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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k ES 2 059 376 kInt. Cl. : C12N 15/74

11 N.◦ de publicaci´ on: 5

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˜ ESPANA

C07K 15/00 A23C 19/032

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 87304557.9 kFecha de presentaci´on : 21.05.87 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 246 909 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 25.11.87

T3

86 86 87 87

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54 T´ıtulo: Pl´ asmidos que confieren a las bacterias insensibilidad frente a los fagos.

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73 Titular/es: University College Cork

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72 Inventor/es: Daly, Charles;

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74 Agente: Gil Vega, V´ıctor

30 Prioridad: 21.05.86 IE 1352/86

College Road Cork, County Cork, IE Charles Daly y Gerald Francis Fitzgerald

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.11.94

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

16.11.94

Aviso:

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Fitzgerald, Gerald F.; Coffey Aidanof Ballylaneen; Baumgartner, Andreas y Costello, Veronica A.

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 059 376 T3 DESCRIPCION

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Esta invenci´on se refiere a pl´ asmidos que confieren a las bacterias insensibilidad frente a los fagos, en particular a las bacterias a´cidas l´ acticas en las que se han introducido dichos pl´ asmidos, y al uso de tales pl´ asmidos en la industria alimentaria, en particular en la industria l´ actea. Se sabe que la actividad de un cultivo iniciador de las fermentaciones l´ acticas, tales como la producci´ on de queso, cultivos de suero de leche, cultivos de mantequilla, leche cortada, etc., puede ser afectada adversamente por un ataque de bacteri´ ofagos. Se acepta que existe una necesidad urgente de extender la gama de cepas insensibles a los fagos, estables industrialmente y a disposici´ on de la industria l´ actea. Los estudios gen´eticos sobre los estreptococos l´acticos han sugerido que puede utilizarse la manipulaci´on gen´etica para construir cepas de caracter´ısticas industriales nuevas y/o mejoradas. Los t´erminos “insensibilidad frente a los fagos” e “insensible a los fagos” se usan en esta solicitud de patente para expresar la incapacidad de un bacteri´ofago para propagarse en una cepa hu´esped. En la literatura sobre bacteri´ ofagos y estreptococos l´acticos, el t´ermino “resistente” se utiliza normalmente para describir hu´espedes que no permiten la propagaci´ on de fagos, aunque no se conoce el mecanismo de tal “resistencia”. En un sentido estrictamente cient´ıfico, el t´ermino “resistencia” implica la incapacidad de un fago para ser adsorbido en un hu´esped.

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En la literatura se han descrito varios mecanismos de codificaci´on de pl´ asmidos relacionados con la transmisi´on de insensibilidad a un hu´esped ante el ataque de fagos en los estreptococos l´ acticos. La insensibilidad puede producirse a nivel de adsorci´ on, restricci´on-modificaci´ on (R-M) del DNA del fago, o debido a fuertes mecanismos todav´ıa sin caracterizar que impiden la maduraci´ on de los fagos.

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Sanders y Klaenhammer (19) y de Vos y otros (20), han descrito dos sistemas codificados de bloqueo de la adsorcion en los pl´ asmidos. Estas mol´eculas, pME0030 (30 Mdal, de S. lactis ME 2, ref. 19) y pSK112 (34 Mdal, de S. cremoris SK11, ref 20) hacen el efecto de inhibir significativamente la adsorci´on de fagos en hu´espedes que contienen pl´ asmidos, con la consecuente supresi´on de la replicaci´on de fagos. La eliminaci´on de los pl´ asmidos de sus respectivos hu´espedes, da como resultado una adsorci´on de fagos muy eficaz y una sensibilidad aumentada frente a fagos espec´ıficos. Sin embargo, como ning´ un pl´ asmido es conjugable, puede ser dif´ıcil utilizarlos para construir nuevos cultivos de cepas iniciadoras insensibles a los fagos.

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Los pl´ asmidos codificados con actividad R-M, algunos de los cuales son conjugables, se presentan en gran n´ umero en los estreptococos l´acticos (21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28). Aunque se han conseguido potentes sistemas R-M por el efecto aditivo de dos pl´ asmidos (21, 24) el potencial de R-M como un mecanismo de defensa contra los fagos es limitado, ya que la insensibilidad conferida no es completa y los fagos que se modifican (es decir, se protegen contra subsecuentes restricciones) constituyen una amenaza contra el hu´esped que anteriormente hab´ıa restringido el fago sin modificar. McKay L.L. y Baldwin K.A. (1) han descrito un pl´ asmido pNP40 que se origina en el Streptococcus lactis subespecie diacetylactis DRC3. El mecanismo asociado con este pl´ asmido fue efectivo a 21◦C y 32◦C as, se presentaron pruebas de que el pNP40 era termosensible en su replicaci´ on. pero no a 37◦ C. Adem´ Klaenhammer y otros han descrito un pl´ asmido pTR2030, originado en S.lactis ME2, que codifica un mecanismo de defensa contra los fagos sensible al calor, que limita el tama˜ no surgente y el tama˜ no de placa de un fago espec´ıfico sin alterar la eficacia de formaci´on de placas (e.o.p.) ni el nivel de adsorci´ on (2). Este pl´ asmido se describe en la especificaci´on europea n´ umero 208 468A2. El mecanismo del pTR 2030 es sensible al calor en un ambiente de S.lactis pero no en los hu´espedes S.cremoris cuando se someten a fagos de cabeza isom´etrica (2, 3). El efecto de la alta temperatura sobre la actividad del mecanismo asociado del pTR2030 contra los fagos de cabeza alargada no est´ a demostrada. El pTR2030 puede transferirse de forma conjugada a una gama de cepas de S. cremoris (3, 4) y ha sido establecido que el pl´ asmido confiere resistencia a peque˜ nos fagos de cabeza isom´etrica. Sin embargo, los fagos de cabeza isom´etrica alargada y grande, o no se inhibieron en los transconjugantes del pTR2030 o mostraron una reducci´ on del tama˜ no de placa sin una reducci´ on en el e.o.p. (5). La presencia de pTR2030 en un lis´ ogeno se mostr´o incapaz de inhibir la inducci´ on de profagos en los S.cremoris R1 pero impidi´ o que el fago lisog´enico infectase el derivado curado de S.cremoris R1 (6) de profagos que conten´ıan pTR2030. Se ha sugerido que el mecanismo de resistencia a los fagos act´ ua en la superficie o membrana de la c´elula para impedir el paso del DNA de los peque˜ nos fagos de cabeza isom´etrica en la c´elula hu´esped, o inhibe los primeros acontecimientos necesarios para la replicaci´on por l´ısis de los fagos que infectan exteriormente (6). Sanders y otros han dise˜ nado una extrategia conjugada para la construcci´ on de estreptococos l´acticos productores r´apidos de a´cido y resistentes a los bacteri´ofagos, para su uso en las fermentaciones de leche, que consiste en la introducci´ on de pTR2030 en cepas receptoras que utilizan lactosa y son sensibles a los antibi´oticos (7). 2

ES 2 059 376 T3

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Este informe tambi´en describe el uso de an´ alisis de supresi´on para localizar la regi´on del pTR2030 que codifica la resistencia a los fagos y la clonaci´on de un fragmento espec´ıfico de Hind III en E.coli usando el vector de pl´ asmido pBR322. Se secuenci´o una regi´ on 150 bp del pTR2030 y se sintetizaron qu´ımicamente 19 pares de base del interior de dicha regi´ on, para usarlos como un sondeo muy espec´ıfico para identificar cepas que contienen pTR2030. Las referencias 4, 5, 6 y 7 y la especificaci´on europea n´ umero 208 462A2 se publicaron despu´es de la fecha de prioridad de la presente solicitud de patente.

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Aunque se ha producido un considerable progreso en el estudio de los mecanismos de insensibilidad frente a los fagos en los pl´ asmidos codificados, todav´ıa existe una necesidad definida de sistemas m´ as potentes. En particular, es muy deseable conseguir un mecanismo para usar en la industria alimentaria, que sea insensible al calor y activo contra los virulentos fagos de cabeza alargada en relaci´ on con los S.cremoris y S.lactis.

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Un objetivo de la presente invenci´ on es proporcionar pl´ asmidos que codifiquen insensibilidad frente a los fagos en especies u ´ tiles para la fabricaci´ on de queso y otros campos de la industria alimentaria.

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La invenci´on proporciona un pl´ asmido aislado que porta uno o m´ as genes que son capaces de conferir insensibilidad frente a uno o m´ as fagos, a las bacterias Streptococcus cremoris, no siendo afectada la resistencia a dichos fagos a temperaturas comprendidas entre 35◦C y 40◦ C, caracterizado porque tiene genes que tambi´en son capaces de conferir insensibilidad frente a los fagos, a los Streptococcus lactis y a los Streptococcus lactis subespecie diacetylactis, no destruyendose dicha capacidad de conferir insensibilidad frente a los fagos a temperaturas de hasta 39◦C.

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Los pl´ asmidos de la presente invenci´on son pl´ asmidos aislados.

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El t´ermino “pl´asmido aislado” tal como se usa en esta solicitud de patente, significa un pl´ asmido que se ha sacado del hu´esped original en el cual se hab´ıa identificado, asi como su progenie y derivados que tienen iguales propiedades de insensibilidad frente a los fagos, e incluye dichos pl´ asmidos tanto cuando se encuentran libres de bacterias como en el caso en que han sido introducidos en otra c´elula bacteriana. En particular, la invenci´ on proporciona un pl´ asmido como el que acaba de definirse, que se origina en una cepa de Streptococcus cremoris o de Streptococcus lactis, y un pl´ asmido que confiere insensibilidad frente a los peque˜ nos fagos de cabeza isom´etrica peque˜ na y de cabeza alargada. La invenci´on proporciona adem´ as un pl´ asmido recombinante que lleva genes que codifican la utilizaci´on de lactosa y la insensibilidad frente a los fagos en los estreptococos l´acticos, siendo dicho pl´asmido generado mediante clonaci´ on in vivo.

