k

˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

19

k 2 126 605 kInt. Cl. : C07H 17/08, C12P 19/62

11 N´ umero de publicaci´on: 6

51

˜ ESPANA

C12N 1/20, A01N 43/22 //(C12N 1/20, C12R 1:01), (C12P 19/62, C12R 1:01)

k

TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

12

kN´umero de solicitud europea: 92925146.0 kFecha de presentaci´on : 09.11.92 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 573 628 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 15.12.93

T3

86 86 87 87

k

54 T´ıtulo: Nuevos compuestos de A83543 y procedimiento para su producci´ on.

k

30 Prioridad: 08.11.91 US 790282

08.11.91 US 790287 08.11.91 US 790616

9330 Zionsville Road Indianapolis, Indiana 46268, US

k

72 Inventor/es: Creemer, Lawrence;

k

74 Agente: Elzaburu M´ arquez, Alberto

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

01.04.99

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

01.04.99

ES 2 126 605 T3

k

73 Titular/es: Dow AgroSciences LLC

Aviso:

k

Kirst, Herbert A.; Mynderse, Jon S.; Broughton, Mary C.; Huber, Mary L. B.; Martin, James W. y Turner, Jan R.

k

En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 126 605 T3 DESCRIPCION Nuevos compuestos de A83543 y procedimiento para su producci´on. 5

La invenci´on se refiere a nuevos compuestos del producto de fermentaci´on A83543. Los insectos objetivo desarrollan r´ apidamente resistencia a los insecticidas sint´eticos, incluyendo el desarrollo de resistencia a los m´as nuevos insecticidas piretroides (v´ease Pickett (1988), Chem. Britain, 137). Por tanto, hay demanda de nuevos insecticidas.

10

15

20

Se ha demostrado recientemente que el producto de fermentaci´on A83543, una familia de compuestos relacionados producidos por cepas de Saccharopolyspora spinosa, y se ha demostrado que presentan una excelente actividad insecticida. El A83543 y cada uno de los compuestos son u ´ tiles para el control de ´acaros e insectos, particularmente especies Lepidoptera y Diptera. Por “compuestos de A83543” se entiende compuestos naturales consistentes en un sistema de anillo 5,6,5-tric´ıclico, condensado a una lactona macroc´ıclica de 12 miembros, un az´ ucar neutro y un aminoaz´ ucar (v´ease Kirst et al. (1991), Tetrahedron Letters, 32:4839). La familia de compuestos de A83543 naturales incluye un g´enero indicado en la Solicitud EPO N◦ 0375316 y que tiene la siguiente f´ ormula general:

25

30

35

en la que R1 es H o un grupo seleccionado entre

40

45

50

55

y R2 , R4 , R3 , R5 y R6 son hidr´ ogeno o metilo; o una sal de adici´on de a´cido de los mismos cuando R1 es distinto de hidr´ ogeno. 60

El producto de fermentaci´ on A83543 se ha mostrado que comprende los compuestos individuales A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H y A83543J, y diversas

2

ES 2 126 605 T3 pseudoagliconas de los mismos (v´ease Publicaci´on de Patente Europea N◦ 0 375 316). Las estructuras de estos compuestos individuales se muestran a continuaci´ on.

5

10

15

20

25

30

35

en las que R1 , R2 , R3 , R4 , R5 y R6 son para cada compuesto como sigue: Estructuras de compuestos de A83543

40

Compuesto

R1

R2

R3

R4

R5

R6

A

(a)

Me

H

Me

Me

Me

B

(b)

Me

H

Me

Me

Me

C

(c)

Me

H

Me

Me

Me

D

(a)

Me

Me

Me

Me

Me

E

(a)

Me

H

H

Me

Me

F

(a)

H

H

Me

Me

Me

G

(d)

Me

H

Me

Me

Me

H

(a)

Me

H

Me

H

Me

J

(a)

Me

H

Me

Me

H

45

50

55

60

3

ES 2 126 605 T3 (Continuaci´ on) Compuesto

R1

R2

R3

R4

R5

R6

PsaA1

H

Me

H

Me

Me

Me

PsaD1

H

Me

Me

Me

Me

Me

PsaE1

H

Me

H

H

Me

Me

PsaF1

H

H

H

Me

Me

Me

PsaH1

H

Me

H

Me

H

Me

PsaJ1

H

Me

H

Me

Me

H

PsaL1

H

Me

Me

Me

Me

H

5

10

15

20

La presente invenci´on se dirige a compuestos de F´ ormula 1: 25

30

35

40

en la que R7 , R8 , R9 , R10 y R11 son cada uno individualmente como sigue:

45

(Ver Compuestos en p´ aginas siguientes)

50

55

60

4

ES 2 126 605 T3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

5

ES 2 126 605 T3

5

10

15

20

25

30

35

40

La invenci´on se dirige tambi´en a un procedimiento para preparar compuestos 13, 14, 15 ´o 16, cuyo procedimiento comprende separar el grupo R11 que contiene cetona de un compuesto correspondiente 9, 10, 11 o´ 12. 45

Preferiblemente, el procedimiento mencionado antes comprende oxidar un compuesto correspondiente de f´ ormula 1 en el que R11 es 50

55

para producir el compuesto que contiene cetona correspondiente 9, 10, 11 o 12, y separar despu´es el grupo R11 que contiene cetona de dicho compuesto 9, 10, 11 ´o 12 para producir el compuesto correspondiente 13, 14, 15 o´ 16. 60

Otro aspecto de la invenci´ on es un procedimiento para preparar un compuesto 21 o´ 22, cuyo procedimiento comprende desmetilar el compuesto correspondiente 13 ´o 14.

6

ES 2 126 605 T3 La invenci´on se dirige adem´ as a un procedimiento para preparar un compuesto 9, 10, 11 o´ 12, cuyo procedimiento comprende oxidar un compuesto correspondiente de f´ ormula 1, en el que R11 es

5

10

Las pseudoagliconas de la presente invenci´ on se producen mediante el siguiente esquema: Esquema A 15

A83543J→Compuesto 9→Compuesto 13→Compuesto 17 A83543PsaA2→A83543AgA A83543L→Compuesto 10→Compuesto 14→Compuesto 18

20

A83543PsaD2→A83543AgD A83543M→Compuesto 11→Compuesto 15→Compuesto 17 A83543PsaB2→A83543AgA

25

A83543N→Compuesto 12→Compuesto 16→Compuesto 18 A83543PsaN2→A83543AgD

30

El A83543J se describe en el documento EP-A-0375316. Los materiales de partida A83543L, A83543M y A83543N son compuestos de F´ormula 1 en la que R7 , R8 , R9 , R10 y R11 son cada uno individualmente como sigue:

35

40

45

50

55

60

En otro de sus aspectos, la invenci´ on proporciona un procedimiento para producir A83543AgA, A83543AgD, A83543AgE o A83543AgF, que comprende 7

ES 2 126 605 T3 (a) hidrolizar A83543A, A83543B, A83543C, A83543G, A83543H, A83543J, A83543PsaA1, A83543PsaA2, A83543PsaH1, A83543PsaJ1, A83543PsaB2 o´ A83543PsaC2 para producir A83543AgA; o 5

(b) hidrolizar A83543PsaD2 o´ A83543PsaN2 para producir A83543AgD; o (c) hidrolizar A83543E o A83543PsaE1 para producir A83543AgE; o (d) hidrolizar A83543F o A83543PsaF1 para producir A83543AgF.

