UNIVERSIDAD DE TALCA INSTITUTO DE QUIMICA DE RECURSOS NATURALES

ACTIVIDAD GASTROPROTECTORA DE LOS TERPENOS ÁCIDO CIPERENOICO, JATROFONA, SUS DERIVADOS NATURALES Y SEMISINTÉTICOS

MARIANO PERTINO

TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE: DOCTOR EN CIENCIAS, MENCIÓN INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO DE PRODUCTOS NATURALES

Director: Prof. Guillermo Schmeda Hirschmann Co-Director: Prof. Jaime Rodríguez

DICIEMBRE, 2006

Actividad gastroprotectora de los terpenos ácido ciperenoico, jatrofona, sus derivados naturales y semisintéticos

Gastroprotective activity of cyperenoic acid, jatrophone and their natural and semisynthetic derivatives

Mariano Pertino

Fecha inicio Tesis: Fecha término Tesis:

Abril, 2004 Octubre, 2006

Director de Tesis: Prof. Guillermo Schmeda Hirschmann, Universidad de Talca, Instituto de Química de Recursos Naturales, Casilla 747, Talca, Chile. FAX: +56-71-200448. E-mail: [email protected]

Co-Director de Tesis: Prof. Jaime Rodríguez, Universidad de Talca, Facultad de Ciencias de la Salud, Casilla 747, Talca, Chile. FAX: +56-71-200262. E-mail: [email protected]

Integrantes de la Comisión de Tesis: 1. Prof. Maritza Hoeneisen (Universidad de Concepción) 2. Prof. Héctor Figueroa (Universidad Católica del Maule) 3. Prof. Iván Palomo (Universidad de Talca) 4. Prof. Leonardo Silva Santos (Universidad de Talca)

Agradecimientos.

•

A la Universidad de Talca, por la beca doctoral otorgada.

•

Al proyecto FONDECYT 1030583 y al Programa de Productos Naturales Bioactivos por el financiamiento de la Tesis doctoral.

•

Al profesor Guillermo Schmeda-Hirschmann, por su valiosa ayuda en el desarrollo de la Tesis y la confianza depositada en mí.

•

A los profesores Jaime Rodríguez, Cristina Theoduloz y Ivan Razmilic, por el apoyo otorgado.

•

A todo el personal del Instituto de Química de Recursos Naturales, por su grata compañía y disponibilidad.

•

A mis amigos, Cristina, Marianela, Javier, Margarita, Orlando, Alejandro, Jaime y Alejandra, por sus consejos desinteresados y sinceros, y por su valiosa amistad.

•

A mis padres Silvia y Norberto, por el amor incondicional que siempre me han dado.

•

A mis hermanos Gabriel y Fernando, cuñadas Stella y Andrea, sobrinos Analia, Pilar y Leonardo, también a mi familia Isabel, Aida, Rorberto y Robertito, especialmente a los que ya no están Juan y Lila, por TODO.

Dedicatoria A mis padres, Silvia y Norberto, A mi familia.

Índice. Página Resu men

V

Abstract

VII

1

Introducción

1

1.1

Marco teórico

1

1.2

Hipótesis de trabajo

13

1.3

Objetivos generales

13

1.4

Objetivos específicos

14

2

Materiales y Métodos

15

2.1

Material vegetal

15

2.2

Extracción

15

2.2.1

Método A

15

2.2.2

Método B

15

2.3

Aislamiento

16

a. Extractos obtenidos por el método A

16

b. Extractos obtenidos por el método B

17

c. Aislamiento de jatrofolonas A y B

18

2.4

Modificaciones químicas

18

2.4.1

Derivados del ácido ciperenoico

18

a. Metilación

18

b. Reducción

19

c. Acetilación

19

Obtención de amidas (d-f)

20-22

d. Reacción con etilamina

20

e. Reacción con butilamina

21

f. Reacción con p-anisidina

21

g. Hidrogenación

22

I

2.4.2

Derivados de los diterpenos jatrofolonas A y B

22

a. Metilación

23

b. Formación del éter propílico

23

c. Acetilación de jatrofolona A

24

d. Acetilación de jatrofolona B

24

e. Metilación y alquilación α al carbonilo con un grupo metilo

25

f. Alquilación α al carbonilo con un grupo metilo

25

g. Alquilación α al carbonilo con un grupo propilo

26

h. Formación del éter propílico y alquilación α al carbonilo con

27

un grupo propilo Obtención de ésteres (i-k)

27-29

i. Reacción con cloruro de 3-cloropropionilo

27

j. Reacción con cloruro de 4-nitrobenzoilo

28

k. Reacción con cloruro de 4-clorobenzoilo

29

2.5

Biotransformación del diterpeno jatrofona

29

2.5.1

Escala analítica

30

2.5.2

Escala preparativa

30

2.6

Cromatografía en capa fina (TLC)

31

2.7

Técnicas de separación empleadas

32

2.8

Solventes y Reactivos

32

2.9

Determinación de constantes físicas y espectroscópicas

32

2.10

Determinación de la lipofilia teórica

33

2.11

Determinación de la bioactividad

33

2.11.1

Animales

33

2.11.2

Modelo de úlcera gástrica inducida con HCl/EtOH

33

2.11.3

Cultivo de células MRC-5

34

2.11.4

Cultivo de células AGS

34

2.11.5

Citotoxicidad

35

2.11.6

Análisis estadístico

35

II

3

Resultados

36

3.1

Aislamiento de compuestos bioactivos de los rizomas de

36

Jatropha isabelli 3.2

Derivados del ácido ciperenoico

41

3.3

Derivados de las jatrofolonas A y B

46

3.4

Biotransformación de jatrofona

54

3.5

Actividad biológica

58

3.5.1

Compuestos bioactivos de los rizomas de Jatropha isabelli

58

a. Efecto gastroprotector

58

b. Citotoxicidad y lipofilia

59

Ácido ciperenoico y derivados

61

a. Efecto gastroprotector

61

b. Citotoxicidad y lipofilia

62

Derivados de las jatrofolonas A y B

63

a. Efecto gastroprotector

63

b. Citotoxicidad y lipofilia

65

4

Discusión

67

4.1

Biotransformación

69

4.2

Lipofilia teórica

70

4.3

Efecto gastroprotector

71

4.4

Citotoxicidad

76

4.5

Efecto gastroprotector y citotoxicidad

78

5

Conclusiones

79

6

Proyecciones

80

7

Bibliografía

82

3.5.2

3.5.3

III

8

Anexos

98

8.1

Descripción de los compuestos mayoritarios presentes en

98

Jatropha isabelli (compuestos 1-7) 8.2

Descripción de los sesquiterpenos derivados del ácido

100

ciperenoico (compuestos 8-14) 8.3

Descripción de los diterpenos derivados de jatrofolonas A y B

101

(compuestos 15-30) 8.4

Descripción del derivado biotransformado de la jatrofona

103

(compuesto 31) 8.5

Publicaciones

105

8.6

Presentaciones a congresos

105

IV

Resumen.

Jatropha isabelli Muell. Arg. (Euphorbiaceae), es conocida en Paraguay como “yaguá rová” y una infusión, decocción o maceración de los rizomas es usada en la medicina tradicional como digestivo. En el marco de esta Tesis se investigó la actividad gastroprotectora y citotoxicidad de productos naturales y sus derivados semisintéticos, obtenidos de J. isabelli. De los rizomas se aislaron el triterpeno ácido acetil aleuritólico (1), el sesquiterpeno ácido ciperenoico (2), los diterpenos jatrofona (3) y las jatrofolonas A (4) y B (5), un nuevo diterpeno al cual hemos llamado 9β, 13β-dihidroxiisabelliona (6) y el monoterpeno 1,4-epoxi-p-mentan-2-ol (7).

Los compuestos mayoritarios (1-5) fueron evaluados como gastroprotectores, por vía oral, en el modelo de úlcera gástrica inducida por HCl/EtOH en ratones. Los compuestos 1, 2 y 4 se evaluaron a tres diferentes dosis (25, 50 y 100 mg/kg) y los compuestos 3 y 5 se ensayaron en cinco dosis (6, 12, 25, 50 y 100 mg/kg). Todos los productos mostraron efecto gastroprotector relevante y esta actividad fue dependiente de la dosis. Se seleccionaron para proseguir la investigación los compuestos mayoritarios 2, 3, 4 y 5.

A partir del ácido ciperenoico (2) se prepararon 7 derivados (8-14) los cuales se ensayaron a una dosis de 50 mg/kg. El mejor efecto gastroprotector de esta serie fue presentado por el ácido 15-patchoulanoico (14), reduciendo el índice de lesión en un 86%, mientras que el efecto del ciperenol, metil éster del ácido ciperenoico y las etil y butilamidas del ácido ciperenoico se mantuvo en el mismo rango reduciendo las lesiones gástricas entre 72 y 77%. Sin embargo, el ciperenol y el metil éster del ácido ciperenoico fueron más citotóxicos que las amidas, con valores de IC50 de 48 y 75 µM para el ciperenol y 44 y 75 µM para el metil éster, sobre células AGS y fibroblastos respectivamente.

Partiendo de los diterpenos 4 y 5, se prepararon por reacciones de semisíntesis 16 derivados, de los cuales 12 son nuevos. La biotransformación de jatrofona (3) por Aspergillus niger produjo el nuevo diterpeno 9β-hidroxiisabeliona (31).

V

Jatrofona mostró efecto gastroprotector muy fuerte a las dosis de 25, 50 y 100 mg/kg, reduciendo las lesiones entre 80-93%, decreciendo su efecto a la dosis de 12 mg/kg (57%) y desapareciendo éste a la dosis de 6 mg/kg. Mientras jatrofolona A presentó efecto asociado a la dosis, con el efecto máximo (reducción de la lesión del 54%) a 100 mg/kg, la jatrofolona B demostró acción gastroprotectora muy fuerte aún a la dosis más baja (6 mg/kg, 65% reducción de lesiones), disminuyendo las lesiones en un 83 a 91% entre las dosis de 12 a 100 mg/kg. Teniendo en cuenta la curvas de dosis respuesta de las jatrofolonas A y B se decidió evaluar los derivados de la jatrofolona A a 100 mg/kg y los derivados de la jatrofolona B, así como los compuestos 27-30, a 25 mg/kg. En los derivados de jatrofolona B, fue observada una disminución de la actividad gastroprotectora tanto para los derivados éteres como para los ésteres, en comparación con el compuesto de partida que presentaba un grupo OH libre en C14. En los derivados de jatrofolona A los éteres metílicos y propílicos de esta serie presentaron un efecto gastroprotector mejor que el producto natural. La esterificación del OH fenólico redujo el efecto gastroprotector a excepción del derivado 20. La adición de un grupo metilo adicional en C-2 condujo a la pérdida de selectividad estereoquímica en la molécula.

La jatrofona presentó una citotoxicidad alta, con valores de IC50 de 2,8 µM en fibroblastos y 2,5 µM para células AGS. La jatrofolona B no fue citotóxica sobre fibroblastos y células AGS, mientras la jatrofolona A exhibió una alta selectividad contra las células AGS (IC50: 49 µM). Al comparar el efecto citotóxico de las jatrofolonas A y B contra las células AGS, es clara la importancia de la estereoquímica, como puede comprobarse comparando los valores de IC50 de 49 µM y >1000 µM para los isómeros β y α en C-16, respectivamente.

En total, se aislaron y obtuvieron por semisíntesis 31 compuestos, de los cuales dos productos naturales son nuevos, así como 16 derivados de semisíntesis. Los resultados obtenidos sugieren un gran potencial de los diterpenos de Euphorbiaceae como fuente de nuevos productos gastroprotectores de origen semisintético.

Palabras claves: Jatropha isabelli, Euphorbiaceae, Efecto gastroprotector, Citotoxicidad, Ácido ciperenoico, Jatrofona, Jatrofolonas A y B, Semisíntesis, Biotransformación. VI

Abstract.

Jatropha isabelli rhizomes have a long historical use as a digestive herbal remedy in Paraguayan traditional medicine. It is prepared as an infusion, decoction or maceration. The present work is aimed toward the study of gastrotective and citotoxic activities of natural compounds and some semisynthetic derivatives obtained from rhizomes of J. isabelli. The following compounds were isolated after carrying out the extraction procedures: the triterpene acetyl aleuritolic acid (1), the sesquiterpene cyperenoic acid (2), the diterpenes jatrophone (3) and jatropholones A (4) and B (5), a new jatrophone derivative (6) and a monoterpene (7). The gastroprotective effect of the compounds (1-5) was assessed in the HCl/EtOH-induced gastric lesions model in mice. The main plant compounds 2, 3, 4 and 5 were selected for further investigation. The biotransformation of jatrophone (3) by Aspergillus niger produced the new diterpene 9β-hydroxyisabellione (31).

The gastroprotective effect of cyperenoic acid and 7 semisynthetic derivatives (8-14) was assessed at a single oral dose of 50 mg/kg. The compound 15-patchoulanoic acid (14) presented the best gastroprotective effect, reducing gastric lesions by 86%. The gastroprotective effects shown by cyperenol, cyperenoic acid methyl ester and the ethyl- and butylamides obtained from cyperenoic acid were in the same range, reducing gastric lesions by 72-77%. Cyperenol and cyperenoic acid methyl ester, however, were more cytotoxic.

Starting with the diterpenes 4 and 5, 16 derivatives were prepared by semisynthesis, 12 of which are reported for the first time. Jatrophone elicited a strong gastroprotective effect at doses of 25, 50 and 100 mg/kg reducing lesions between 88-93%. At a dose of 12 mg/kg the effect was reduced (57%) and no effect was observed at 6 mg/kg dose. Jatropholone A presented a dose-related response, with a maximum effect (54% lesion reduction) at 100 mg/kg. Jatropholone B showed a strong action at all the doses, reducing lesions by 65-91%. The jatropholone A derivatives were compared at 100 mg/kg while the jatropholone B derivatives and the compounds 27-30 were assessed at 25 mg/kg. A decrease in gastroprotective activity was observed both, for the ether as well as for the ester derivatives of jatropholone B, compared with the parent compound presenting a free OH group at C-14. In VII

the jatropholone A derivatives, the methyl and propyl ethers presented a better gastroprotective effect than the natural product. Esterification of the phenolic OH reduced the gastroprotective effect. The placement of an additional methyl group at C-2 led to stereochemistry selectivity loss at this place of the molecule.

The cytotoxicity of compounds was assessed towards fibroblasts and AGS cells. Jatrophone was toxic against both cell lines (IC50 values: 2.8 and 2.5 µM, respectively). Jatropholone B (5) was not cytotoxic while jatropholone A (4) displayed a selective effect against AGS cells (IC50: 49 µM). The relevance of stereochemistry in the biological effects is clear comparing the effect of jatropholone A and B against AGS cells, with IC50 values of 49 and >1000 µM for the β and α C-16 isomers, respectively.

Altogether, 31 compounds were isolated or obtained by semisynthesis. Two natural products are described for the first time, as well as 16 semisynthesis derivatives. The obtained results suggest a great potential for Euphorbiaceae diterpenes as a source of new gastroprotective products of semisynthetic origin.

Keywords: Jatropha isabelli, Euphorbiaceae, Gastroprotective effect, Cytotoxicity, Ciperenoic acid, Jatrophone, Jatropholones A and B, Semisynthesis, Biotransformation.

VIII

Abreviaturas Ac2O

Anhídrido acético

AcOEt

Acetato de etilo

AINE

Antiinflamatorio no esteroidal

AGS

Línea de células de adenocarcinoma gástrico humano

AMP

Adenosina monofosfato

br d

Doblete ancho

br s

Singulete ancho

CC

Cromatografía en columna

CDCl3

Cloroformo deuterado

CH2N2

Diazometano

cm

10-2 metro

COSY

Correlation spectroscopy (espectroscopía de correlación)

COX

Ciclooxigenasa

d

Doblete

dd

Doble doblete

ddq

Doble doble cuarteto

ddqbr

Doble doble cuarteto ancho

DFT

Density functional theory (teoría de densidad funcional)

DMF

Dimetilformamida

DMSO

Dimetilsulfóxido

EI

Electron ionization (ionización de electrones)

EP

Éter de petróleo

ESI

Electrospray ionization (ionización por electrospray)

EtOH

Etanol

Et2O

Éter etílico

Et3N

Triétil amina

eV

electrón Volt

FT-IR

Espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier

g

gramo

GSH

Glutatión reducido

h

Hora

H2

Hidrógeno

Ham F12

Medio de cultivo

HCl

Ácido clorhídrico

HMBC

Heteronuclear multiple bond correlation (correlación heteronuclear de enlace multiple)

HRMS

High resolution mass spectrometry (espectrometría de masas de alta resolución)

HSQC

Heteronuclear single-quantum correlation (correlación heteronuclear simple cuanto)

Hz

Hertz

IC50

Concentración que produce el 50% de efecto inhibitorio del parámetro evaluado

IR

Infrarrojo

J

Constante de acoplamiento

kg

103 gramos

l

litro

Lan

Lansoprazol

LiAlH4

Hidruro de litio y aluminio

log P

Logaritmo del coeficiente de partición n-octanol/agua

m

Multiplete

M

Molar

MeI

Yodo metano

MEM-E

Medio esencial mínimo Eagle

MeOH

Metanol

mg

10-3 gramo

MHz

Mega Hertz

min

minutos

ml

10-3 litro

mm

10-3 metro

mmol

Milimol

mM

Milimolar

MRC-5 nm

Línea celular permanente derivada de fibroblastos de pulmón humano 10-9 metro

m/z

Relación entre masa y carga

N2

Nitrógeno

NaH

Hidruro de sodio

Na2SO4

Sulfato de sodio

NO

Óxido nítrico

NOESY

Nuclear Overhauser effect spectroscopy (espectroscopía de efecto Overhauser nuclear)

PBS

Buffer fosfato salino

Pd/C

Paladio sobre carbono

PG

Prostaglandina

PGE2

Prostaglandina E2

ppm

Partes por millón

PropI

Yodo propano

Py

Piridina

q

Cuarteto

Rf

Factor de retención

RMN

Resonancia magnética nuclear

rpm

Revoluciones por minuto

s

Singulete

SH

Sulfhidrilo

SFB

Suero fetal bovino

SOCl2

Cloruro de tionilo

sRNA

soluble ribonucleic acid (ácido ribonucleico soluble)

t

Triplete

THF

Tetrahidrofurano

TLC

Cromatografía en capa fina

VIH

Virus de la inmunodeficiencia humana

20

[α] D

Rotación óptica

°C

Grados Celsius

δ

Desplazamiento químico

µg

10-6 gramo

µl

10-6 litro

µM

10-6 Molar

1. Introducción.

1.1 Marco teórico.

Una úlcera péptica es definida como una pérdida de la integridad de la mucosa del estómago y /o duodeno (Del Valle, 2001). Se debe al desequilibrio entre los mecanismos de defensa de la mucosa gastroduodenal y las fuerzas que la alteran (Figura 1). La presencia de ácido y de pepsina gástricos es un requisito indispensable en todas las ulceraciones pépticas (Crawford, 2003).

Figura 1. Estructura de la mucosa gástrica antes y después de la ulceración (Crawford, 2003).

1

Cuando se produce una rotura de la barrera mucosa, la muscularis mucosae limita la lesión. Cuando ésta es superficial y afecta sólo a la mucosa, cura en un plazo de horas o días. Cuando se extiende a la submucosa, la curación completa requiere varias semanas. Aunque nuestros conocimientos sobre estos mecanismos de defensa son imperfectos, es fácil comprender que estos procesos son fundamentales, pues de lo contrario la pared gástrica sufriría el mismo destino de cualquier trozo de carne deglutido (Crawford, 2003).

El primer nivel de defensa del estómago corresponde a los factores secretados dentro del lumen: ácido, moco, bicarbonato y sustancias antibacterianas. La función principal del ácido gástrico es reducir el número de bacterias ingeridas que entran al intestino delgado y activar la pepsina. El segundo nivel de defensa es el epitelio, el cual es marcadamente resistente al daño inducido por ácido. El epitelio actúa también como una barrera para la difusión pasiva de sustancias dañinas. La microcirculación representa el tercer nivel de defensa de la mucosa, es modulado por el sistema nervioso y diferentes mediadores inflamatorios. La sangre diluye y/o neutraliza el ácido o toxinas y previene que se acumulen en la mucosa a concentraciones citotóxicas. El cuarto nivel de defensa es el sistema inmune de la mucosa, constituido de varios inmunocitos residentes dentro de la lámina propia que actúan como centinelas. El nivel final de defensa en la mucosa entra en juego cuando la úlcera ya se ha formado. La úlcera es reparada a través del crecimiento y redesarrollo de las glándulas gástricas, crecimiento de nuevos vasos sanguíneos y reinervación de la mucosa por los nervios extrínsecos e intrínsecos (Wallace y Ma, 2001).