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La invenci´on tambi´en proporciona un pl´ asmido recombinante que lleva genes que codifican la insensibilidad frente a los fagos, la utilizaci´on de lactosa y la capacidad conjugativa de alta frecuencia en los estreptococos l´acticos, siendo dicho pl´asmido generado mediante clonaci´ on in vivo. 45

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En sus aspectos particulares, la invenci´ on proporciona los pl´ asmidos pCI 750 pCI 777 pCi 829 pCI 528 los derivados isog´enicos de los mismos; los pl´asmidos sustancialmente similares a ellos, en particular los pl´ asmidos que tienen por lo menos una homolog´ıa del 80% con ellos; y el DNA de tales pl´asmidos que codifica la insensibilidad frente a los fagos con o sin utilizaci´on de lactosa y con o sin capacidad de conjugaci´ on de alta frecuencia. La invenci´on tambi´en proporciona hu´espedes bacterianos, en particular hu´espedes estreptoc´ocicos en los que se han introducido uno o m´ as de los pl´ asmidos definidos arriba. M´ as en particular un hu´esped en el que se han introducido dos de los pl´ asmidos definidos en lo que antecede, cuyo efecto sobre el modelo de insensibilidad frente a los fagos es aditivo (es decir, en el caso de fagos que est´ an s´ olo inhibidos parcialmente por cada pl´asmido, la presencia de dos pl´ asmidos juntos proporciona sustancialmente una insensibilidad total). En particular, la invenci´ on proporciona derivados isog´enicos de estos pl´asmidos 3

ES 2 059 376 T3 que incluyen derivados de los mismos marcados con LAC, pl´asmidos sustancialmente similares a ellos, y pl´ asmidos que tienen un DNA codificador de la insensibilidad frente a los fagos que es sustancialmente similar a la del pCI750, pCI829 y pCI528. 5

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La invenci´on se refiere especialmente a todos los materiales definidos en lo que antecede, en una forma biol´ ogicamente pura o en forma esencialmente pura. Adem´as, la invenci´on proporciona cultivos para iniciar productos l´ acteos, en particular cultivos iniciadores de queso, que contienen cualquiera de los materiales acabados de definir. La invenci´ on tiene tambi´en potencial para su uso en cultivos usados en la carne y en fermentaciones c´ arnicas, tales como la fabricaci´ on de salchichas alemanas, cultivos para la fermentaci´ on de vegetales y cultivos probi´ oticos. La invenci´on proporciona tambi´en procedimientos para conferir a las bacterias insensibilidad frente a los fagos, procedimientos que consisten en introducir en dichas bacterias un pl´ asmido de los definidos anteriormente, y en un cultivo iniciador alimentario que incluye bacterias en las que se ha introducido un pl´ asmido como los definidos antes. Esta solicitud de patente describe m´ as particularmente tres pl´ asmidos que confieren una valiosa insensibilidad frente a los fagos, entre los cuales se incluyen fagos virulentos de cabeza alargada, ofreciendo dichos pl´ asmidos ventajas sobre otros pl´ asmidos descritos en la literatura. Por ejemplo, algunos de los pl´ asmidos de la t´ecnica anterior no son conjugables y no pueden usarse f´ acilmente para construir cepas promotoras de insensibilidad frente a los fagos. Los pl´ asmidos pNP40 (1) y pTR2030 (2 a 7) son ambos sensibles al calor en un medio de S.lactis, aunque el u ´ltimo es insensible al calor en hu´espedes de S.cremoris cuando se dosifica contra peque˜nos fagos de cabeza isom´etrica. Como contraste, los pl´ asmidos descritos en esta solicitud de patente codifican mecanismos insensibles al calor que son eficaces contra fagos de cabeza alargada tanto en ambientes de S.cremoris como de S. lactis. Esto es de la mayor importancia en la fabricaci´ on industrial de queso. El pCI528, basado en su capacidad para inhibir fagos de cabeza alargada e isom´etrica, es el pl´ asmido insensible a los fagos m´ as potente normalmente disponible. Adem´ as, el efecto a˜ nadido de los mecanismos asociados con los pCI750 y pCI829, contra los fagos de cabeza alargada, tiene aplicaciones pr´acticas muy significativas. Desde un punto de vista de los mecanismos, el pCI750 difiere del pTR2030 en que el u ´ltimo no inhibe la inducci´ on de profagos cuando estos est´ an presentes en un hu´esped lisog´enico, mientras que el pCI750 produce una reducci´ on muy severa de los niveles de inducci´on. Adem´ as, la presencia del pCI750 en un hu´esped es incapaz de reducir el e.o.p. de los fagos de cabeza alargada. Los pCI750 y pCI829 pueden reducir el e.o.p. entre 0,5 y 7 ciclos logar´ıtmicos. El pCI528 es diferente de los pNP40 y pTR2030 en que el efecto sobre la adsorci´on de fagos contribuye a la totalidad del mecanismo de insensibilidad frente a los fagos. Breve descripci´ on de los dibujos

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La presente invenci´on se describir´ a en lo que sigue, haciendo referencia a los dibujos adjuntos, que muestran distintos aspectos de la misma y son los siguientes: Figura 1. Gel de agarosa (0,7%) que muestra pl´ asmidos del S.cremoris UC653 y los transconjugantes insensibles a los fagos Lac+ elegidos.

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Banda 1. Banda 2. Banda 3.

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Banda 4. Banda 5. Banda 6.

Pesos moleculares est´andar del E.coli V517. Receptor de S.lactis MG1363 Sm libre de pl´ asmidos. Donante de S.cremoris UC653 que contiene 6 pl´ asmidos de 44, 26, 15, 10, 2,6 y 1,6 Mdal. S.lactis AB001 que contiene pCI750 de 43,6 Mdal y pCI726 de 26 Mdal. S.lactis AB003 que contiene pl´asmido de 83 Mdal. S.lactis AB002 que contiene pl´asmido de 77 Mdal.

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Figura 2. Gel de agarosa (0,7%) que muestra los perfiles de los pl´asmidos del S.lactis UC811 y los transconjugantes insensibles a los fagos Lac+ elegidos. 4

ES 2 059 376 T3 Banda 1. Banda 2. Banda 3. 5

Banda 4. Bandas 5 a 7. 10

Pesos moleculares est´andar del E.coli V517. Receptor de S.lactis MG1363 Sm libre de pl´ asmidos. Donante de S.lactis UC811 que contiene pl´ asmidos de 42, 27, 24,5, 15, 12,5, 6,5, 5,0, 3,6, 2,0, 1,5 y 1,4 Mdal. Transconjugantes AC001 que contienen pCI829 de 27 Mdal y pCI842 de 42 Mdal. Transconjugantes elegidos que contienen pl´asmidos de la cepa UC811.

Figura 3. Construcci´ on de una cepa de S.lactis que contiene dos pl´ asmidos insensibles a los fagos, los pCI829 y pCI751. 15

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Banda 1. Banda 2. Banda 3. Banda 4.

Pesos moleculares est´andar del E.coli V517. olo el pCI751 y se usa como reLac− que alberga s´ ceptor. Cepa AB012 donante que alberga el pCI829. S.lactis AC003 que contiene los pl´asmidos pCI751 y pCI829.

Figura 4. Mapas de restricci´ on de los pl´ asmidos pCI750 y pCI829 insensibles a los fagos. 25

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Figura 5. Vector de transporte del pl´ asmido pAM401 usado para la clonaci´on de fragmentos del pCI829. (Tomado de Wirth y otros, ver referencia 18). Figura 6. Gel de agarosa que muestra el pl´ asmido ordenado por la EcoR1 y los pl´ asmidos recombinantes que siguen a la clonaci´ on en el pAM401. Bandas 1, 3, 4 y 5.

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Banda 7.

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Banda 8. Banda 9.

Figura 7. Gel de agarosa (0,7%) que muestra los perfiles de los pl´asmidos del S.cremoris UC503 y derivados curados de pl´ asmidos seleccionados. Bandas 1 a 3.

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Banda 4.

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Pl´ asmidos recombinantes ordenados por EcoR1 que muestran el pAM401 linearizado (10,4 kb) y fragmentos de pCI829 de 2,5, 2,1, 1,7 y 0,7 kb. Ordenaci´ on EcoR1 del pCI829 mostrando fragmentos de 21, 12, 2,5, 2,1, 1,7, 0,8, 0,7 y 0,4 kb. El pCI829 sin ordenar. Ordenaci´ on est´andar del EcoR1/HindIII lambda.

Derivados sensibles a los fagos del S.cremoris UC503 curado procedente del pl´ asmido pCI528 de 28 Mdal. La cepa UC563 se muestra en la banda 2. S.cremoris UC503 que contiene los pl´asmidos insensibles a los fagos de 46, 33, 28, 17, 4,0 y 2,1 Mdal.

Figura 8. Gel de agarosa (0,7%) que muestra la construcci´ on de una cepa de S.lactis que contiene el pl´ asmido pCI528 insensible a los fagos del S.cremoris UC503. Banda 1. Banda 2.

S.cremoris UC503. S.cremoris UC563 curado a partir del PCI528.

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ES 2 059 376 T3 Banda 3. Banda 4. 5

Banda Banda Banda Banda Banda Banda

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5. 6. 7. 8. 9. 10.

S.cremoris UC504 que contiene pAMβ1. S.lactis UC504, es decir un transformante de S. lactis que contiene pCI528, pAMβ1 y dos pl´ asmidos cr´ıpticos de la cepa UC503. S.cremoris UC504 curado a partir del PAMβ1. S.lactis 505 curado a partir del pLP712. S.lactis 505 que contiene pLP712 y pLP829. S.lactis MG1299 que contiene pLP712. Pesos moleculares est´andar de E. coli V517. S.lactis MG3020 que contiene pAMβ1.