10

15

20

Las pseudoagliconas y agliconas de esta invenci´ on son u ´ tiles como compuestos intermedios en la preparaci´on de insecticidas. Por ejemplo, cuando se cultivan microorganismos apropiados en presencia de los compuestos reivindicados, los compuestos reivindicados se bioconvierten en componentes de A83543 activos insecticidamente, como se ilustra en el Ejemplo 19. La glicosilaci´on puede realizarse por s´ıntesis qu´ımica as´ı como por bioconversi´ on microbiana. Las estructuras qu´ımicas de los materiales de partida, Compuestos 1-3, se determinaron por m´etodos espectrom´etricos, incluyendo espectroscop´ıa de resonancia magn´etica nuclear (NMR) y espectroscop´ıa ultravioleta (UV), y por comparaci´ on con los compuestos de A83543 conocidos (v´ease Kirst et al. (1991), supra). Los siguientes p´arrafos describen las propiedades f´ısicas y espectrales de los Compuestos 1-3. A83543L El A83543L tiene las siguientes caracter´ısticas:

25

Peso molecular. 731 F´ ormula emp´ırica: C41 H65 NO10

30

UV (EtOH): 244 nm (=10.362) MS (FAB): (M+H) m/z 732

35

La Tabla I resume los datos espectrales de resonancia magn´etica nuclear (NMR) 1 H y A83543L (en d6 -acetona). TABLA I 1

Datos de NMR H y 40

45

50

55

60

Posici´on 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

13

C de A83543L en acetona-d6 13

C

172,59 34,32 48,39 42,75 123,29 137,19 45,33 35,61 76,62 38,59 46,99 49,99 148,51 145,11 203,09 48,43 80,91 35,04 8

1

H∗

– 3,07/2,42 2,91 3,45 5,53 – 2,18 2,01/1,45 4,32 2,36/1,38 1,03 2,77 7,02 – – 3,30 3,55 1,55

13

C para

ES 2 126 605 T3 TABLA I (Continuaci´ on) Posici´on

13

19 20 21 22 23 24 6-CH3 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 2’-OCH3 4’-OCH3 1” 2” 3” 4” 5” 6” N(CH3 )2

22,50 30,89 76,81 29,11 9,55 16,29 20,85 96,37 82,44 72,33 84,59 68,34 18,31 59,05 60,74 104,06 31,90 18,74 65,97 74,04 19,39 40,97

C

1

H∗

5

10

15

20

25

30 ∗

1,79/1,19 1,53 4,45 1,49 0,81 1,13 1,74 4,86 3,33 3,73 2,95 3,50 1,20 3,44 3,51 4,46 1,93/1,39 1,83/1,52 2,12 3,57 1,21 2,21

Los valores se tomaron de un espectro de correlaci´on 2D de un enlace heteronuclear.

A83543M 35

El A83543M tiene las siguientes caracter´ısticas: Peso molecular: 703 40

F´ ormula emp´ırica: C39 H61 NO10 UV (EtOH): 244 nm (=10.240) MS (FAB): (M+H) m/z 704

45

La Tabla II resume los datos espectrales de resonancia magn´etica nuclear (NMR) 1 H y A83543M (en d6 -acetona). TABLA II 50

Datos de NMR 1 H y Posici´on

55

60

1 2 3 4 5 6 7

13

C de A83543M en acetona-d6 13

C

172,65 34,53 48,80 42,36 129,80 130,34 42,05 9

1

H∗

– 3,08/2,44 2,94 3,50 5,87 5,91 2,14

13

C para

ES 2 126 605 T3 TABLA II (Continuaci´ on) Posici´on

13

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 2’-OCH3 4’-OCH3 1” 2” 3” 4” 5” 6” N(CH3 )2

37,21 77,04 38,30 47,12 50,44 148,34 144,93 203,08 48,36 81,22 35,15 22,38 31,09 76,82 29,11 9,57 16,44 96,46 82,50 72,23 84,61 68,40 18,34 59,08 60,72 104,15 31,78 29,11 61,86 76,55 19,34 34,16

C

1

H∗

5

10

15

20

25

30

35

40

∗

1,97/1,36 4,34 2,36/1,36 0,94 2,87 7,05 – – 3,31 3,55 1,52 1,78/1,17 1,50 4,66 1,48 0,80 1,13 4,84 3,31 3,72 2,94 3,48 1,19 3,44 3,50 4,48 1,88/1,42 2,11/1,23 2,02 3,27 1,22 2,34

Los valores se tomaron de un espectro de correlaci´on 2D de un enlace heteronuclear.

45

A83543N El A83543N tiene las siguientes caracter´ısticas: 50

Peso molecular. 717 F´ ormula emp´ırica: C40 H63 NO10 UV (EtOH): 244 nm (=10.446)

55

MS (FAB): (M+H) m/z 718 La Tabla III resume los datos espectrales de resonancia magn´etica nuclear (NMR) 1 H y A83543N (en d6 -acetona). 60

10

13

C para

ES 2 126 605 T3 TABLA III 1

Datos de NMR H y 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

∗

55

60

13

C de A83543N en acetona-d6

Posici´on

13

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 6-CH3 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 2’-OCH3 4’-OCH3 1” 2” 3” 4” 5” 6” N(CH3 )2

172,65 34,41 50,00 42,85 123,38 137,25 45,39 35,67 76,78 38,65 47,07 50,07 148,41 145,17 203,14 48,44 81,14 35,13 22,44 31,05 76,78 29,11 9,56 16,41 20,82 96,51 82,51 72,24 84,62 68,41 18,34 59,09 60,71 104,13 31,78 29,11 61,88 76,58 19,33 34,18

C

1

H∗

– 3,06/2,43 2,90 3,45 5,55 – 2,18 2,01/1,46 4,32 2,37/1,40 1,03 2,78 7,03 – – 3,31 3,56 1,51 1,81/1,20 1,51 4,65 1,48 0,81 1,12 1,73 4,86 3,32 3,73 2,95 3,50 1,18 3,43 3,51 4,48 1,87/1,40 2,11/1,23 2,00 3,26 1,22 2,34

Los valores se tomaron de un espectro de correlaci´on 2D de un enlace heteronuclear.

Los Compuestos 1-3, componentes de A83543 naturales, se producen generalmente cultivando una cepa productora de A83543 adecuada de S. spinosa sp. nov. en condiciones aer´ obicas sumergidas en un medio de cultivo deseado, hasta producir una cantidad recuperable de un factor natural. Los Compuestos 1-3 pueden recuperarse usando diversos procedimientos de aislamiento y purificaci´ on que se entienden en la t´ecnica. Los A83543M y A83543N tambi´en pueden prepararse por desmetilaci´ on qu´ımica a partir de A83543J 11

ES 2 126 605 T3 y A83543L.