La secreción de ácido se produce a través de la célula parietal de las glándulas fúndicas del estómago en respuesta a un estímulo como ver, saborear, oler, masticar y tragar un alimento, o por la presencia de alimento en el estómago o intestino. Estos estímulos resultan en la activación de los receptores de histamina, acetilcolina o gastrina localizados en la membrana de la célula parietal, los cuales inician el camino de transducción de señales que convergen en la activación de la enzima H+, K+-ATPasa (el paso final de la secreción de ácido). La Figura 2 muestra el proceso en la generación de ácido gástrico (Olbe et al., 2003).

2

El aumento en la acidez puede ser causado por estrés (mental y físico), dieta, alcohol, café, tabaco y tratamiento con drogas antiinflamatorias no esteroidales.

Figura 2. Mecanismos regulatorios de la secreción de ácido en la célula parietal (modificada de Olbe et al., 2003).

Los antiinflamatorios no esteroidales (AINEs), como la aspirina, son las drogas de mayor consumo en el mundo. Su extenso uso es debido a sus propiedades analgésicas, antiinflamatorias y antipiréticas. Sin embargo, estos agentes producen efectos adversos sobre el tracto digestivo debido a que inhiben la ciclooxigenasa (COX), enzima responsable en la síntesis de prostaglandinas (PG) endógenas (Villegas et al., 2004). Diversos estudios demuestran la presencia de dos isoformas de la ciclooxigenasa: COX-1 (isoforma constitutiva) expresada en la mayoría de los tejidos y en las plaquetas de la sangre, responsable de la producción de PG, y la COX-2 (isoforma inducible), expresada solamente en respuesta a agentes antiinflamatorios en células epiteliales, fibroblastos, eosinófilos, monocitos y macrófagos. La acción antiinflamatoria de los AINEs es a través de la COX-2, mientras que sus efectos adversos como el daño gástrico es debido a la inhibición de la COX-1 (Bavbek et 3

al., 2006). Las prostaglandinas son conocidas por tener un efecto antisecretorio sobre la producción de ácido gástrico. Pueden actuar directamente sobre las células parietales reduciendo la síntesis intracelular de adenosina monofosfato (AMP) cíclico como también su propia actividad secretora. Además tienen efecto citoprotector ya que estimulan la secreción de mucus y bicarbonato y mantienen el correcto funcionamiento del flujo sanguíneo (Rao et al., 1998).

La integridad de la mucosa gástrica es mantenida por un proceso dinámico de muerte y proliferación celular. Entre los factores involucrados en la lesión de la mucosa gástrica se encuentran el daño oxidativo (debido a especies reactivas de oxígeno) y la apoptosis o muerte celular programada. Ellos juegan un rol importante en la pérdida de la integridad de la mucosa gástrica causada por varios factores agresivos (Biswas et al., 2003).

Otros mediadores importantes en la citoprotección gástrica son el oxido nítrico (NO) y los compuestos con grupos sulfhidrilos (SH). Evidencias experimentales demuestran que el NO reduce la severidad del daño gástrico de la mucosa inducido por etanol. Este efecto puede estar relacionado con la acción del NO sobre diferentes blancos, incluyendo la prevención de la adherencia de leucocitos al endotelio, mantenimiento del flujo sanguíneo de la mucosa y estimulación de la secreción de mucus (Muscará et al., 1999). Respecto a los compuestos con grupos sulfhidrilos, diversos estudios han demostrado que protegen a la mucosa gástrica subyacente contra los radicales libres (Tariq y Moutaery, 2005; Andreo et al., 2006). Luego de su oxidación los grupos sulfhidrilos son recuperados por la enzima glutatión reductasa, la cual rompe los enlaces S-S y forma los grupos sulfhidrilos (Ávolos et al., 1998).

Las neuronas aferentes nociceptivas que innervan el estómago y cuyo papel es supervisar el daño del tejido fino y activar los mecanismos de protección habían sido poco consideradas hasta hace poco tiempo. El descubrimiento que las neuronas sensoriales contribuyen a la homeostasis de la mucosa gástrica resultó de la exploración de un rasgo neurofarmacológico que las hizo distinguir de otras neuronas. El estómago es innervado por dos grupos distintos de aferentes extrínsecos, los aferentes espinales y los vagales. Los aferentes espinales son originados desde cuerpos celulares en los ganglios de la raíz dorsal y alcanzan el estómago vía 4

los nervios esplénicos y mesentéricos, mientras que las fibras aferentes vagales se originan de cuerpos celulares presentes en los ganglios nodular y yugular (Holzer y Pabst, 1999).

La capsaicina, el ingrediente principal del ají, se une a receptores vanilloides específicos (VR-1) de neuronas sensoriales primarias. Dosis bajas de capsaicina estimulan los nervios sensoriales primarios abriendo los canales catiónicos no selectivos asociados a los receptores vanilloides, dando por resultado la liberación local de neurotransmisores tales como péptido genéticamente relacionados con calcitonina (CGRP) y sustancia P. La acumulación de ácido en el lumen gástrico induce a las fibras nociceptivas nerviosas para liberar CGRP, el cual, vía la activación de los receptores CGRP1, facilita el lanzamiento de somatostatina y decrece la liberación de gastrina, histamina, y acetilcolina y de esta manera inhibe la salida adicional de ácido. La acción gastroprotectiva del transmisor primario CGRP implica también mensajeros secundarios tales como óxido nítrico (NO), PGI2 y PGE2, mediadores que aumentan el flujo sanguíneo de la mucosa. Otros mecanismos protectores son reflejados por la capacidad que tiene la capsaicina de estimular la secreción de moco y bicarbonato en la mucosa gastroduodenal. La administración intragástrica aguda a dosis excitatorias de capsaicina atenúa el daño macroscópico e histológico causado por HCl, sales biliares, aspirina, indometacina, y etanol (Holzer y Pabst, 1999).

Por otra parte, altas dosis (neurotóxicas) de capsaicina conducen a la ablación o inactivación funcional de los nervios sensoriales. El tratamiento previo de ratas con una dosis neurotóxica de capsaicina no causa daño por sí misma pero exacerba las erosiones de la mucosa causadas por factores perjudiciales tales como estrés, HCl, sales biliares, aspirina, indometacina y etanol (Holzer y Pabst, 1999).

Hasta 1983, la secreción ácida del estómago se consideraba el principal factor causal de la úlcera duodenal. Por ello, el tratamiento de elección eran los fármacos antisecretores. Así, a la cimetidina le siguieron otros antagonistas H2 (ranitidina, famotidina) y los fármacos inhibidores de la bomba de protones (omeprazol, lansoprazol). Pero, aunque estos medicamentos supusieron un avance, no lograron reducir el número de recidivas ulcerosas. Este hecho supuso un estímulo para la búsqueda de nuevas alternativas y fue así como ese 5

mismo año se descubrió la implicancia de Helicobacter pylori en este tipo de patologías (Hernández et al., 1996). Helicobacter pylori es una bacteria Gram negativa que coloniza la mucosa gástrica donde se asienta y se multiplica liberando varias sustancias tóxicas, desencadenando e iniciando un daño histológico. La bacteria es capaz de protegerse de los efectos letales del ácido gástrico gracias a que posee una potente enzima denominada ureasa, la cual forma una “nube de amonio” que le sirve para tamponar su entorno vital y poder colonizar el epitelio (Valenzuela, 2004; Piñol Jiménez y Paniagua Estévez, 1999). A pesar que no está demostrada totalmente la relación de causalidad entre el microorganismo y la úlcera péptica, es evidente el hecho de que la erradicación de la bacteria va acompañada de una disminución drástica en el índice de recidivas ulcerosas (Hernández et al., 1996).

El tratamiento de las infecciones por H. pylori in vivo con un sólo agente ha sido relativamente ineficaz, y ha ocasionado la aparición de cepas de H. pylori resistentes a fármacos. A causa de esta resistencia actualmente se están empleando, con buenos resultados, programas terapéuticos antimicrobianos dobles o triples, en combinación con fármacos antisecretores (Brunton, 1996).

Los objetivos del tratamiento de las úlceras son el alivio del dolor, promoción de la cicatrización y prevención de las recurrencias. Las estrategias terapéuticas tienen como finalidad equilibrar los factores agresivos (secreción de ácido gástrico, pepsina, infección por H. pylori) contra los factores de defensa o citoprotectores (secreción de bicarbonato, secreción de moco, producción de prostaglandinas). Los fármacos que reducen la secreción de ácido gástrico (antagonistas de los receptores H2 de la histamina e inhibidores covalentes de la H+, K+-ATPasa de la célula parietal) promueven con eficacia la cicatrización (Brunton, 1996).

Muchos estudios se han realizado sobre el tratamiento de las úlceras pépticas a partir de productos naturales. En la literatura se puede encontrar una gran cantidad de extractos y compuestos con efecto gastroprotector. Entre los extractos activos no sorprende el hecho de que la mayoría de ellos provengan de plantas utilizadas en medicina tradicional, por ejemplo: Anethum graveolens, utilizado tradicionalmente en algunas enfermedades gastrointestinales (Hosseinzadeh et al., 2002), Ageratum conyzoides, usada contra el tratamiento de úlceras, 6

purgante, entre otros usos (Shirwaikar et al., 2003), Pfaffia sp., usada en molestias gástricas (Freitas et al., 2003), Gingko biloba, de conocida actividad antioxidante (Shetty et al., 2000). Otro detalle a destacar es que se utilizan extractos obtenidos de diferentes partes de la planta, por ejemplo: corteza de Camelia sinensis (Maity et al., 2003), hojas y tallo de Phyllanthus amarus (Raphael y Kuttan, 2003), fruto de Hippophae rhamnoides (Süleyman et al., 2001), rizomas de Picrorhiza kurroa (Ray et al., 2002) y semillas de Curcubita moschata (Munasinghe et al., 1993).

En relación a los compuestos con actividad gastroprotectora, la gran diversidad de estructuras que tienen efecto sobre la úlcera péptica deja en claro la existencia de diferentes mecanismos de acción para el tratamiento de esta patología. En literatura se han reportado flavonoides, alcaloides, terpenos y otros compuestos con actividad gastroprotectora (Lewis y Hanson, 1991). Entre los terpenos con actividad gastroprotectora podemos mencionar: poligodial, aislado de Tasmania lanceolata (Matsuda et al., 2002), carbenoxolona sódica, aislada de Glycyrrhiza glabra (Lewis y Hanson, 1991), sesquiterpenos conjugados con aminoácidos, aislados de Saussurea lappa (Matsuda et al., 2000), lactonas sesquiterpénicas, aisladas de Artemisia douglasiana (Giordano et al., 1990, Guardia y Guzman, 1994), solidagenona, aislada de Solidago chilensis (Schmeda-Hirschmann et al., 2002), lactonas diterpenicas, aisladas de Croton cajucara (Hiruma-Lima et al., 1999, Hiruma-Lima et al., 2000, Silva Melo et al., 2003) y ácido oleanólico, obtenido de Fabiana imbricata (Astudillo et al., 2002; Rodríguez et al., 2003).

Los terpenos son metabolitos secundarios que poseen una enorme variedad de estructuras y son de amplia distribución en el reino vegetal. Un gran número de plantas contiene elevadas cantidades de estos metabolitos, cuya principal función es la defensa química frente al ataque de patógenos. Se ha reportado una variada gama de actividades biológicas de los terpenos, incluyendo efecto antibacteriano, antifúngico, inhibidores enzimáticos, hormonas vegetales, inhibidores del crecimiento vegetal, antialimentarios de insectos, antitumorales, edulcorantes, principios amargos y actividad alelopática (Theis y Lerdau, 2003).

7

La familia Euphorbiaceae se caracteriza por poseer una gran variedad de diterpenos que se encuentran clasificados en grupos de acuerdo a la naturaleza química de sus núcleos hidrocarbonados, los cuales están biosintéticamente relacionados (Figura 3). Entre ellos se destacan los esqueletos químicos del casbano, jatrofano, latirano, jatrofolano, crotofolano y ramnofolano, los que se conocen como diterpenos macrocíclicos, siendo en general compuestos no tóxicos. Sin embargo, dentro de esta familia se encuentran también los esqueletos del tigliano, dafano e ingenano conocidos como esteres de forbol los cuales son compuestos promotores de tumor (Evans, 1986).

El género Jatropha (Euphorbiaceae) posee entre 165 y 175 especies distribuidas en las regiones secas, semisecas y subhúmedas de América, África, península Arábiga, India e islas del Pacífico (Ramirez y Gordillo, 1994). Existen diferentes especies de Jatropha cuyos extractos muestran variadas actividades. Extractos de Jatropha multifida poseen actividad antibacteriana (Aiyelaagbe, 2000). Los extractos de J. gossipiifolia y especies relacionadas han sido utilizadas por muchos años para tratar cancer (Kupchan et al., 1976). Los aceites de J. curcas son utilizados para el tratamiento de ciática, gota, parálisis, reumatismo, ciertas enfermedades de la piel y como antidiarreico (Mujundar et al., 2000), habiéndose reportado su actividad antiinflamatoria (Mujundar y Misar, 2004), antitumoral (Lin et al., 2003), antiulcerosa (Villegas et al., 1997) y anti VIH (Matsuse et al., 1999). Jatropha elliptica es utilizada en medicina tradicional del Brasil para tratar neoplasias, inflamación, úlceras y enfermedades renales entre otras (Calixto y Sant’Ana, 1990). El extracto crudo de sus rizomas posee una potente actividad antibacteriana (Marquez et al., 2005).

Por su parte, Jatropha isabelli Muell. Arg. (Euphorbiaceae), es conocida en el este de Paraguay como “yaguá rová” y una infusión, decocción o maceración de los rizomas es usada en la medicina tradicional como digestivo, para el tratamiento de reumatismo, gota y como abortiva (Schmeda-Hirschmann et al., 1996). En bases de datos botánicos se encuentra que Jatropha isabelli es sinónimo de Jatropha gossipiifolia y Jatropha gosypiifolia (http://www.ipni.org/index.html).

8

Tetraprenil -OPP

Cembrano

Ramnofolano

Casbano

Jatrofano A

Latirano

Jatrofano B

Tigliano

Jatrofolano

Dafano

Ingenano Crotofolano

Figura 3. Camino biosintético hipotético de los diterpenos de Euphorbiaceae (modificada de Evans, 1986).

9

Los terpenos del género Jatropha son típicos de las Euphorbiaceae y comprenden diferentes esqueletos químicos. Se han aislado terpenos de Jatropha grossidentata (Jakupovic et al., 1988, Schmeda-Hirschmann et al., 1992), J. weddelliana (Brum et al., 2001) y J. podagrica (Aiyelaagbe et al., 1998), siendo en su mayoría diterpenos del tipo latirano, como por ejemplo jatrogrossidiona, 4E-jatrogrossidentadiona y 15-epi-4E-jatrogrossidentadiona (Figura 4) los cuales fueron aislados desde las tres especies de Jatropha mencionadas anteriormente.

OH

OH

O

O

O

O

H O Jatrogrossidiona

HO

15β-OH : 4E-jatrogrossidentadiona 15α-OH : 15-epi-4E-jatrogrossidentadiona

Figura 4. Estructuras de algunos diterpenos del tipo latirano.

Los diterpenos del tipo jatrofano, jatrofolano y latirano son compuestos macrocíclicos que exhiben acción antitumoral. Estos compuestos pueden originar nuevas drogas antitumorales de baja toxicidad. Compuestos relacionados también han mostrado propiedades analgésicas y antiulcerogénicas (Evans, 1986).

Existen relativamente pocos informes sobre el efecto gastroprotector de sesquiterpenos aislados de plantas medicinales. La mayoría de los estudios se han centrado en lactonas sesquiterpénicas (Giordano et al., 1990; Lewis y Hanson, 1991; Foglio et al., 2002) y poligodial y sus derivados (Matsuda et al., 2002). Recientemente, Matsuda et al. (2002) y Pongpiriyadacha et al. (2003) han divulgado que el modo de acción subyacente para la actividad gastroprotectora de poligodial y compuestos relacionados puede incluir efectos sobre

10

las prostaglandinas endógenas (PGs), compuestos con grupos sulfhidrilo (SHs), óxido nítrico (NO) y receptores vanilloides. Foglio et al. (2002) han sugerido que las lactonas sesquiterpénicas dihidro-epideoxiarteannuina B y deoxiartemisinina actúan como compuestos gastroprotectores incrementando el contenido de prostaglandinas.

Dentro de los diterpenos con actividad gastroprotectora más estudiados se encuentran los clerodanos aislados desde Croton cajucara incluyendo trans-dehidrocrotonina (DHC) (Souza-Brito et al., 1998; Hiruma-Lima et al., 1999; Rodríguez et al., 2004) trans-crotonina (Hiruma-Lima et al., 2002), crotonina (Albino de Almeida et al., 2003) y derivados de DHC (Melo et al., 2003). Hiruma-Lima et al. (1999) sugieren que el efecto gastroprotector de la DHC puede ser debido a un efecto sinérgico provocado entre el aumento de la liberación de PGE2 y el antagonismo no competitivo de los receptores-H2 y muscarínicos. Recientemente, se ha demostrado que el diterpeno solidagenona y sus análogos estructurales actúan in vitro como gastroprotectores incrementando el contenido celular de glutatión reducido (GSH), además algunos derivados exhiben actividad curativa in vitro estimulando la proliferación celular (Rodríguez et al., 2005).

Entre los triterpenos gastroprotectores podemos mencionar a la carbenoxolona sódica como uno de los más conocidos y estudiados. Lewis y Hanson (1991) han reportado que este compuesto actúa como gastroprotector manteniendo el contenido de PG en la mucosa gástrica en altas concentraciones e inhibiendo la secreción de pepsina. Otros triterpenos activos son el ácido oleanólico, ácido ursólico, lupeol acetato y taraxerol (Lewis y Hanson, 1991). Recientemente, Sánchez et al. (2006) han evaluado la actividad gastroprotectora del ácido oleanólico y varios derivados en modelos in vitro.

Los objetivos perseguidos en la investigación de plantas empleadas como medicinales son: a) aislamiento de los compuestos bioactivos para su uso directo como drogas y b) producir compuestos bioactivos con estructuras novedosas o conocidas permitiendo generar derivados semisintéticos de mayor actividad y/o menor toxicidad (Fabricant y Farnsworth, 2001).

11

En el Programa de Investigación de Productos Bioactivos de la Universidad de Talca, se ha venido estudiando desde hace años, la actividad gastroprotectora de terpenos de origen natural y semisintético, obtenidos a partir de drogas crudas de América del Sur (Schmeda-Hirschmann et al., 2002; Rodríguez et al., 2003; Schmeda-Hirschmann et al., 2005; Schmeda-Hirschmann et al., 2005a; Sepúlveda et al., 2005). En algunos casos, se ha investigado el posible mecanismo de acción de ciertos terpenos que han demostrado poseer una gran capacidad para prevenir la lesión ulcerosa (Rodríguez et al., 2005; Rodríguez et al., 2006; Sánchez et al., 2006). Siguiendo con estos estudios se propuso determinar la actividad gastroprotectora de los terpenos mayoritarios de Jatropha isabelli, una de las drogas crudas más reputadas en Paraguay como digestivo, así como de los derivados semisintéticos obtenidos a partir de terpenos promisorios.

12

1.2 Hipótesis de trabajo.

En base a los antecedentes mencionados, se postulan las siguientes hipótesis de trabajo:

•

La capacidad de Jatropha isabelli para actuar como una droga cruda digestiva se debe a los terpenos mayoritarios que la constituyen.

•

La jatrofona, así como otros terpenos presentes en los rizomas de Jatropha isabelli poseen actividad gastroprotectora en ratones.

•

El ácido ciperenoico y las jatrofolonas A y B, pueden ser modificados por semisíntesis para acceder a derivados que permitan establecer tendencias en la relación estructura/actividad de estos grupos de terpenos.

•

La modificación estructural puede originar compuestos con mayor relación actividad/citotoxicidad.