Pl´ asmido Un pl´ asmido es una mol´ecula de DNA extracromos´omica capaz de replicaci´on aut´ onoma. Distintos pl´ asmidos

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El pCI750 es un pl´asmido de 43,6 Mdal (66kb) identificado originalmente en el S.cremoris UC653. Este pl´ asmido puede transferirse conjugativamente al grupo de receptores de estreptococos N donde confiere insensibilidad frente a la infecci´on bacteriof´agica. La cepa S.lactis AB001 que contiene este pl´asmido ha sido depositada en la Colecci´ on nacional de bacterias industriales (National Collection of Industrial Bacteria) (NCBI), Aberdeen, Escocia, con el n´ umero de acceso 12261 el 16 de mayo de 1986. El pCI777 es un pl´asmido de 77 Mdal generado siguiendo in vivo la clonaci´ on de genes que se utilizan en la lactosa en el pl´asmido de insensibilidad frente a los fagos despu´es de un experimento de conjugaci´ on entre el S.cremoris UC653 y el S.lactis MG1363Sm. Codifica insensibilidad frente a los fagos, utilizaci´ on de lactosa y una capacidad conjugativa de alta frecuencia. La cepa S.lactis AB002 que contiene este pl´ asmido ha sido depositada en la NCIB el 16 de mayo de 1986 con el n´ umero de acceso 12262. Es representativa de los pl´asmidos pCI751 y pCI783.

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El pCI751 es un pl´asmido de 51 Mdal generado siguiendo in vivo la clonaci´ on de genes que se utilizan en la lactosa en el pl´asmido de insensibilidad frente a los fagos despu´es de un experimento de conjugaci´ on entre el S.lactis AB001 y el S.lactis LM0230Sp. Codifica insensibilidad frente a los fagos, utilizaci´ on de lactosa y una capacidad conjugativa de alta frecuencia.

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El pCI783 es un pl´asmido de 83 Mdal generado siguiendo in vivo la clonaci´ on de genes que se utilizan en la lactosa en el pl´asmido de insensibilidad frente a los fagos despu´es de un experimento de conjugaci´ on entre el S.cremoris UC653 y el S.lactis MG1363Sm. Codifica insensibilidad frente a los fagos y utilizaci´ on de lactosa.

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El pCI829 es un pl´asmido de 27 Mdal (44kb) identificado originalmente en el S.lactis UC653. Este pl´ asmido puede transferirse conjugativamente al grupo de receptores de estreptococos N donde confiere insensibilidad a la infecci´on bacteriof´agica. La cepa S.lactis AC001 que contiene este pl´asmido ha sido depositada en la NCIB con el n´ umero de acceso 12263 el 16 de mayo de 1986.

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El pCI528 es un pl´asmido de 28 Mdal (43kb) identificado originalmente en el S.cremoris UC503. Este pl´ asmido puede transferirse conjugativamente al grupo de receptores de estreptococos N donde confiere insensibilidad a la infecci´on bacteriof´agica. La cepa S.lactis UC505 que contiene este pl´asmido ha sido depositada en la NCIB con el n´ umero de acceso 12478 el 18 de mayo de 1987. Grupo de estreptococos N

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Este grupo de bacterias incluye tres especies del genero Streptococcus: S.lactis, S.cremoris y S.lactis subespecie Diacetylactis. Estas bacterias pueden tambi´en denominarse estreptococos l´acticos mesof´ılicos. S.cremoris UC653

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El S.cremoris UC653 es una cepa aislada originalmente de un cultivo iniciador de una mezcla de cepas. Esta cepa ha sido utilizada como componente de un iniciador de cepa definido utilizado en la fabricaci´on de quesos de Cheddar, y est´ a depositada en la Colecci´ on de cultivos en existencia, Departamento de 6

ES 2 059 376 T3 microbiolog´ıa alimentaria y l´ actea, Colegio Universitario, Cork. Tambi´en ha sido depositado en la NCIB el 20 de mayo de 1986 con el n´ umero de acceso 12265. S.cremoris UC503 5

El S.cremoris UC503 es una cepa aislada originalmente de un cultivo iniciador de una mezcla de cepas utilizado en la fabricaci´ on de quesos de Cheddar. Fue depositada en la NCIB el 18 de mayo de 1987 con el n´ umero de acceso 12477. Esta cepa se llamaba anteriormente S.cremoris F. 10

S.cremoris UC563

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El S.cremoris UC563 es un derivado del S.cremoris UC503 curado a partir del pl´ asmido de insensibilidad frente a los fagos 28 Mdal siguiendo el tratamiento acriflavin (28 µg/ml). Esta cepa es significativamente m´as sensible a los fagos UC503 y tambi´en sensible a los fagos c2 y UC811 que son incapaces de formar placas sobre el S.cremoris UC503. S.lactis UC811 (antes BA2)

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El S.lactis UC811 es una “cepa de laboratorio” cl´ asica y est´a depositada en la Colecci´on de cultivos en existencia, Departamento de microbiolog´ıa alimentaria y l´actea, Colegio Universitario, Cork. Tambi´en ha sido depositada en la NCIB el 20 de mayo de 1986 con el n´ umero de acceso 12266. Esta cepa se denominaba antes S.lactis BA2. S.lactis MG1363 Sm

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El S.lactis MG1363 Sm es un derivado libre de pl´ asmidos del S.lactis 712 obtenido del M. Gasson, Food Research Institute, Reading, U.K. (Instituto de investigaci´ on alimentaria M.Gasson, Reading, G.B.), que se ha hecho resistente a la estreptomicina en el laboratorio de estos inventores. Esta cepa se utiliz´ o como receptora en experimentos de conjugaci´ on. 30

S.lactis MG1229

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asmidos nativos El S.lactis MG1229 es un derivado del S.lactis 712 curado a partir de todos sus pl´ excepto el pLP712, un pl´ asmido Lac/Prt. Esta cepa se obtuvo de M. Gasson, Food Research Institute, Reading, U.K. (Instituto de investigaci´ on alimentaria M.Gasson, Reading, G.B.), y se utiliz´o como receptora en experimentos de conjugaci´ on. S.lactis MG3020

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asmido de amplio rango El S.lactis MG3020 es un derivado del S.lactis MG1363Sm que contiene el pl´ como hu´esped pAMβ1 (17 Mdal). Adem´ as de la resistencia a la eritromicina (Em) codificada en el pAMβ1, esta cepa es resistente a la estreptomicina y se obtuvo de M. Gasson, Food Research Institute, Reading, U.K. (Instituto de investigaci´on alimentaria M.Gasson, Reading, G.B.). Esta cepa se utiliz´o como donante de pAMβ1 en experimentos de conjugaci´on.

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S.lactis LM0230 Sp

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El S.lactis LM0230 Sp es un derivado sensible a los bacteri´ofagos y libre de pl´ asmidos del S.lactis C2 obtenido de L.L. McKay, Universidad de Minnesota, St. Paul, Minnesota, EE.UU. Esta cepa se us´ o como receptora en experimentos de conjugaci´ on. S.lactis LM2305

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El S.lactis LM2305 es un derivado del S.lactis C2, sensible a los bacteri´ofagos y libre de pl´ asmidos, obtenido de L.L. McKay, Universidad de Minnesota, St. Paul, Minnesota, EE.UU. Esta cepa se us´ o como receptora en experimentos de conjugaci´ on. S.lactis MMS366

60

ofagos, resistente El S.lactis MMS366 es Lac− , recombinaci´on deficiente (Rec− ), sensible a los bacteri´ a la rifampicina y aislado del S.lactis ML3, que contiene pl´ asmidos de 31, 9, 5, 6, 1,98 y 1,0 Mdal, obtenido de L.L. McKay, Universidad de Minnesota, St. Paul, Minnesota, EE.UU. Esta cepa se us´ o como 7

ES 2 059 376 T3 receptora en experimentos de conjugaci´ on. S.lactis LM3301 5

El S.lactis LM3301 es un derivado del S.lactis ML3, Lac− y sensible a los bacteri´ofagos, que contiene pl´ asmidos de 31, 9, 5,6, 1,98 y 1,0 Mdal, obtenido de L.L. McKay, Universidad de Minnesota, St. Paul, Minnesota, EE.UU. S.lactis SK3 Lac− TcR

10

15

20

El S.lactis SK3 Lac− TcR es un derivado del S.lactis K3, negativo a la lactosa y resistente a la teon traciclina. La cepa se hiz´o Lac− siguiendo un subcultivo a 37◦ C, y TcR despu´es de la introducci´ conjugativa del transpos´ on Tn919 en el laboratorio de estos inventores. El S.lactis SK3 Lac− TcR se us´o como receptor en experimentos de conjugaci´on. S.lactis subespecie diacetylactis 18-16 Lac− TcR El S.lactis subespecie diacetylactis 18-16 Lac− TcR es un derivado Lac− TcR del S.lactis subespecie diacetylactis 18-16 construido de manera id´entica a la descrita antes para el S.lactis SK3 Lac− TcR . El S.lactis subespecie diacetylactis 18-16 Lac− TcR se us´o como receptor en experimentos de conjugaci´on. S.lactis subespecie diacetylactis 18-16 Lac− S

25

El S.lactis subespecie diacetylactis 18-16 Lac− S es un derivado Lac− resistente a la estreptomicina del S.lactis subespecie diacetylactis 18-16 y se us´ o como receptor en experimentos de conjugaci´on. S.cremoris UC411 Lac− FusR

30

El S.cremoris UC411 Lac− FusR es un derivado Lac− (hecho con un subcultivo a 37◦C) del S.cremoris UC411, resistente al a´cido fus´ıdico (FusR ). Esta cepa se hizo resistente al Fus formando placas con 109 c´elulas en placas que conten´ıan 25 µg/ml de Fus y seleccionando mutantes resistentes espont´ aneos. Transformante

35

Los transformantes se definen como c´elulas que se originan de la introducci´ on de DNA puro (DNA de pl´ asmido en el caso de este estudio) en receptores protopl´asticos. S.lactis UC504

40

El S.lactis UC504 es un transformante que se origina del tratamiento de protoplastos de S.lactis MG1363 Sm con el DNA total de pl´ asmido del S.cremoris UC503 (pAMβ1). El S. lactis UC504 contiene PCI528 (28 Mdal), pAMβ1 (17 Mdal) y dos pl´ asmidos cr´ıpticos de 18,0 y 2,1 Mdal del S.cremoris UC503. Transconjugante

