Actividad con tutoría - Área Virología - Seminario 16- 2016. Patogénesis del virus Zika. La actividad ha sido diseñada en base a los siguientes trabajos científicos originales: Hamel R, Dejarnac O, Wichit S, Ekchariyawat P, Neyret A, Luplertlop N, Perera-Lecoin M, Surasombatpattana P, Talignani L, Thomas F, Cao-Lormeau VM, Choumet V, Briant L, Desprès P, Amara A, Yssel H, Missé D. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 2015 89(17):8880-96. Tang H, Hammack C, Ogden SC, Wen Z, Qian X, Li Y, Yao B, Shin J, Zhang F, Lee EM, Christian KM, Didier RA, Jin P, Song H, Ming GL. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 2016 18; 1-4. Lazear HM, Govero J, Smith AM, Platt DJ, Fernandez E, Miner JJ, Diamond MS. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe 2016 19; 1-11. Mlakar J, Korva M, Tul N, Popović M, Poljšak-Prijatelj M, Mraz J, Kolenc M, Resman Rus K, Vesnaver Vipotnik T, Fabjan Vodušek V, Vizjak A, Pižem J, Petrovec M, Avšič Županc T. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 2016 374(10):951-8. Las figuras presentadas han sido tomadas y adaptadas a partir de dichos trabajos a menos que se indique lo contrario.

Ud es un residente de la división de infectología de un hospital de Argentina. Un día recibe un llamado del departamento de obstetricia, donde le presentan el siguiente caso: Se presenta una mujer de 25 años, sin antecedentes de enfermedades importantes (ni en miembros de su familia), cursando la semana 29 de embarazo. La mujer refiere haber residido en Natal (Rio Grande do Norte, Brasil) durante varios meses, trabajando como voluntaria. Durante esa estadía quedó embarazada. En la semana 13 de embarazo aproximadamente, refiere haber cursado un síndrome febril, con dolor muscular, retroocular y un rash maculopapular generalizado. Tras la respectiva consulta, recibió un diagnóstico clínico de sospecha de infección por virus Zika, sin diagnóstico de certeza. Durante la semana 20 de embarazo vuelve a Argentina y, en su control obstétrico, se observan signos de anomalías fetales. El ultrasonido realizado a la paciente en la semana 32 de gestación confirmó un retraso en el crecimiento fetal y una circunferencia de cabeza por debajo del 2do percentil correspondiente a esa semana de gestación (microcefalia severa, Figura 1). El fluido amniótico y tamaño de placenta eran normales así como también el flujo sanguíneo fetal, umbilical y uterino. Subsecuentemente, la madre reportó una disminución de los movimientos fetales y la terminación espontánea del embarazo se desencadenó en los siguientes días.

Figura 1: Niño recién nacido con perímetro cefálico típico (Panel de la izquierda), con microcefalia moderada (centro) y microcefalia severa (derecha). Typical Head Size: Tamaño de cabeza normal. Adaptado de Baden et al. N Engl J Med 2016;374:1552-63

Habiendo corroborado la limitada información acerca de la patogénesis del virus Zika que existe en la bibliografía y habiendo obtenido el consentimiento escrito de la madre y del comité de ética de su institución, decide realizar un estudio anatomopatológico del feto. Los hallazgos histológicos más sobresalientes fueron la presencia de calcificaciones en la corteza de la materia blanca así como también calcificaciones a nivel subcortical. Se observó presencia de macrófagos y células de la microglía activados así como también inflitrado perivascular de linfocitos T y B. Sobre cortes de cerebro se realizó la técnica de inmunofluorescencia y microscopía electrónica. 1. En base a lo que observa en las figura 2 responda: A

B

E

A

C

D A

Figura 2: Paneles A, B y C: Microscopia electrónica sobre secciones ultrafinas de cerebro fetal, donde se señalan partículas simil Flavivirus. Panel D: Microscopia electrónica de una partícula viral mediante tinción negativa. Panel E: Inmunofluorescencia indirecta anti virus ZIKA sobre tejido cerebral fetal.

a. Los resultados de la microscopía electrónica son definitivos respecto de una posible infección con virus ZIKA? Si la respuesta es no, qué otras técnicas utilizaría para confirmar su observación?

b. En la inmunofluorescencia, cuál cree que fue el origen del anticuerpo primario utilizado para realizar la reacción? Qué otro se le ocurre? Qué controles realizaría para saber que la reacción es específica? c. Además, decide complementar las observaciones anteriores mediante la técnica de RT-PCR. Sobre qué material partiría? Qué controles realizaría? Cómo aportaría mayor evidencia acerca de una posible relación causal entre el virus Zika y los hallazgos histológicos antes observados? 2. Luego, decide encarar un estudio básico de patogénesis a nivel celular del virus Zika. Para ello, comienza con el objetivo de determinar qué tipos celulares son susceptibles y permisivos a la infección. En base a sus conocimientos acerca de la patogénesis de otros arbovirus y teniendo en cuenta los resultados del caso presentado, qué tipos celulares probaría? 3. Cómo interpreta los resultados del experimento mostrado en la figura 3? Indique verdadero o falso.

a. Las células precursoras neuronales son susceptibles a la infección por el virus Zika. b. Las células precursoras neuronales son susceptibles y permisivas a la infección por el virus Zika. c. Existe mayor expresión de Caspasa3, y por ende mayor apoptosis, en células no infectadas por virus Zika, en comparación con las infectadas.

