El repilo del olivo: clonación, cuantificación de la expresión génica y análisis del polimorfismo entre cultivares de genes expresados diferencialmente YOSELÍN BENÍTEZ1,2, CARMEN GARCÍA-LIMONES1, ENRIQUETA MOYANO1, ANTONIO TRAPERO3, JOSÉ LUIS CABALLERO1, JUAN MUÑOZBLANCO1, GABRIEL DORADO1* 1

Dep. Bioquímica y Biología Molecular, Campus Rabanales, Córdoba; 2Delbruck Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory, One Bungtown Road, New York (USA); 3Dep. Agronomía, ETSIAM, Córdoba

RESUMEN

ABSTRACT

El olivo (Olea europaea) puede ser parasitado por el hongo Spilocaea oleagina, provocando una enfermedad llamada repilo. La interacción entre el huésped fúngico y la planta hospedadora ha sido estudiada a nivel molecular. La metodología de expresión génica diferencial (DDRT-PCR o DD) ha permitido obtener cientos de fragmentos de cDNA (ESTs), que han sido clonados y secuenciados. La expresión génica ha sido estudiada mediante PCR cuantitativa a tiempo real (QRT-PCR). El salicilato de sodio (SA), benzotiadiazol (BTH), metiljasmonato sódico (MJ) y etefón (ET) indujeron la expresión de genes de defensa del olivo, si bien sus patrones y dianas fueron diferentes. No obstante, existe una interacción entre las diferentes rutas de defensa, ya que elicitores distintos pueden inducir los mismos genes. Los cultivares tolerantes mostraron niveles basales de expresión de los genes de defensa más elevados que los cultivares susceptibles. Por tanto, cada cultivar de

The olive tree (Olea europaea) can be parasited by the fungus Spilocaea oleagina, causing the olive leaf spot disease. The interaction between the fungic guest and the host plant has been studied at the molecular level. The methodology of differential gene expression (DDRT-PCR or DD) has allowed to obtain hundreds of fragments of DNA (ESTs), that have been cloned and sequenced. The gene expression has been studied by means of quantitative real-time PCR (QRT-PCR). The sodium salicylate (SA), sodium benzothiadiazole (BTH), sodium methyljasmonate (MJ) and ethephon (ET) induced the expression of genes of defense of the olive tree, although their patterns and targets were different. However, a cross-talk between the different defense pathways exists, since different elicitors can induce the same genes. The tolerant cultivars showed higher baseline levels of defensive gene expression than the susceptible varieties. Therefore, each

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olivo muestra un perfil de expresión génica característico, tanto antes (niveles basales) como después de la infección por el huésped parásito. De este modo, la cuantificación de la expresión de algunos genes clave puede emplearse para determinar el grado de tolerancia o susceptibilidad del olivo a la enfermedad del repilo. Esta herramienta molecular puede servir para guiar una selección asistida por marcadores moleculares de expresión. Ello permite poder prescindir de inóculos de hongos vivos, que eran necesarios hasta ahora en tales estudios, evitando así los problemas que ello conlleva. Del mismo modo, esta aproximación molecular puede emplearse en el ensayo y validación de fungicidas. Por otro lado, existe polimorfismo genético (SNPs) en estos genes de defensa entre los diferentes cultivares de olivo.

olive tree cultivar shows a characteristic profile of gene expression, both before (basal levels) and after the infection by the parasitic guest. This way, the quantification of the expression of some key genes can be exploited to determine the degree of tolerance or susceptibility of the olive tree to the leaf spot disease. This molecular tool can be used for expression-marker assisted breeding. These developments allow to avoid the use of inocula of the living fungi, that were necessary until now in such studies, preventing therefore the problems that it entails. Likewise, this molecular approach can be used to test and validate fungicides. On the other hand, there is genetic polymorphism (SNPs) in these genes of defense between the different olive tree cultivars.