1.3 Objetivo general.

•

Determinar el efecto gastroprotector y citotoxicidad de los terpenos mayoritarios de Jatropha isabelli, así como, de los derivados semisintéticos del sesquiterpeno ácido ciperenoico y de los diterpenos jatrofolonas A y B.

13

1.4 Objetivos específicos.

•

Aislar y purificar los terpenos mayoritarios presentes en los rizomas de Jatropha isabelli.

•

Identificar cada uno de los metabolitos mediante métodos espectroscópicos y espectrométricos (1H RMN, 13C RMN, IR, MS, etc.).

•

Modificar el ácido ciperenoico por semisíntesis para obtener derivados en la posición C-15.

•

Modificar los diterpenos jatrofolonas A y B mediante reacciones de semisíntesis.

•

Biotransformar mediante hongos seleccionados el diterpeno jatrofona para obtener derivados hidroxilados.

•

Determinar la actividad gastroprotectora de los compuestos en el modelo de úlcera gástrica inducida por HCl/EtOH en ratones.

•

Evaluar la relación estructura/actividad del sesquiterpeno ácido ciperenoico y de los diterpenos jatrofolonas A y B.

•

Determinar la citotoxicidad de los compuestos evaluados en modelos animales (naturales y de semisíntesis) mediante el ensayo de incorporación del rojo neutro en células AGS y fibroblastos.

14

2. Materiales y Métodos.

2.1 Material vegetal.

Los rizomas de Jatropha isabelli Muell. Arg. (Euphorbiaceae), conocida en la medicina tradicional de Paraguay como “yaguá rová” (7 kg) fueron colectados en Altos, Departamento Cordillera, Paraguay, en mayo de 2004. Los rizomas fueron cortados y secados primero a temperatura ambiente y luego tres días en estufa a 40 ºC.

2.2 Extracción.

La extracción del material en estudio se realizó utilizando dos diferentes métodos para poder determinar un procedimiento óptimo que permitiera obtener el mayor rendimiento de metabolitos secundarios de interés.

2.2.1

Método A:

Los rizomas de Jatropha isabelli (3,00 kg) se sometieron a reflujo (3 x 5,00 l) por 30 minutos sucesivamente con: EP, AcOEt y MeOH. Obteniéndose 50,5 g (1,68 %), 68,3 g (2,27 %) y 185 g (6,16 %) de extraíbles en EP, AcOEt y MeOH respectivamente.

2.2.2

Método B:

Los rizomas de Jatropha isabelli (4,00 kg) se sometieron a reflujo con MeOH (3 x 5,00 l) por 30 minutos. Por concentración a presión reducida se obtuvieron 390 g (9,8 %) de extracto crudo. Se hicieron particiones con CHCl3 (3 x 2,00 l) y AcOEt (3 x 2,00 l) obteniéndose 87,3 g (2,18 %) y 58,5 g (1,46 %) de extractos CHCl3 y AcOEt respectivamente. El extracto polar fue llevado a sequedad obteniéndose 215 g (5,38 %).

15

2.3 Aislamiento.

a. Los extractos de EP (50,5 g) y AcOEt (68,3 g) obtenidos por el método de extracción A se combinaron y fueron cromatografiados en una columna de Sílica gel (2,00 kg, 200-500 µm, longitud de columna 65 cm, diámetro 9 cm) aplicando presión. El gradiente fue EP – EP:AcOEt – AcOEt. Se recolectaron 31 fracciones de 2,00 l cada una. Las fracciones se combinaron teniendo en cuenta sus patrones de TLC, de acuerdo al siguiente orden:

Fracción Solvente 1 (1-9) EP-EP: AcOEt (95:5) 2 (10-24) EP: AcOEt (95:5-90:10) 3 (25-28) EP: AcOEt (90:10-70:30) 4 (29-30) EP: AcOEt (70:30-20:80) 5 (31) EP: AcOEt (20:80)-AcOEt Total

Peso (g) 7,40 18,7 17,7 35,0 13,4 92,2

El grupo de fracciones 1 (1-9) contenía hidrocarburos apolares de poco interés para esta Tesis. El grupo de fracciones 2 (10-24) fue recromatografiado sobre Sílica gel (400 g, 63-200 µm, longitud de la columna 48 cm, diámetro 5 cm) obteniéndose después de cristalización 0,20 g de ácido acetil aleuritólico (1) y 1,30 g de ácido ciperenoico (2).

El grupo de fracciones 3 (25-28) fue sometido a permeación en Sephadex LH-20 (longitud de la columna 48,5 cm, diámetro 4,5 cm) con MeOH. Se obtuvieron 24 fracciones de 20 ml cada una las cuales fueron juntadas teniendo en cuenta sus patrones de TLC. Los siguientes compuestos fueron obtenidos: 0,40 g del triterpeno 1 (fracciones 1-5), 1,20 g de jatrofona (3) (fracciones 6-12). Las fracciones 13-19 fueron repurificadas en Sephadex LH-20 aislándose 1,20 g de la mezcla de isómeros, jatrofolona A y B (4 y 5) y 1,30 g de ácido ciperenoico (2). De las fracciones 20-24 se aislaron 20,0 mg del monoterpeno 1,4-epoxi-p-mentan-2-ol (7).

El grupo de fracciones 4 fue purificado por cromatografía en columna de Sílica gel, obteniéndose 3,50 g de jatrofona (3) y 42,0 mg de un nuevo diterpeno del núcleo jatrofano al cual llamamos 9β, 13β–dihidroxiisabelliona (6). El grupo de fracciones 5 (31) no se trabajó 16

porque contenía metabolitos secundarios de alta polaridad que escapan a los objetivos de esta tesis.

b. Los extractos de CHCl3 (58,5 g) y AcOEt (87,3 g) (método B) combinados fueron cromatografiados en una columna de Sílica gel (2,00 kg, 200-500 µm, longitud de columna 65 cm, diámetro 9 cm) aplicando presión. El gradiente fue EP – EP:AcOEt – AcOEt – MeOH. Se recolectaron 36 fracciones de 2,00 l cada una. De acuerdo a sus patrones cromatográficos en TLC, las fracciones se combinaron según el siguiente orden:

Fracción Solvente 1 (1-8) EP-EP: AcOEt (95:5) 2 (9-15) EP: AcOEt (95:5-90:10) 3 (16-21) EP: AcOEt (90:10-88:12) 4 (22-25) EP: AcOEt (88:12-70:30) 5 (26-32) EP: AcOEt (70:30-AcOEt) 6 (33-36) AcOEt-MeOH Total

Peso (g) 7,60 13,8 9,60 27,7 44,6 32,5 135,8

El grupo de fracciones 1 (1-8) contiene hidrocarburos apolares, similares a los obtenidos por el método A. Los grupos de fracciones 2 (9-15), 3 (16-21) y 4 (22-25) fueron sometidos separadamente a permeación en gel (Sephadex LH-20; longitud de la columna 48,5 cm, diámetro 4,5 cm) con MeOH como fase móvil. Del grupo de fracciones 2 (9-15) se obtuvo, después de cristalización, 0,40 g de ácido acetil aleuritólico (1) y 2,00 g de ácido ciperenoico (2). Del grupo de fracciones 3 (16-21) se aislaron 0,60 g de 1, 1,40 g de 2 y 1,50 g de los isómeros jatrofolona A y B (4 y 5). Del grupo de fracciones 4 (22-25) se obtuvieron 1,40 g de jatrofona (3) y del grupo de fracciones 5 (26-32) luego de cromatografía en columna de Sílica gel se obtuvieron 4,80 g de 3. El grupo de fracciones 6 (33-36) no se trabajó por lo mismo que el grupo de fracciones 5 (31) del método A.

17

c. Aislamiento de las jatrofolonas A y B.

Una mezcla de las jatrofolonas A y B (0,15 g) fue purificada mediante cromatografía en columna (Sílica gel, 50 g, 63-200 µm, longitud de columna 31 cm, diámetro 2 cm) utilizando un sistema de solvente isocrático constituído por EP:AcOEt (90:10). Se colectaron 60 tubos de 20 ml de acuerdo al siguiente orden:

Fracción 27-35 36-44 45-54

Compuesto Jatrofolona A Jatrofolona A y B Jatrofolona B

Peso (mg) 33 61 50

2.4 Modificaciones químicas.

Se prepararon derivados del ácido ciperenoico y de las jatrofolonas A y B mediante reacciones de reducción, acetilación, metilación, esterificación, entre otras (Warren, 1978).

2.4.1 Derivados del ácido ciperenoico.

La preparación de derivados se llevó a cabo siguiendo metodologías clásicas de reacciones de química orgánica. El objetivo de estas reacciones fue la obtención de derivados modificados en la posición 14 y la reducción del doble enlace ∆4,5.

a. Metilación.

CH2N2/Et2O 4

5

14 COOH

COOCH3

2

10

18

En un balón se colocaron 550 mg (2,35 mmol) del ácido ciperenoico (2). Se agregó una solución de diazometano en éter etílico hasta disolución total de la muestra (20,0 ml) y se mantuvo en agitación constante por 12 horas. Se obtuvieron 565 mg (2,27 mmol) del metil éster del ácido ciperenoico (10) (rendimiento 97%).

b. Reducción.

LiAlH4 /THF

COOCH3

CH2OH

10

8

En un balón de tres bocas se pesaron 150 mg (0,60 mmol) del metil éster (10) y se disolvieron en 25,0 ml de THF anhidro. Bajo atmósfera de N2 y agitación constante se fueron adicionando lentamente 34,0 mg (0,900 mmol) de LiAlH4. A continuación el sistema se mantuvo en baño de aceite a 90 °C durante 12 h. Transcurrido este tiempo se paró la reacción con el agregado de hielo y HCl diluido. Se extrajo con AcOEt y se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y concentró a presión reducida. Se obtuvo un crudo de 180 mg, que se purificó por CC en Sílica gel obteniéndose 50,0 mg (0,230 mmol) del ciperenol (8) (rendimiento 38%).

c. Acetilación.

Ac2O/Py

CH2OH

CH2OAc

8

9 19

En un balón se colocaron 78 mg (0,35 mmol) del alcohol 8. Se disolvieron en 1,0 ml de piridina bajo baño de hielo y agitación constante, luego se agregó 1,0 ml de anhídrido acético. Se mantuvo en agitación a temperatura ambiente durante 24 horas. Se paró la reacción mediante el agregado de agua fría, se extrajo con AcOEt, se eliminó la piridina con el agregado de HCl al 10%, la fase orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida obteniéndose 72 mg (0,27 mmol) del acetato de ciperenilo (9) (rendimiento 78%).

Obtención de amidas:

d. Reacción con etilamina.

SOCl2/NH2CH2CH3 Benceno seco, Et3N COOH

CONHCH2CH3

2

11

En un balón de tres bocas se pesaron 150 mg (0,640 mmol) de ácido ciperenoico (2), se disolvieron en 10,0 ml de benceno anhidro. Bajo baño de hielo, agitación constante y atmósfera de N2 se adicionaron lentamente 100 µl (1,38 mmol) de SOCl2. Posteriormente se agregaron 300 µl (2,15 mmol) de Et3N y después de 30 minutos se adicionaron lentamente 50,0 mg (1,11 mmol) de etilamina disuelta en benceno anhidro. La mezcla se mantuvo en un baño de aceite a 90 ºC durante 20 h. Terminada la reacción se adicionó agua y se neutralizó, se extrajo con AcOEt, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y concentró a presión reducida. Se obtuvo un crudo de 130 mg el cual fue purificado mediante CC Sílica gel obteniéndose 50,0 mg (0,190 mmol) de N-etil ciperenamida (11) (rendimiento: 30%).

20

e. Reacción con butilamina.

SOCl2/NH2(CH2)3CH3 Benceno seco, Et3N COOH

CONHCH2CH2CH2CH3

2

12

En un balón de tres bocas se pesaron 200 mg (0,850 mmol) de ácido ciperenoico (2). La muestra se disolvió en 15,0 ml de benceno anhidro. Bajo baño de hielo, agitación constante y atmósfera de N2 se adicionaron lentamente 125 µl (1,73 mmol) de SOCl2. Posteriormente se agregaron 360 µl (2,57 mmol) de Et3N y después de 30 minutos se adicionaron lentamente 90 mg (1,23 mmol) de butilamina disuelta en benceno anhidro. La mezcla de reacción se mantuvo en un baño de aceite a 90 ºC durante 20 h. Se procedió como en d. Se obtuvo un crudo de 230 mg el cual fue purificado mediante CC Sílica gel obteniéndose 100 mg (0,350 mmol) de

N-butil ciperenamida (12) (rendimiento: 41%).

f. Reacción con p-anisidina.

SOCl2/NH2PhOCH3 Benceno seco, Et3N COOH O

2

N H 13

21

OCH3

En un balón de tres bocas se pesaron 140 mg (0,600 mmol) de ácido ciperenoico (2), que se disolvieron en 10,0 ml de benceno anhidro. Bajo baño de hielo, agitación constante y atmósfera de N2 se adicionaron lentamente 100 µl (1,38 mmol) de SOCl2. Posteriormente se agregaron 250 µl (1,79 mmol) de Et3N y después de 30 minutos se adicionaron lentamente 150 mg (1,22 mmol) de p-anisidina disuelta en benceno anhidro, luego se mantuvo en un baño de aceite a 90 ºC durante 20 h. Se procedió como en d. Se obtuvo un crudo de 160 mg el cual fue purificado mediante CC Sílica gel obteniéndose 25,0 mg (7,00x10-2 mmol) del N-(4-metoxifenil) ciperenamida (13) (rendimiento: 12%).

g. Hidrogenación.

H2 , Pd/C + H

H

COOH

COOH

COOH

2

14a

14b

En un balón se colocaron 100 mg (0,430 mmol) del ácido ciperenoico (2). Se disolvió la muestra con 20,0 ml de acetato de etilo y se agregaron 20,0 mg de catalizador Pd/C al 10 % manteniendo en agitación constante. Se extrajo el aire del balón y se dejó en atmósfera de hidrógeno durante 20 horas. Se filtró obteniéndose 80,0 mg (0,340 mmol) de la mezcla de compuestos hidrogenados en una relación 2:1 (14a y 14b) (rendimiento: 79%).

2.4.2 Derivados de los diterpenos jatrofolonas A y B.

La preparación de derivados se llevó a cabo siguiendo metodologías clásicas de química orgánica. El objetivo de estas reacciones fue la obtención de derivados modificados en la posición 14 y modificaciones en la posición α al grupo carbonilo (posición 2).

22

a. Metilación. OH

OCH3

1 R

14

2

NaH/ DMF

H

H

R

CH3I O

O H

4 5

H

R β CH3; α H α CH3; β H

15 21

R β CH3; α H α CH3; β H

En un balón de dos bocas provisto de refrigerante, septum, agitador magnético y atmósfera de N2 se colocaron 100 mg (0,340 mmol) de la mezcla de jatrofolonas A y B y 8,00 ml de DMF, luego se agregaron en cantidad estequiométrica 13,5 mg (0,340 mmol) de NaH al 60% (dispersión en aceite mineral) y se inyectaron con una jeringa a través del septum 60,0 µl (0,900 mmol) de yoduro de metilo. Se dejó en agitación durante 4 horas. Transcurrido este tiempo se paró la reacción con el agregado de hielo y HCl diluido, se extrajo con AcOEt y se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y concentró a presión reducida, obteniéndose un crudo de 86,0 mg el cual fue purificado por CC (Sílica gel) obteniéndose 34,0 mg (0,110 mmol) del metil éter de jatrofolona A (15) (rendimiento: 65%) y 19,0 mg (6,00x10-2 mmol) del metil éter de jatrofolona B (21) (rendimiento: 35%).

b. Formación del éter propílico. OH

O

NaH/ DMF

H

R

H

R

PropI O

O H

4 5

H

R β CH3; α H α CH3; β H

16 22

23

R β CH3; α H α CH3; β H

En un balón de dos bocas provisto de refrigerante, septum, agitador magnético y atmósfera de N2 se colocaron 100 mg (0,340 mmol) de la mezcla de jatrofolanos A y B y 8,00 ml de DMF. Seguidamente, se agregó en cantidad estequiométrica NaH al 60% (13,5 mg, 0,340 mmol) y se inyectaron con una jeringa a través del septum 90,0 µl (0,920 mmol) de yoduro de propilo. Se dejó en agitación durante 4 horas. Se procedió como en a, obteniéndose 36,0 mg (0,110 mmol) del propil éter de jatrofolona A (16) (rendimiento: 65%) y 27,0 mg (8,00x10-2 mmol) del propil éter de jatrofolona B (22) (rendimiento: 47%). c. Acetilación de jatrofolona A. OH

OAc

Ac2O/Py

H

O

H

O H

H

4

17

En un balón se colocaron 16 mg (5,40x10-2 mmol) del alcohol y la muestra se disolvió en 1,00 ml de piridina bajo baño de hielo y agitación constante. Se agregó 1,00 ml de anhídrido acético, se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 24 horas. Se paró la reacción agregando agua fría, se extrajo con AcOEt, se eliminó la piridina con el agregado de HCl al 10%, la fase orgánica se secó sobre MgSO4, se filtró y concentró a presión reducida obteniéndose 15,0 mg (4,40x10-2 mmol) del compuesto acetilado (17) (rendimiento 82%). d. Acetilación de jatrofolona B. OH

OAc

Ac2O/Py

H

O

H

O H

H

5

23

24

En un balón se colocaron 12 mg (0,040 mmol) del alcohol y se procedió como en g, obteniéndose 13 mg (0,038 mmol) del compuesto acetilado (23) (rendimiento 96%).

e. Metilación y alquilación α al carbonilo con un grupo metilo. OH

OCH3

NaH/ DMF

H

R

H

CH3I O

O H

4 5

H

R β CH3; α H α CH3; β H

27

En un balón de dos bocas provisto de refrigerante, septum, agitador magnético y atmósfera de N2 se colocaron 60,0 mg (0,200 mmol) de la mezcla de jatrofolonas A y B y 5,00 ml de DMF, luego se agregó NaH al 60% en exceso (16,5 mg, 0,410 mmol) y se inyectaron con una jeringa a través del septum 40,0 µl (0,600 mmol) de yoduro de metilo. Se dejó en agitación durante 4 horas. Terminada la reacción se adicionó agua fría y se procesó según la metodología usual especificada en a. Se obtuvieron 40,0 mg (0,120 mmol) del compuesto 27 (rendimiento: 60%).

f. Alquilación α al carbonilo con un grupo metilo.

O

O

NaH/ DMF

H

R

H

CH3I O

O H

4 5

H

R β CH3; α H α CH3; β H

28

25

En un balón de dos bocas provisto de refrigerante, septum, agitador magnético y atmósfera de N2 se colocaron 65 mg (0,19 mmol) de la mezcla de éteres propílicos de las jatrofolonas A y B y 6 ml de DMF. A continuación, se agregó NaH al 60% en exceso (8,0 mg, 0,20 mmol) y se inyectaron con una jeringa a través del septum 60 µl (0,62 mmol) de yoduro de propilo. Se dejó en agitación durante 4 horas. Se procedió como en a. Se obtuvieron 45 mg (0,13 mmol) del compuesto 28 (rendimiento: 68%).

g. Alquilación α al carbonilo con un grupo propilo. OCH3

OCH3

NaH/ DMF H

R

H

PropI O

O H

15 21

H

R β CH3; α H α CH3; β H

29

En un balón de dos bocas provisto de refrigerante, septum, agitador magnético y atmósfera de N2 se colocaron 50 mg (0,16 mmol) de la mezcla de jatrofolonas A y B metilados y 4,0 ml de DMF. A continuación, se agregó NaH al 60% en exceso (7,0 mg, 0,18 mmol) y se inyectaron con una jeringa a través del septum 40 µl (0,41 mmol) de yoduro de propilo. Se dejó en agitación durante 4 horas. Se procedió como en a. Se obtuvieron 30 mg (9,0x10-2 mmol) del compuesto 29 (rendimiento: 56%).