5

10

15

Los derivados de N-desmetilo se preparan haciendo reaccionar un factor natural en presencia de entre uno y trece equivalentes de yodo y una base adecuada tal como acetato s´odico. La reacci´on se efect´ ua en un disolvente org´ anico polar, tal como metanol, o una mezcla de un disolvente org´ anico polar y agua, tal como metanol acuoso. La reacci´on se efect´ ua preferiblemente a una temperatura entre 30◦ C y 90◦C durante 2 a 6 horas, a un pH entre 8 y 10. Adem´as, los A83543L y A83543N pueden prepararse cultivando cualquiera de las cepas productoras de A83543 conocidas en presencia de A83543PsaL1. Los Compuestos 1-3 pueden reaccionar para formar diversas sales de adici´on de a´cido. Las sales adecuadas representativas incluyen las sales formadas mediante reacciones est´ andares con a´cidos org´anicos e inorg´ anicos tales como, por ejemplo, ´acidos sulf´ urico, clorh´ıdrico, fosf´ orico, ac´etico, succ´ınico, c´ıtrico, l´actico, ma´elico, fum´arico, c´ olico, pamoico, m´ ucico, glut´ amico, canf´orico, glut´ arico, glic´ olico, ft´alico, tart´ arico, f´ ormico, l´aurico, este´ arico, salic´ılico, metanosulf´ onico, bencenosulf´ onico, s´ orbico, p´ıcrico, benzoico, cinn´amico y similares. Estas sales son u ´ tiles, por ejemplo, para separar y purificar los Compuestos 1-3. Adem´ as, algunas de las formas de sales pueden tener una solubilidad en agua acrecentada. Estas sales se preparan usando procedimientos est´ andares para preparaci´ on de sales.

20

25

Por conveniencia en las discusiones que siguen relativas a la producci´on de los Compuestos 1-3 cultivando cepas productoras de A83543 de S. spinosa, se han dado las siguientes designaciones a dos cepas conocidas productoras de A83543A: A83543.1 y A83543.4 (v´ease documento EPO N◦ 0 375 316); como se comenta despu´es, se han usado estas cepas para desarrollar nuevas cepas. Se han dado las designaciones A83543.6 y A83543.7 a dos nuevas cepas productoras de A83543J; los componentes A83543L, A83543M y A83543N se producen por A83543.6 y A83543.7. Los cultivos A83543.1, A83543.4, A83543.6 y A83543.7 se han depositado y forman parte de la colecci´ on de cultivos en existencia del Midwest Area Regional Research Center, Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, del que est´ an disponibles para el p´ ublico con los siguientes n´ umeros de admisi´ on:

30

35

40

45

NRRL N◦

Cepa N◦

18395 18538 18719 18720

A83543.1 A83543.4 A83543.6 A83543.7

El cultivo A83543.1 se obtuvo por mutaci´ on qu´ımica del cultivo A83543, que se aisl´ o de una muestra de tierra recogida en las Islas V´ırgenes (v´ease Mertz y Yao (1990), Int’l J. of Systematic Bacteriology, 40:34). Los cultivos A83543.4 y A83543.6 se derivaron del cultivo A83543.1 por mutag´enesis inducida qu´ımicamente con N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina. El cultivo A83543.7 se deriv´ o del A83543.4 por mutag´enesis inducida qu´ımicamente con N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina. Los siguientes datos muestran que estos distintos aislados son todos cepas de S. spinosa y tienen muy pocas diferencias de cultivo, morfol´ogicas o bioqu´ımicas. Excepto por diferencias en la producci´on de componentes de A83543, estos aislados parecen similares al cultivo progenitor. Caracter´ısticas de cultivo

50

55

60

Los cultivos A83543.1, A83543.4, A83543.6 y A83543.7 se desarrollaron en doce medios de placas de agar y se compar´ o su crecimiento, color inverso, producci´on de hifas a´ereas, color de la masa de esporas y producci´ on de pigmento soluble. No se observaron diferencias significativas en ninguno de los medios usados. Los cultivos crecieron bien en medios complejos y definidos. Se produjeron hifas a´ereas en muchos de los medios usados. El color de la masa de esporas a´erea era principalmente blanco, y el lado inverso era de amarillo a amarillo-marr´on. No estaba presente una pigmentaci´ on distintiva; sin embargo, se liber´o en algunos medios un pigmento marr´ on soluble. Estas caracter´ısticas de cultivo son las mismas presentadas en la descripci´on taxon´ omica original de A83543.1 (v´ease Mertz y Yao (1990), supra). Caracter´ısticas morfol´ ogicas No se observaron diferencias significativas entre ninguna de las cepas comparadas. Estaban presentes en muchos de los medios hifas a´ereas bien formadas, que estaban segmentadas en cadenas largas de 12

ES 2 126 605 T3

5

esporas dispuestas como garfios y lazos abiertos. Se observaron tambi´en espirales, pero eran cortas e incompletas. La morfolog´ıa general era rectus-flexibilis. Las hifas a´ereas de cada una de las cepas ten´ıan una apariencia arrosariada distintiva, con muchos espacios vac´ıos en la cadena de esporas. Este aspecto demostr´o que una vaina de esporas revest´ıa la cadena de esporas, lo que es un aspecto distintivo del g´enero Saccharopolyspora. Caracter´ısticas fisiol´ ogicas

10

Se compararon los an´alisis de ´acidos grasos de cada una de las cepas. Las c´elulas se desarrollaron durante 96 horas a 28◦ C en caldo de tripticasa soja (Difco Laboratories, Detroit, MI). Los ´esteres de metilo de a´cidos grasos se analizaron mediante cromatograf´ıa gas-l´ıquido con un sistema de cromatograf´ıa gasl´ıquido controlado por ordenador modelo 5898A (Hewlett-Packard Co., Palo Alto, CA) (v´ease Miller y Berger, “Bacterial Identification by Gas Chromatography of Whole Cell Fatty Acids”, Nota de Aplicaci´ on de Hewlett-Packard 228-41. Estos resultados se presentan en la Tabla IX).

15

TABLA IX Composici´ on porcentual de a ´cidos grasos de cepas A83543

20

25

30

35

1

40

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Acido graso

A83543.1

A83543.4

A83543.6

A83543.7

15:0 ISO 16:0 ISO 16:1 Cis 9 15:0 ISO 2OH 16:0 17:1 ISO F1 17:0 ISO 17:0 Anteiso 17:1 B 17:1 C 17:0 16:1 2OH 18:1 Iso F 18:1 Cis 9

15,95 28,71 – 2,67 1,20 5,52 13,55 8,39 4,14 2,52 4,26 1,87 6,55 0,34

22,47 22,00 1,35 2,02 0,69 8,62 20,67 3,94 3,97 2,88 1,49 1,52 4,16 1,03

16,49 25,76 – 3,87 0,63 7,54 16,40 4,69 4,65 4,90 3,13 1,93 5,82 0,64

17,00 27,39 – 3,95 0,60 5,51 13,89 5,18 6,68 5,53 3,84 0,92 6,00 0,63

F, B y C indican posiciones de dobles enlaces o configuraciones que son desconocidas.

