADNc desarrollado en el vector de expresión λgt11. Esos clones se subclonaron a partir del vector λgt11 en el vector pUC18. La determinación de la secuencia nucleótida identificó claramente aquellos clones que son clones de ADNc que codifican la isoforma II de la ADP-glucosa pirofosforilasa de la patata. Este ADNc se proporcionó con el promotor del ARN-35S del virus del mosaico de la coliflor y la señal de poliadenilación de octopina sintasa del plásmido de Ti pTiACH5. En el proceso, la orientación del segmento que codifica el ADNc de ADP-glucosa pirofosforilasa se seleccionó de manera que se lea la hebra no codificante del ADNc. El gen 35S-anti-ADP-glc2 comprende los tres fragmentos A, B y C, y se preparó según lo siguiente:

65

El fragmento A (529 pb) contiene el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). Ese fragmento incluye los nucleótidos 6909 a 7437 de CaMV (Franck et al., Cell 21, 285-294), y está localizado entre el sitio de ruptura de Eco RI/Kpn I. El fragmento B (191 pb) contiene la señal de poliadenilación de gen 3 del ADN-T del plásmido de Ti pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J., 3, 835-846), nucleótidos 11749-11939, que se aisló como un fragmento Pvu II a partir del plásmido pAGV 40 (Herrera-Estrella et al., (1983) Nature 303, 209-213) y, tras adición 10

ES 2 208 632 T3 de ligadores Sph I al sitio de ruptura de Pvu II, se clonó entre los sitios de ruptura Sph I/Hind III del poliligador de pUC 18. 5

El fragmento C contiene un fragmento de Eco RI de 1,7 kb que codifica la isoforma II de las dos isoformas de la ADP-glucosa pirofosforilasa de la patata. La orientación de ese clon de ADNc se seleccionó de forma que se lea la hebra no codificante, que en una planta de patata transgénica conduce a la formación de un denominado ARN “anti-sentido”. La presencia del ARN anti-sentido conduce a una reducción en el ARN “sentido”-ADP-glucosa pirofosforilasa 2 formado en la patata y por tanto a una inhibición en la biosíntesis del almidón. El gen 35S-anti-ADPglc2 está en forma de un fragmento Eco RI/Hind III en el poliligador del vector pUC18 (véase Fig. 2).

10

15

El gen 35S-anti-ADP-glc2, localizado en el plásmido p35S-anti-ADP-glc2, se insertó en vectores binarios y, por medio del sistema de agrobacterias descrito anteriormente, se transfirió a las plantas de la patata. A partir de las células transformadas se regeneraron plantas intactas y fértiles. Esas plantas se investigaron para determinar la presencia de ARN de ADP-glucosa pirofosforilasa-glc2 por medio de un análisis de transferencia Northern. Las plantas que se habían transformado con el gen 35S-anti-ADP-glc2, localizado en el plásmido p35S-anti-ADP-glc2, mostraron una cantidad reducida del ARN celular endógeno de ese gen. La reducción asociada en la cantidad de almidón y en la actividad de ADP-glucosa pirofosforilasa se determina enzimáticamente usando métodos estándar (véase Ejemplo 1). Ejemplo 3

20

Preparación del plásmido p35S-anti-ADP-glc1+2 e inserción del gen 35S-anti-ADP-glc1+2, localizado en el plásmido, en el genoma de la planta 25

30

El gen 35S-anti-ADP-glc1+2 se preparó por inserción del fragmento de Xba I de 1,5 kb a partir del plásmido p35Santi-ADP-glc1 en el sitio de Xba I del plásmido p35S-ADP-glc2. En el proceso, la orientación del fragmento de Xba I se seleccionó de forma que se lea la hebra no codificante del fragmento Xba I, lo que conduce de este modo en la planta de patata transgénica a la formación de un denominado ARN “anti-sentido” de las dos isoformas (isoforma I y II) de la ADP-glucosa pirofosforilasa de la patata. La presencia de los ARN “anti-sentido” conduce a una reducción en los ARN sentido-ADP-glucosa pirofosforilasa 1 y sentido-ADP-glucosa pirofosforilasa 2 formados en la patata, y por tanto a una reducción en la biosíntesis del almidón. El gen 35S-anti-ADP-glc1+2 está en forma de un fragmento Eco RI/Hind III en el poliligador del vector pUC18 (véase Fig. 3). El gen 35S-anti-ADP-glc1+2 localizado en el plásmido p35S-anti-ADP-glc1+2 comprende los cuatro fragmentos A, B, C1 y C2, y se preparó según lo siguiente:

35

40

45

50

El fragmento A (529 pb) contiene el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). Ese fragmento incluye los nucleótidos 6909 a 7437 de CaMV (Franck et al., Cell 21, 285-294), y está localizado entre el sitio de ruptura de Eco RI/Kpn I. El fragmento B (191 pb) contiene la señal de poliadenilación de gen 3 del ADN-T del plásmido de Ti pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J., 3, 835-846), nucleótidos 11749-11939, que se aisló como un fragmento Pvu II a partir del plásmido pAGV 40 (Herrera-Estrella et al., (1983) Nature 303, 209-213) y, tras adición de ligadores Sph I al sitio de ruptura de Pvu II, se clonó entre los sitios de ruptura Sph I/Hind III del poliligador de pUC 18. El fragmento C1 contiene un fragmento Eco RI de 1,7 kb que codifica la isoforma II de las dos isoformas de la ADP-glucosa pirofosforilasa de la patata. La orientación de ese clon de ADNc se selecciona de forma que se lea la hebra no codificante (véase Ejemplo 2), lo que en la planta de patata transgénica conduce a la formación de un denominado ARN “anti-sentido”. El fragmento C2 contiene el fragmento Xba I/Xba I de 1,5 kb de p35S-anti-ADP-glc1 que codifica la isoforma I de las dos ADP-glucosa pirofosforilasas. La orientación de los fragmentos C1 y C2 se seleccionó de forma que se leyera la hebra no codificante de cada fragmento C1 y C2, lo que en la planta de patata transgénica conduce a la formación de un denominado ARN “antisentido” de las dos isoformas (isoforma I e isoforma II) de la ADP-glucosa pirofosforilasa de la patata.

55

El gen 35S-anti-ADP-glc1+2 está en forma de un fragmento Eco RI/Hind III en el poliligador del vector pUC18.

60

65

El gen 35S-anti-ADP-glc1+2 contenido en el plásmido p35S-anti-ADP-glc1+2 se insertó en vectores binarios y, por medio del sistema de agrobacterias, se transfirió a las plantas de la patata. A partir de las células transformadas se regeneraron plantas intactas y fértiles. Esas plantas se investigaron en busca de la presencia de ARN ADP-glucosa pirofosforilasa I y ARN ADP-glucosa pirofosforilasa II por medio de análisis de transferencia Northern (véase punto 6, métodos). Las plantas que se habían transformado con el gen 35S-anti-ADP-glc1+2 localizado en el plásmido p35Santi-ADP-glc1+2 muestran una cantidad enormemente reducida de los ARN celulares endógenos de las dos ADPglucosa pirofosforilasas (I y II). La reducción asociada en la concentración de almidón y en la actividad de ADPglucosa pirofosforilasa se determinó enzimáticamente usando métodos estándar (véase Ejemplo 1).

11

ES 2 208 632 T3 REIVINDICACIONES

5

10

1. Un plásmido que comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína de ADP-glucosa pirofosforilasa, o subunidad de la misma, de una planta de patata, presente en orientación invertida, que está ligada operablemente a secuencias reguladoras, funcional en plantas que modifican las características bioquímicas de una célula vegetal, comprendiendo dicha modificación una reducción en la concentración de almidón y un aumento en la concentración de al menos un sacárido seleccionado del grupo que consta de monosacáridos y oligosacáridos, en el que las secuencias reguladoras comprenden un promotor y una señal de terminación de genes víricos y/o de plantas. 2. Un plásmido según la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ADN codifica la isoforma I, la isoforma II, o ambas isoformas, de una ADP-glucosa pirofosforilasa, o subunidad de la misma, de una planta de patata. 3. Plásmido p35S-anti-ADP-glc1 (DSM5879).