45

Los transconjugantes se definen como c´elulas que surgen de la transferencia conjugativa del DNA de un donante a una bacteria receptora. S.lactis AB001 50

55

Se trata de un transconjugante que se origina de un experimento de conjugaci´ on entre el S.cremoris UC653 donante y el S.lactis MG1363Sm receptor. El S. lactis AB001 contiene pl´asmidos de 26 Mdal (pCI726 que codifica capacidad para utilizar lactosa) y de 43.6 Mdal (pCI750 que codifica insensibilidad frente a los bacteri´ofagos). Ha sido depositado en la NCIB con el n´ umero de acceso 12261 el 16 de mayo de 1986. S.lactis AB002

60

Es un transconjugante que se origina de un experimento de conjugaci´ on entre el S.cremoris UC653 donante y el S.lactis MG1363Sm receptor. El S.lactis AB002 contiene un u ´ nico pl´ asmido de 77 Mdal (pCI777 que codifica capacidad para utilizar lactosa e insensibilidad frente a los bacteri´ ofagos). Esta cepa demuestra una capacidad conjugativa de alta frecuencia. Ha sido depositado en la NCIB con el n´ umero 8

ES 2 059 376 T3 de acceso 12262 el 16 de mayo de 1986. S.lactis AB003 5

Es un transconjugante que se origina de un experimento de conjugaci´ on entre el S.cremoris UC653 donante y el S.lactis MG1363Sm receptor. El S.lactis AB003 contiene un u ´ nico pl´ asmido de 83 Mdal (pCI783 que codifica capacidad para utilizar lactosa e insensibilidad frente a los bacteri´ ofagos). S.lactis AC001

10

Es un transconjugante que se origina de un experimento de conjugaci´ on entre el S.lactis UC811 donante y el S.lactis MG1363Sm receptor. Contiene pl´ asmidos de 27 Mdal (pCI829 que codifica insensibilidad frente a los bacteri´ofagos) y de 42 Mdal (pCI842 que codifica utilizaci´ on de lactosa). Esta cepa ha sido depositada en la NCIB con el n´ umero de acceso 12263 el 16 de mayo de 1986. 15

S.lactis AC003

20

Es un transconjugante que se origina de un experimento de conjugaci´ on entre el S.lactis AB012 donante y el S.lactis AC001 receptor. Contiene pl´ asmidos de 51 Mdal (pCI751 que codifica utilizaci´ on de lactosa e insensibilidad frente a los bacteri´ofagos) y de 27 Mdal (pCI829 que codifica insensibilidad frente a los fagos). S.lactis MM20

25

Es un transconjugante que se origina de un experimento de conjugaci´ on entre el S.cremoris UC653 donante y el S.lactis MMS366 receptor. Contiene pl´ asmidos de 26 Mdal (pCI726 que codifica genes de utilizaci´on de lactosa) y de 27 Mdal (pCI750 que codifica insensibilidad frente a los bacteriofagos). S.lactis MM21

30

Es un transconjugante que se origina de un experimento de conjugaci´ on entre el S.cremoris UC653 donante y el S.lactis MMS366 receptor. El S.lactis MM21 contiene un u ´nico pl´ asmido de 60 Mdal (pCI760 que codifica capacidad para utilizar lactosa e insensibilidad frente a los bacteri´ ofagos). 35

S.lactis UC505 Es un transconjugante que se origina de un experimento de conjugaci´ on entre el S.lactis UC504 donante y el S.lactis MG1299 receptor. Contiene pl´ asmidos pCI528 (28 Mdal) y pLP712 833 Mdal). Ha sido depositado en la NCIB con el n´ umero de acceso 12478 el 18 de mayo de 1987.

40

E.coli LE392 (pAM401)

45

Esta cepa se us´o como fuente del vector de clonaci´on pAM401. Este pl´ asmido, obtenido originalmente de D. Clewell, Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI, EE.UU., fue introducido en el E.coli LE392 en el laboratorio de estos inventores. Bacteri´ ofagos (fagos) Los bacteri´ofagos son virus capaces de infectar bacterias.

50

Los fagos 712, SK1, StL5, Eb1 y c2 son capaces de infectar el S.lactis MG1363 Sm. El fago c2 es un fago de cabeza alargada (29), mientras que el fago 712, como se acepta generalmente en la t´ecnica, es un peque˜ no fago de cabeza isom´etrica y asi se mostr´o en un examen morfol´ ogico realizado en el laboratorio de estos inventores. 55

Los fagos 18-16 y drc3 son capaces de infectar el S.lactis subespecie diacetylactis 18-16S.

60

Los fagos uc503 infectan el S.cremoris UC503, mientras que los fagos uc503, c2 y UC811 infectan los mutantes curados a partir del pl´ asmido de 28 Mdal. Los fagos sk3 y uc411 son capaces de infectar hu´espedes S.lactis SK3 Lac− TcR y S.cremoris UC411 Lac− FusR , respectivamente.

9

ES 2 059 376 T3 Cepas bacterianas, bacteri´ ofagos y medios

5

Las cepas bacterianas se hicieron crecer rutinariamente en el medio M17 de Terzaghi y Sandine (8) en el que la glucosa sustituy´ o a la lactosa cuando fue necesario (GM17). El medio s´ olido conten´ıa el 1,5% de agar (Oxoid n´ umero 3). Al medio selectivo se a˜ nadieron los antibi´ oticos (Sygma, G.B) estreptomicina (Sm) y espectinomicina (Sp) en cantidades de 600 µg/ml y 150 µg/ml respectivamente. El m´etodo utilizado para generar mutantes de estreptococos l´acticos espont´aneos insensibles a los antibi´oticos habia sido previamente dado a conocer por Hill y otros (9).

10

Experimentos de conjugaci´ on

15

Los acoplamientos superficiales de agar se realizaron como describe McKay y otros (10). Para seleccionar la transferencia Lac se utiliz´o el agar indicador de lactosa (LIA) de McKay y otros (11) que contiene el antibi´ otico apropiado. La sensibilidad frente a los fagos de los transconjugantes Lac+ se determin´o usando el m´etodo de ensayo de mancha. Brevemente, este ensayo consiste en incorporar 0,1 ml de los cultivos de ensayo completamente desarrollados en una capa de agar blando (0,7%) M17 que se vierte en una placa de agar duro (1,5%) M17. Despu´es de la solidificaci´on, se esparcieron sobre la capa 10 µl de on durante la la suspensi´on de fagos apropiada (108 pfu/ml). Los resultados se leyeron tras una incubaci´ noche a 30◦C.

20

Frecuencia de transferencia

25

La frecuencia de transferencia de un marcador espec´ıfico (es decir, utilizaci´on de lactosa o insensibilidad frente a los fagos) se refiere al n´ umero de transconjugantes obtenido dividido por el n´ umero de receptores y se describe como la frecuencia por receptor. Transformaci´ on

30

Los protoplastos del S.lactis MG1363Sm se hicieron, transformaron y regeneraron como describen Gasson y Anderson (12). El DNA de transformaci´ on fue un DNA total de pl´ asmido del S.cremoris UC503 (pAMβ1) y los transformantes se eligieron tomando como base la resistencia de Em. Ensayo de sensibilidad frente a los fagos

35

La sensibilidad de las cepas espec´ıficas frente a los fagos, se determin´o usando un “ensayo de mancha” en el cual se incorporaron 0,1 ml de un cultivo totalmente desarrollado a una capa de agar blando (0,7%) M17, que se verti´o en una placa de agar duro (1,5%) M17. Despu´es de la solidificaci´on, se esparcieron on sobre la capa 10 µl de una suspensi´ on de fagos (108 pfu/ml). Los resultados se leyeron tras una incubaci´ ◦ durante la noche a 30 C.

40

Determinaci´ on del efecto de la temperatura sobre el mecanismo de insensibilidad frente a los fagos

45

El efecto de la temperatura elevada (hasta 40◦C) sobre el mecanismo de la insensibilidad frente a los fagos se determin´ o ensayando los fagos (precalentados a la temperatura apropiada) en el cultivo (precalentado) e incubando las muestras a la temperatura deseada. Pruebas de actividad de la leche

50

Para determinar la efectividad de los mecanismos de insensibilidad frente a los fagos, se utiliz´ o el ensayo de actividad descrito por Heap y Lawrence (4) en pruebas de laboratorio simuladas de fabricaci´ on de queso. Adsorci´ on de bacteri´ ofagos

55

60

on de Se a˜ nadieron 0,6 ml de la suspensi´ on de fagos (105 pfu/ml) a un tubo de microcentrifugaci´ 1,5 ml que conten´ıa 0,2 ml de CaCl2 (0,185 M) y 0,6 ml del cultivo de prueba totalmente desarrollado resuspendido en M17 (pH 7,5). El tubo se agit´ o vigorosamente durante 10 s y se incub´o a 30◦C durante 14 min para dejar que se produjera la adsorci´on. Tras el enfriamiento en hielo para detener la reacci´ on, el tubo se centrifug´ o en un microcentrifugador (Eppendorf) durante 10 min para transformar las c´elulas en bolas y adsorber los fagos. Se sac´o una muestra del sobrenadante y se midi´ o en cuanto a los fagos usando como indicador un hu´esped sensible. El porcentaje de fagos adsorbido se determin´ o como 100 x [(cant. de control - cant. residual)/cant. de control]. 10

ES 2 059 376 T3

Aislamiento y an´ alisis del DNA de pl´ asmido

5

10

Para aislar el DNA del pl´ asmido de los estreptococos y E.coli V517, se us´o el m´etodo de Anderson y McKay (14). Los perfiles del pl´ asmido se analizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 0,7% (Sigma, G.B.) usando un aparato vertical de gel. La electroforesis se realiz´o en una soluci´ on tamp´ on TAE odico, pH 7,8). Los geles se ti˜ neron en una soluci´ on (40 mM Tris, 10 mM Na2 EDTA, 12 mM acetato s´ de bromuro de etidio (5 µg/ml) y el DNA se visualiz´ o con luz UV de onda corta. Mapas de restricci´ on, an´ alisis de hibridaci´ on y clonaci´ on molecular Las ordenaciones con endonucleasas de restricci´on se realizaron como describen Maniatis y otros (15). Los mapas de restricci´on del pCI750 y pCI829 se prepararon como describen Coveney y otros (16).