El an´ alisis de componentes principales es una rama de la estad´ıstica multivariante que trata con relaciones internas de un conjunto de variables. En este an´ alisis, la mayor magnitud de varianza dentro de los datos originales o resultados de ensayos se expresa como componentes principales (v´ease Alderson, “The Application and Relevance of Nonheirarchic Methods in Bacterial Taxonomy”, en Computer-Assisted Bacterial Systematics 227 (1985)). Puede construirse un gr´ afico que muestra dispersi´on o variabilidad. Las relaciones pueden evaluarse examinando la varianza, y caracterizar una poblaci´on microbiana. En la Figura 1 se representa un gr´ afico bidimensional de componentes principales de los an´ alisis de a´cidos grasos de las cepas A83543.1, A83543.4, A83543.6 y A83543.7. Los valores se refieren a los grados de separaci´ on entre las cepas implicadas. Las diferencias entre las cepas representan diferencias de cepas. Como es el caso con otros organismos, las caracter´ısticas de las cepas productoras de A83543A y productoras de A83543J est´ an sometidas a variaci´on. As´ı, pueden obtenerse mutantes de estas cepas por m´etodos f´ısicos y qu´ımicos conocidos en la t´ecnica. Por ejemplo, pueden obtenerse otras cepas por tratamiento con productos qu´ımicos tales como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina. Los Compuestos 1-3 se producen cultivando una cepa productora de A83543 de S. spinosa, seleccionada del grupo constituido por NRRL 18719 y NRRL 18720, o´ un mutante de la misma productor de A83543J, en un medio de cultivo adecuado. Un “mutante productor de A83543J” es un mutante natural o inducido derivado de S. spinosa NRRL 18719 o´ NRRL 18720, que es capaz de producir cantidades recuperables de A83543J (as´ı como A83543L, A83543M o A83543N). Despu´es de la producci´on, los Compuestos 1-3 pueden separarse del medio de cultivo usando diversos 13

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procedimientos de aislamiento y purificaci´on que son bien comprendidos en la t´ecnica. Por econom´ıa de producci´ on, rendimiento o´ptimo y facilidad de aislamiento de producto, se prefieren ciertos medios de cultivo. Por ejemplo, las fuentes de carbono preferidas en fermentaci´ on a gran escala son glucosa y oleato de metilo, aunque pueden usarse tambi´en ribosa, xilosa, fructosa, galactosa, manosa, manitol, almid´ on soluble, dextrina de patata, aceites tales como aceite de soja y similares. Las fuentes de nitr´ ogeno preferidas son harina de semilla de algod´ on, leche peptonizada y licor de ma´ız macerado, aunque pueden usarse tambi´en harina de pescado, harina de soja digerida, extracto de levadura, case´ına hidrolizada con enzima, extracto de carne y similares. Entre las sales inorg´ anicas nutrientes que pueden incorporarse en los medios de cultivo est´an las sales solubles acostumbradas capaces de producir iones zinc, sodio, magnesio, calcio, amonio, cloruro, carbonato, sulfato, nitrato y similares. Deben incluirse tambi´en en el medio de cultivo elementos en trazas esenciales necesarios para el crecimiento y desarrollo del organismo. Tales elementos en trazas tienen lugar com´ unmente como impurezas en otros sustituyentes del medio en cantidad suficiente para cumplir los requisitos de crecimiento del organismo. Habitualmente, si la formaci´ on de espuma es un problema, pueden a˜nadirse a medios de fermentaci´on a gran escala peque˜ nas cantidades (es decir, 0,2 ml/l) de un agente antiespumante tal como propilenglicol. No obstante, en el caso de cultivos productores de A83543, los desespumantes convencionales inhiben la producci´ on de A83543. La formaci´on de espuma puede controlarse incluyendo aceite de soja o PLURONIC L-101 (BASF, Parsippany, NJ) en el medio (1-3 %). Puede a˜ nadirse aceite adicional si se desarrolla la formaci´ on de espuma. Para la producci´on de cantidades sustanciales de los factores naturales, se prefiere la fermentaci´ on aer´obica sumergida en biorreactores agitados; no obstante, pueden obtenerse peque˜ nas cantidades de factores naturales por cultivo en matraz con sacudidas. Debido al retraso de tiempo en la producci´ on asociado com´ unmente con la inoculaci´ on de grandes biorreactores con la forma de esporas del organismo, es preferible usar un in´ oculo vegetativo. El in´ oculo vegetativo se prepara inoculando un peque˜ no volumen de medio de cultivo de un cultivo en existencia conservado en nitr´ ogeno l´ıquido para obtener un cultivo del organismo reciente, creciente activamente. El in´oculo vegetativo se transfiere despu´es a un biorreactor grande. El medio del in´ oculo vegetativo puede ser el mismo que el usado para fermentaciones mayores, pero tambi´en son adecuados otros medios. Los Compuestos 1-3 se producen por cepas productoras de A83543J cuando crecen a temperaturas on parecen entre alrededor de 24 y aproximadamente 33◦ C. Las temperaturas o´ptimas para la producci´ ser aproximadamente 28-30◦C.

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Como es acostumbrado en procedimientos de cultivo aer´ obico sumergido, se sopla aire est´eril en el recipiente desde el fondo mientras se agita el medio con impulsores de turbina convencionales. En general, la intensidad de aireaci´on y la velocidad de agitaci´ on deben ser suficientes para mantener el nivel de ox´ıgeno disuelto en o por encima del 80 % de saturaci´ on de aire, preferiblemente por encima del 70 %, con una presi´ on interna del recipiente de aproximadamente 0,34 atm´ osferas. La producci´ on de los Compuestos 1-3 puede seguirse durante la fermentaci´ on ensayando extractos del caldo. Un m´etodo preferido para seguir la producci´on es el an´ alisis de los extractos del caldo por cromatograf´ıa l´ıquida de alta eficacia (HPLC). Un sistema de an´ alisis adecuado se describe en el Ejemplo 1.