Que relación tiene la respuesta a la ultima pregunta con el caso que disparo este trabajo?

A Figura 3: A. Imágenes de microscopia confocal de células precursoras neuronales humanas infectadas con Virus Zika o sin infectar (Mock). En verde, inmunotincion de la proteína E de Zika virus. DAPI= Marcador de ADN. B. Células Vero (línea celular tipo epitelial) tratadas con los sobrenadantes provenientes del cultivo infectado mostrado en el panel A. C. Inmunomarcacion de células precursoras neuronales infectadas con Virus Zika o sin infectar (Mock), contra la proteína E del virus ZIKA (verde) y Caspasa 3. Panel de la derecha: Cuantificación de la expresión de Caspasa3 en sendos cultivos.

B

C

4. En un intento de tratar de identificar el receptor celular que media la entrada del virus a la célula, decide evaluar si las moléculas TIM1 y AXL (miembros de la familia de receptores para fosfatidilserina y que facilitan la infección de células epiteliales por DENV) tienen alguna función en el ciclo de replicación de ZIKV. Para ello utiliza la línea celular A549 (línea celular de tipo epitelial), la cual expresa de manera endógena TIM1 y AXL, y la infecta con virus Zika en distintas condiciones. En base a los resultados indique la respuesta correcta:

Figura 4: Células A549 fueron infectadas con virus Zika en presencia de anticuerpos neutralizantes anti-TIM1 y/o anti-AXL o con una IgG no especifica como control. NI=No Infectadas. El porcentaje de infección fue evaluado por citometía de flujo.

a. Las moléculas TIM-1 y AXL no están involucradas en la susceptibilidad de células epiteliales al virus Zika. b. La molécula TIM-1 es un factor fundamental para la entrada del virus Zika a células epiteliales. c. Tanto TIM-1 como AXL son fundamentales para lograr una infección productiva por virus Zika en células epiteliales. d. La molécula AXL es un factor fundamental para la entrada del virus Zika a células epiteliales.

5. Con el fin de indagar acerca de los mecanismos inmunológicos involucrados en el control de la infección por el virus Zika, Ud. decide estudiar el curso de la infección en distintas líneas de ratones transgénicos knock-out: ratones IFNAR1-/- (no responden a los IFNs de tipo 1), ratones Irf3-/- Irf5-/- IRF7-/- (no producen IFNs tipo 1), MAVS-/- e Irf3-/- (ambos deficientes en la vía de señalización que lleva a la producción de IFNs tipo 1). Ratones WT=Ratones normales no transgénicos. En base a la figura 5, elija la opción correcta y justifique. a. Los mecanismos de inmunidad innata basados en la producción de IFNs de tipo I son FUNDAMENTALES/DETRIMENTALES en el control de la infección por virus Zika. b. Los ratones transgénicos Ifnar1-/- podrían constituir un BUEN/MAL modelo para estudiar los mecanismos subyacentes a la transmisión sexual del virus Zika. c. Los ratones WT/Ifnar1-/- serian el mejor modelo para evaluar posibles agentes antivirales y/o vacunas. ESTO ES MAS QUE NADA PARA DISCUTIR!

% Supervivencia

%Peso inicial

Días post-infección

D. Hígado

E. Riñón

F. Suero

Virus

C. Bazo

Día 2

Día 6

Día 6

H. Cerebro

Día 2

Día 6

Día 2

Día 6

I. Médula Espinal

Virus

G. Testículo

Día 2

Día 2

Día 6

Día 2

Día 6

Día 2

Día 6

Figura 5: Ratones con distintos genotipos fueron inoculados con virus Zika por la ruta subcutánea (sc). Todos los días post-infección, los ratones fueron pesados y su peso se documento en relación a su peso previo a la infección (A). La mortalidad se documento a lo largo de 14 días (B). C a I: En ratones WT y Ifnar1-/- además se documento la producción viral en distintos tejidos. Para ello se inocularon ratones y, a los 2 o 6 dias postinfeccion por vía sc, se sacrificaron y se cuantifico el virus Zika en los tejidos indicados.