INTRODUCCIÓN

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l repilo es la enfermedad más común del olivo en España (Barranco et al., 2004; Trapero y Blanco, 2004). Provoca la caída de las hojas del árbol y causa pérdidas anuales del 6% en la cosecha de este cultivo. Se trata de una patología fúngica, causada por el hongo Spilocaea oleagina (Cast.) Hughes (sinónimo de Cycloconium oleaginum Cast.). Existe un conocimiento escaso de la epidemiología y fitopatología de esta enfermedad. Curiosamente, existen además resultados contradictorios respecto a la posible susceptibilidad o tolerancia de los diferentes cultivares de olivo al repilo, aunque dicha enfermedad se conoce desde mediados del siglo XX. Está claro que, como en otras plantas, existen mecanismos de defensa tanto morfológicos (cutítula) como químicos (compuestos fenólicos). Se presenta por vez primera un análisis molecular de los genes implicados en la interacción entre este hongo huésped y su árbol hospedador. Para ello se han elegido tres cultivares de olivo, que muestran una tolerancia baja, intermedia y alta a la enfermedad (no existe la resistencia completa). El estudio se ha realizado a diferentes tiempos tras la inoculación del hongo. Se ha empleado la técnica de Expresión Diferencial (DDRT–PCR o DD; del

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ingles, «Differential Display Reverse Transcription–PCR») para identificar, clonar y secuenciar genes del parásito y de la planta que se inducen diferencialmente en este patosistema. Posteriormente se ha cuantificado su expresión génica mediante PCR a tiempo real (QRT–PCR o QRT; del ingles, «Quantitative Real–Time PCR»). Para ello se han utilizado diferentes sustancias elicitoras y fungicidas. Con ello se pretenden varios objetivos, como son: i) conocer las bases moleculares de la enfermedad del repilo del olivo; ii) desarrollar una herramienta molecular para predecir la susceptibilidad o tolerancia al parásito, incluso en ausencia del mismo (selección guiada por marcadores de expresión); iii) desarrollar una herramienta molecular para el ensayo de fungicidas, también en ausencia del hongo; y iv) tratar de ligar los resultados anteriores a loci cuantitativos de resistencia a la enfermedad.

MATERIALES Y MÉTODOS Olivo, hongo e inoculaciones. Los estudios se realizaron con el cultivar ‘Lechín de Sevilla» de Olea europaea. Esta variedad ha sido descrita como «resistente» (es decir, más tolerante) al patógeno Spilocaea oleagina. Las hojas de Olea europaea infectadas se recogieron en el Banco de Germoplasma de Olivo del Centro de Investigación y Formación Agraria (CIFA, Córdoba). Se emplearon de 100.000 a 150.000 conidias/ml de agua en las inoculaciones posteriores. Se inocularon plantones de olivo jóvenes (cuatro meses) con el aislado del hongo previamente obtenido. Para ello se empleó un cañón de aspersión. Las muestras se incubaron a 15 ºC y 98% de humedad relativa en la oscuridad durante dos a cuatro días para facilitar la infección. Después se expusieron a ciclos de 12–12 horas de luz–oscuridad a 17 ºC y alta humedad relativa (80–98%). Las muestras controles se sometieron a las mismas condiciones (excepto la infección). Las hojas infectadas y controles se recogieron a los cinco y 21 días, se congelaron en nitrógeno líquido (–196 ºC) y se almacenaron a –80 ºC hasta su uso posterior. Exposición a elicitores. Se emplearon los siguientes elicitores de la respuesta defensiva en plantas: salicilato de sodio (SA; 10 mM), benzotiadiazol (BTH; un análogo comercial del SA e inductor de la Respuesta Sistémica Adquirida: SAR; del inglés, «Systemic Acquired Response»; 1’1 mM), metiljasmonato sódico (MJ; 0’1 mM), etefón (1 mM) y cloruro cúprico (CuCl2; 2’5 mM) disueltos en tampón fosfato (50 mM y pH 7’0). Las hojas escindidas de los plantones ‘Lechín de Sevilla’ y expuestas a los elicitores se mantuvieron a 25 ºC sobre papel Whatman humedecido. Las muestras se recolectaron a las 24, 72 y 120 h tras la exposición. I CONGRESO DE CULTURA DEL OLIVO