26

h. Formación del éter propílico y alquilación α al carbonilo con un grupo propilo. OH

O

NaH/ DMF

H

R

H

PropI O

O H

4 5

H

R β CH3; α H α CH3; β H

30

En un balón de dos bocas provisto de refrigerante, septum, agitador magnético y atmósfera de N2 se colocaron 70 mg (0,24 mmol) de la mezcla de jatrofolonas A y B y 6,0 ml de DMF. Seguidamente, se agregó NaH al 60% en exceso (19 mg, 0,48 mmol) y se inyectaron con una jeringa a través del septum 70 µl (0,72 mmol) de yoduro de propilo. Se dejó en agitación durante 4 horas. Se procedió como en a, obteniéndose un crudo de 65 mg que se purificó mediante CC en Sílica gel obteniéndose 50 mg (0,13 mmol) del compuesto 30 (rendimiento: 54%). Obtención de ésteres: i. Reacción con cloruro de 3-cloropropionilo. O

OH

O

NaH/ DMF

H

R

H

R

ClCOCH2CH2Cl O

O H

4 5

H

R β CH3; α H α CH3; β H

18 24

27

R β CH3; α H α CH3; β H

En un balón de dos bocas provisto de refrigerante, septum, agitador magnético y atmósfera de N2 se colocaron 100 mg (0,340 mmol) de la mezcla de jatrofolonas A y B y 8,00 ml de DMF. A continuación se agregaron en cantidad estequiométrica 13,5 mg (0,340 mmol) de NaH al 60% y se inyectaron con una jeringa a través del septum 90,0 µl (0,940 mmol) de cloruro de 3-cloropropionilo. Se dejó en agitación durante 24 horas. Se procedió como en a, obteniéndose un crudo de 88,0 mg, que se purificó mediante CC en Sílica gel obteniéndose 35,0 mg (0,100 mmol) del correspondiente éster de jatrofolona A (18) (rendimiento: 59%) y 21,0 mg (6,00x10-2 mmol) del éster de jatrofolona B (24) (rendimiento: 35%).

j. Reacción con cloruro de 4-nitrobenzoilo.

O

O

OH

NaH/ DMF

H

R

NO2

H

R

ClCOPhNO2 O

O

H

H

4 5

R β CH3; α H α CH3; β H

19 25

R β CH3; α H α CH3; β H

En un balón de dos bocas provisto de refrigerante, septum, agitador magnético y atmósfera de N2 se colocaron 100 mg (0,340 mmol) de la mezcla de jatrofolonas A y B y 8,00 ml de DMF. Seguidamente, se agregaron en cantidad estequiométrica 13,5 mg (0,340 mmol) de NaH al 60% y se inyectaron con una jeringa a través del septum 170 mg (0,920 mmol) de cloruro de 4-nitrobenzoilo disueltos en 3,00 ml de DMF. Se dejó en agitación durante 24 horas. Se procedió como en a, obteniéndose un crudo de 112 mg, que se purificó mediante CC en Sílica gel obteniéndose 45,0 mg (0,100 mmol) del correspondiente éster de jatrofolona A (19) (rendimiento: 59%) y 31,0 mg (7,00x10-2 mmol) del (rendimiento: 41%).

28

éster de jatrofolona B (25)

k. Reacción con cloruro de 4-clorobenzoilo.

O

OH

O

NaH/ DMF

H

R

Cl

H

R

ClCOPhCl O

O H

4 5

H

R β CH3; α H α CH3; β H

20 26

R β CH3; α H α CH3; β H

En un balón de dos bocas provisto de refrigerante, septum, agitador magnético y atmósfera de N2 se colocaron 100 mg (0,340 mmol) de la mezcla de jatrofolonas A y B y 8,00 ml de DMF. Seguidamente, se agregaron en cantidad estequiométrica 13,5 mg (0,340 mmol) de NaH al 60% y se inyectaron con una jeringa a través del septum 120 µl (0,930 mmol) de cloruro de 4-clorobenzoilo. Se dejó en agitación durante 24 horas. Se procedió como en a, obteniéndose un crudo de 95,0 mg que se purificó mediante CC (Sílica gel) obteniéndose 34,0 mg (8,00x10-2 mmol) del correspondiente éster de jatrofolona A (20) (rendimiento: 47%) y 19,0 mg (5,00x10-2 mmol) del éster de jatrofolona B (26) (rendimiento: 29%).

2.5 Biotransformación del diterpeno jatrofona.

El estudio se realizó con tres microorganismos diferentes, pertenecientes a especies de referencia de la ATCC y la Universidad de Buenos Aires, Argentina (UBA): Aspergillus niger (ATCC 16404), Fusarium moliniforme (UBA 1061) y Mortierella isabelina (ATCC 38063).

29

2.5.1 Escala analítica.

En la primera etapa de cultivo, los microorganismos se cultivaros en condiciones aeróbicas a temperatura ambiente en Erlenmeyer de 125 ml conteniendo 30,0 ml de medio Czapek (composición en g/l: NaNO3, 3,00; K2HPO4, 1,00; MgSO4.7H2O, 0,500; KCl, 0,500; FeSO4.7H2O, 1,00x10-2; sacarosa, 30,0) modificado con la adición de extracto de levadura (5,00 g/l) y ácido láctico (pH 5,5) (Gouiric et al., 2004; Schmeda-Hirschmann et al., 2004). Se dejó en agitación a 250 rpm y 28 °C ± 2 °C por 48 h. El segundo estado de cultivo aeróbico fue iniciado transfiriendo 3,00 ml del inóculo del estado I y llevándolo a un volumen final del 10% (30,0 ml). Luego de 48 horas se agregó el sustrato (jatrofona) disuelto en DMF, en una concentración de 333 mg/l por frasco. La transformación del sustrato por los microorganismos se verificó diariamente mediante TLC, así como el contenido de la fuente de carbono en el medio de cultivo. Se realizaron tres experimentos con dos repeticiones cada uno para cada hongo. Se realizaron además análisis comparativos por cromatografía de capa fina de cultivos blanco sin el substrato y sin los hongos.

2.5.2 Escala preparativa.

El ensayo se llevó a cabo empleando como organismo biotransformador el hongo imperfecto Aspergillus niger (ATCC 16404). El primer estado de cultivo fue realizado como se describe

para el experimento a escala analítica. En la segunda etapa, a 10 Erlenmeyer de 1 litro conteniendo 300 ml de un medio de cultivo de 72 h, se agregó el sustrato a una concentración de 667 mg/l. Después de 24 días, el cultivo fue separado por filtración en medio de cultivo y micelio. Al medio de cultivo se le agregó HCl diluido hasta llegar a pH 5, se extrajo con AcOEt y la fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y luego se concentró, obteniéndose 400 mg de solubles en AcOEt. El análisis por TLC del extracto crudo (EP:AcOEt 7:3) mostró un compuesto mayoritario correspondiente a la jatrofona (Rf 0,47) y un metabolito más polar (Rf 0,41). El extracto crudo se permeó en Sephadex LH-20, utilizando MeOH como fase móvil y la mezcla de diterpenos se cromatografió en columna de Sílica gel (100 g, 200-500 µm, longitud de columna 42 cm, diámetro 1,8 cm) con gradiente de EP-

30

EP:AcOEt como eluyente, obteniéndose 30 fracciones. Teniendo en cuenta sus patrones de TLC estas se juntaron en 5 grupos de fracciones. El primer grupo de fracciones no contenía compuestos de interés y fue descartado. Los grupos de fracciones 2-3 permitieron recuperar 240 mg de jatrofona, mientras que los grupos de fracciones 4-5 contenían una mezcla de jatrofona y el metabolito biotransformado. Mediante cromatografía en placa preparativa, (Sílica gel, EP:Acetona 8:2), se obtuvieron 20,0 mg de jatrofona (Rf 0,32) y 13,0 mg del biotransformado (Rf 0,19). En la Figura 5 se presenta el compuesto 31 obtenido por biotransformación de jatrofona por A. niger.

19

20

O 1 16

13

14

O

2

11 10 9

12

15

Aspergillus niger (ATCC 16404)

6

10

14

O 1 16

7

3

18

11

8

4 5

19

20 18

13

15 O

2

9

12 8

H 7

4 3

O

OH

6

5

17

O

17

3

31

Figura 5. Biotransformación de jatrofona por A. niger.

2.6 Cromatografía en capa fina (TLC).

Las separaciones cromatográficas se monitorearon mediante TLC empleando cromatoplacas de Sílica gel 60 F254 (Merck), las cuales se visualizaron con luz ultravioleta a 254 y 366 nm. Las cromatoplacas se revelaron vaporizándolas con una solución de p-anisaldehido (Etanol: ácido acético glacial: ácido sulfúrico: p-anisaldehido 85:10:5:1) y posteriormente calentando a 110 °C por 3 min.

31

2.7 Técnicas de separación empleadas.

•

Columnas cromatográficas conteniendo Sílica gel (Merck Kieselgel 60), con un tamaño de partícula entre 0,063 y 0,200 mm.

•

Columnas de permeación en gel (Sephadex LH-20, Pharmacia Fine Chemicals).

•

Placas preparativas elaboradas con Sílica gel 60 PF254 con yeso (Merck), formándose placas de aproximadamente 2 mm de espesor sobre un soporte de vidrio.

2.8 Solventes y Reactivos.

Las reacciones químicas se realizaron utilizando reactivos p.a. comerciales. Para el fraccionamiento y aislamiento mediante cromatografía en columna se utilizaron solventes grado técnico previamente destilados.

2.9 Determinación de constantes físicas y espectroscópicas.

Se midieron los puntos de fusión en un equipo Electrothermal 9100. La rotación óptica se midió en un polarímetro Jasco, DIP-370, a 25 °C, con lámpara de sodio en una celda de 10,0 cm y 1,00 ml, disolviendo las muestras en cloroformo o metanol (la concentración se expresó en g/100 ml).

Se midieron los espectros IR en un espectrofotómetro Nicolet Nexus FT-IR utilizando pastillas de KBr. Los espectros de RMN se midieron en un espectrometro Bruker a 400 MHz para 1H y 100 MHz para 13C, utilizando como solvente CDCl3. Los espectros de masas HRMS (ESI) se midieron en espectrómetro Q-Tof II de Micromass (Micromass, Manchester, UK). Los espectros de masas HRMS (EI) se midieron en espectrómetro Autospec Micromass con una energía de ionización de 70 eV.

32

2.10 Determinación de la lipofília teórica.

La lipofilicidad de un compuesto en forma experimental se determina utilizando el coeficiente de partición (P) entre n-octanol y agua. El trasporte pasivo a través de la membrana es proporcional al logaritmo del coeficiente de partición P (Silverman, 1992).

La lipofilia de los compuestos estudiados, así como también de los derivados obtenidos por semisíntesis se calculó en forma teórica con el programa ChemDraw Ultra 8.0.

2.11 Determinación de la bioactividad.

2.11.1 Animales.

Para determinar la actividad gastroprotectora se utilizaron ratones macho Swiss albino de 30 ± 3 g de peso. Los animales se adquirieron en el Instituto de Salud Pública de Chile y se alimentaron con una dieta Champion certificada con libre acceso a agua, bajo condiciones estándar de 12 h luz/oscuridad, en un ambiente con 50% de humedad relativa y 22 °C de temperatura. Los protocolos fueron aprobados por el Comité de Bioética de la Universidad de Talca, el cual sigue las recomendaciones del Canadian Council on Animal Care (Olfert et al., 1993).

2.11.2 Modelo de úlcera gástrica inducida con HCl/EtOH.

Este experimento se realizó según Yesilada et al. (1997) y optimizado en estudios realizados en la Universidad de Talca (Schmeda-Hirschmann et al., 2002; Rodríguez et al., 2003; Schmeda-Hirschmann et al., 2005a; Schmeda-Hirschmann et al., 2005b; Sepúlveda et al., 2005). Grupos de 8 ratones elegidos al azar se mantuvieron en ayuno por 24 horas con libre acceso al agua antes de realizar el experimento debido a que los compuestos a evaluar y el lansoprazol (control) se administraron oralmente. Cincuenta minutos después de la administración oral de los compuestos emulsionados en 12% de Tween 80, lansoprazol (20 mg/kg) o 12% Tween 80 (10 ml/kg), todos los grupos fueron tratados oralmente, para inducir 33

las lesiones gástricas, con 0,20 ml de una solución de HCl 0,30 M y etanol al 60%. Los animales se sacrificaron por dislocación cervical 1 hora después de la administración de HCl/EtOH. Los estómagos se extirparon e inflaron con una inyección de formalina al 5%. Los estómagos se fijaron en formalina al 5% durante 30 minutos y se abrieron a lo largo de la curvatura mayor.

El daño gástrico se observó en la mucosa gástrica como líneas negras-rojas, paralelas a lo largo del eje del estómago. Se midió la longitud (mm) de cada lesión y el índice de lesión se expresó como la sumatoria de cada una de las lesiones.

2.11.3 Cultivo de células MRC-5.

Los fibroblastos de pulmón humano MRC-5 (ATCC CCL-171) se cultivaron en monocapa en medio esencial mínimo de Eagle (MEM-E, GIBCO, USA) con sales de Earle, L-glutamina 2,00 mM y 2,20 g/l de bicarbonato de sodio, suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) inactivado por calor, 100 UI/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina, en un incubador con una atmósfera saturada de agua y 5% CO2 a 37 °C. El pasaje celular se mantuvo entre 10 y 16. El medio se renovó cada 2 días.

2.11.4 Cultivo de células AGS.

Las células epiteliales gástricas humanas AGS (ATCC CRL 1739) se cultivaron en monocapa en medio Ham F12 (GIBCO, USA) conteniendo L-glutamina 2,00 mM y 1,50 g/l de bicarbonato de sodio, suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) inactivado por calor, 100 UI/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina, en un incubador con una atmósfera saturada de agua y 5% CO2 a 37 °C. El pasaje celular se mantuvo entre 42 y 48. El medio se renovó cada 2 días.

34

2.11.5 Citotoxicidad.

Cultivos confluentes de células de MRC-5 y AGS fueron tratadas con el medio que contenía los terpenos, así como el compuesto de referencia lansoprazol, en un rango de concentración que iba desde 0-1000 µM. Los productos primero fueron disueltos en DMSO y luego en el medio de cultivo correspondiente suplementado con 2% de SFB. El contenido final de DMSO en el medio evaluado y en los controles fue de 1%. Las células fueron expuestas por 24 h al medio evaluado con o sin el compuesto (control). Cada concentración fue probada en sextuplicado junto con el control y repetida cuatro veces en experimentos separados. Al final de la incubación, se realizo el ensayo de incorporación del rojo neutro (Rodríguez y Haun, 1999). Para ello, el medio de cultivo fue removido y las células lavadas con PBS estéril. Posteriormente las células fueron incubadas durante 4 horas con 0,10 ml/pocillo de una solución que contenía 50 µg/ml de rojo neutro en medio libre de suero. Las células se volvieron a lavar con PBS y luego se adicionó 0,10 ml de una solución de ácido acético al 1% (v/v):etanol al 50% (v/v) para extraer el colorante. Después de rápida agitación la absorbancia se leyó a 540 nm en un equipo marca Bio-Tek instrument, modelo ELx800. Para calcular los valores de IC50 los resultados fueron transformados en porcentaje respecto a los controles (100%) y los valores de IC50 fueron obtenidos gráficamente de la curva dosis-respuesta.

2.11.6 Análisis estadístico.

Los resultados son expresados como los promedios ± error estándar (E.E.). Las diferencias estadísticas entre grupos tratados y el control se determinaron por el análisis de varianza de una vía (ANOVA) luego de realizar la prueba de Bartlett para establecer la homogeneidad de las varianzas. Cuando se detectaron diferencias significativas, se realizó el test de comparaciones múltiples de Dunnett. Se consideran de interés los valores con niveles de significancia P < 0,05. Todos los análisis estadísticos fueron realizados usando el software Statistica 5.1 (StatSoft, Inc.).

35

3. Resultados.

La Tesis presentada describe el aislamiento, identificación, modificación estructural, efecto gastroprotector y citotoxicidad de terpenos presentes en los rizomas de la Euphorbiaceae Jatropha isabelli. Se presenta en primer lugar, la elucidación estructural de los nuevos compuestos obtenidos de los rizomas de “yaguá rova” para analizar a continuación los derivados del sesquiterpeno ácido ciperenoico preparados por semisíntesis, la obtención de derivados semisintéticos de los diterpenos jatrofolonas A y B así como del nuevo producto de biotransformación del diterpeno jatrofona.

La estructura de todos los compuestos fue elucidada mediante métodos espectroscópicos, principalmente FT-IR, 1H y

13

C RMN, espectrometría de masas (MS) y la determinación de

constantes físicas (punto de fusión y rotación óptica). La descripción de los compuestos (1-31) se presenta en Anexos.

3.1 Aislamiento de compuestos bioactivos de los rizomas de Jatropha isabelli.

De los rizomas de Jatropha isabelli se aislaron 5 compuestos mayoritarios: el triterpeno ácido acetil aleuritólico (1) (0,023%), el sesquiterpeno ácido ciperenoico (2) (0,086%), los diterpenos jatrofona (3) (0,156%), jatrofolona A (4) (0,020%) y jatrofolona B (5) (0,020%). Además se aislaron 42 mg de un nuevo diterpeno al cual hemos llamado 9β, 13βdihidroxiisabelliona (6) y 20 mg del monoterpeno 1,4-epoxi-p-mentan-2-ol (7). La estructura de todos los compuestos se presenta en la Figura 6. Los datos espectroscópicos de 1H y 13C RMN del ácido acetil aleuritólico (1) están de acuerdo con los reportados por Maciel et al. (1998) mientras los del ácido ciperenoico (2) concuerdan con los de Achenbach y Benirschke (1997). La información espectroscópica de la jatrofona (3) se comparó con los datos publicados por Taylor et al. (1983) y las jatrofolonas A y B (4 y 5) coinciden con los reportes de Purushothaman y Chandrasekharan (1979). Los datos espectroscópicos de 1H y

13

C RMN de la jatrofona 3, su nuevo derivado 6 y el acetilado de

este 6a se presentan en la Tabla 1. 36

El compuesto 6 presentó en el espectro de masas HRMS (EI) la fórmula molecular C20H26O5 indicando 8 grados de insaturación. La naturaleza de las funciones oxigenadas se determinó mediante espectroscopía de IR. La principal diferencia entre el espectro de FT-IR del compuesto 6 y la jatrofona fue la aparición de una banda ancha de absorción a 3415 cm-1, indicando la presencia de grupos OH, así como también, la de dos señales de absorción correspondientes a carbonilos en 1764 y 1659 cm-1, difiriendo de las señales de carbonilo de jatrofona que aparecen en 1693 y 1660 cm-1. La acetilación del compuesto 6 dio origen al monoacetato 6a, cuyo espectro de IR presenta una banda ancha de absorción a 3441 cm-1, indicando una función OH libre y tres funciones carbonilo a 1767, 1750 y 1651 cm-1. La estructura del compuesto 6 mostraba en el espectro de 1H RMN una gran similitud con la de jatrofona. En lugar del par de d a δ 6,02 y δ 6,47 (J = 16,4 Hz) para la jatrofona, dos d a δ 3,67 y δ 4,11 (J = 11,7 Hz) fueron observados para el compuesto 6, sugiriendo la hidroxilación del doble enlace. Además, la aparición de un grupo metilo a δ 1,22 en lugar del grupo metilo oleofínico a δ 1,77 para la jatrofona, indica una función hidroxilo adicional.

En el espectro de

13

C RMN de 6, en lugar de las señales que correspondían a los C-sp2 a δ

128,66 (d) y 159,00 (d) así como también las de δ 183,21 (s) y 112,36 (s) para la jatrofona, fueron observados dos dobletes a δ 66,68 y 79,86 y dos singuletes a δ 76,85 y 87,71. Además, el grupo metilo en C-20 a δ 6,00 para la jatrofona fue desplazado a δ 14,23 en el compuesto 6. Por lo tanto, el compuesto 6 presenta dos funciones OH adicionales en lugar de los dobles enlaces y un anillo adicional es requerido según la fórmula molecular. La posición de los grupos OH fue deducida a partir de los desplazamientos químicos de los átomos de C y de las correlaciones de HMBC.

Las constantes de acoplamiento para los dobletes en δ 3,67 y 4,11 (J = 11,7 Hz) sugieren una correlación trans similar a la observada para los aductos de propanotiol de jatrofona informados por Taylor et al. (1983a). La estereoquímica de los carbonos 8 y 9 fue confirmada por experimentos de NOESY. Claras correlaciones fueron observadas entre el doblete en δ 4,11 con el doblete en δ 2,20 y la señal del metilo en δ 1,17, mientras que el doblete en δ 3,67

37

presentó correlaciones espaciales con el grupo metilo ubicado en δ 1,14. Por lo tanto, El átomo de hidrógeno en C-8 y el grupo hidroxilo en C-9 para el compuesto 6 deben ser β orientados.