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Siguiendo la producci´ on en matraces de sacudidas o en reactores agitados, los Compuestos 1-3 pueden recuperarse del medio de fermentaci´on por m´etodos usados en la t´ecnica. Los compuestos producidos durante la fermentaci´on de la cepa productora de A83543J tienen lugar en los micelios y en el caldo. Los Compuestos 1-3 son lip´ ofilos; cuando se usa una cantidad sustancial de aceite en la fermentaci´ on, es m´as eficaz la extracci´on del caldo completo. Si s´ olo se usan peque˜ nas cantidades de aceite, la porci´on principal de los Compuestos 1-3 est´ a presente en los micelios. En ese caso, se consigue una recuperaci´ on m´as eficaz de los Compuestos 1-3 filtrando inicialmente el medio para separar el caldo de la masa micelial (la biomasa). Los Compuestos 1-3 pueden recuperarse de la biomasa mediante una variedad de t´ecnicas. Una t´ecnica adecuada implica lavar con agua la biomasa separada para separar el caldo que queda, mezclar la biomasa con un disolvente polar en el que sean solubles los Compuestos 1-3, por ejemplo, metanol o acetona, separar y concentrar el disolvente, extraer el concentrado con un disolvente no polar y/o adsorberlo en un adsorbente de gel de s´ılice de fase inversa, tal como una resina C8 ´o C18 de fase inversa, o un pol´ımero poroso elevado tal como HP-20 ´o HP-20SS (Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd. Jap´ on). El material activo se eluye del adsorbente con un disolvente adecuado, tal como, por ejemplo, mezclas acetonitrilo:metanol, que contienen opcionalmente peque˜ nas cantidades de THF. 14

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Una t´ecnica preferida para aislar Compuestos 1-3 de la biomasa implica a˜ nadir un volumen igual de acetona al caldo completo, filtrar la mezcla en un filtro cer´ amico para separar la biomasa y extraer el filtrado con acetato de etilo. El extracto en acetato de etilo se concentra bajo vac´ıo para separar la acetona, y la capa acuosa se separa de la capa org´anica. La soluci´on en acetato de etilo se concentra adicionalmente bajo vac´ıo, y se extrae el concentrado con a´cido acuoso diluido (pH 3). Los Compuestos 1-3 pueden purificarse adicionalmente por cromatograf´ıa como se describe aqu´ı. Una t´ecnica m´as preferida para aislar Compuestos 1-3 de la biomasa implica a˜ nadir un volumen igual de acetona al caldo completo, filtrar la mezcla en un filtro cer´ amico para separar la biomasa y ajustar el pH del filtrado en alrededor de pH 9 a aproximadamente pH 13. Esta soluci´ on se aplica a HP-20SS (Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd., Jap´ on) y se lava la columna con una mezcla de metanol, acetonitrilo y agua (1:1:2). Cualquiera de los Compuestos 1-3 puede eluirse con una mezcla 95:5 de metanol/acetonitrilo (1:1) y acetato am´ onico acuoso al 0,1 % (pH 8,1). Las fracciones que contienen Compuestos 1-3 se combinan y liofilizan. Los Compuestos 1-3 pueden purificarse adicionalmente por cromatograf´ıa como se describe aqu´ı. Alternativamente, los s´ olidos del cultivo, incluyendo constituyentes del medio y micelio, pueden usarse sin extracci´on o separaci´on, pero preferiblemente despu´es de separar agua, como fuente de los Compuestos 1-3. Por ejemplo, despu´es de producir los Compuestos 1-3, el caldo de fermentaci´on completo puede secarse por liofilizaci´on, por secado en tambor o por destilaci´on azeotr´ opica y secado. Ejemplo 1

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M´etodo de ensayo para el Compuesto 1 (A83543L), el Compuesto 2 (A83543M) y el Compuesto 3 (A83543N) El siguiente m´etodo de cromatograf´ıa l´ıquida de alta eficacia (HPLC) anal´ıtica es u ´ til para vigilar una fermentaci´ on para producir el Compuesto 1 (A83543L), el Compuesto 2 (A83543M) y el Compuesto 3 (A83543N) y otros componentes de A83543. Una muestra del caldo completo se diluye con tres vol´ umenes de acetonitrilo para extraer los componentes de los micelios. La soluci´on resultante se filtra despu´es a trav´es de un filtro de PTFE de 0,45 micr´ ometros para separar la materia en part´ıculas antes de la inyecci´on en el sistema de ensayo de HPLC. Se usa una soluci´ on de A83543A purificado con una concentraci´ on de 100 mg/ml en metanol como patr´ on externo para el ensayo, y las a´reas de pico de todos los componentes de A83543 se relacionan con este patr´ on de calibraci´ on para determinar las concentraciones de los componentes individuales. Sistema de HPLC:

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Soporte de columna: columna de 4,6 x 100 mm, ODS-AQ, part´ıculas esf´ericas de 5 µm, poro de 120 ˚ A (YMC, Inc., Morris Plains, NJ) Fase m´ovil: CH3 CN/MeOH/H2 O (40/40/20) que contiene 0,05 % de acetato am´onico

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Caudal: 3 ml/min Detecci´on: UV a 250 nm

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Tiempos de retenci´on: A83543A 9,1 min A83543J 5,7 min A83543L 7,3 min A83543M 2,6 min A83543N 3,3 min

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ES 2 126 605 T3 Ejemplo 2 Preparaci´ on de A83543J, Compuesto 1 (A83543L), Compuesto 2 (A83543M) y Compuesto 3 (A83543N) con Cultivo A83543.6 5

A. Fermentaci´ on en matraz de sacudidas

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Se us´ o el cultivo Saccharopolyspora spinosa NRRL 18719, bien como un gl´ obulo liofilizado o bien como una suspensi´on mantenida en nitr´ ogeno l´ıquido, para inocular un medio vegetativo que ten´ıa la siguiente composici´on: Medio vegetativo Ingrediente

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Caldo de tripticasa∗ Extracto de levadura MgSO4 · 7H2 O Glucosa Maltosa Agua desionizada

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30 3 2 5 4 q.s. 1 l

Autoclave 30 min a 120◦ C ∗

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Cantidad (g)

Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville, MD

Pueden prepararse cultivos en pico de flauta o placas a˜ nadiendo 2,5 % de agar al medio vegetativo. El cultivo en pico de flauta inoculado se incuba a 30◦C durante 10 a 14 d´ıas. El cultivo en pico de flauta maduro se rasca con una herramienta est´eril para soltar las esporas y para separar y macerar la mata micelial. Un cuarto de las esporas sueltas y el producto de cultivo obtenidos as´ı se usan para inocular 50 ml de un medio vegetativo de primera fase. Alternativamente, el medio de primera fase pueden inocularse desde una ampolla de nitr´ogeno l´ıquido. Cuando se mantiene el cultivo en nitr´ ogeno l´ıquido, se preparan ampollas homogeneizando un cultivo vegetativo (48-72 horas de incubaci´ on, 30◦ C), diluyendo 1:1 (volumen:volumen) con un agente de suspensi´ on est´eril y distribuyendo en tubos est´eriles (1,5 ml/tubo). El agente de suspensi´ on contiene lactosa (100 g), glicerol (200 ml) y agua desionizada (q.s. hasta 1 l). Se usa una ampolla de nitr´ ogeno l´ıquido para inocular 100 ml de medio vegetativo en matraces Erlenmeyer de 500 ml (o 50 ml de medio en matraces de 250 ml). Los cultivos se incuban a 30 ◦C durante 48 horas en un sacudidor orbitando en un c´ırculo de 5,08 cm a 260 rpm. El cultivo incubado (10 % v/v de in´ oculo) se usa para inocular 50 ml o´ 100 ml, dependiendo del tama˜ no del matraz Erlenmeyer, de un medio de producci´ on que tiene la siguiente composici´ on: Medio de producci´ on

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Ingrediente

Cantidad (g)

Glucosa Leche peptonizada∗ Harina de semillas de algod´on∗∗ Licor de ma´ız macerado CaCO3 (calidad t´ecnica) Oleato de metilo Agua de grifo