15

4. Plásmido p35S-anti-ADP-glc2 (DSM 5880). 5. Plásmido p35S-anti-ADP-glc1+2 (DSM 5881).

20

25

6. Una célula de planta transgénica de una planta productora de almidón que comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína de ADP-glucosa pirofosforilasa, o subunidad de la misma, de una planta de patata presente en orientación invertida que está operablemente ligada a secuencias reguladoras, que conduce tanto a una reducción en la concentración de almidón como a un aumento en la concentración de al menos un sacárido seleccionado del grupo que consta de monosacáridos y oligosacáridos. 7. Una célula de planta transgénica, que comprende uno o más de los plásmidos según una o más de las reivindicaciones 1 a 5. 8. Una célula de planta transgénica según una o más de las reivindicaciones 6 y 7, que es una célula de patata.

30

35

9. Una planta transgénica, siendo dicha planta una planta productora de almidón, que comprende una célula de plantas según una o más de las reivindicaciones 6 a 8 que comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína de ADP-glucosa pirofosforilasa, o subunidad de la misma, de una planta de patata, presente en orientación invertida, que está operablemente ligada a secuencias reguladoras, que conduce tanto a una reducción en la concentración de almidón como a un aumento en la concentración de al menos un sacárido seleccionado del grupo que consta de monosacáridos y oligosacáridos. 10. Una planta transgénica derivada de una planta productora de almidón, que comprende uno o más plásmidos según una o más de las reivindicaciones 1 a 5.

40

11. Una planta transgénica según una o más de las reivindicaciones 9 y 10, que es una planta de patata. 12. Tubérculo de patata producido por una planta transgénica según la reivindicación 11.

45

13. Tubérculo de patata que comprende una célula de planta transgénica según una o más de las reivindicaciones 6 a 8. 14. Uso de un tubérculo de patata según una o más de las reivindicaciones 12 y 13, para la producción de materia prima para la extracción de sacarosa.

50

15. Uso de un plásmido según una o más de las reivindicaciones 1 a 5, para la producción de una planta transgénica. 16. Uso de un plásmido según una o más de las reivindicaciones 1 a 5, para la producción de una planta de patata transgénica.

55

60

17. Uso de una célula de planta según una o más de las reivindicaciones 6 a 8, para la producción de una planta transgénica. 18. Uso de una célula de planta según una o más de las reivindicaciones 6 a 8, para la producción de una planta de patata transgénica. 19. Uso de una secuencia de ADN que codifica una proteína de ADP-glucosa pirofosforilasa, o subunidad de la misma, de una planta de patata para la reducción de la concentración de almidón y un aumento de la concentración de al menos un sacárido seleccionado del grupo que consta de monosacáridos y oligosacáridos.

65

20. Uso de un plásmido según una o más de las reivindicaciones 1 a 5, para la reducción de la concentración de almidón y el aumento de la concentración de al menos un sacárido seleccionado del grupo que consta de monosacáridos y oligosacáridos. 12

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5

21. Método para la producción de una célula de planta transgénica, que comprende la etapa de insertar en una célula hospedante vegetal una secuencia de ADN que codifica una ADP-glucosa pirofosforilasa, o subunidad de la misma, de una planta de patata, presente en orientación invertida, que está operablemente ligada a secuencias reguladoras, que conduce tanto a una reducción en la concentración de almidón como a un aumento en la concentración de al menos un sacárido seleccionado del grupo que consta de monosacáridos y oligosacáridos. 22. Método para la producción de una planta transgénica que comprende el método de la reivindicación 21 y además la etapa de regenerar una planta completa.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del 7-10-1992, no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluida en la mencionada reserva. 13

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