La orientación del grupo metilo en C-20 fue determinada por comparación entre el compuesto 6 y el compuesto 31, obtenido por biotransformación de la jatrofona con Aspergillus niger (Figura 5). En el espectro de 1H RMN del compuesto 31 se observa que el

H-11α esta

situado en δ 2,07, mientras que en el compuesto 6 el H-11α se encuentra en δ 2,20. Esta desprotección del H sólo puede ser posible si el grupo OH en C-13 se encuentra β orientado (Esquema 1). El espectro de FT-IR también está de acuerdo con la estereoquímica propuesta, debido a que no se observa variación entre las señales de absorción de ambos grupos carbonilos α,β-insaturados de los compuestos 6 y 31 (1659 cm-1). Si el grupo OH en C-20 del compuesto 6 hubiese estado en posición α, se habría producido un cambio en la banda de absorción del carbonilo α,β-insaturado, debido a la interacción entre el hidrógeno del grupo OH y el carbonilo en C-7 (Esquema 1).

H OH O H O 11

H

13

OH

O

20

Esquema1. Estructura tridimensional del compuesto 9β, 13β-dihidroxiisabelliona (6).

38

30

29

27

19 18

12 25

11

26 13 9

2 3

21

5

4

10

8

O

2

9

12

15

7

4 3

7

6

6

5

COOH

7

6

16

8

12

15

AcO

17 23

24

Compuesto 1

Compuesto 2

OH 15 1 R

1

18

11

13

14

O

9 11

8

10 5

13

1

COOH 28

19

20

10

3

17 16

14

2

22

15

1 4

20

14

2 3

4

20

13 12

5

14

O

H

19

9

6 17

Compuesto 4 5

7

1

10

8

18 H

O

2

18

1

9

12

15

7

10

13

16

11 O

OH 11

20 14

Compuesto 3 19

8

OR

3 6

5

5

Compuesto

6 6a

O 4

3

8 9

R H Ac

Figura 6. Estructura de los terpenos de Jatropha isabelli.

39

OH

O

17

R β CH3; α H α CH3; β H

6

H 7

4

2

10

Compuesto 7

O

Tabla 1. Datos espectroscópicos de 1H y 13C RMN de los compuestos 3, 6 y 6a en CDCl3; δ en ppm, J en Hz.

1α 1β 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 α 11 β 12 13 14 15 16 17 18 19 20 OAc CO CH3

3 2,17 dd (13,7; 5,9) 1,88 dd (13,7; 7,8) 3,00 ddq (7,8; 7,0; 5,9) 5,83 br s 5,84 br s 6,02 d (16,4) 6,47 d (16,4) 2,89 d (14,7) 2,43 d (14,7) 1,10 d (7,0) 1,90 s 1,27 s 1,39 s 1,77 s

H 6 2,44 dd (13,7; 6,4) 2,01 dd (13,7; 7,8) 3,25 ddqbr (7,8; 6,6; 6,4) 6,36 s 6,70 s 3,67 d (11,7) 4,11 d (11,7) 2,20 d (15,2) 1,86 d (15,2) 1,18 d (6,6) 1,90 br s 1,17 s 1,14 s 1,22 s

6a 2,41 dd (13,7; 6,6) 1,97 dd (13,7; 7,6) 3,20 ddqbr (7,6; 7,1; 6,6) 6,31 s 6,61 s 3,83 d (12,2) 5,40 d (12,2) 2,30 d (15,2) 1,86 d (15,2) 1,14 d (7,1) 1,83 s 1,12 s 1,10 s 1,28 s

-

-

1,96 s

40

3

C 6

6a

42,41 t

49,90 t

50,21 t

38,28 d 123,68 d 137,05 s 147,05 d 141,72 s 201,94 s 128,66 d 159,00 d 36,59 s

37,78 d 154,67 d 138,79 s 131,27 d 136,78 s 202,84 s 66,68 d 79,86 d 37,00 s

38,00 d 154,50 d 138,00 s 130,34 d 136,94 s 200,67 s 65,94 d 79,91 d 37,62 s

41,17 t

43,25 t

43,83 t

183,21 s 112,36 s 203,85 s 99,71 s 18,93 q 20,69 q 30,35 q 26,86 q 6,00 q

76,85 s 87,71 s 213,67 s 91,37 s 19,21 q 21,94 q 27,53 q 22,00 q 14,23 q

76,94 s 87,56 s 213,48 s 91,79 s 19,50q 22,23 q 27,90 q 23,88 q 14,53 q

-

-

169,73 s 20,80 q

3.2 Derivados del ácido ciperenoico.

A partir de ácido ciperenoico 2 y siguiendo las reacciones descritas en Materiales y Métodos se obtuvieron 7 derivados del sesquiterpeno (8-14). Las estructuras se presentan en la Figura 7.

Compuesto

R

8

CH2OH

9

CH2O 1’CO 2’CH3

Ácido ciperenoico (2)

COOH

10

COO 1’CH3

11

CONH 1’CH2 2’CH3

12

14

2

9

1

3

11 8

12

CONH 1’CH2 2’CH2 3’CH2 4’CH3

5

4

7

6

O

2'

13

R

3' 4'

1'

15

7'

N H

CH3

6'

5'

14 2

14

13

10

13

10

11 8

12 5

4

2

10

9

1

3

14

1

3

11

H 6

COOH

COOH

15

15

Compuesto 14a

Compuesto 14b

Figura 7. Estructura del ácido ciperenoico y sus derivados.

41

8

5

7

6

9

12 4

H

13

7

Los datos espectroscópicos de 1H y

13

C RMN del ácido ciperenoico (2) y ciperenol (8)

concuerdan con los reportados en bibliografía (Achenbach y Benirschke, 1997; Takano y Kawaminami, 1988; Jacobs et al., 1987). El metil éster del ácido ciperenoico (10) concuerda con los datos publicados por Achenbach y Benirschke (1997) y los del ciperenil acetato (9) con lo reportado por Takano y Kawaminami (1988). Los compuestos 11-14 por su parte no han sido previamente reportados en literatura. Los datos espectroscópicos de de 1H y

13

C

RMN del ácido ciperenoico (2) y sus derivados (8-14) se presentan en las Tablas 2 y 3. El ciperenol (8) se obtuvo por reducción del metil ciperenoato (10). En el espectro de 1H RMN se observa la aparición de dos dobletes, correspondientes al alcohol primario, en δ 4,25 (J = 12,7 Hz) y δ 4,21 (J = 12,7 Hz). En el espectro de

13

C RMN desaparece la señal en δ

166,00 (s) correspondiente al grupo carbonilo de éster metílico, apareciendo un triplete a δ 60,62 característico de alcohol. Además se observa un desplazamiento significativo en C-4 y C-5, los cuales corresponden al doble enlace, pasando en C-4 de δ 123,33 (s) a δ 131,17 (s) y en C-5 de δ 169,30 (s) a δ 146,27 (s). Estos desplazamientos se deben a la desaparición de la conjugación del doble enlace con el carbonilo del éster, la cual hacía que el C-5 se desplace hacia campos más bajos del valor normal correspondiente a un carbono vinílico no conjugado. El ciperenil acetato (9) generado por acetilación del ciperenol (8), muestra en el espectro de 1H RMN como señal más característica un singulete en δ 2,04, correspondiente al CH3 del acetato y en 13C RMN una señal en δ 170,99 (s) asignable al grupo carbonilo de acetato.

Las amidas alifáticas 15-N-etil-ciperenamida (11) y 15-N-butil-ciperenamida (12) fueron generadas a partir del ácido ciperenoico (2). Sus espectros de 1H RMN muestran como señales más características un multiplete a campos relativamente altos, correspondiente a un grupo CH2 en posición α al grupo amida (δ 3,40 y 3,27 para la etil- y butilamida, respectivamente) y un singulete ancho en δ 5,46 en la etilamina y δ 5,50 en la butilamida asignable al grupo NH. El espectro de 13C RMN también está de acuerdo con las estructuras propuestas mostrando la aparición de 2 y 4 carbonos más en los compuestos 11 y 12, respectivamente. Por su parte, la amida aromática (13) presenta en el espectro de 1H RMN dos dobletes integrando cada uno por dos hidrógenos en δ 6,90 (J = 9,0 Hz) y δ 7,52 (J = 8,8 Hz) señales características de un 42

anillo aromático para sustituido, también se observa un singulete en δ 3,83, correspondiente al grupo metoxi y un singulete ancho en δ 7,17 perteneciente al grupo NH. La sustitución en posición para del anillo aromático, también se detecta claramente en el espectro de 13C RMN, donde solamente aparecen 4 señales correspondientes a carbonos aromáticos, debido a la presencia de cuatro carbonos equivalentes (C-2’ con C-6’ en δ 114,16 (d) y C-3’ con C-5’ en δ 121,47 (d), ver Tabla 3), el grupo metoxi aparece como un cuarteto en δ 55,50.

Las TLC del compuesto 14 en diferentes mezclas de solventes mostraban una mancha única. Sin embargo, en el espectro de 1H RMN se observa que las señales aparecen duplicadas en una relación de 2:1. Las señales más distintivas fueron las que corresponden al grupo metilo en H-14, apareciendo en el producto mayoritario en δ 0,78 y en el compuesto minoritario en δ 0,86, así como también, las señales correspondientes a los H-4 y H-5 (Tabla 2), indicando una mezcla de isómeros en una relación de 2:1 (14a:14b). La obtención de los dos productos, como resultado de la hidrogenación, es una consecuencia de la adición de H, tanto por el lado superior de la molécula como por el lado inferior de la misma. La orientación cis del COOH y el grupo metilo en H-14 explican el efecto de desplazamiento hacia campos más bajos, observado en el compuesto minoritario sobre este grupo metilo, el cual aparece en δ 0,86, mientras que en el compuesto mayoritario el mismo grupo metilo, el cual tiene una configuración trans con el grupo ácido, aparece en δ 0,78. El derivado 14a es más estable, tanto desde el punto de vista termodinámico como cinético, y aparece en una relación de 2:1 con su isómero 14b. Las diferencias entre ambas estructuras se pueden observar también en los datos de

13

C RMN, donde las señales de los C-4 y C-5 de ambas estructuras difieren

claramente, sugiriendo una diferente estereoquímica (Tabla 3). La asignación completa de las señales de 1H y

13

C RMN de los dos compuestos fue posible por la utilización de técnicas

espectroscópicas bidimensionales como HMBC, COSY y HSQC. Los compuestos no pudieron ser aislados como compuestos puros y fueron evaluados como la mezcla diasteromérica.

43

Tabla 2. Datos espectroscópicos de 1H RMN de los compuestos 2, 8-14, en CDCl3, δ H en ppm, J en Hz. Compuestos 2, 8-14: J 14, 10: 6,6 Hz; Compuestos 8 y 9: J 15, 15’: 12,7 Hz.

H

8 1,71 m; 1,51 m 2,69 m; 2,46 m

9 1,66 m; 1,44 m 2,59 m; 2,36 m

2 1,78 m; 1,57 m 2,83 m; 2,74 m

10 1,76 m; 1,54 m 2,82 m; 2,70 m

11 1,78 m; 1,55 m 2,81 m; 2,73 m

12 1,70 m; 1,50 m 2,75 m; 2,62 m

13 1,84 m; 1,61 m 2,92 m; 2,79 m

4

-

-

-

-

-

-

-

5

-

-

-

-

-

-

-

2,35 m; 1,90 m 1,90 m 1,86 m; 1,33 m 1,48 m; 1,13m 2,03 m 0,83 s 1,00 s 0,86 d 4,25 d; 4,21 d -

2,34 m; 1,86 m 1,84 m 1,87 m; 1,28 m 1,42 m; 1,07 m 1,96 m 0,76 s 0,93 s 0,79 d 4,62 d; 4,55 d 2,04 s -

2,77 m; 2,28 br d (16) 2,00 m 1,92 m; 1,41 m 1,55 m; 1,17 m 2,10 m 0,86 s 1,03 s 0,90 d

2,76 m; 2,24 br d (16) 1,98 m 1,90 m; 1,38 m 1,52 m; 1,14 m 2,08 m 0,84 s 1,01 s 0,87 d

2,75 m; 2,25 br d (16) 2,02 m 1,92 m; 1,40 m 1,53 m; 1,16 m 2,09 m 0,86 s 1,03 s 0,88 d

2,64 m; 2,15 br d (16) 1,84 m 1,93 m; 1,30 m 1,45 m; 1,08 m 1,99 m 0,77 s 0,93 s 0,79 d

-

-

-

-

3,75 s -

3,40 m (7,3) 1,22 t (7,3) 5,46 br s

2 3

6 7 8 9 10 12 13 14 15 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 7’ NH

44

2,83 m; 2,32 br d (16) 2,07 m 1,94 m; 1,43 m 1,59 m; 1,20 m 2,12 m 0,89 s 1,05 s 0,92 d

14a 1,62 m; 1,48 m 2,23 m; 1,85 m 3,08 ddd (12,7; 11,0; 9,1) 2,81 ddd (12,5; 10,0; 7,3) 1,86 m; 1,62 m 1,75 m 1,84 m; 1,30 m 1,55-1,65 m; 1,09 m 2,02 m 0,96 s 0,99 s 0,78 d

14b 1,60 m; 1,48 m 2,13 m; 1,95 m 2,67 ddd (17,6; 11,0; 6,6) 2,54 ddd (15,7; 9,8; 5,9) 1,97 m; 1,63 m 1,91 m 1,84 m; 1,26 m 1,55-1,65 m; 1,04 m 2,01 m 1,00 s 0,96 s 0,86 d

-

-

-

-

3,27 m 1,48 m 1,33 m 0,89 t (7,3) 5,50 br s

7,52 d (8,8) 6,90 d (9,0) 6,90 d (9,0) 7,52 d (8,8) 3,83 s 7,17 br s

-

-

Tabla 3. Datos espectroscópicos de

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 7’

8 65,96 s 26,14 t 37,85 t 131,17 s 146,27 s 27,58 t 48,56 d 27,61 t 28,13 t 35,33 d 41,18 s 26,12 q 19,29 q 17,95 q 60,62 t -

9 66,05 s 26,01 t 38,15 t 126,42 s 148,83 s 27,53 t 48,51 d 27,60 t 28,07 t 35,34 d 41,22 s 26,01 q 19,27 q 17,87 q 61,92 t 170,99 s 20,91 q -

13

C RMN de los compuestos 2, 8-14, en CDCl3, δ en ppm.

2 68,23 s 25,74 t 36,33 t 123,19 s 173,10 s 31,34 t 48,20 d 26,96 t 27,90 t 36,00 d 41,73 s 26,22 q 19,28 q 17,99 q 171,05 s -

10 67,80 s 25,73 t 36,68 t 123,33 s 169,30 s 31,08 t 48,20 d 27,01 t 27,89 t 35,86 d 41,63 s 26,19 q 19,26 q 17,93 q 166,00 s 50,90 q -

11 67,77 s 25,76 t 36,78 t 126,08 s 165,55 s 30,67 t 48,61 d 27,11 t 27,90 t 35,78 d 41,48 s 26,20 q 19,23 q 17,91 q 161,73 s 34,06 t 15,10 q -

45

12 67,76 s 25,73 t 36,79 t 126,21 s 165,60 s 30,64 t 48,61 d 27,09 t 27,89 t 35,76 d 41,45 s 26,18 q 19,20 q 17,89 q 161,45 s 39,00 t 31,91 t 20,20 t 13,77 q -

13 68,18 s 25,78 t 36,91 t 126,41 s 163,63 s 30,88 t 48,70 d 27,08 t 27,93 t 35,92 d 41,61 s 26,24 q 19,24 q 17,98 q 155,19 s 131,39 s 114,16 d 121,47 d 157,35 s 121,47 d 114,16 d 55,50 q

14a 60,54 s 26,43 t 33,67 t 47,72 d 43,54 d 30,69 t 47,24 d 27,15 t 29,54 t 32,43 d 44,43 s 27,30 q 20,96 q 17,57 q 180,75 s -

14b 59,87 s 26,26 t 34,02 t 52,74 d 46,98 d 33,57 t 48,95 d 27,18 t 28,42 t 33,51 d 44,10 s 27,98 q 20,46 q 16,89 q 182,82 s -

3.3 Derivados de las jatrofolonas A y B.

Los diterpenos jatrofolona A y B (4 y 5) fueron modificados mediante las reacciones de semisíntesis descritas en Materiales y Métodos obteniéndose 16 derivados (15-30). Las estructuras se presentan en la Figura 8. Los datos espectroscópicos de 1H y

13

C RMN de la jatrofolona A (4) y su acetato (17)

coinciden con los reportados por Parthasarathy y Pardha Saradhi (1984), los de la jatrofolona B concuerdan con los citados por Purushothaman y Chandrasekharan (1979). Por su parte, los metil éteres de jatrofolonas A y B (15 y 21) y los acetatos de las jatrofolonas A y B (17 y 23) han sido reportados por Smith et al. (1986), mientras que los compuestos 16, 18-20, 22 y 24-

30 no han sido reportados previamente. Los datos espectroscópicos de 1H y 13C RMN de las jatrofolonas A y B, así como los de todos sus derivados (15-30) se presentan en las Tablas 4-8. Mediante espectroscopía de 1H RMN resulta muy difícil distinguir a la jatrofolona A de la jatrofolona B, así como también sus derivados epiméricos. Sin embargo, en los espectros de 13

C RMN se puede apreciar que los desplazamientos del grupo metilo C-16 para las

jatrofolonas A (β CH3) oscila entre valores de δ 15,59 a 15,82 ppm, mientras que el grupo metilo C-16 para las jatrofolonas B (α CH3) contiene valores entre δ 16,15 a 16,96 ppm, por lo tanto este método espectroscópico resulta de gran utilidad para diferenciar ambos epímeros.

Los metil y propil éteres de jatrofolonas A y B (15, 21 y 16, 22) se obtuvieron a partir de las jatrofolonas A y B (4 y 5). En el espectro de 1H RMN de los metil y propil éteres se observa la desaparición del singulete ancho en aproximadamente δ 5 correspondiente al grupo OH de las jatrofolonas A y B, apareciendo un singulete en δ 3,83 correspondiente al OCH3 en los metil éteres de jatrofolonas A y B (15 y 21) y un multiplete en δ 3,87 acompañado por un multiplete en δ 1,84 y un triplete en δ 1,10 en los propil éteres de jatrofolonas A y B (16 y 22). El espectro de

13

C RMN muestra como señal más característica en el metil éter un cuarteto en

aproximadamente δ 60 y en el propil éter un triplete en aproximadamente δ 74.

46

OR2

OR2 15 1

R1

2 3

16

4

20 14 13 12

5

19

H

O

H

8

7

17

18

9

6

R1

10

11 O

H

Jatrofolona A (compuesto 4) R1

4

H

16

H

17

H

Jatrofolona B (compuesto 5)

R2

H

15

H

R1

H 1’

H

5

CH3

21

H

CH2 2’CH2 3’CH3

22

H

23

H

1’

1’

CO 2’CH3

R2 H 1’ 1’

CH2 2’CH2 3’CH3 1’

CO 2’CH3

O

18

H

CH3

O

H

24

2'

2'

3'

1'

O

O

3'

19

3'

2'

H

1'

H

25

4'

2' 1'

5'

7'

4' 5'

7' NO2

6'

6'

O

3'

2'

2'

1'

H

NO2

O

3'

20

3'

1'

4'

H

26

5'

7'

4' 5'

7' Cl

6'

1'

6'

Jatrofolonas R1

27

2’

CH3

28

4’

CH3

29

2’

30

4’

R2 1’ 1’

CH2 2’CH2 3’CH3

CH2 3’CH2 4’CH3 5’

CH3

6’

CH2 CH2 CH3

1’ 1’

CH3

2’

CH2 CH2 3’CH3

Figura 8. Estructura de la jatrofolona A, jatrofolona B y sus derivados semisintéticos.

47

Cl

Los acetatos de jatrofolonas A y B (17 y 23) se prepararon por acetilación de las jatrofolonas A y B. En ambos espectros de 1H RMN se destaca un singulete en aproximadamente δ 2,40 que corresponde al grupo metilo de acetato y en 13C RMN una señal en δ 168,50 (s), asignable al grupo carbonilo de acetato, y otra señal en δ 20,55 (q) para el CH3 del acetato. La reacción entre las jatrofolonas A y B con cloruro de 3-cloropropionilo, da lugar a la formación de los ésteres de 3-cloropropionilo, los que luego mediante una reacción de eliminación E2 generan los compuestos 2-propenil éster de jatrofolonas A y B (18 y 24). En el espectro de 1H RMN se destacan las señales de tres H vinílicos como doble dobletes en δ 6,08 (J = 10,5 y 1,0 Hz), 6,39 (J = 17,4 y 10,5 Hz) y 6,67 (J = 17,4 y 1,0 Hz). El espectro de 13C RMN presenta una señal en δ 163,51 (s), correspondiente al grupo carbonilo del éster y dos señales en δ 127,30 y 133,06 correspondientes a carbonos sp2.