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Purificación de DNA genómico y RNA total. Se obtuvieron tanto del olivo como del parásito siguiendo diferentes metodologías. Expresión Diferencial (DDRT–PCR; DD). Se han comparado los perfiles de amplificación de cDNA del cultivar ‘Lechín de Sevilla’ entre el tiempo 0 y la tercera semana tras la infección con el hongo Spilocaea oleagina. Se emplearon 12 cebadores anclados y ocho (ARP1 a ARP4; ARP9 a ARP12) de los 20 disponibles (kit »Hieroglyph» de Beckman Coulter, Fullerton, CA, EUA; ). Los amplicones se resolvieron mediante electroforesis. De esta forma se escindieron unas 300 bandas correspondientes a genes expresadas diferencialmente. Los falsos positivos se descartaron mediante hibridación »dot blot» y las bandas con aparente sobre–expresión se clonaron en el vector «pGEM–T Easy» de Promega (Madison, WI, EUA; ). Finalmente se secuenciaron 85 clones. Los fragmentos de secuencias expresadas (EST; del inglés, «Expressed Sequence Tags») se compararon con GenBank usando los algoritmos FASTA (paquete Wisconsin) de Accelrys (San Diego, CA, EUA; ) y BLAST del NCBI () vía GeneQuest (paquete Lasergene) para Mac OS de DNAStar (Madison, WI, EUA; ). «Dot blots» de ESTs. Se desnaturalizaron muestras de DNA plasmídico portadoras de los ESTs (0’4 M NaOH, 10 mM Na2–EDTA, pH 8’0) y posteriormente se aplicaron sobre membranas de nylon Hybond N+ de Amersham Biosciences (Bucks, RU; ). Como controles se emplearon muestras del plásmido «pGEM–T Easy» y muestras sin DNA. Una membrana se hibridó con una sonda ss– DNA transcrita a partir del RNA total del cultivar ‘Lechín de Sevilla’ control (sin infectar), mientras que la otra se hibridó con una sonda similar pero procedente de plantones tras cinco días de infección. El cDNA se sintetizó a partir de 10 µg de RNA total mediante el uso de oligo(dT) como cebador. Cuantificación de la expresión génica (QRT–PCR; QRT). Los estudios de expresión génica se han realizado mediante QRT-PCR a tiempo real (Muñoz et al, 2004; Quesada et al., 2004) en un termociclador iCycler (Bio-Rad). (Hercules, CA, EUA; ), usando Sybr Green de Molecular Probes (Eugene, OR, EUA; ) como fluoróforo. Las amplificaciones se llevaron a cabo en un volumen total de 25 µl con la siguiente mezcla de reacción: tampón de PCR (1X), MgCl2, (1’5 mM) dNTPs (0’2 mM), pareja de cebadores (0’2 µM de cada uno), Sybr Green I (3 µl; diluido 1:15.000), cDNA transcrito (3 µl) y AmpliTaq Gold (0’5 U) de Applied Biosystems (Foster City, CA, EUA; ). La curva de fusión sirvió para confirmar la pre-

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sencia de un solo amplicón tras cada reacción. Como control interno (gen constitutivo) se empleó una región transcrita de interespaciador de rRNAs (16S–23S). Las reacciones se realizaron por triplicado, normalizándose los valores de Ct (ciclo umbral) en relación a los del control interno. También se calculó la eficiencia de cada reacción de QRT-PCR. Estos valores se emplearon para determinar los incrementos de expresión génica entre las diferentes condiciones fisiológicas consideradas, según la expresión: Incremento de variación = 2-Δ(ΔCt), siendo ΔCt = Ct (problema) – Ct (gen constitutivo) y Δ(ΔCt) = ΔCt (problema) – ΔCt (control). Hibridación «Southern» de los amplicones de PCR. El origen (olivo u hongo) de los fragmentos amplificados se determinó mediante hibridación «Southern». Para ello se amplificaron 50 ng de DNA genómico de ‘Lechín de Sevilla’ y del hongo con los cebadores específicos diseñados para cada EST clonado. Los amplicones se segregaron mediante electroforesis y se transfirieron a membranas Hybond N+. La membrana se hibridó con una sonda generada mediante PCR a partir de los plásmidos portadores de los ESTs correspondientes al cDNA de cada clon. Sólo las bandas que hibridaran con tales sondas corresponderían a la banda subclonada (o serían muy similares a ella). Las bandas que hibridaron con ambos DNAs se subclonaron y secuenciaron.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se han amplificado, clonado y secuenciado cientos de fragmentos de cDNA (mRNA) llamados etiquetas de expresión de genes (EST; del inglés, «Expressed Sequence Tag»). Para ello se ha provocado la infección del olivo por parte del parásito fúngico. Posteriormente se ha aplicado la técnica de Expresión Diferencial, que permite comparar bibliotecas de expresión diferentes, identificando los genes que sufren alguna alteración en su expresión entre dichas bibliotecas. Se ha cubierto el 40% del transcriptoma analizado. Una vez subclonados y secuenciados, los ESTs fueron comparados con la base de datos GenBank (nucleótidos y traducción a péptidos) mediante los algoritmos BLAST y FASTA. Ello permitió determinar su identidad en algunos casos, o bien confirmar que se trataba de genes inéditos en otros casos, lo cual los hacía especialmente interesantes. Entre lo genes identificados destacan aquellos relacionados con los mecanismos de defensa estructural (cutítula), estrés oxidativo mediante especies activas de oxígeno (ROS; del inglés, «Reactive Oxygen Species») y síntesis de compuestos fenólicos defensivos. I CONGRESO DE CULTURA DEL OLIVO