80 20 30 10 5 30∗∗∗ q.s. hasta 1 l

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pH ajustado en pH 7,0 con NaOH 1 N, esterilizado 40 min a 120◦C

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Nutriente de leche peptonizada, Sheffield Products, Norwich, NY

∗∗

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Proflo, Traders Protein, Memphis, TN

∗∗∗

La cantidad de oleato de metilo fue 30 ml

El medio de producci´on inoculado se incuba en matraces Erlenmeyer de 250 ml o´ 500 ml a 30◦C durante 7 a 10 d´ıas en un sacudidor que orbita a un c´ırculo de 5,08 cm a 260 rpm. 10

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B. Fermentaci´ on en reactor agitado Con el fin de proporcionar un volumen mayor de in´ oculo, se usan 10 ml de medio de primera fase incubado, preparado como se describe en el Ejemplo 2, Secci´ on A, para inocular 400 ml de un medio vegetativo de segunda fase que tiene la misma composici´on que el medio de primera fase. Este medio vegetativo de segunda fase se incuba en un matraz Erlenmeyer de boca ancha de 2 l durante aproximadamente 48 horas a 30◦ C en un sacudidor que orbita en un c´ırculo de 5,08 cm a 260 rpm. El medio vegetativo de segunda fase incubado (2 l) preparado as´ı se usa para inocular de 80 a 115 litros de medio de producci´ on est´eril, preparado como se describe en el Ejemplo 2, Secci´on A.

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Se deja fermentar el medio de producci´ on inoculado en un biorreactor agitado de 165 l durante 7 d´ıas a 10 d´ıas a una temperatura de 30◦ C. El flujo de aire y la velocidad del agitador en el recipiente agitado se controlan por ordenador para mantener un nivel de ox´ıgeno disuelto en o por encima del 60 % a aproximadamente el 80 % de saturaci´ on de aire.

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Ejemplo 3 Preparaci´ on de A83543J, A83543L, A83543M y A83543N con Cultivo A83543.7

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El cultivo Saccharopolyspora spinosa NRRL 18720 puede usarse como se describe en el Ejemplo 2 para preparar A83543J, A83543L, A83543M y A83543N. Ejemplo 4 Aislamiento de A83543J, A83543L, A83543M y A83543N

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El caldo de fermentaci´on (105 l), preparado como se describe en el Ejemplo 2, se ajust´ o en pH 10 (inicialmente pH 6,8) a˜ nadiendo NaOH 5 N. La mezcla resultante se filtr´ o a trav´es de un filtro cer´ amico. Se desech´o el filtrado, se a˜ nadi´ o a los s´olidos miceliales una mezcla de acetona y agua (1:1, 50 l) y se filtr´ o la mezcla resultante. Se a˜ nadi´ o a los s´olidos miceliales una segunda mezcla de acetona y agua (1:1, 50 l), y se ajust´ o el pH de la mezcla resultante en pH 3,0 con ´acido sulf´ urico al 25 %. Se filtr´ o la mezcla resultante, y se a˜ nadi´ o al s´olido micelial una tercera mezcla de acetona y agua (1:1, 50 l). La mezcla resultante se filtr´ o y se combinaron los filtrados a´cidos. Los filtrados combinados se extrajeron con heptano (10 l). Se separaron las fases y se a˜ nadi´ o la fase acuosa a una segunda porci´ on de heptano (10 l). El pH de la mezcla resultante se ajust´ o en pH 10 con NaOH 5 N. La emulsi´on resultante se diluy´ o con 50 l de agua. Se separaron las fases y se extrajo la fase acuosa con una tercera porci´on de heptano (10 l). Se separaron las fases y el segundo y tercer extracto en heptano se combinaron y concentraron hasta un volumen de aproximadamente 4 litros. Por reposo, el concentrado se separ´o en 3 fases: acuosa, emulsi´on y org´ anica. La fase org´anica se liofiliz´ o para dar 15,29 g de producto crudo. El producto crudo se disolvi´ o en metanol (500 ml), se filtr´o y se concentr´ o a sequedad bajo vac´ıo. El residuo se disolvi´ o en una segunda porci´ on de metanol (20 ml) y se aplic´o a una columna de LH-20 SEPHADEX (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, NJ, 7,5 cm x 46 cm), eluyendo con metanol y recogiendo fracciones de 25 ml. Usando el sistema de HPLC descrito en el Ejemplo 1, se analizaron las fracciones para determinar qu´e fracciones conten´ıan los compuestos de inter´es. Las fracciones 18-50 se combinaron y concentraron a sequedad. El residuo se disolvi´ o en una mezcla de etanol, acetonitrilo y agua (5:5:1) y se cromatografi´ o en porciones de 1 ml en una columna de HPLC de fase inversa preparativa (Rainin DYNAMAX-60A, C18, 41,4 mm x 300 mm, part´ıculas de 8 mm, poro de 60 ˚ A, Woburn, MA). La columna se eluy´ o con una mezcla de metanol, acetonitrilo y agua (87,5:87,5:25) con acetato am´onico a˜ nadido hasta una concentraci´ on final 17

ES 2 126 605 T3 del 0,1 % (pH 7,6). Las fracciones se analizaron usando un sistema de HPLC, similar al descrito en el Ejemplo 1, combinando fracciones similares y concentrando para dar tres concentrados semipuros A, B y C. 5

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El concentrado semipuro C se recromatografi´ o en el sistema descrito en el p´arrafo precedente, cargando 200 ml en cada una de 10 pruebas. Las fracciones de cada una de las pruebas se combinaron y concentraron para dar las preparaciones C1 y C2. La preparaci´ on C2 se cromatografi´ o una tercera vez; sin embargo, se us´o agua en lugar del acetato am´ onico al 0,1 % (etapa de desalaci´ on). Las fracciones que conten´ıan A83543L en al menos 99,5 % de pureza por HPLC se combinaron y concentraron. El residuo se cristaliz´o en etanol/agua (1:1) para dar 2,4 g de A83543L. La preparaci´ on C1 y el concentrado semipuro B se combinaron y desalaron como se describe en el p´ arrafo precedente (pruebas 12 x 200 ml); no obstante, el compuesto deseado se eluy´ o con una mezcla de metanol, acetonitrilo y agua (11:11:3). Las fracciones que conten´ıan A83543J en al menos 99,5 % de pureza por HPLC se combinaron y concentraron. El residuo se disolvi´ o en t-butanol caliente y se liofiliz´o para dar 4,3 g de A83543J. El concentrado semipuro A se cromatografi´ o como se ha descrito antes, excepto que los compuestos deseados se eluyeron con una mezcla de metanol, acetonitrilo y agua (37,5:37,5:25), con acetato am´ onico a˜ nadido hasta una concentraci´ on final del 0,1 %. Las fracciones de cada una de las pruebas (4) se combinaron y concentraron para dar las preparaciones A1, A2 y A3. La preparaci´ on A1 se cromatografi´o usando la columna descrita antes; sin embargo, la columna se eluy´o con una mezcla de metanol, acetonitrilo y agua (2:2:1). Las fracciones que conten´ıan A83543M en al menos 99,5 % de pureza por HPLC se combinaron y concentraron. El residuo se disolvi´ o en t-butanol y se liofiliz´o para dar 136 mg de A83543M. La preparaci´ on A2 se cromatografi´o y trat´ o como se describe en el p´arrafo precedente para dar 71 mg de A83543N.