Los compuestos 19, 20, 25 y 26 preparados a partir de las jatrofolonas A y B corresponden a ésteres aromáticos para sustituidos. Estos compuestos presentan espectros de 1H RMN muy similares, destacándose las señales en δ 8,40 (d, J = 9,1; 2H) y δ 8,44 (d, J = 9,1; 2H) en los compuestos para-nitrofenil éster de jatrofolonas A y B (19 y 25) y las señales en δ 7,53 (d, J = 8,6; 2H) y δ 8,19 (d, J = 8,6; 2H) en los para-clorofenil éster de jatrofolonas A y B (20 y 26). En los espectros de 13C RMN se destacan cuatro señales de C-aromáticos en δ 134,30 (s) (C-2’), 131,39 (d) (C-3’ y C-7’), 123,93 (d) (C-4’ y C-6’) y 151,16 (s) (C-5’) para los compuestos 19 y 25, y las señales en δ 127,40 (s) (C-2’), 131,62 (d) (C-3’ y C-7’), 129,17 (d) (C-4’ y C-6’) y 140,54 (s) (C-5’) en los compuestos 20 y 26 (ver Tablas 5 y 7). Los compuestos 27-30 presentan espectros de 1H y

13

C RMN los cuales están íntimamente

relacionados entre si. Los compuestos 27 y 30 se prepararon a partir de las jatrofolonas A y B (4 y 5). El espectro de 1H RMN del compuesto 27 se diferencia del de los compuestos 4 y 5 en la aparición de dos nuevas señales singulete ambas integrando por 3H, mientras que el espectro de

13

C RMN muestra dos carbonos cuarteto más. El espectro de 1H RMN del

compuesto 30 se diferencia del de los compuestos 4 y 5 en la aparición de seis nuevas señales, cuatro multipletes integrando cada uno por 2H y dos tripletes integrando ambos por 3H.

48

Tabla 4. Datos espectroscópicos de 1H RMN de la jatrofolona A (4) y sus derivados (15-20), en CDCl3, δ H en ppm, J en Hz.

18 19 20 1’ 2’

4 2,55 dd (16,6; 4,6) 3,30 dd (16,6; 8,1) 2,67 m 2,70 m 0,97 m 1,86 m 1,61 d (8,1) 1,32 d (7,3) 4,71 br s; 5,23 br s 1,28 s 0,86 s 2,31 s -

15 2,63 dd (16,4; 4,7) 3,38 dd (16,4; 7,6) 2,67 m 2,70 m 0,93 m 1,82 m 1,56 d (8,1) 1,26 d (7,3) 4,67 br s; 5,19 br s 1,23 s 0,82 s 2,27 s 3,83 s -

16 2,56 dd (16,9; 4,6 ) 3,36 dd (16,9; 8,1) 2,64 m 2,71 m 0,91 m 1,80 m 1,56 d (8,1) 1,26 d (7,3) 4,66 br s; 5,19 br s 1,23 s 0,81 s 2,27 s 3,87 m 1,84 m

17 2,42 dd (16,9; 4,9) 3,14 dd (16,9; 8,1) 2,65 m 2,69 m 0,94 m 1,83 m 1,58 d (8,3) 1,24 d (7,3) 4,71 br s; 5,22 br s 1,23 s 0,82 s 2,17 s 2,37 s -

3’

-

-

1,10 t (7,3)

-

4’ 6’ 7’ OH

5,09 br s

-

-

-

1α 1β 2 7 8 9 11 16 17

49

18 2,44 dd (16,9; 4,9) 3,15 dd (16,9; 8,6) 2,65 m 2,72 m 0,93 m 1,85 m 1,59 d (8,1) 1,25 d (7,3) 4,72 br s; 5,22 br s 1,23 s 0,82 s 2,17 s 6,39 dd (17,4; 10,5) 6,08 dd (10,5; 1,0) 6,67 dd (17,4; 1,0) -

19 2,47 dd (16,9; 4,7) 3,19 dd (16,9; 8,1) 2,65 m 2,74 m 0,95 m 1,87 m 1,62 d (8,3) 1,25 d (7,3) 4,75 br s; 5,25 br s 1,24 s 0,86 s 2,22 s -

20 2,47 dd (16,9; 4,7) 3,18 dd (16,9; 8,1) 2,65 m 2,74 m 0,95 m 1,85 m 1,61 d (8,1) 1,24 d (7,3) 4,74 br s; 5,24 br s 1,23 s 0,85 s 2,21 s -

8,44 d (9,1)

8,19 d (8,6)

8,40 d (9,1) 8,44 d (9,1) 8,40 d (9,1) -

7,53 d (8,6) 8,19 d (8,6) 7,53 d (8,6) -

Tabla 5. Datos espectroscópicos de

13

C RMN de la jatrofolona A (4) y sus derivados

(15-20), en CDCl3, δ en ppm.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 7’

4 30,35 t 42,61 d 208,08 s 137,50 s 132,65 s 146,06 s 33,57 t 21,47 t 28,39 d 19,49 s 26,02 d 136,63 s 134,27 s 150,06 s 130,73 s 15,82 q 114,85 t 28,21 q 16,14 q 13,24 q -

15 31,39 t 42,54 d 207,67 s 142,86 s 137,92 s 146,16 s 33,47 t 21,50 t 28,46 d 19,43 s 26,03 d 138,57 s 137,48 s 154,60 s 133,28 s 15,72 q 114,70 t 28,21 q 16,20 q 13,67 q 59,80 q -

16 31,63 t 42,56 d 207,71 s 143,03 s 137,82 s 146,20 s 33,49 t 21,50 t 28,51 d 19,38 s 26,05 d 138,72 s 137,21 s 153,79 s 133,20 s 15,69 q 114,65 t 28,20 q 16,17 q 13,90 q 74,01 t 23,79 t 10,64 q -

17 30,95 t 42,44 d 207,06 s 143,21 s 137,90 s 145,80 s 33,31 t 21,41 t 28,23 d 19,63 s 25,99 d 139,67 s 137,90 s 145,59 s 133,21 s 15,61 q 115,08 t 28,18 q 16,14 q 13,94 q 168,50 s 20,55 q -

* pueden intercambiarse.

50

18 31,00 t 42,48 d 207,02 s 143,26 s 137,97 s* 145,59 s 33,32 t 21,43 t 28,28 d 19,63 s 26,05 d 139,74 s 137,93 s* 145,61 s 133,25 s 15,59 q 115,08 t 28,17 q 16,14 q 13,92 q 163,51 s 127,30 d 133,06 t -

19 31,04 t 42,49 d 206,72 s 143,00 s 138,32 s 145,59 s 33,28 t 21,45 t 28,17 d 19,72 s 26,09 d 140,32 s 137,79 s 145,44 s 133,50 s 15,59 q 115,26 t 28,26 q 16,18 q 14,05 q 162,36 s 134,30 s 131,39 d 123,93 d 151,16 s 123,93 d 131,39 d

20 31,06 t 42,50 d 206,97 s 143,31 s 138,09 s* 145,81 s 33,32 t 21,45 t 28,18 d 19,67 s 26,07 d 139,93 s 138,04 s* 145,31 s 133,37 s 15,59 q 115,16 t 28,28 q 16,18 q 14,03 q 163,33 s 127,40 s 131,62 d 129,17 d 140,54 s 129,17 d 131,62 d

Tabla 6. Datos espectroscópicos de 1H RMN de la jatrofolona B (5) y sus derivados (21-26), en CDCl3, δ H en ppm, J en Hz.

18 19 20 1’ 2’

5 2,57 dd (16,4 ; 3,4) 3,24 dd (16,4 ; 7,8) 2,66 m 2,68 m 0,96 m 1,85 m 1,63 d (8,3) 1,34 d (7,3) 4,72 br s; 5,28 br s 1,28 s 0,85 s 2,31 s -

21 2,58 dd (16,9; 3,7) 3,30 dd (16,9; 7,6) 2,62 m 2,66 m 0,91 m 1,82 m 1,57 d (8,3) 1,28 d (7,3) 4,68 br s; 5,25 br s 1,24 s 0,81 s 2,28 s 3,83 s -

22 2,56 dd (16,9; 3,4) 3,30 dd (16,9; 7,8) 2,60 m 2,65 m 0,91 m 1,80 m 1,57 d (8,3) 1,28 d (7,3) 4,68 br s; 5,24 br s 1,23 s 0,80 s 2,28 s 3,86 m 1,84 m

23 2,45 dd (17,1; 3,9) 3,10 dd (17,1; 8,1) 2,62 m 2,65 m 0,93 m 1,83 m 1,59 d (8,3) 1,26 d (7,3) 4,73 br s; 5,27 br s 1,23 s 0,81 s 2,17 s 2,38 s -

3’

-

-

1,10 t (7,3)

-

4’ 6’ 7’ OH

4,89 br s

-

-

-

1α 1β 2 7 8 9 11 16 17

51

24 2,46 dd (16,9; 4,2) 3,09 dd (16,9; 7,8) 2,60 m 2,67 m 0,91 m 1,83 m 1,60 d (8,1) 1,26 d (7,3) 4,74 br s; 5,27 br s 1,23 s 0,82 s 2,17 s 6,39 dd (17,4; 10,5) 6,08 dd (10,5; 1,0) 6,67 dd (17,4; 1,0) -

25 2,49 dd (16,9; 3,2) 3,13 dd (16,9; 7,6) 2,61 m 2,68 m 0,95 m 1,87 m 1,63 d (8,3) 1,27 d (7,3) 4,77 br s; 5,31 br s 1,24 s 0,85 s 2,22 s -

26 2,49 dd (16,9; 3,4) 3,13 dd (16,9; 7,9) 2,60 m 2,68 m 0,95 m 1,86 m 1,62 d (8,1) 1,26 d (7,3) 4,76 br s; 5,29 br s 1,23 s 0,85 s 2,21 s -

8,44 d (9,1)

8,19 d (8,6)

8,40 d (9,1) 8,44 d (9,1) 8,40 d (9,1) -

7,53 d (8,6) 8,19 d (8,6) 7,53 d (8,6) -

Tabla 7. Datos espectroscópicos de

13

C RMN de la jatrofolona B (5) y sus derivados

(21-26), en CDCl3, δ en ppm.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 7’

5 30,15 t 42,43 d 208,28 s 137,42 s 131,79 s 145,62 s 33,50 t 21,46 t 28,34 d 19,49 s 25,96 d 137,21 s 134,37 s 150,20 s 131,09 s 16,15 q 115,16 t 28,22 q 16,15 q 13,32 q -

21 31,17 t 42,37 d 207,84 s 143,34 s 137,84 s 145,62 s 33,36 t 21,49 t 28,46 d 19,42 s 26,03 d 138,79 s 137,66 s 154,66 s 132,46 s 16,94 q 115,08 t 28,20 q 16,18 q 13,68 q 59,72 q -

22 31,39 t 42,38 d 207,88s 143,55 s 137,72 s 145,70 s 33,38 t 21,50 t 28,48 d 19,39 s 26,03 d 138,95 s 137,38 s 153,84 s 132,37 s 16,96 q 115,02 t 28,20 q 16,17 q 13,93 q 73,95 t 23,79 t 10,64 q -

23 30,70 t 42,29 d 207,24 s 143,73 s 138,14 s 145,86 s 33,24 t 21,40 t 28,19 d 19,63 s 25,98 d 139,86 s 137,83 s 145,05 s 132,40 s 16,83 q 115,45 t 28,19 q 16,15 q 13,97 q 168,50 s 20,55 q -

52

24 30,74 t 42,32 d 207,20 s 143,79 s 138,21 s 145,66 s 33,24 t 21,42 t 28,25 d 19,63 s 26,02 d 139,91 s 137,86 s 145,04 s 132,44 s 16,78 q 115,47 t 28,18 q 16,14 q 13,96 q 163,51 s 127,30 d 133,06 t -

25 30,79 t 42,32 d 206,89 s 143,52 s 138,24 s 145,64 s 33,20 t 21,44 t 28,17 d 19,72 s 26,06 d 140,50 s 138,02 s 145,64 s 132,69 s 16,78 q 115,64 t 28,23 q 16,18 q 14,08 q 162,34 s 134,30 s 131,39 d 123,93 d 151,16 s 123,93 d 131,39 d

26 30,80 t 42,33 d 207,14 s 143,83 s 138,28 s 145,85 s 33,24 t 21,44 t 28,18 d 19,67 s 26,05 d 140,10 s 138,00 s 145,01 s 132,55 s 16,78 q 115,54 t 28,26 q 16,19 q 14,06 q 163,31 s 127,40 s 131,62 d 129,17 d 140,54 s 129,17 d 131,62 d

Tabla 8. Datos espectroscópicos de 1H y 13C RMN de las jatrofolonas (27-30), en CDCl3; δ en ppm, J en Hz. H 1α 1β 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’

27 2,89 d (16,14) 2,96 d (16,14) 2,68 m 0,90 m 1,82 m 1,56 d (8,1) 1,20 s* 4,66 br s; 5,20 br s 1,23 s 0,82 s 2,27 s 3,82 s 1,19 s* -

28 2,95 d (16,9) 3,03 d (16,9) 2,72 m 1,00 m 1,90 m 1,65 d (8,1) 1,28 s* 4,75 br s; 5,29 br s 1,32 s 0,90 s 2,36 s 3,94 m 1,94 m 1,19 t (7,3) 1,27 s* -

29 2,79 dd (16,9; 8,6) 3,02 t (17,9) 2,65 m 0,93 m 1,81 m 1,55 d (8,1) 1,17 s 4,63 br s; 5,19 br s 1,23 s 0,82 s 2,27 s 3,83 s 1,48 m 1,25 m 0,87 t (7,1) -

C 30 2,77 dd (17,1; 9,3) 3,00 t (17,4) 2,65 m 0,93 m 1,80 m 1,55 d (8,1) 1,16 s 4,63 br s; 5,20 br s 1,23 s 0,81 s 2,27 s 3,86 m 1,84 m 1,10 t (7,6) 1,49 m 1,25 m 0,86 t (7,1)

* pueden intercambiarse.

53

27

28

29

30

39,19 t

39,43 t

41,98 t

42,02 t

45,50 s 209,61 s 141,67 s 138,04 s 145,98 s 33,38 t 21,51 t 28,47 d 19,44 s 26,05 d 138,70 s 137,95 s 154,79 s 131,95 s 24,69 q*

45,30 s 209,64 s 141,84 s 137,85 s 146,02 s 33,40 t 21,53 t 28,52 d 19,39 s 26,07 d 138,84 s 137,79 s 153,98 s 131,87 s 24,68 q*

48,96 s 209,74 s 141,12 s 137,83 s 146,12 s 33,37 t 21,52 t 28,49 d 19,41 s 26,09 d 138,58 s 137,66 s 154,00 s 133,13 s 23,56 q

48,96 s 209,91 s 142,45 s 137,76 s 146,20 s 33,39 t 21,52 t 28,49 d 19,39 s 26,07 d 138,78 s 137,39 s 153,78 s 133,05 s 23,60 q

114,80 t

114,75 t

114,76 t

114,71 t

28,21 q 16,22 q 13,68 q 59,76 q 26,19 q* -

28,20 q 16,18 q 13,90 q 73,95 t 23,78 t 10,64 q 26,16 q* -

28,20 q 16,20 q 13,65 q 59,72 q 36,86 t 18,08 t 14,65 q -

28,22 q 16,21 q 13,90 q 73,94 t 23,80 t 10,69 q 37,05 t 18,10 t 14,69 q

El espectro de

13

C RMN muestra seis carbonos más, cuatro carbonos triplete y dos carbonos

cuarteto. El compuesto 28 se formó a partir de una mezcla de los propil éteres de jatrofolonas A y B (16 y 22), mientras que el 29 se generó por reacción de la mezcla de los metil éteres de jatrofolonas A y B (15 y 21). El espectro de 1H RMN del compuesto 28 se diferencia del de los compuestos 16 y 22 en la aparición de una nueva señal singulete que integra por 3H. El espectro de

13

C RMN muestra un carbono cuarteto más. El espectro de 1H RMN del

compuesto 29 se diferencia del de los compuestos 15 y 21 en la aparición de tres nuevas señales, dos multipletes integrando cada uno por 2H y un triteple que integra por 3H. El espectro de 13C RMN muestra tres carbonos más, 2C triplete y 1C cuarteto.

3.4 Biotransformación de jatrofona.

La jatrofona fue biotransformada solamente por A. niger, obteniéndose un derivado más polar que la jatrofona. A partir del espectro de masas HRMS (EI) del compuesto se calculó la fórmula molecular C20H26O4 indicando 8 grados de insaturación. La principal diferencia que muestra el espectro de FT-IR del compuesto 31 con el de jatrofona es la presencia de una banda ancha de absorción a 3477 cm-1, indicando la presencia de grupos OH en la molécula. Además las dos de carbonilo a 1756 y 1659 cm-1 difieren de las de jatrofona a 1693 y 1660 cm-1. El espectro de 1H RMN del compuesto 31 mostraba una gran similitud con el de jatrofona. Las principales diferencias fueron observadas en la desaparición de dos señales doblete a δ 6,02 y 6,47 (J = 16,4 Hz) en la jatrofona, apareciendo dos señales doblete en δ 3,56 y 4,12 (J = 11,5 Hz) en el compuesto 31, sugiriendo hidroxilación del doble enlace. En el derivado biotransformado un metilo a δ 1,01 (d, J = 7,1 Hz) y un cuarteto a δ 2,40 (J = 7,1 Hz) aparecen en lugar del metilo olefínico en δ 1,77, indicando la presencia de una secuencia CH3-CH. En el espectro 13C RMN de 31, en lugar de las señales que correspondían a C-sp2 en δ 128,66 (d) y 159,00 (d) así como en δ 183,21 (s) y 112,36 (s) para la jatrofona, fueron observados dos dobletes a δ 65,97 y 80,08, un singulete en δ 84,62 y un doblete en δ 53,40. Por lo tanto, el compuesto 31 presenta una función OH y un anillo adicional es requerido según la fórmula 54

molecular. La ubicación del grupo OH se dedujo a partir de los desplazamientos químicos de C y de las correlaciones de HMBC. Las constantes de acoplamiento para los dobletes en δ 3,56 y 4,12 (J = 11,5 Hz) sugieren una relación trans similar a la que se observa para los aductos de propanotiol de jatrofona publicados por Taylor et al. (1983a).

Basados en los datos mencionados y con el fin de determinar la estereoquímica absoluta de la molécula, se propuso un mecanismo de reacción entre la jatrofona (3) y una enzima oxidasa (Enz) presente en el hongo Aspergillus niger. La estereoquímica de la reacción entre la jatrofona y la enzima oxidasa, es un ejemplo de las reacciones tandem estereoselectivas (reacción secuencial Michael-Michael-enolato-hidrólisis), que nos condujo a racionalizar la formación preferencial del compuesto 31 como el producto único (Esquema 2). Sólo se formó un regioisómero en la biocatálisis con A. niger, lo cual es explicado por la restricción conformacional de la jatrofona y del impedimento estérico del nucleófilo de la enzima oxidasa. El primer paso está dado por la adición de un grupo RO− de la oxidasa formando regioselectivamente el enolato E 3b. Asumiendo la conformación 3 como la preferida en términos de estabilidad para la jatrofona, la estereoselectividad va a depender de la diferenciación diastereotópica facial de la cetona α,β-insaturada en 3a, la cual está dada por los grupos que controlan la trayectoria del ataque de la enzima. La proyección de Newman de

3 muestra dos caminos posibles para la adición nucleofílica: el menos impedido y favorecido para el ataque de la oxidasa (3aA), y el desfavorecido por efectos estereoelectrónicos según lo atribuido (3aB). Además, los cálculos teóricos de las geometrías asociadas a la adición de la oxidasa, llevados a cabo mediante cálculos de DFT (B3LYP/6-31G) utilizando el programa Gaussian 98, corroboraron que el confórmero más estable es 3 (12 kcal/mol), según lo representado en el Esquema 2, el que produjo el enolato E (3b) y concordantemente la generación del primer centro estereogénico producido en el proceso tipo Michael a través de

3aB. Otro aspecto interesante en la ciclación es que el proceso de formación de los productos es exotérmico a trabes de los cálculos de las energías relativas de los productos formados (DFT, B3LYP/6-31G).