15

Las t´ecnicas de mancha e hibridaci´ on de Southern han sido descritas por Southern y Covenney y otros (16). Los fragmentos de EcoRI del pCI829 fueron sometidos a clonaci´ on r´ apida usando el vector pAM401 y utilizando las metodolog´ıas de clonaci´ on descritas por Maniatis y otros (15). los clones que contienen pl´ asmidos recombinantes se identificaron por cribado al azar del contenido de pl´asmidos de los transformantes.

20

Resultados Transferencia conjugativa de la utilizaci´ on de lactosa y de la insensibilidad frente a los fagos desde los S.cremoris y S.lactis 25

Los marcadores asociados con la utilizaci´on de lactosa y la insensibilidad frente a los fagos se transfirieron desde el S.cremoris UC653 y el S.lactis UC811 donantes, a un receptor S.lactis MG1363 Sm en acoplamientos de superficie en agar (10). Las frecuencias de transferencia se muestran en la tabla 1. 30

Los transconjugantes de estos acoplamientos se designaron AB001, AB002 y AB003 o AC001, dependiendo de si derivan de los donantes de la cepa UC653 o UC811 respectivamente. Todos estos transconjugantes eran totalmente resistentes a los fagos 712 y dejaron que los fagos c2 formaran placas de un tama˜ no reducido. Ambos fagos son l´ıticos para la cepa MG1363.

35

An´ alisis del perfil de pl´ asmido de transconjugantes derivados de donantes S.cremoris UC653 y S.lactis UC811

40

Los tres transconjugantes Lac+ insensibles a los fagos 712 aislados del acoplamiento de UC653 x MG1363 se sometieron a l´ısis por el m´etodo de Anderson y McKay (14) y se analizaron sus perfiles de pl´ asmido. El S.lactis AB001 conten´ıa los pl´ asmidos de 43,6 Mdal (pCI750) y de 26 Mdal (pCI726), mientras que el S.lactis AB002 y el S.lactis AB003 conten´ıan los pl´asmidos de 77 Mdal (pCI777) y de 83 Mdal (pCI783) respectivamente (figura 1). El transconjugante S.lactis AC001 (tambi´en Lac+ e insensible a los fagos 712) conten´ıa un pl´ asmido de 27 Mdal (pCI829) y otro de 42 Mdal (pCI842) (figura 2).

45

50

Se completaron otros experimentos de acoplamiento entre los donantes AB001 y AC001 y un receptor S.lactis LM0230 Sp (tabla 1). Los transconjugantes mostraron los mismos patrones de resistencia que los AB001 y AC001, es decir, insensibilidad parcial frente a los fagos c2 e insensibilidad total frente a los fagos 712. Un transconjugante representativo fenot´ıpico derivado del acoplamiento AB001 x LM0230 se design´ o S.lactis AB012 y conten´ıa un pl´ asmido recombinante insensible a los fagos y a la lactosa de 51 Mdal (pC1751). An´ alisis de las capacidades conjugativas de los pl´ asmidos en cuanto a la insensibilidad frente a los fagos y a la utilizaci´ on de lactosa

55

Otros experimentos de acoplamiento comparando la capacidad del AB001 y AB002 para actuar como donantes mostraron que el AB002 pod´ıa transferir Lac (e insensibilidad frente a los fagos) a frecuencias aproximadamente cuatro ciclos logar´ıtmicos mayores que el AB001 (tabla 2). Esto indicaba que el pCI777 que est´a presente en el S.lactis AB002 contiene genes que confieren una capacidad para transferir a frecuencia alta.

60

El pl´asmido pCI750 presente en el S.lactis AB001 se elimin´o usando tratamientos de curado de pl´ asmidos. Las sustancias aisladas sin esta mol´ecula volvieron a ser sensibles a los fagos 712. Sin em11

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5

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25

bargo, estas sustancias aisladas conten´ıan todav´ıa pCI726 y pemanec´ıan Lac+ confirmando que el pCI750 codificaba genes de utilizaci´on de lactosa mientras que el pCI750 codificaba insensibilidad frente a los fagos. Adem´as, los intentos repetidos para transferir el pCI726 al S.lactis LM2306 en experimentos de conjugaci´ on no tuvieron exito, lo que indicaba que el pCI750 conten´ıa genes que confer´ıan capacidad de conjugaci´ on junto con insensibilidad frente a los fagos. Un experimento de conjugaci´ on entre el S.cremoris UC653 como donante y el S.lactis MMS336 como receptor (que es deficiente a la recombinaci´on) produjo tambi´en transconjugantes Lac+ insensibles a los fagos 712 (tabla 2). Sin embargo, estos eran de dos tipos, (a) S.lactis MM20 que conten´ıa dos pl´ asmidos de 43,6 Mdal (pCI750) y de 26 Mdal (pCI726) y (b) S.lactis MM21 que conten´ıa un u ´ nico pl´ asmido de 60 Mdal. Este u ´ ltimo resultado muestra que la recombinaci´ on entre los pCI750 y pCI726 puede todav´ıa on es independiente del Rec. producirse en una cepa Rec− , lo que sugiere que la recombinaci´ Introducci´ on del mecanismo de insensibilidad frente a los fagos codificado en el pCI750, a una cepa que contiene pCI829, es decir, construcci´ on de una cepa que contiene pl´ asmidos insensibles a los fagos La insensibilidad frente a los fagos codificada en el pCI750 se introdujo en el pCI751 (derivado del pCI750 y que contiene genes lac) en un derivado del S.lactis AC001 Lac− (que todav´ıa contiene pCI829) en experimentos de conjugaci´on que generan el transconjugante AC003 (figura 3). El efecto de la presencia de ambos mecanismos en una sola cepa fue conferir una insensibilidad total frente a los fagos c2 (que fueron capaces de formar placas en cepas que conten´ıan uno solo de los pCI750 o pCI829) adem´as de continuar la insensibilidad frente a los fagos 712. Este efecto se muestra en la tabla 9, en la que las sustancias aisladas que contienen solo pCI750 o pCI829 permitieron a los fagos c2 formar placas de 1,5 mm de di´ ametro (que son significativamente menores que las formadas en la cepa MG1363 Sm que est´a libre de pl´ asmidos). Sin embargo toda la capacidad de formar placas se elimina en el caso del transconjugante AC003, que contiene el mecanismo de insensibilidad frente a los fagos codificado en ambos pl´asmidos. Extensi´ on y efectividad de la insensibilidad frente a losfagos conferida por los pCI750 y pCI829

30

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60

Se examin´o el efecto de la insensibilidad frente a los fagos de los pl´asmidos pCI750 y pCI829 sobre un amplio campo de fagos (tabla 3). El pl´ asmido pCI750 presente en el S.lactis AB001 fue capaz de conferir insensibilidad total a los fagos sk1 de modo id´entico a la insensibilidad conferida frente a los fagos 712. Adem´as, las placas desarrolladas por todos los fagos que eran capaces de formar placas en cualquiera de los hu´espedes que conten´ıan pCI750 y pCi829 o los mecanismos codificados por los pCI750 y pCI829 juntos, eran de un tama˜ no reducido muy significativamente con relaci´ on al tama˜ no de las formadas sobre el S.lactis MG1363 Sm (que no contiene pl´ asmidos). En todos los casos, la reducci´on del tama˜ no de las placas fue mayor que el 50%. Adem´as, el t´ıtulo de virulencia de los fagos para los hu´espedes AB001, AC001 y AC003 (con la u ´ nica excepci´on del fago ml3 que hizo placas sobre el AC001) se redujo entre 0,5 y 7 ciclos logar´ıtmicos en relaci´on con los del S.lactis MG1363 Sm, lo que sugiere que en estos pl´ asmidos se codific´o un segundo mecanismo de insensibilidad (es decir, adem´ as del mecanismo resultante en la eliminaci´on o reducci´on del tama˜ no de las placas, tabla 3). El proceso de fabricaci´ on de queso de Cheddar incluye una operaci´ on de elaboraci´ on en la que la temperatura aumenta desde 30◦ C hasta 37◦C o m´as. Los datos de la tabla 3 indican que las temperaturas de 37◦ C a 40◦ C no tienen un efecto adverso sobre la capacidad del pCI750 o del pCI829 para inhibir la replicaci´ on de fagos. Esto significa que ambos pl´ asmidos son adecuados para su inclusi´ on en cepas usadas en la fabricaci´ on industrial del queso de Cheddar. El examen morfol´ogico de algunos de los fagos descritos en la tabla 3, muestra que el fago 712 es un miembro del grupo de fagos que se presenta comunmente como de cabeza isom´etrica. Sin embargo, los fagos c2 y ml3 tienen ambos cabeza alargada (29) y son miembros de un grupo de fagos de cabeza alargada extremadamente virulento. Esto puede explicar porque estos fagos pueden superar el efecto protector de un solo pl´ asmido insensible a los fagos. En cualquier caso, es significativo que la presencia de dos pl´ asmidos puede conferir el alto grado de insensibilidad frente a los fagos observado en este estudio. Transferencia de los pl´ asmidoscon insensibilidad frente a los fagos a cepas seleccionadas de S.lactis, S.cremoris y S.lactis subespecie diacetylactis Los transconjugantes AB002 (que contienen el pl´asmido recombinante pCi829 insensible a los fagos y a la Lac) y AC003 (que contiene el pl´ asmido pCI829 insensible a los fagos y el pl´asmido recombinante pCI751 insensible a los fagos y a la Lac) se usaron como donantes en una serie de experimentos de conjugaci´ on con receptores seleccionados (tabla 4). En todos los casos los receptores eran Lac− (aislados siguiendo tratamientos de curado a 37◦C) y conten´ıan el transposon TN919 resistente a la tetraciclina (en el caso de cepas SK3 y 18-16) o eran mutantes resistentes al a´cido fus´ıdico (Fus) (en el caso de la 12