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La expresión de los genes correspondientes a los ESTs fue analizada por «Northern blot» reverso, a fin de identificar posibles falsos positivos. Asimismo, los estudios de «Southern blot–PCR» permitieron asignar los ESTs al huésped parásito, al olivo hospedador, o a ambos. Se obtuvo un amplio abanico de respuestas, dependiendo del gen analizado y de las condiciones experimentales de la infección o inducción. Los estudios de cuantificación de la expresión génica realizados mediante QRT-PCR han permitido detectar diferencias entre cultivares, entre compuestos elicitores y fungicidas y en relación al tiempo transcurrido tras la infección. La inducción de expresión de algunos genes fue espectacular, no sólo tras la aplicación de agentes elicitores, sino incluso en estado basal (control). De este modo, se comprobó que los cultivares de olivo más tolerantes (como ‘Lechín de Sevilla’) presentaban en general una mayor expresión génica que los cultivares más susceptibles (como ‘Picual’). El cultivar ‘Arbequina’ mostró en general niveles de expresión intermedios. Ello está de acuerdo con su clasificación como medianamente tolerante. Asimismo, los patrones de expresión fueron peculiares para los distintos genes estudiados. En general, los mayores niveles de expresión aparecieron tras cinco días de la inoculación vs. 21 días. El elicitor SA provocó incrementos espectaculares de expresión génica de hasta 30 veces en algunos genes del cultivar ‘Lechín de Sevilla’. También se observaron incrementos menores pero significativos (de cinco a dos veces) para otros genes conocidos o de identidad desconocida (no publicados en GenBank). Como era de esperar, el patrón de expresión temporal fue característico para cada gen. Los mayores incrementos se detectaron a los cinco días de la inoculación del hongo vs. un día. El BTH es un compuesto comercializado como fungicida que mostró un perfil de expresión temporal similar al del SA, aunque con algunas diferencias. Se observaron inducciones de 11 veces, así como otras menores de siete, cuatro o dos veces. De nuevo, el patrón de expresión temporal fue diferente y peculiar para cada gen. Los mayores incrementos se detectaron a los cinco días de la inoculación del hongo vs. un día. Los valores máximos de inducción se detectaron tras un día de infección vs. cinco días. Por su parte, el MJ indujo también grandes incrementos de expresión génica de hasta 30 veces. En este caso se observaron en general patrones diferentes de inducción de la expresión génica de los observados con SA o BTH. Se apreciaron también incrementos menores de 3 a dos veces. El patrón de expresión temporal también fue diferente para los distintos genes. Los valores mayores correspondieron a los tres días de la infección vs. un día.