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Ejemplo 5 S´ıntesis de A83543M (Compuesto 2) 35

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Se a˜ nadieron A83543J (105,4 mg, 0,15 mmoles) y acetato s´odico trihidrato (144,6 mg, 1,06 mmoles) a una mezcla de metanol y soluci´ on tamp´ on de pH 9 (Fisher Scientific, Lexington, MA). La suspensi´ on nadi´ o despu´es en una porci´on yodo (46,6 mg, 0,18 mmoles). Despu´es resultante se calent´o a 47◦ C, y se a˜ nadi´ o de aproximadamente 10 min, la soluci´ on se hizo homog´enea. Despu´es de cuatro horas a 47◦C, se a˜ la reacci´on a una soluci´ on de tiosulfato s´ odico al 5 %. La mezcla acuosa incolora resultante se extrajo con cloruro de metileno. Los extractos en cloruro de metileno se combinaron, lavaron con salmuera y secaron sobre K2 CO3 . La soluci´on en cloruro de metileno seca se evapor´o a sequedad bajo vac´ıo para dar 57,3 mg de A83543M como un vidrio amarillo p´ alido (54 % de rendimiento). Ejemplo 6

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S´ıntesis de A83543N (Compuesto 3) Usando un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 5, se convirti´ o qu´ımicamente A83543L (102,5 mg) en A83543N (66,5 mg). 50

Ejemplo 12 Preparaci´ on de A83543AgA (Compuesto 17) 55

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A una soluci´ on de A83543PsaA1 (6,03 g, 10,7 mmoles) en metanol (267 ml) se a˜ nadi´ o H2 SO4 7,2 N (396 ml), y la soluci´ on se calent´ o a reflujo durante 3 horas. La mezcla se enfri´ o despu´es en un ba˜ no de hielo. Se a˜ nadieron con cuidado una gran cantidad de NaHCO3 (s´olido) y NaHCO3 acuoso saturado; no obstante, nunca se llev´o el pH por encima de 1,0. La soluci´on acuosa se mezcl´o con ´eter et´ılico y se separ´ o. La porci´on acuosa se extrajo despu´es con ´eter et´ılico reciente. Los extractos en ´eter se comon reducida. El semis´olido binaron, lavaron con salmuera, secaron sobre K2 CO3 y evaporaron a presi´ amarillo resultante (4,89 g) se purific´ o por cromatograf´ıa de fase normal con 100 % de diclorometano y un gradiente hasta el 7,5 por ciento de metanol en diclorometano, dando A83543AgA (2,83 g, 66 por ciento 18

ES 2 126 605 T3 de rendimiento) como un vidrio incoloro. Ejemplo 13 5

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Preparaci´ on de Compuesto 9 Una suspensi´ on de N-clorosuccinimida (104,7 mg, 0,78 mmoles) en diclorometano (2,6 ml) se enfri´o ogeno. Se a˜ nadi´ o a esta suspensi´on sulfuro de diisopropilo (0,125 ml, 0,86 mmoles), y a -78◦C bajo nitr´ nadi´ o despu´es lentamente A83543J (184,6 mg, 0,26 se agit´ o la mezcla a -78◦ C durante media hora. Se a˜ mmoles) en diclorometano (1 ml). Cuando se complet´ o la adici´on, la soluci´ on se agit´o a -78◦ C durante 6,25 horas. Se a˜ nadi´ o despu´es trietilamina (0,109 ml, 0,78 mmoles), y se calent´o la soluci´on a temperatura ambiente. La mezcla era roja. Despu´es de calentar, se a˜ nadi´ o ´eter et´ılico (6 ml) y se form´o un precipitado. El precipitado se disolvi´ o en diclorometano, y esto se combin´ o con la soluci´on en ´eter et´ılico. La soluci´on resultante se lav´o con HCl 0,1 N, se lav´o despu´es con salmuera, se sec´o con MgSO4 y se evapor´o a temperatura ambiente. El vidrio incoloro resultante (215 mg) se semipurific´ o por cromatograf´ıa r´ apida con 5 por ciento de metanol en diclorometano, dando el Compuesto 9 como un semis´ olido incoloro (151,2 mg). La recuperaci´ on en peso y el espectro de NMR mostraron la contaminaci´ on del producto con sulfuro de diisopropilo, pero el producto se us´o sin purificaci´ on adicional. Ejemplo 14 Preparaci´ on de Compuesto 10

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Se repiti´ o el procedimiento usado en el Ejemplo 13 partiendo de A83543L (997,4 mg, 1,36 mmoles), y dio el Compuesto 10 como un semis´olido incoloro (850 mg). Ejemplo 15 Preparaci´ on de A83543PsaA2 (Compuesto 13)

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A una soluci´ on de Compuesto 9 (1,89 g, 2,64 mmoles) en metanol (100 ml) se a˜ nadi´ o K2 CO3 (anhidro; 1,82 g, 13,2 mmoles), y la mezcla se agit´o a temperatura ambiente durante una hora. Se a˜ nadi´ o despu´es ´eter et´ılico (100 ml) y se filtr´o la mezcla. El filtrado se evapor´o a temperatura ambiente, dando un s´ olido amarillo. El s´olido amarillo se disolvi´ o en diclorometano, se lav´ o con agua, despu´es con salmuera, y se sec´o o despu´es el diclorometano a presi´on reducida, dando un semis´ olido incoloro (1,53 con MgSO4 . Se evapor´ g). Este semis´ olido se purific´ o por cromatograf´ıa r´ apida con 5 por ciento de metanol en diclorometano a 10 por ciento de metanol en diclorometano en un gradiente de una etapa, dando A83543PsaA2 (1,09 g, 76 por ciento de rendimiento) como un vidrio blanquecino. Ejemplo 16 Preparaci´ on de A83543PsaD2 (Compuesto 14)

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Se repiti´o el procedimiento descrito en el Ejemplo 15 usando como material de partida el producto del Ejemplo 13 (770 mg, 1,06 mmoles) y produciendo A83543PsaD2 (246 mg, 42 por ciento de rendimiento) como un vidrio incoloro. Ejemplo 17

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Preparaci´ on de A83543AgD (Compuesto 18)

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A una suspensi´ on de A83543PsaD2 (132 mg, 0,24 mmoles) en agua (5 ml) se a˜ nadi´ o gota a gota H2 SO4 1 N hasta que la mezcla tuvo un pH de 1,7 y era homog´enea. Esta soluci´on se calent´o a 80◦C durante 3,75 horas, durante cuyo tiempo se separ´ o un aceite de la soluci´ on. La mezcla se enfri´ o a temperatura ambiente y se a˜ nadi´ o diclorometano para disolver el aceite. La capa acuosa se separ´o y extrajo con diclorometano reciente. Las soluciones en diclorometano se combinaron, lavaron r´ apidamente con H2 SO4 1 N, secaron con K2 CO3 y evaporaron a temperatura ambiente dando un vidrio amarillo p´ alido (82,9 mg). El producto se purific´ o por cromatograf´ıa r´apida con 5 por ciento de metanol en diclorometano, dando A83543AgD (63,6 mg, 63 por ciento de rendimiento) como un vidrio incoloro.