ES 2 059 376 T3

5

cepa UC411) para facilitar la selecci´on de los transconjugantes. Tambi´en en todos los casos, la transferencia del marcador de Lac se detect´ o a una alta frecuencia razonable y una elevada proporci´ on de estos ologos de la cepa receptora original (tabla transconjugantes Lac+ eran tambi´en insensibles a los fagos hom´ 4). Estos datos muestran que la caracter´ıstica de insensibilidad frente a los fagos puede transferirse por conjugaci´ on a un campo de tipos receptores. Pruebas de actividad de la leche

10

15

Los genes de utilizaci´on de lactosa del pCI726 y el mecanismo de insensibilidad frente a los fagos del pCI750 se introdujeron en el S.lactis subespecie diacetylactis 18-16 S en experimentos de conjugaci´ on procedentes del donante S.cremoris UC653 (frecuencia de transferencia de Lac igual a 1,6 x 10−6 por receptor, de los cuales el 23% eran totalmente insensibles a los fagos 18-16 y drc3 que son altamente l´ıticos para la cepa bruta 18-16). Los transconjugantes insensibles a los fagos elegidos e sometieron a pruebas de actividad de la leche, con objeto de definir la eficiencia del mecanismo de insensibilidad frente a los fagos en esta cepa cuando el cultivo se somet´ıa a ciclos de crecimiento repetidos en leche a 30◦ C y 37◦C en presencia de ambos fagos. Bajo estas condiciones simuladas de fabricaci´on de quesos, la presencia de los fagos 18-16 y drc3 no tuvo efecto sobre la capacidad de los transconjugantes 18-16 insensibles a los fagos para producir niveles normales de a´cido. Este resultado indica que el mecanismo de insensibilidad frente a los fagos del pCI750 tendr´ a una aplicaci´ on pr´ actica en el proceso industrial.

20

Naturaleza del mecanismo de insensibilidad frente a los fagos asociado con los pCI750 y pCI829

25

30

Las pruebas de adsorci´ on han mostrado que la presencia del pCI750 o del pCI829 en un S.lactis MG1363 no influye sobre la capacidad de los fagos para ser adsorbidos. Adem´ as, se han realizado estudios preliminares en el caso del pCI750 para demostrar su efecto en la capacidad de inducci´ on de profagos. La introducci´ on del pCI750 en un hu´esped lisog´enico redujo la capacidad de inducci´ on de los profagos en relaci´on con un control que no conten´ıa el pl´ asmido insensible a los fagos, lo que suger´ıa que el mecanismo asociado interfiere con la replicaci´ on de DNA, la s´ıntesis de proteinas o incluso una fase posterior en el ciclo de infecci´on. Esto contrasta con el efecto del pTR2030 dado a conocer por el Laboratorio Klaenhammer, que no interfer´ıa con la capacidad de inducci´on de profagos, por lo que se propuso como forma de acci´ on del pl´ asmido un efecto a nivel de la superficie de la c´elula, de la membrana de la misma o alguna fase temprana del ciclo l´ıtico (6). Mapas de restricci´ on de los pl´ asmidos pCI750 y pCI829 insensibles a los fagos

35

Se realiz´ o un an´ alisis de los pl´ asmidos pCI750 y pCI829 usando una variedad de enzimas de restricci´on. Los datos de restricci´ on son los siguientes. An´ alisis de restricci´ on del pCI750 40

Enzima

N´ umero de fragmentos

Tama˜ no de los fragmentos (kb)

BamHI Bc1I

2 7

Bg1II BstEII EcoRV HindIII

muchos 2 6 11

35,6, 30,4 21,32, 13,77, 12,55, 9,75, 4,78, 2,13, 1,69 no determinado 56,74, 9,26 41,69, 11,1, 5,48, 5,26, 1,45, 1,08 23,22, 12,18, 6,70, 5,08, 4,13, 3,51, 3,28, 2,43, 2,03, 1,85, 1,60 20,97, 14,51, 10,26, 5,91, 3,35, 3,10, 2,25, 2,19, 1,70, 1,55 26,01, 20,44, 9,66, 6,54, 8,35 25,33, 20,06, 13,16, 7,51

45

50

55

HpaII

10

PvuII SalI

5 4

60

13

ES 2 059 376 T3 An´ alisis de restricci´ on del pCI829 Enzima

N´ umero de fragmentos

SacI StuI Bg1II PvuII C1aI EcoRV HaeIII HincII AvaI HpaII

1 2 3 3 4 6 4 6 5 8

EcoRI

8

5

10

15

20

25

30

Tama˜ no de los fragmentos (kb)

40,0 32,9, 6,9 20,8, 14,4, 4,0 22,9, 8,3, 5,1 21,2, 7,4, 6,1, 4,8 25,1, 5,9, 4,5, 3,1, 2,7, 2,1 25,1, 5,49, 5,0, 4,36 11,8, 5,6, 4,5, 3,8, 2,5, 1,7 16,3, 12,5, 9,1, 4,6, 3,2 12,6, 11,9, 10,8, 3,9, 2,4, 2,2, 1,2, 0,4 21,0, 12,1, 2,5, 2,1, 1,7, 0,84, 0,69, 0,41

Se observar´ a que pudo haber peque˜ nos fragmentos de DNA que no se detectaron en los geles. Se construyeron los mapas de restricci´ on preliminares de los pCI750 y pCI829 (figura 4). La forma y secuencia de los sitios de divisi´on en los mapas, es t´ıpico del pl´ asmido de que se trate y pueden usarse muy f´ acilmente para identificar las distintas mol´eculas. Un experimento de hibridaci´ on y mancha de Southern, usando el pCI750 como prueba en forma de biotina no mostr´ o homolog´ıa detectable entre el mismo y el pCI829, lo que sugiere que los dos pl´asmidos no comparten secuencias comunes significativas. Clonaci´ on de fragmentos de PCI829 en E.coli

35

40

45

La endonucleasa de restricci´on EcoR1 ordena el pl´ asmido pCI829 en 8 fragmentos de de 21,0, 12,1, 2,5, 2,1, 1,7, 0,84, 0,69 y o,41 kb. Utilizando t´ecnicas de clonaci´on molecular, el DNA del pCI829 ordenado por la EcoR1 fue sometido a clonaci´ on r´ apida en el vector pl´ asmido de transporte ordenado por la EcoR1, pAM401 (figura 5, referencia 18). Continuando el ligamiento en presencia de ligasa T4, el DNA se transform´o en E.coli DB11. Los transformantes se eligieron sobre la base de su resistencia a la tetraciclina, codificada en el pAM401. Los transformantes resistentes a la tetraciclina surgieron a una asmido de los transformantes elegidos frecuencia de 3 x 102 /µg DNA y se examinaron los perfiles de pl´ al azar. La ordenaci´ on de los pl´ asmidos recombinantes realizada por la EcoR1 mostr´o que hab´ıan sido clonados los fragmentos del pCI829 de 2,5, 2,1, 1,7, 0,84 y o,69 kb (figura 6). Los fragmentos clonados elegidos, pueden usarse para identificar cepas que contienen pCI829 (siguiendo los experimentos de control adecuados paraasegurar que los fragmentos no se hibridizan con ning´ un pl´ asmido residente en las citadas cepas). Identificaci´ on de un pl´ asmido insensible a los bacteri´ ofagos del S.cremoris UC503

50

55

La experiencia de este laboratorio ha mostrado que el S.cremoris UC503 ten´ıa un elevado nivel natural de insensibilidad frente a los fagos. Los mutantes que mostraban una insensibilidad incrementada frente a los fagos hom´ologos uc503 (es decir un aumento significativo del tama˜ no de las placas) se aislaron r´ apidamente, ya de forma espont´ anea o tras un tratamiento con acriflavina (20 µg/ml). El an´ alisis de los perfiles del pl´asmido de los mutantes representativos elegidos, mostr´o la p´erdida real de un pl´ asmido de 28 Mdal, el pCI528 (figura 7). Adem´ as, estos mutantes eran tambi´en sensibles a los fagos c2 y uc811, fagos incapaces de formar placas en el S.lactis UC503 que contiene el pCI528 (tabla 5). Introducci´ on del pl´ asmido pCI528 insensible a los fagos en el S.lactis MG1363

60

Usando la movilizaci´ on conjugativa descrita en lo que antecede para los pl´ asmidos pCI750 y pCI829, no fue posible transferir el pCI528 desde su hu´esped S.cremoris UC503 hasta un receptor S.lactis MG1363 Sm. La introducci´on del pl´ asmido promiscuo pAMβ1 como agente movilizador (desde un donante S.lactis 14

ES 2 059 376 T3

5

10

MG3020) tampoco di´ o resultado para resolver la transferencia del pCI528. Se aplic´ o el planteamiento alternativo de usar una transformaci´ on del protoplasto. Se aisl´ o el DNA total del pl´asmido del S.cremoris UC503 que conten´ıa pAMβ1 y se utiliz´o para transformar los protoplastos del S.lactis MG1363. Los transformantes se eligieron sobre la base de su resistencia a la eritromicina (Em) codificada por el pAMβ1 y se examinaron los perfiles de pl´asmido de 50 sustancias aisladas individuales. Una sola sustancia aislada, designada U504, conten´ıa un pl´ asmido de 28 Mdal (adem´ as del pAMβ1 y dos pl´ asmidos cr´ıpticos de la cepa UC503) (figura 8, banda 4). El pAMβ1 se elimin´o del UC504 siguiendo tratamientos de curado por calor. El pCI528 se libr´o de la presencia de los dos pl´ asmidos cr´ıpticos mediante su conjugaci´ on en el S.lactis MG1299 (es decir, S.lactis MG1363 con pLP712 un pl´ asmido Lac/Prt del S.lactis 712). El perfil de pl´ asmido de un transconjugante, designado UC505, que contiene los dos pl´ asmidos pCI528 y pCI712 se muestra en la figura 8 (banda 7). Comparaci´ on de los patrones de sensibilidad frente a los fagos de las cepas S.lactis UC505 y MG1363 Sm

15

El S.lactis MG1363 es sensible a los fagos 712, c2, ml3 y jj50 (tabla 6). Sin embargo, cuando estos fagos se titularon contra el UC505, ninguno de ellos form´ o placas, incluso teniendo en cuenta que los fagos tales como los ml3 hab´ıan mostrado previamente ser extremadamente virulentos. El aumento de la temperatura hasta 37◦C o 39◦C no produjo efecto sobre el mecanismo de insensibilidad o dicho efecto fue m´ınimo.