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Al contrario de lo esperado, la aplicación de mezclas de SA+MJ redujo significativamente la expresión de algunos genes. Además, el patrón de expresión temporal de dicha mezcla fue en general diferente del producido por SA o MJ por separado. La mezcla indujo niveles de expresión de hasta cuatro veces, con otros incrementos menores de tres y dos veces para otros genes estudiados. Como en los casos anteriores, el perfil temporal de expresión génica fue diferente para los distintos genes estudiados. Los incrementos mayores se observaron tras cinco días de la infección vs. un día. Por su parte, el ET es un conocido inductor de la síntesis de etileno en las plantas, que a su vez es un elicitor de los mecanismos de defensa de éstas. En este caso se observaron reducciones en los niveles de inducción génica a 10 veces, con otros valores menores de cinco, cuatro y dos veces, según el gen estudiado. Los perfiles temporales de expresión variaron con el gen estudiado, como en los casos anteriormente descritos, mostrando niveles mayores a los cinco días tras la exposición vs. un día. Los agricultores saben desde hace muchos años que determinados compuestos de cobre (como el sulfato cúprico) tienen la propiedad de proteger a los cultivos frente a los infecciones por hongos. Este hecho empírico está de acuerdo con la inducción de fitoalexinas por parte de los iones Cu2+. Por otro lado, el cobre es un metal pesado que puede generar radicales hidroxilo y otras especies activas de oxígeno (ROS; del inglés, »Reactive Oxygen Species»). As su vez, estos compuestos químicos sirven de señales para desencadenar mecanismos de defensa en la planta. En definitiva, estos procesos conllevan la inducción de un abanico más o menos amplio de genes de defensa, como los indicados anteriormente. Por otro lado, el cobre puede inducir la muerte celular (como en la respuesta hipersensible). Por todo ello, fue sorprendente que la aplicación de cloruro cúprico (CuCl2) redujera la inducción génica a 1’5 veces del gen más inducido (30 veces) con los elicitores anteriores. Otras inducciones fueron de ocho, cinco y dos veces, para diferentes genes. Como en los casos anteriores, los perfiles de expresión temporal fueron también diferentes para los distintos genes. Por otro lado, los mayores incrementos se detectaron a los cinco días tras la infección vs. un día. Finalmente, se han detectado polimorfismos de un solo nucleótido (SNP; del inglés, «Single Nucleotide Polymorphism») en genes expresados diferencialmente en la enfermedad del repilo. Para ello se han amplificado y secuenciado fragmentos genómicos de dichos genes en varios cultivares de olivo (‘Arbequina’, ‘Dolce Agogia’, ‘Domat’, ‘Frantoio’, ‘Gordal de Sevilla’, ‘Hojiblanca’, ‘Leccino’, ‘Lechín de Sevilla’, ‘Manzanilla de Sevilla’ y ‘Picual’). Estos resultados confirman la gran variabilidad genética existenI CONGRESO DE CULTURA DEL OLIVO

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te entre las diferentes variedades de olivo. Estos marcadores moleculares (Dorado, 2001, 2006; Dorado et al., 2001) pueden ser útiles para identificación de las variedades de olivo. Este trabajo es el primero que analiza el repilo a nivel génico-molecular. Aunque anteriormente existía una ausencia prácticamente total de conocimientos moleculares sobre el repilo, es importante disponer de dicha información. De este modo se podrá conocer mejor la biología de esta enfermedad, así como diseñar estrategias más eficientes para combatirla y permitir una selección genética de resistencia al repilo guiada por marcadores de expresión. Como se ha indicado, el repilo es la enfermedad más importante del olivar español, causando grandes pérdidas anuales de producción. Nuestros resultados permiten utilizar la técnica de QRT-PCR para predecir el grado de tolerancia o susceptibilidad al repilo de las diferentes variedades de olivo. Pueden ser por tanto aplicados a programas de mejora, ya que sólo se requiere una pequeña cantidad de RNA para llevar a cabo el test correspondiente. También pueden aplicarse para detectar la infección del hongo en estadíos muy tempranos. Asimismo, pueden emplearse para evaluar la actividad antifúngica de diferentes tratamientos, así como dosis y tiempos óptimos de aplicación. Además, no es necesario en ningún caso el uso de inóculos del hongo, porque lo que se estudian son los niveles de expresión basal e inducidos de varios genes clave en la planta. De este modo se evitan completamente los problemas derivados de la viabilidad del inóculo, tiempos de infección, posibles contaminaciones, etc. Todo esto representa una estrategia más eficiente, más ecológica y más barata en la lucha contra el parásito. Por otro lado, estos avances posibilitan también la obtención de olivos más resistentes a parásitos mediante biotecnología (Dorado, 2002; Chawla y Dorado, 2006).

AGRADECIMIENTOS Financiado por Proyectos CAO00-018-C7-1 y CAO00-018-C7-3, Grupo PAI CTS-413 (Junta de Andalucía) y proyecto Oliv-Track QLRT2001-02386 (Unión Europea).

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BIBLIOGRAFÍA

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