55

El enolato E 3b también presenta las restricciones estereoelectrónicas del confórmero asociadas a las interacciones desfavorables de los pares de electrones oxígeno-oxígeno entre la butenolidona y el enolato. El enolato 3b ataca selectivamente la única cara disponible (cara si) de la butenólidona (o del ión oxonio). El ataque del enolato también exhibió un acercamiento antiperiplanar de los sistemas π del enolato nucleofílico y del doble enlace de la butenólidona. El arreglo sinclinal sería el preferido para que el estado de transición del intermediario ión oxonio esté presente y no pueda ser desechado. Los centros estereogénicos formados de esta manera son también selectivos, dando la estereoquímica trans como se muestra en el intermediario 3c.

Finalmente, la hidrólisis del enolato, previamente formado en 3c, por la adición de un hidrógeno del agua o del medio ácido por su cara si da el intermediario 3d que después de la liberación de la enzima produce el compuesto 31 como el producto único de la reacción, según lo representado en el Esquema 2.

O

O O

+

− O

O

O

O

O Nu, Enz

A

H

B

3

− O

H

3a

Nu

OEnz

O H 3b

Nu

O OO

OO H

O

OEnz

−O

H

OEnz

H OH

O 3c

O 3d

31

Esquema 2. Mecanismo de reacción propuesto para la ciclación oxidativa de jatrofona mediada por Aspergillus niger.

56

Se determinó la citotoxicidad del nuevo diterpeno 31 obtenido por biotransformación por el método de incorporación del rojo neutro sobre células AGS y fibroblastos de pulmón humano con valores de IC50 de 53,1 y 260 µM respectivamente. El compuesto 31 obtenido por transformación microbiana de jatrofona con Aspergillus niger no ha sido previamente reportado. Proponemos el nombre 9β-hidroxiisabelliona para el compuesto 31. Los datos espectroscópicos de 1H y

13

C RMN del compuesto 31 y de la

jatrofona 3 (para fines comparativos) se presentan en la Tabla 9.

Tabla 9. Datos espectroscópicos de 1H y 13C RMN de la jatrofona 3 y su biotransformado 31 en CDCl3; δ H en ppm, J en Hz.

H 1α 1β 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 α 11 β 12 13 14 15 16 17 18 19 20

3 2,17 dd (13,7; 5,9) 1,88 dd (13,7; 7,8) 3,00 ddq (7,8; 7,0; 5,9) 5,83 br s 5,84 br s 6,02 d (16,4) 6,47 d (16,4) 2,89 d (14,7) 2,43 d (14,7) 1,10 d (7,0) 1,90 s 1,27 s 1,39 s 1,77 s

C 31 2,33 dd (13,2; 6,4) 1,85 dd (13,2; 7,8) 3,16 ddq br (7,8; 7,1; 6,4) 6,29 br s 6,70 br s 3,56 d (11,5) 4,12 d (11,5) 2,07 d (14,7) 1,96 d (14,7) 2,40 q (7,1) 1,14 d (7,1) 1,87 s 1,11 s 1,13 s 1,01 d (7,1)

57

3

31

42,41 t

48,26 t

38,28 d

37,58 d

123,68 d 137,05 s 147,05 d 141,72 s 201,94 s 128,66 d 159,0 d 36,59 s

154,16 d 139,36 s 131,86 d 136,71 s 202,08 s 65,97 d 80,08 d 38,05 s

41,17 t

50,06 t

183,21 s 112,36 s 203,85 s 99,71 s 18,93 q 20,69 q 30,35 q 26,86 q 6,00 q

84,62 s 53,40 d 216,94 s 93,52 s 19,31 q 22,04 q 21,51 q 27,33 q 7,22 q

3.5 Actividad biológica.

3.5.1 Compuestos bioactivos de los rizomas de Jatropha isabelli.

a. Efecto gastroprotector.

Los cinco compuestos mayoritarios presentes en los rizomas de Jatropha isabelli, el triterpeno ácido acetil aleuritólico (1), el sesquiterpeno ácido ciperenoico (2), los diterpenos jatrofona (3), jatrofolona A (4) y jatrofolona B (5) fueron evaluados como gastroprotectores por vía oral en el modelo de úlcera gástrica inducida por HCl/EtOH en ratones. Los compuestos 1, 2 y 4 se evaluaron a tres diferentes dosis (25, 50 y 100 mg/kg) y los compuestos 3 y 5 se ensayaron en cinco dosis (6, 12, 25, 50 y 100 mg/kg). Además se evaluó en el mismo modelo el nuevo derivado de la jatrofona 6 y su acetato 6a a dosis fija de 25 mg/kg. Los resultados se muestran en la Tabla 10.

El triterpeno 1 demostró el efecto gastroprotector más alto en la dosis más baja, reduciendo las lesiones en un valor cercano al 50%, con menor efecto en las dosis de 50 y 100 mg/kg. El sesquiterpeno ácido ciperenoico (2) exhibió efecto gastroprotector dependiente de la dosis, reduciendo las lesiones ulcerosas en 45 y 75% a las dosis de 50 y 100 mg/kg, respectivamente. El diterpeno jatrofona (3) mostró muy fuerte efecto gastroprotector, sin diferencias estadísticamente significativas entre las dosis de 25, 50 o 100 mg/kg, reduciendo las lesiones desde 80% hasta 93%, decreciendo su efecto a la dosis de 12 mg/kg (57%) y desapareciendo totalmente este a la dosis de 6 mg/kg. La jatrofolona A (4) presentó una respuesta relativa a la dosis, con el efecto máximo (reducción de la lesión del 54%) en la dosis más alta (100 mg/kg). La jatrofolona B (5) demostró acción gastroprotectora muy fuerte aún a la dosis más baja (6 mg/kg, 65% reducción de lesiones), disminuyendo las lesiones en un 83 a 91% entre las dosis de 12 a 100 mg/kg. El nuevo diterpeno 9β, 13β-dihidroxiisabelliona (6) presentó un moderado efecto gastroprotector (35%), mientras que su acetato (6a), redujo las lesiones gástricas en 65%.

58

Tabla 10. Efecto gastroprotector de los compuestos 1-6a.

Compuesto

Dosis (mg/kg)

Control de 2

25 50 100 20 25 50 100 6 12 25 50 100 25 50 100 6 12 25 50 100 25 25

Ácido ciperenoico 2 Control 1, 3-6a Lansoprazol Ácido acetil aleuritólico 1

Jatrofona 3

Jatrofolona A 4

Jatrofolona B 5

9β, 13β-dihidroxiisabelliona 6 6a

Índice de lesión (mm) 44,3 + 2,7 44,3 + 2,5 24,4 + 2,8* 11,0 + 1,9* 35,4 ± 1,6 9,4 ± 1,2* 16,7 ± 1,2* 24,5 ± 1,9* 22,8 ± 1,7* 35,7 ± 2,1 15,1 ± 2,1* 7,0 ± 1,5* 3,5 ± 0,6* 2,5 ± 0,6* 22,6 ± 3,2* 19,9 ± 1,7* 16,1 ± 2,3* 12,4 ± 1,5* 6,0 ± 1,1* 5,9 ± 1,1* 5,0 ± 0,5* 3,1 ± 0,5* 22,9 ± 2,2* 12,3 ± 2,7*

% Inhibición de lesiones 0 45 75 73 53 31 36 0 57 80 90 93 36 44 54 65 83 83 86 91 35 65

Los resultados se expresan como la media aritmética ± error estándar (E.E.). ANOVA seguida por test de Dunnett * P < 0,01 comparado con el control correspondiente.

b. Citotoxicidad y lipofilia. La citotoxicidad de los compuestos aislados fue determinada sobre fibroblastos y células AGS por el método de incorporación del rojo neutro descrito en Materiales y Métodos. Los resultados se muestran en la Tabla 11.

59

El ácido acetil aleuritólico (1) y la jatrofolona B (5) no fueron citotóxicos a las concentraciones ensayadas, con valores de IC50 mayores a 1000 µM. Por su parte, el ácido ciperenoico presentó mayor citotoxicidad contra células AGS (463 µM) que contra fibroblastos (968 µM).

La jatrofona (3) mostró una citotoxicidad alta, con valores de IC50 de 2,8 µM en fibroblastos y 2,5 µM para células AGS. La jatrofolona A (4) fue selectiva contra las células AGS, con valor de IC50 de 49 µM. El efecto del nuevo derivado de núcleo jatrofona 6 y el de su acetato 6a, presentaron tendencias similares, con valores de citotoxicidad más altos contra fibroblastos que contra células AGS.

La lipofilia de los compuestos es presentada en la Tabla 11. El compuesto 1 mostró el valor más alto de lipofilia teórica, mientras que los compuestos 6 y 6a fueron los menos hidrofóbicos.

Tabla 11. Citotoxicidad sobre fibroblastos y células AGS y lipofilia teórica (calculada con el programa ChemDraw Ultra 8.0.) de los compuestos 1-6a.

Compuesto Lansoprazol Ácido acetil aleuritólico (1) Ácido ciperenoico (2) Jatrofona (3) Jatrofolona A (4) Jatrofolona B (5) 9β, 13β-dihidroxiisabelliona (6) 6a

Citotoxicidad IC50 (µM) AGS Fibroblastos 115 306 >1000 >1000 463 968 2,5 2,8 49 >1000 >1000 >1000 200 87,5 92,8 25,8

60

Lipofilia (log P) 7,993 3,287 2,047 4,414 4,414 0,562 0,792

Ácido ciperenoico y derivados.

a. Efecto gastroprotector.

A partir de la curva de dosis-respuesta obtenida para el producto natural ácido ciperenoico (2) a las dosis de 25, 50 y 100 mg/kg (Figura 9), se decidió evaluar los derivados obtenidos por semisíntesis a la dosis oral fija de 50 mg/kg, para poder determinar tendencias en la relación estructura/actividad de este grupo de terpenos.

Índice de lesión (mm)

50

40

30

*

20

* 10

*

0 Control

25

50

100

Lan (20 mg/kg)

Ácido ciperenoico (mg/kg)

Figura 9. Actividad gastroprotectora del ácido ciperenoico (2) a 25, 50 y 100 mg/kg y lansoprazol a 20 mg/kg. Los resultados se expresan como la media aritmética ± error estándar (E.E.). ANOVA seguida por test de Dunnett * P < 0,01 comparado con el control.

El ácido ciperenoico y los sesquiterpenos 8-14, presentaron diferente efecto gastroprotector. Los resultados son presentados en la Tabla 12. El mejor efecto fue observado para el derivado

14, obtenido como una mezcla diasteromérica por la reducción del doble enlace ∆4, 5 del ácido ciperenoico. El compuesto 14 redujo el índice de lesión en un 86%, siendo el más activo de los sesquiterpenos evaluados y más activo que el lansoprazol a 20 mg/kg. Los productos 8 y 10-14 no demostraron diferencias significativas en la actividad gastroprotectora (P < 0,01). Mientras que el compuesto acetilado (9) presentó actividad gastroprotectora del 49%.

61

Tabla 12. Efecto gastroprotector del ácido ciperenoico (2) y sus derivados (8-14). Compuesto (50 mg/kg) Control 8 9 Ácido ciperenoico (2) 10 11 12 13 14 Lansoprazol (20 mg/kg)

Índice de lesión (mm) 35,4 ± 1,6 8,3 ± 1,0* 18.1 ± 1,4* 13,4 ± 2,0* 10,0 ± 1,1* 8,9 ± 1,1* 8,4 ± 1,4* 12,7 ± 0,8* 5,0 ± 0,8* 9,4 ± 1,2*

% Inhibición de lesiones 77 49 62 72 75 76 64 86 73

Los resultados se expresan como la media aritmética ± error estándar (E.E.). ANOVA seguida por test de Dunnett * P < 0,01 comparado con el control.

b. Citotoxicidad y lipofilia.

El ciperenol (8) y el metil éster del ácido ciperenoico (10), fueron los compuestos más citotóxicos con valores de IC50 de 44 y 75 µM para el ciperenol y 48 y 75 µM para el metil éster contra células AGS y fibroblastos, respectivamente. Los compuestos 9 y 12 no fueron selectivos contra ninguna de las dos líneas celulares evaluadas, con valores de IC50 cercanos a 150 µM y 100 µM, respectivamente. El p-anisidil derivado (13) presentó valores de citotoxicidad muy similares a los del ácido ciperenoico (2). Los valores de citotoxicidad y lipofilia son presentados en la Tabla 13.

El compuesto con mayor valor de lipofilia teórica fue el obtenido para la amida aromática 13. La menor lipofilia fue la del ciperenol (8).

62

Tabla 13. Citotoxicidad sobre fibroblastos y células AGS y lipofilia teórica (calculada con el programa ChemDraw Ultra 8.0.) del ácido ciperenoico 2 y sus derivados (8-14). Citotoxicidad IC50 (µM) AGS Fibroblastos 44 75 143 163 463 968 48 75 189 474 96 91 439 841 618 950 115 306

Compuesto

8 9 Ácido ciperenoico (2) 10 11 12 13 14 Lansoprazol

Lipofilia (log P) 3,156 3,271 3,287 3,550 3,210 4,113 4,409 3,678 -

3.5.3 Derivados de las jatrofolonas A y B.

a. Efecto gastroprotector.

Para determinar la dosis a la cual evaluar los derivados de las jatrofolonas A y B se procedió a realizar una curva de dosis-respuesta tanto para la jatrofolona A, a las dosis de 25, 50 y 100 mg/kg (Figura 10), como para la jatrofolona B, a las dosis de 6, 12, 25, 50 y 100 mg/kg (Figura 11).

40

Índice de lesión (mm)

35 30

* 25

* *

20 15

* 10 5 0 Control

25

50

100

Lan (20 mg/kg)

Jatrofolona A (mg/kg)

Figura 10. Actividad gastroprotectora de jatrofolona A (4) a 25, 50 y 100 mg/kg y lansoprazol a 20 mg/kg. Los resultados se expresan como la media aritmética ± error estándar (E.E.). ANOVA seguida por test de Dunnett * P < 0,01 comparado con el control. 63

40

Índice de lesión (mm)

35 30 25 20

*

15

* 10

*

*

*

5

*

0 Control

6

12

25

50

Jatrofolona B (mg/kg)

100

Lan (20 mg/kg)

Figura 11. Actividad gastroprotectora de jatrofolona B (5) a 6, 12, 25, 50 y 100 mg/kg y lansoprazol a 20 mg/kg. Los resultados se expresan como la media aritmética ± error estándar (E.E.). ANOVA seguida por test de Dunnett * P < 0,01 comparado con el control.

Teniendo en cuenta la curva de dosis respuesta, se decidió evaluar los derivados de la jatrofolona A en la dosis de 100 mg/kg, y los derivados de la jatrofolona B así como los compuestos 27-30 a 25 mg/kg, para poder determinar tendencias en la relación estructura/actividad de este grupo de terpenos. Los resultados se muestran en la Tabla 14.

Los compuestos 15, 16, 20, 29 y 30 redujeron las lesiones gástricas entre 60 y 70%, siendo tan activos como lanzoprazol a 20 mg/kg. Los compuestos 17, 22 y 24 protegieron la mucosa gástrica en forma significativa (P < 0,01). Mientras que los compuestos 18, 19, 21, 23, 25, 26,

27 y 28 no demostraron efecto gastroprotector significativo.

64

Tabla 14. Efecto gastroprotector de los derivados de jatrofolona 15-30.

Compuesto Control Lansoprazol (20 mg/kg) Jatrofolonas A (100 mg/kg) 15 16 17 18 19 20 Jatrofolonas B (25 mg/kg) 21 22 23 24 25 26 Jatrofolonas (25 mg/kg) 27 28 29 30

Índice de lesión (mm) 22,0 ± 1,5 9,4 ± 1,2**

% Inhibición de lesiones 57

6,6 ± 1,2** 8,8 ± 1,0** 12,3 ± 2,1** 18,9 ± 2,4 19,1 ± 2,4 6,4 ± 0,9**

70 60 44 14 13 71

15,0 ± 2,0 10,4 ± 1,5** 14,8 ± 1,8 12,4 ± 1,0** 15,5 ± 2,2 22,0 ± 1,1

31 53 33 44 29 0

24,4 ± 2,5 39,4 ± 5,5 6,7 ± 1,0** 8,0 ± 1,3**

0 0 69 64

Los resultados se expresan como la media aritmética ± error estándar (E.E.). ANOVA seguida por test de Dunnett * P < 0,05 y ** P < 0,01 comparado con el control.

b. Citotoxicidad y lipofilia. Los derivados más citotóxicos fueron los compuestos 16, 21, 22, 24, 28 y 29 con valores de IC50 entre 45 y 90 µM en células AGS y entre 45 y 75 µM en fibroblastos. Los compuestos 17,

23 y 30, presentaron valores de citotoxicidad cercanos a 100 µM en ambas líneas celulares, mientras que los compuestos 19, 20, 25-27, no fueron citotóxicos, con valores de IC50 > 1000 µM en fibroblastos y células AGS. Los valores de citotoxicidad y lipofilia se muestran en la Tabla 15.

65

El compuesto más lipofílico de la serie fue el 30 con un valor de lipofilia (log P) de casi el doble que el mostrado por las jatrofolonas A y B (7,043 contra 4,414). Los acetatos 17 y 23 fueron los compuestos con menor valor de lipofilia teórica.

Tabla 15. Citotoxicidad sobre fibroblastos y células AGS y lipofilia teórica (calculada con el programa ChemDraw Ultra 8.0.) de los derivados de jatrofolona 15-30. Compuesto Jatrofolonas A 15 16 17 18 19 20 Jatrofolonas B 21 22 23 24 25 26 Jatrofolonas 27 28 29 30 Lansoprazol

191 88,3 100 105 >1000 >1000

187 55,8 98,9 190 >1000 >1000

63,8 88,3 148 44,4 >1000 >1000

56,6 48,3 100 73,2 >1000 >1000

Lipofilia (log P) 4,414 4,677 5,501 4,389 5,073 5,453 6,845 4,414 4,677 5,501 4,389 5,073 5,453 6,845

>1000 74,8 80,4 104 115

>1000 55,1 55,5 117 306

5,384 6,208 6,218 7,043 -

Citotoxicidad IC50 (µM) AGS Fibroblastos

66

4. Discusión.

Poco se sabe de la química y actividad biológica de las Euphorbiaceae del Paraguay. Los pocos estudios existentes se han enfocado en el aislamiento de diterpenos de Jatropha grossidentata, una planta usada para el aprendizaje shamánico por los indígenas Ayoreo en el Chaco paraguayo (Jakupovic et al., 1988; Schmeda-Hirschmann et al., 1992), y el efecto antiprotozoario de los principales diterpenos de J. grossidentata así como de jatrofona de J. isabelli (Schmeda-Hirschmann et al., 1996). Es interesante destacar que Jatropha isabelli es sinónimo de J. gossipiifolia y J. gosypiifolia de acuerdo a bases internacionales de datos botánicos (http://www.ipni.org/index.html).

En esta Tesis se han aislado cinco terpenoides a partir de los rizomas de Jatropha isabelli. Estos compuestos aparecen en los extractos de polaridad baja y media de la planta. Los productos identificados son el triterpeno ácido acetil aleuritólico, el sesquiterpeno ácido ciperenoico y los diterpenos jatrofona, jatrofolona A y jatrofolona B. Además, se describe por primera vez un nuevo producto natural (6). Mediante modificaciones por semisíntesis del ácido ciperenoico, se prepararon siete derivados, cuatro de los cuales se describen por primera vez. A partir de los diterpenos jatrofolona A y jatrofolona B, se prepararon por reacciones de semisíntesis 16 derivados, de los cuales 12 son reportados por primera vez. Un nuevo compuesto hidroxilado (31) fue obtenido mediante biotransformación de jatrofona por el hongo Aspergillus niger. En total, se aislaron y obtuvieron por semisíntesis 31 compuestos, de los cuales dos productos naturales son nuevos, así como 16 derivados de semisíntesis.