20

Examen de la adsorci´ on de los fagos 712, c2, ml3 y jj50 en la UC505

25

30

35

Las pruebas de adsorci´ on mostraron que los fagos 712, c2, ml3 y jj50 se adsorb´ıan en el S.lactis MG1363 con gran eficiencia (tabla 7). Sin embargo, las eficiencias de adsorci´ on de los mismos fagos en la UC505 estaban comprendidas entre el 35% y el 45%. Estos datos sugieren que el mecanismo de insensibilidad frente a los fagos asociado con el pCI829 es diferente de los mecanismos codificados en los pCI750 y pCI829 y tambi´en en el pTR2030 del grupo de Klaenhammer. Pruebas de actividad de la leche que comparan la capacidad de las cepas S.lactis MG1299 y UC505 para producir a ´cido en presencia de fagos hom´ ologos Las pruebas de actividad de la leche de Heap-Lawrence se realizaron para comparar la capacidad de las UC505 y MG1299 para producir a´cido en presencia de fagos virulentos. Los datos de la tabla 8 muestran que la UC505 fue capaz de sobrevivir 12 ciclos de la prueba en presencia de elevadas cantidades de fagos 712, c2, ml3 o jj50, o de una mezcla de los cuatro con ning´ un efecto sobre la capacidad de producir ´acido. Como contraste, la MG1299 fue incapaz de producir a´cido expuesta a cualquier combinaci´ on de fagos. Documentaci´ on citada

40

1. McKay, L.L., y K.A. Baldwin. 1984. El pl´ asmido conjugativo de 40 Mdal en Streptococcus lactissubespecie diacetylactis DRC3 est´a asociado con la resistencia a nisin y bacteri´ofagos. Appl. Environ. Microbiolog., 47: 68 a 74. 45

2. Klaenhammer, T.R. y R.B. Sanozky, 1985. Transferencia conjugativa desde el Stretococcus lactis ME2 de pl´ asmidos que codifican resistencia a los fagos, resistencia a nisin y capacidad de fermentaci´on de lactosa: evidencia de un pl´ asmido conjugativo de alta frecuencia responsable de infecci´on abortiva de bacteri´ofagos virulentos. J. Gen. Microbiol., 131: 1531 a 1541.

50

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55

60

4. Sing, W.D. y T.R. Klaenhammer, 1986. Transferencia conjugativa de determinantes de la resistencia a los bacteri´ofagos en el pTR2030 a las cepas de Streptococcus cremoris. Appl. Environ. Microbiol., 51: 1264 a 1271. 5. Jarvis, A.W. y T.R. Klaenhammer, 1986. Resistencia a los bacteri´ ofagos conferida a los estreptococos l´acticos por el pl´asmido conjugativo pTR2030: efectos en los fagos de cabeza peque˜ na isom´etrica, grande isom´etrica y alargada. Appl. Environ. Microbiol., 51: 1272 a 1277. 6. Jarvis, A.W. y T.R. Klaenhammer, 1987. El pl´ asmido resistente a los bacteri´ofagos pTR2030 15

ES 2 059 376 T3 inhibe la infecci´ on o los bacteri´ ofagos atemperados rlt pero no la inducci´ on de los profagos rlt en los Streptococcus cremoris. Appl. Environ. Microbiol., 53: 385 a 389.

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ES 2 059 376 T3

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10

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20

25

30

TABLA 1 Transferencia conjugativa de insensibilidad frente a los fagos y Lac. Transconjugantes Lac+ Donante

Receptor

Frecuencia por recept. y % insens. frente a fagos 712

S.cremoris UC653 S.lactis BA2 S.lactis AB001 S.lactis AC001

S.lactis S.lactis S.lactis S.lactis

3,3 x 10−7 70 (AB001) 1,43x 10−4 11 (AC001) 7,6 x 10−9 15 1,8 x 10−5 60

MG1363Sm MG1363Sm LM0230 LM0230

35

40

TABLA 2 Transferencia conjugativa de insensibilidad frente a los fagos y Lac. Transconjugantes Lac+ 45

Donante

Receptor

Frecuencia por recep. y % insens. frente a fagos 712

S.lactis AB001 S.lactis AB002 S.cremoris UC653

S.lactis LM2306 4,0 x 10−7 75,0 S.lactis LM2306 3,7 x 10−3 91,7 S.lactis MMS366 3,0 x 10−7 100 Designaci´ on transconjugante (a) MM20 (b) MM21

50

55

60

17

ES 2 059 376 T3 TABLA 3 Efecto de la temperatura sobre la replicaci´ on de fagos seleccionados en S.lactis MG1363 y derivados insensibles a los bacteri´ ofagos (valores EOP) 5

10

15

Cepa S.lactis MG1363 Sm Fagos 712 c2 ml3 Temp.

eb1

stl5

sk1

21◦C 30◦C 37◦C 40◦C

1,0 1,0 1,0 sd

1,0 1,0 1,0 sd

1,0 1,0 1,0 sd

1,0 1,0 sd sd

1,0 1,0 1,0 1,0

1,0 1,0 1,0 1,0

20

25

30

Cepa S.lactis AB001 Fagos 712 c2 Temp. 21◦C 30◦C 37◦C 40◦C

0 0 0 sd

0 2x10−2 2x10−4 7x10−1

ml3

eb1

stl5

sk1

0 5x10−1 7x10−1 4x10−1

3x10−6 9x10−3 6x10−4 sd

5x10−3 8x10−3 2x10−3 sd

0 0 0 sd

35

40

45

Cepa S.lactis AC001 Fagos 712 c2 Temp.

ml3

21◦ C 30◦ C 37◦ C 40◦ C

0 1,0 1,0 1,0

0 0 0 sd

0 5x10−2 1x10−2 2x10−1

50

55

60

18

Cepa S.lactis AC003 712 c2 ml3 Temp.

0 0 0 sd

0 1x10−7 1x10−5 9x10−4

0 2x10−3 3x10−1 6x10−1

ES 2 059 376 T3 TABLA 4 Transferencia de los mecanismos de insensibilidad frente a los fagos de los pCI750 y pCI829 asociados a cepas seleccionadas de estreptococos l´ acticos 5

Transconjugantes Lac+ Frecuencia % ins. por recep. fagos h

Donante

Receptor

S.lactis AB002

S.lactis SK3 Lac− TcR

10

15

20

S.lactis AC003

S.lactis sub. diacetylactis 18-16 Lac− TcR S.cremoris UC411 Lac− FusR

25

30

S.lactis sub. diacetylactis 18-16 Lac− TcR S.cremoris UC411 Lac− FusR S.lactis SK3 Lac− TcR

2,0x10−3

88

1,5x10−4

50

1,5x10−3 3,0x10−3

94 83

5,0x10−5

83

6,0x10−4

50

TABLA 5 Datos que muestran la sensibilidad frente a los fagos aumentada del S.cremoris (curado del pl´ asmido insensible a los fagos pCI528) comparada con la del S.cremoris UC503 principal (que contiene pCI528) Hu´esped S.cremoris UC503 Fago pfu/ml tama˜ no placa

Hu´esped S.cremoris UC563 pfu/ml tama˜ no placa

c2 uc811

3x103 1x102

35

0 0

0 0

< 1,55 mm < 1 mm

40

45

50

55

TABLA 6 Comparaci´ on de la sensibilidad del S.lactis MG1363 (libre de pl´ asmidos) y del S.lactis UC505 (que contiene el pl´ asmido insensible a los fagos pCI528) frente a fagos virulentos seleccionados a 30◦ C, 37◦ C y 39◦ C

Fagos

pfu/ml a diferentes temperaturas en ◦ C S.lactis MG1363 S.lactis UC505 30 37 39 30 37 39

712 jj50 c2 ml3

2x109 2x106 4x108 1x1010

3x108 2x1068 7x108 > 1010

6x108 3x106 3x108 > 1010

60

19

0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0

ES 2 059 376 T3 TABLA 7 Comparaci´ on de la eiciencia de adsorci´ on de fagos en S.lactis MG1363 y S.lactis UC505 (que contiene el pCI528) 5

Fagos

10

% de adsorci´on S.lactis MG1363 S.lactis UC505

712 jj50 c2 ml3

97,46 94,91 94,53 97,64

37,31 40,98 45,34 36

15

20

25

30

35

40

45

50

55

TABLA 8 Comparaci´ on de la capacidad del S.lactis MG1299 (que contiene pLP712) y del S.lactis UC503 (que contiene pLP712 y pCI528) para reducir el pH de la leche en presencia de fagos 712, jj50, c2, ml3 y una mezcla de los cuatro, usando la prueba de actividad de la leche de Heap-Lawrence (13). Ciclo fagos

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Ciclo fagos

1 2 3 4 5 6 7

S.lactis MG1363 Control∗ 712 jj50

4,94 5,06 4,84 5,17 5,06 4,96 5,08 5,03 4,95 5,06 5,06 5,20

c2

ml3

mezcla

6,47 6,49 6,55 6,48 6,48 6,40 6,47 6,41 6,33 6,47 6,48 6,49

6,49 6,49 6,55 6,48 6,48 6,40 6,47 6,41 6,33 6,47 6,48 6,49

6,48 6,49 5,75 6,49 6,48 6,43 6,48 6,41 6,36 6,46 6,47 6,47

6,48 6,49 6,53 6,49 6,48 6,44 6,44 6,41 6,35 6,45 6,47 6,48

6,48 6,49 6,55 6,49 6,48 6,42 6,44 6,41 6,33 6,47 6,45 6,49

S.lactis UC505 Control∗ 712

jj50

c2

ml3

mezcla

4,89 5,07 5,87 5,12 5,18 4,96 5,06

4,88 5,05 4,86 5,11 5,15 4,95 5,08

4,88 5,02 4,88 5,10 5,16 5,94 5,10

4,93 5,06 4,92 5,19 5,17 4,96 5,08

4,94 5,09 5,91 5,13 5,19 5,52 5,13

4,87 5,02 4,93 5,10 5,18 4,97 5,07

60

20

ES 2 059 376 T3 Tabla 8 (cont.)