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Los Compuestos 21 y 22 pueden prepararse por desmetilaci´ on qu´ımica de los Compuestos 13 y 14, respectivamente, usando met´oxido s´ odico/yodo. La reacci´on se efect´ ua preferiblemente en un disolvente 19

ES 2 126 605 T3 org´ anico polar, tal como metanol. Adem´ as, la reacci´on se efect´ ua a una temperatura de alrededor de -10◦C a aproximadamente 15◦ C, preferiblemente entre 0◦ C y 5◦ C. Los tiempos de reacci´on var´ıan de alrededor de 4 horas a aproximadamente 6 horas. 5

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Ejemplo 19 Como se ha indicado antes, los compuestos de esta invenci´ on son u ´ tiles como compuestos intermedios en la preparaci´ on de insecticidas. Por ejemplo, cuando se cultivan microorganismos apropiados en presencia de los compuestos reivindicados, los compuestos reivindicados se bioconvierten en componentes de A83543 activos insecticidamente, como se ilustra seguidamente. Este ejemplo ilustra la preparaci´on de A83543A cultivando NRRL 18538 en presencia de A83543AgA. Se us´ o el cultivo Saccharopolyspora spinosa NRRL 18538, como un gl´ obulo liofilizado o como una suspensi´ on mantenida en nitr´ ogeno l´ıquido, para inocular un medio vegetativo que ten´ıa la siguiente composici´on: Ingrediente

Cantidad (g)

Case´ına hidrolizada con enzima Extracto de levadura MgSO4 · 7H2 O Glucosa Agua desionizada

30 3 2 10 q.s. hasta 1 l

El pH se ajust´ o en 6,5 con hidr´ oxido s´ odico.

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Pueden prepararse cultivos en pico de flauta o placas a˜ nadiendo 2,5 % de agar al medio vegetativo. El cultivo en pico de flauta inoculado se incuba a 30◦C durante 10 a 14 d´ıas. El cultivo en pico de flauta maduro se rasca con una herramienta est´eril para soltar las esporas y para separar y macerar la mata micelial. Aproximadamente un cuarto de las esporas sueltas y el producto de cultivo obtenidos as´ı se usan para inocular 50 ml de un medio vegetativo de primera fase. Alternativamente, el medio de primera fase pueden inocularse desde una ampolla de nitr´ogeno l´ıquido.

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Cuando se mantiene el cultivo en nitr´ ogeno l´ıquido, se preparan ampollas usando vol´ umenes iguales on. El medio de suspensi´ on de cultivo vegetativo (48-72 horas de incubaci´ on, 30◦ C), y medio de suspensi´ contiene lactosa (100 g), glicerol (200 ml) y agua desionizada (q.s. hasta 1 l).

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Se usa una ampolla de nitr´ ogeno l´ıquido para inocular 100 ml de medio vegetativo en matraces Erlenmeyer de 500 ml (o 50 ml de medio en matraces de 250 ml). Los cultivos se incuban a 30◦ C durante 48 horas en un sacudidor orbitando en un c´ırculo de 5,08 cm a 250 rpm. El cultivo incubado (5 % v/v de in´ oculo) se usa para inocular 100 ml de un medio de producci´ on que tiene la siguiente composici´ on: Ingrediente

Cantidad (g)

Glucosa Leche peptonizada Harina de semillas de algod´on Licor de ma´ız macerado CaCO3 Oleato de metilo Agua de grifo

80 20 30 10 5 30 q.s. hasta 1 l

El pH se ajust´ o en 7,2 con hidr´ oxido s´ odico La conversi´on de A83543AgA en A83543A se consigui´o por adici´ on de A83543AgA (4,88 mg, 0,195 mg/ml) a un cultivo de 65 h de NRRL 18538 en el medio de producci´ on mencionado antes (25 ml en un matraz de 250 ml) e incubando el cultivo durante 31 horas m´ as. Se a˜ nadi´ o acetonitrilo (3,0 ml) a una parte al´ıcuota (1,0 ml) del cultivo. Esta muestra se mezcl´o y centrifug´ o, y se inyect´o una parte al´ıcuota en una columna de HPLC anal´ıtica dise˜ nada para ensayar los diversos componentes del cultivo de A83543. El an´ alisis del caldo de fermentaci´ on mostr´ o la presencia de 2,44 mg (0,098 mg/ml) de A83543A.

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ES 2 126 605 T3 REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de F´ ormula 1: 5

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en la que R7 , R8 , R9 , R10 y R11 son cada uno individualmente como sigue:

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(Ver Compuestos en p´ aginas siguientes) 30

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2. Un procedimiento para preparar un compuesto 13, 14, 15 o´ 16 como se ha definido en la reivindicaci´on 1a¯ , cuyo procedimiento comprende separar el grupo R11 que contiene cetona de un compuesto correspondiente 9, 10, 11 o´ 12 como se ha definido en la reivindicaci´on 1a¯ . 3. Un procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 2a¯ , cuyo procedimiento comprende oxidar un compuesto correspondiente de f´ ormula 1 como se ha definido en la reivindicaci´ on 1a¯ , en el que R11 es

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para producir el compuesto que contiene cetona correspondiente 9, 10, 11 o´ 12, y separar despu´es el grupo R11 que contiene cetona de dicho compuesto 9, 10, 11 ´o 12, para producir el compuesto correspondiente 13, 14, 15 o´ 16. 4. Un procedimiento para preparar un compuesto 21 o´ 22 como se ha definido en la reivindicaci´on 1a¯ , cuyo procedimiento comprende desmetilar el compuesto correspondiente 13 ´o 14 como se ha definido 23

ES 2 126 605 T3 en la reivindicaci´on 1a ¯.

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5. Un procedimiento para preparar un compuesto 9, 10, 11 o´ 12 como se ha definido en la reivindicaci´ on 1a¯ , cuyo procedimiento comprende oxidar un compuesto correspondiente de f´ ormula 1 como se ha definido 11 en la reivindicaci´on 1a ¯ , en el que R es

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6. Un procedimiento para preparar un compuesto 17, 18, 19 o´ 20 como se ha definido en la reivindicaci´on 1a¯ , cuyo procedimiento comprende (a) hidrolizar A83543A, A83543B, A83543C, A83543G, A83543H, A83543J, A83543PsaA1, A83543PsaA2, A83543PsaH1, A83543PsaJ1, A83543PsaB2 o´ A83543PsaC2 para producir A83543AgA; o

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(b) hidrolizar A83543PsaD2 o´ A83543PsaN2 para producir A83543AgD; o (c) hidrolizar A83543E o A83543PsaE1 para producir A83543AgE; o 25

(d) hidrolizar A83543F o A83543PsaF1 para producir A83543AgF.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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