5

10

Ciclo fagos

8 9 10 11 12

S.lactis UC505 Control∗ 712

5,13 5,09 5,08 5,17 5,27

5,09 5,09 5,04 5,15 5,23

jj50

c2

ml3

mezcla

5,08 5,07 5,03 5,11 5,21

5,07 5,03 5,05 5,60 5,21

5,08 5,05 5,04 5,09 5,24

5,06 5,06 5,04 5,14 5,25

15

∗ Sin a˜ nadir fagos a la leche.

20

25

En el ciclo 1 se a˜ nadieron 0,1 ml de cada suspensi´ on de fagos apropiada (10 pfu/ml aproximadamente). En los ciclos siguientes (2 a 12) se a˜ nadieron 0,5 ml de suspensi´ on de fagos y 0,05 ml de suero del ciclo anterior. TABLA 9 Efecto de los mecanismos codificados en los pCI750 y pCI829 individualmente y juntos sobre el tama˜ no de las placas de los fagos 712 y c2 Hu´esped y pl´ asmido

Tama˜ no de las placas mm fago 712 fago c2

30

35

S.lactis S.lactis S.lactis S.lactis

MG1363 (sin pl´ asmidos) AB001 (pCI750) AC001 (pCI829) AC003 (pCI751+pCI829)

40

45

50

55

60

21

0 0 0 0

3 1 a 1,5 1 a 1,5 0

ES 2 059 376 T3 REIVINDICACIONES

5

10

15

20

1. Procedimiento de preparaci´ on de un pl´ asmido aislado que contiene uno o m´ as genes capaces de conferir a las bacterias de Streptococcus cremoris insensibilidad frente a uno o m´ as fagos, no siendo afectada la resistencia frente a dichos fagos a temperaturas comprendidas entre 35◦ C y 40◦C, caracterizado porque los genes son genes contenidos en los pl´ asmidos pCI750, pCI777 y pCI528, depositados en cepas bacterianas S.lactis AB001, AB002 y UC505 respectivamente en la National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen, Scotland (Colecci´ on nacional de bacterias industriales, Aberdeen, Escocia) con los n´ umeros de acceso 12261, 12262 y 12478 respectivamente, que tambi´en son capaces de conferir insensibilidad frente a los fagos a los Streptococcus lactis y a los Streptococcus lactis subespecie diacetylactis, no siendo destruida la capacidad de conferir insensibilidad frente a los fagos a temperaturas de hasta 39◦ C, o son genes que tienen la suficiente homolog´ıa secuencial para conferir tambi´en insensibilidad frente a los fagos a los Streptococcus lactis y a los Streptococcus lactis subespecie diacetylactis a temperaturas de asmido est´a aislado del hu´esped original. hasta 39◦C, y porque el pl´ 2. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 1, caracterizado porque el pl´ asmido original procede de una cepa de Streptococcus cremoris. 3. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 1 o 2, caracterizado porque el plasmido confiere insensibilidad frente a los fagos de cabeza isom´etrica peque˜ na y de cabeza alargada. 4. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 1 o 3, caracterizado porque el pl´ asmido es recombinante y contiene genes que codifican determinantes de insensibilidad frente a los fagos y determinantes de utilizaci´on de lactosa en los estreptococos l´acticos.

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30

35

5. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 1 o´ 3, caracterizado porque el pl´ asmido es recombinante y contiene genes que codifican determinantes de insensibilidad frente a los fagos, determinantes de utilizaci´on de lactosa y determinantes de capacidad conjugativa de alta frecuencia en los estreptococos l´acticos. 6. Procedimiento seg´ un cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el pl´ asmido se elige del grupo que consiste en los siguientes: Pl´ asmido pCI750, como el depositado en la cepa bacteriana S.lactis AB001 en la Colecci´on nacional de bacterias industriales, Aberdeen, Escocia, con el n´ umero de acceso 12261. Pl´ asmido pCI777, como el depositado en la cepa bacteriana S.lactis AB002 en la Colecci´on nacional de bacterias industriales, Aberdeen, Escocia, con el n´ umero de acceso 12262.

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45

Pl´ asmido pCI528, como el depositado en la cepa bacteriana S.lactis UC505 en la Colecci´on nacional de bacterias industriales, Aberdeen, Escocia, con el n´ umero de acceso 12478. Pl´ asmidos que contienen uno o m´ as genes que codifican la insensibilidad frente a los fagos, de cualquiera de los pl´ asmidos anteriores depositados en la Colecci´on nacional de bacterias industriales, Aberdeen, Escocia, con los citados n´ umeros de acceso 12261, 12262 y 12478. Y pl´ asmidos que tienen la suficiente homolog´ıa secuencial con los citados pl´asmidos depositados, como para ser capaces de conferir insensibilidad frente a los fagos a los S.lactis, S.lactis subespecie diacetylactis y S.cremoris a temperaturas de hasta 39◦ C.

50

55

7. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 1, caracterizado porque el pl´ asmido tiene un peso molecular de 43,6 Mdal y el patr´ on de restricci´ on siguiente: (Ver Tabla en la p´ agina siguiente)

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ES 2 059 376 T3

Enzima restr.

N´ umero de fragmentos

Tama˜ no de los fragmentos (kb)

BamHI Bc1I

2 7

Bg1II BstEII EcoRV HindIII

muchos 2 6 11

35,6, 30,4 21,32, 13,77, 12,55, 9,75, 4,78, 2,13, 1,69 sin determinar 56,74, 9,26 41,69, 11,1, 5,48, 5,26, 1,45, 1,08 23,22, 12,18, 6,70, 5,08, 4,13, 3,51, 3,28, 2,43, 2,03, 1,85, 1,60 20,97, 14,51, 10,26, 5,91, 3,35, 3,10, 2,25, 2,19, 1,70, 1,55 26,01, 20,44, 9,66, 6,54, 8,35 25,33, 20,06, 13,16, 7,51

5

10

15

HpaII

10

PvuII SalI

5 4

20

o un peso molecular de 27 Mdal y el siguiente patr´ on de restricci´ on: 25

30

35

40

Enzima restr.

N´ umero de fragmentos

SacI StuI Bg1II PvuII C1aI EcoRV HaeIII HincII AvaI HpaII

1 2 3 3 4 6 4 6 5 8

EcoRI

8

Tama˜ no de los fragmentos (kb)

40,0 32,9, 6,9 20,8, 14,4, 4,0 22,9, 8,3, 5,1 21,2, 7,4, 6,1, 4,8 25,1, 5,9, 4,5, 3,1, 2,7, 2,1 25,1, 5,49, 5,0, 4,36 11,8, 5,6, 4,5, 3,8, 2,5, 1,7 16,3, 12,5, 9,1, 4,6, 3,2 12,6, 11,9, 10,8, 3,9, 2,4, 2,2, 1,2, 0,4 21,0, 12,1, 2,5, 2,1, 1,7, 0,84, 0,69, 0,41

45

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55

8. Procedimiento de preparaci´ on de una secuencia de DNA, caracterizado porque se elige un pl´ asmido aislado seg´ un el procedimiento de la reivindicaci´on 6 o 7, y se aisla el DNA que codifica los determinantes de insensibilidad frente a los fagos o el DNA que tiene una suficiente homolog´ıa secuencial para conferir tambi´en insensibilidad frente a los fagos a los S.lactis, S.lactis subespecie diacetylactis y S.cremoris a temperaturas de hasta 39◦C. 9. Procedimiento de preparaci´ on de un hu´esped bacteriano, caracterizado porque uno o m´ as pl´ asmidos aislados seg´ un el procedimiento indicado en las reivindicaciones 1 a 7, se introduce en una bacteria, no siendo la combinaci´ on de hu´esped y pl´asmido una combinaci´ on que sucede naturalmente. 10. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 9, caracterizado porque el hu´esped es un hu´esped estreptoc´ocico l´actico.

60

11. Procedimiento de conferir insensibilidad frente a los fagos a una bacteria utilizada en la fabricaci´on de queso, caracterizado porque comprende la introducci´ on en la bacteria de un pl´ asmido aislado segun el procedimiento indicado en las reivindicaciones 1 a 7, de modo que se proporciona a dicha bacteria una 23

ES 2 059 376 T3 combinaci´on bacteriana de hu´esped y pl´ asmido distinta de las que se producen naturalmente.

5

10

12. Procedimiento de conferir insensibilidad frente a los fagos a un cultivo de iniciaci´on alimentario, caracterizado porque comprende la introducci´ on en las bacterias de un pl´ asmido aislado segun el procedimiento indicado en las reivindicaciones 1 a 7, de modo que se proporciona a dichas bacterias una combinaci´on bacteriana de hu´esped y pl´ asmido distinta de las que se producen naturalmente. 13. Procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 12, caracterizado porque el cultivo iniciador se elige de cultivos iniciadores lact´eos, de cultivos iniciadores de quesos, de carne y de cultivos de fermentaciones c´arnicas, de cultivos de fermentaci´on vegetal y de cultivos probi´ oticos. 14. procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 13, caracterizado porque el cultivo se almacena en forma l´ıquida, congelada, seca y congelada, congelada y concentrada, o seca, congelada y concentrada.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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