El triterpeno ácido acetil aleuritólico (1) ha sido reportado como constituyente de varias especies de Euphorbiaceae. Este compuesto es el principal terpenoide presente en la corteza del tallo de Croton cajucara y reduce el tránsito gastrointestinal en ratones (Maciel et al., 1998; Maciel et al., 2000). El triterpeno también fue reportado en la Euphorbiaceae Croton urucurana (Peres et al., 1997; Gurgel et al., 2005) y Croton tonkinensis (Minh et al., 2004). La actividad antifilarial del ácido acetil aleuritólico aislado desde la Euphorbiaceae Discoglypremna caloneura contra Onchocerca gutturosa fue divulgada recientemente por Nyasse et al. (2006). 67

El ácido ciperenoico (2) ha sido reportado desde Sandwithia guyanensis, Croton crassifolius (Dictionary of Natural Products, 2006) y Jatropha isabelli (Schmeda-Hirschmann et al., 1996). El ciperenol (8) fue descrito por primera vez como un constituyente de los aceites esenciales de los tubérculos de Cyperus scariosus (Nerali y Chakravarti, 1967). El acetato de ciperenilo (9) fue reportado de las raíces de Cirsium dipsacolepis (Takano y Kawaminami, 1988). El ciperenol, ácido ciperenoico y su metil éster (10) fueron aislados desde la corteza de raíz de la Euphorbiaceae brasilera Joannesia princeps (Achenbach y Benirschke, 1997). Varias actividades biológicas han sido descritas para los derivados del ácido ciperenoico. Achenbach y Benirschke (1994) reportaron el efecto tóxico del ciperenol como más fuerte que la de podofilotoxina contra el camarón de agua salada Artemia salina.

Una gran variedad de diterpenos pertenecientes a diversos grupos estructurales incluyendo jatrofanos y jatrofolanos se han reportado como componentes de Euphorbiaceae incluyendo Euphorbia peplus (Jakupovic et al., 1998), E. terracita (Marco et al., 1998), E. pubescens (Valente et al., 2004; 2004a), Jatropha elliptica (Marquez et al., 2005), así como diterpenos del tipo latirano de Jatropha grossidentata (Jakupovic et al., 1988; Schmeda-Hirschmann et al., 1992), J. weddelliana (Brum et al., 2001) y J. podagrica (Aiyelaagbe et al., 1998).

Los diterpenos jatrofona, jatrofolona A, jatrofolona B y el nuevo compuesto 6 son típicos diterpenos de la familia Euphorbiaceae. El diterpeno jatrofona es el principal terpeno presente en los rizomas de la planta. Fue aislado por primera vez por Kupchan et al. (1970) y descrito como el componente antileucémico de Jatropha gosypiifolia por Taylor et al. (1983). Varias actividades biológicas han sido reportadas para la jatrofona, incluyendo reacción con tioles biológicos (Lillehaug et al., 1973), interacción con sRNA de Escherichia coli (D'Alagni et al., 1983), inhibición de la liberación de insulina (Menezes et al., 1992), efecto relajante sobre el músculo uterino (Calixto y Sant'Ana, 1990), acción relajante en la vena porta de ratas (Silva et al., 1995), efecto vasodilatador (Duarte et al., 1992), inhibición de la activación de los linfocitos, probablemente a través de la inhibición del camino de la proteína kinasa C (Gonçalves de Moraes et al., 1996), actividad antiprotozoaria (Schmeda-Hirschmann et al., 1996) y efecto molusquicida (dos Santos y Sant'Ana, 1999). El gran interés por esta molécula 68

ha dado lugar a numerosos estudios sobre la síntesis total de la misma (Smith III et al., 1981; Gyorkos et al., 1990; Han y Wiemer, 1992) así como también de moléculas estructuralmente relacionadas (Smith, III et al., 1989).

Los diterpenos jatrofolonas A y B son compuestos epímeros, que se diferencian sólo en la orientación del grupo metilo en C-16. Estos diterpenos pertenecen al esqueleto denominado jatrofolano. Poco es conocido sobre la actividad biológica de las jatrofolonas A y B, siendo la actividad molusquicida una de las pocas citadas en bibliografía (dos Santos y Sant’Ana, 1999). Sin embargo, la síntesis total de las jatrofolonas A y B ha sido estudiada en varias oportunidades principalmente por la complejidad de la molécula consistente en cuatro anillos fusionados de 5, 6, 7 y 3 miembros (Midland y Lee 1985; Smith, III et al., 1986; Matsuura et al., 2001). El único derivado natural reportado de las jatrofolonas A y B es el compuesto 18hidroxi-jatrofolona B conocido como jatrofol, aislado a partir de la fracción polar de las raíces de Jatropha curcas por Chen et al. (1988) y posteriormente por Naengchomnong et al. (1994) quienes realizaron una serie de modificaciones semisintéticas. Las jatrofolonas A y B fueron modificadas mediante semisintésis por Smith III et al. (1986) quienes generaron los metil éter de jatrofolonas A y B (15 y 21) y los acetatos de las jatrofolonas A y B (17 y 23).

4.1 Biotransformación.

Varios estudios divulgan el uso acertado de microorganismos para la bioconversión de diterpenos. Algunos ejemplos son la biotransformación de stemodina por Rhizopus oryzae (Martin et al., 2005), de isosteviol por Aspergillus niger, Glomerella cingulata y Mortierella elongata (Akihisa et al., 2004), la oxidación microbiana de baccatina y 1β-hidroxibaccatina I con Aspergillus niger (Shen et al., 2003), la biotransformación de un derivado del pimarano con Gibberella fujikuroi (Fraga et al., 2003), dehidroabietanol y teideadiol por Mucor plumbeus (Fraga et al., 2003a), stemodina y varios diterpenos de Stemodia con Aspergillus niger (Chen y Reese, 2002), Mucor plumbeus y Whetzelinia sclerotiorum (Chen et al., 2005).

Aspergillus niger ha sido usado en la biotransformación de varios substratos incluyendo esteroides, terpenos y alcaloides. Se ha utilizado para reducir cetonas a sus alcoholes 69

correspondientes y para oxidar heteroátomos. Sin embargo, las reacciones de hidroxilación de terpenos son las más comunes (Chen y Reese, 2002). Los reportes recientes de biotransformaciones de diterpenos por A. niger incluyen la hidroxilación del ácido dehidroabiético (Gouiric et al., 2004), solidagenona (Schmeda-Hirschmann et al., 2004), derivados del ácido grindélico (Orden et al., 2005), terpenos desde Stemodia maritima (Chen y Reese, 2002) así como isosteviol (de Oliveira, 1999).

La jatrofona (3) presenta un gran número de actividades biológicas las cuales se han mencionado con anterioridad. Sin embargo, es insoluble en agua de modo que su uso farmacológico es muy limitado (D'Alagni et al., 1981). La transformación microbiana de este diterpeno con el hongo A. niger, fue planeada para obtener nuevos derivados hidroxilados que tuvieran una mayor solubilidad, menor citotoxicidad y mejor biodisponibilidad.

Al comparar el efecto citotóxico de la jatrofona (IC50 de 2,4 y 2,8 µM sobre células AGS y fibroblastos respectivamente) con el de su producto obtenido por biotransformación 31 (IC50 de 53,1 µM sobre células AGS y 260 µM en fibroblastos) se puede apreciar claramente una gran disminución en la citotoxicidad sobre las dos líneas celulares evaluadas, realzándose la selectividad contra las células AGS. El compuesto 31 presenta una enorme similitud estructural con el diterpeno natural 6, diferenciándose solamente en que en el C-13 del compuesto 6 hay un grupo OH mientras que el compuesto 31 tiene un H. La citotoxicidad del compuesto 31 presentó valores muy similares a los obtenidos para el compuesto 6 (Tabla 11).

4.2 Lipofilia teórica.

El trasporte por difusión pasiva a través de una membrana biológica se incrementa en forma exponencial con el aumento de la lipofilicidad de un compuesto hasta un cierto nivel de lipofilicidad. Los compuestos muy lipofílicos alcanzan niveles de transporte que se hacen constantes y luego pueden disminuir debido a problemas de disolución en la capa acuosa conectada a la biomembrana (Bundgaad y Friis, 1996).

70

La lipofilia de los compuestos 1-6a fue presentada en la Tabla 11. El compuesto más lipofílico de esta serie fue el triterpeno 1, seguido de las jatrofolonas A y B y posteriormente del sesquiterpeno 2. Todos estros compuestos, a excepción del 2, presentaron valores de IC50 > 1000 µM sobre fibroblastos (el compuesto 2 mostró una IC50 de 968 µM). Mientras que los compuestos menos hidrofóbicos (compuestos 6 y 6a) mostraron valores de IC50 sobre fibroblastos de 87,5 y 25,8 µM, respectivamente. Sin embargo, la jatrofona, que presentó un valor de lipofilia intermedio a los compuestos mencionados, fue altamente citotóxica (2,8 µM sobre fibroblastos).

Estos resultados están en desacuerdo con lo estipulado por Rosenkranz et al. (1992). Es probable que los compuestos menos lipofilicos ingresen con mayor facilidad a la célula y la dañen o que los compuestos más lipofilicos formen aglomerados y por esta razón dañen menos a las células.

La relación entre lipofilia y citotoxicidad sobre células AGS fue menos clara. La actividad gastroprotectora tampoco mostró correlación con los valores de Log P.

Tanto para la serie de sesquiterpenos derivados del ácido ciperenoico, como para los derivados de las jatrofolonas A y B, no fue clara la relación entre los valores de lipofilia teórica con la citotoxicidad ni con el efecto gastroprotector.

4.3 Efecto gastroprotector.

El modelo de úlcera gástrica utilizado en esta Tesis (HCl/EtOH), evalúa la capacidad de la droga (compuesto) de proteger la mucosa gástrica. El etanol (EtOH) induce la formación de úlceras gástricas por una acción directa sobre la mucosa, teniendo poca influencia la formación de ácido gástrico en esta lesión. El etanol es un agente necrotizante que provoca daño tisular por la generación de radicales libres. La presencia de ácido clorhídrico (HCl) sólo acelera el proceso. Por otra parte, el etanol induce la solubilización del mucus presente en el estómago con un decrecimiento concomitante en la diferencia de potencial transmucosal y un

71

incremento del flujo de Na+ y K+ en el lumen. Además, realza la secreción de pepsina, la pérdida de iones H+ y el contenido de histamina en el lumen (Silva Melo et al., 2003). El lansoprazol (Lan) es un inhibidor de la bomba de protones (H+, K+-ATPasa), el cual favorece la cicatrización de las lesiones ulcerosas inhibiendo la secreción de ácido desde las células parietales. Sin embargo, se ha demostrado que el Lan presenta mecanismos de gastroprotección independientes a la inhibición de la secreción de ácido. Un estudio realizado por Tsuji et al. (2002) mostró que Lan es capaz de incrementar la concentración de gastrina en plasma y de aumentar los niveles de PGE2 en la mucosa gástrica. Otro estudio ha demostrado que el Lan reduce el daño gástrico oxidativo inducido por los AINEs, lo cual esta involucrado, en parte, con un incremento en la viabilidad de los compuestos sulfhidrilos de la mucosa (Blandizzi et al., 2005). Por otra parte, se ha sugerido también que el Lan es capaz de incrementar el flujo sanguíneo de la mucosa a través de nervios aferentes sensitivos a capsaicina (Katagiri et al., 2005).

El ácido acetil aleuritólico (1) mostró mejor efecto gastroprotector a la dosis más baja (25 mg/kg), disminuyendo su efecto a las dosis de 50 y 100 mg/kg. Estos resultados podrían ser explicados considerando los experimentos de Maciel et al. (2000), donde se demostró que el ácido acetil aleuritólico, a la dosis de 100 mg/kg, retarda el vaciamiento gástrico en un 40% en el método de ingestión de carbón activado. En este modelo, se administra a los animales (ratones) carbón activado al 10% y se evalúa el tránsito gastrointestinal del carbón con relación a un grupo control que no recibe la droga en estudio. En nuestro caso, el compuesto 1 disminuye su efecto gastroprotector al aumentar la dosis, lo que sugiere que el compuesto retarda el vaciamiento del estómago, por lo que el jugo gástrico está más tiempo en contacto con la mucosa gástrica, generándole el daño correspondiente.

Varios triterpenos han demostrado ser potentes compuestos gastroprotectores como la carbenoxolona sódica, ácido oleanólico, ácido ursólico, lupeol acetato y taraxerol (Lewis y Hanson, 1991). Sánchez et al. (2006) han evaluado la actividad gastroprotectora del ácido oleanólico y varios derivados en modelos in vitro. El triterpeno ácido acetil aleuritólico (1) presenta cierta similitud estructural con el triterpeno ácido oleanólico, siendo esta similitud 72

aún mayor con el acetato del ácido oleanólico (Figura 12). La diferencia estructural entre ambos triterpenos está en la posición del doble enlace y del metilo 27. En el acetato del ácido oleanólico el doble enlace está situado en ∆12, 13 y sobre el C-14 se encuentra el metilo 27. En el compuesto 1 el doble enlace está ubicado en la posición 14 (∆14, 15) y el metilo 27 se encuentra sobre C-13. En ambos compuestos, la configuración del metilo 27 es α. La actividad gastroprotectora del ácido oleanólico y su acetato en el modelo de úlcera gástrica inducida por HCl/EtOH en ratones a 200 mg/kg, fue evaluada por Astudillo et al. (2002). El ácido oleanólico previno las lesiones gástricas en un 53% y su acetato en un 37%. A la dosis de 25 mg/kg, el compuesto 1 mostró mejor efecto gastroprotector que el acetato del ácido oleanólico a 200 mg/kg, reduciendo las lesiones en un 53%. El compuesto 1, a la dosis oral de 25 mg/kg, presentó un efecto similar al del ácido oleanólico a 200 mg/kg, una dosis casi diez veces mayor. Astudillo et al. (2002), evaluaron además la actividad gastroprotectora del ácido oleanólico en los modelos de úlcera gástrica inducida por ligadura de píloro, aspirina y etanol. Los cuales representan diferentes mecanismos de ulceración gástrica. El ácido oleanólico demostró un significativo efecto gastroprotector en los modelos de ligadura de píloro y etanol a las dosis 100 y 200 mg/kg. Estos resultados sugieren que la investigación del efecto gastroprotector de triterpenos debería también incluir productos donde la posición de dobles enlaces y estereoquímica de los metilos fueran diferentes.

27 12

12

13

13 14

COOH

14

15

COOH 15

27 AcO

AcO

1

Figura 12. Estructura del ácido acetil oleanólico y del ácido acetil aleuritólico.

73

El efecto gastroprotector del ácido ciperenoico (2) y de siete derivados fue determinado en el modelo de úlcera gástrica inducida por HCl/EtOH en ratones a 50 mg/kg (Tabla 12). Mientras que el efecto gastroprotector del alcohol ciperenol fue comparable con el del ácido ciperenoico, la acetilación de la función OH bajó el efecto gastroprotector. No hay diferencia estadística significativa entre el efecto gastroprotector del ácido ciperenoico y del metil éster correspondiente. El efecto gastroprotector del ciperenol, metil éster del ácido ciperenoico y las etil y butilamidas del ácido ciperenoico están en el mismo rango, reduciendo las lesiones gástricas entre 72-77%. La acetilación de la función alcohol en C-15 redujo fuertemente el efecto gastroprotector en nuestro modelo animal. Las amidas 11-13 presentaron efecto similar en el ensayo gastroprotector. En los compuestos 11-12, la longitud de la cadena alquílica no parece jugar un papel relevante en el efecto gastroprotector. En rigor, el mejor efecto gastroprotector es presentado por el ácido 15-patchoulanoico (14) comparado con el del ácido ciperenoico (2) (reducción de las lesiones de 86% contra 62%), pero los valores no son estadísticamente diferentes.

Los resultados obtenidos con las jatrofolonas, compuestos 4 y 5, indican la importancia de la estereoquímica en el efecto gastroprotector (Tabla 10). La jatrofolona A, presentó a las tres dosis evaluadas moderado efecto gastroprotector, en contraste con la alta actividad observada para la jatrofolona B incluso a la dosis más baja. En los derivados de jatrofolona B (Tabla 14), una disminución de la actividad gastroprotectora fue observada tanto para los derivados éteres (21-22) como para los derivados ésteres (23-26), en comparación con el compuesto de partida que presentaba a un grupo OH libre en C-14. En los derivados de jatrofolona A, los éteres metílicos y propílicos de esta serie (15 y 16) presentaron un efecto gastroprotector mejor que el producto natural (reducción de las lesiones en 70 y 60% contra un 54% para jatrofolona A). La esterificación del OH fenólico redujo el efecto gastroprotector a excepción del derivado 20. La adición de un grupo metilo en C-2 condujo a la pérdida de selectividad estereoquímica en este lugar de la molécula, mostrando tanto para los metil y propil éteres (27 y 28) carecer de efecto gastroprotector a la dosis evaluada (25 mg/kg). La presencia de una cadena alquílica adicional de tres carbonos en C-2 para los metil y propil éteres en C-14 (29 y 30) conduce a compuestos con similar efecto gastroprotector (del orden de 65%).

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La familia Euphorbiaceae ha demostrado ser una fuente rica de diterpenos gastroprotectores. La mayor parte de los compuestos activos identificados de estas plantas, fueron aislados desde drogas crudas usadas tradicionalmente para tratar lesiones gástricas. Se han realizado extensos estudios en la actividad gastroprotectora de los clerodanos aislados desde Croton cajucara, por grupos de investigación brasileños que reportaron los efectos de trans-dehydrocrotonina (DHC) (Souza-Brito et al., 1998; Hiruma-Lima et al., 1999; Rodríguez et al., 2004) transcrotonina (Hiruma-Lima et al., 2002), crotonina (Albino de Almeida et al., 2003) y derivados de DHC (Melo et al., 2003) (Figura 13). En el modelo de úlcera gástrica inducida por HCl/EtOH en ratones, a una dosis de 100 mg/kg, la DHC reduce la aparición de lesiones en 48%, siendo dos de sus derivados más activos con 78 y 89% (Melo et al., 2003). Otra planta utilizada tradicionalmente para tratar lesiones gástricas es Solidago chilensis (Asteraceae), desde la cual se aisló el diterpeno solidagenona el que presentó en el mismo modelo de úlcera gástrica anteriormente mencionado a 100 mg/kg un efecto gastroprotector del orden de 50%. Varios de sus derivados semisintéticos presentan un efecto inferior a éste y sólo dos de ellos tiene un efecto mayor, del orden de 75% (derivados I y II, ver Figura 13) (SchmedaHirschmann et al., 2002). O

O

O

H

H

H

O

O

H

O

O

CH3

O

H

O

O

CH 3

H

CH3

H

H

CH3

CH3

Dehidrocrotonina

OH

O

H

O

CH3

Crotonina

OH O

Trans-crotonina

OH

O

O

HO H

H O

Solidagenona

H O

OH

Derivado I

Derivado II

Figura 13. Estructura de algunos diterpenos del tipo clerodano y labdano. 75

Los diterpenos jatrofona (3) y jatrofolona B (5), informados en esta Tesis, demostraron ser agentes gastroprotectores más activos que los diterpenos de Croton y Solidago. La jatrofona (a la dosis de 25 mg/kg) y la jatrofolona B (a 12 mg/kg) redujeron las lesiones gástricas en 80% y 83%, respectivamente, mostrando ambos compuestos un mejor efecto que lansoprazol a 20 mg/kg. La jatrofolona B demostró efecto gastroprotector significativo (P < 0,01) incluso a la dosis más baja evaluada (6 mg/kg) reduciendo las lesiones gástricas en 65%.

4.4 Citotoxicidad.

La citotoxicidad del sesquiterpeno ácido ciperenoico (2) y siete de sus derivados fue presentada en la Tabla 13. La citotoxicidad del alcohol 8 fue más alta que la de su acetato 9 con valores de IC50 de 44 y 143 µM para AGS y 75 y 163 µM para fibroblastos, respectivamente. La metilación del ácido ciperenoico condujo a un fuerte aumento en la citotoxicidad. En las amidas 11-12, un aumento en la cadena lateral alquílica del compuesto 11, con 2 carbonos, al compuesto 12, con 4 carbonos, condujo a una más alta citotoxicidad en ambas líneas celulares, mientras que la amida aromática 13 fue menos tóxica que ambas amidas alifáticas. La reducción del doble enlace del ácido ciperenoico (2) para generar el compuesto 14 mostró una diferencia distintiva en la citotoxicidad contra las células AGS, con un valor de IC50 de 618 µM para el compuesto 14 y 463 µM para el compuesto 2. Al comparar el efecto citotóxico de las jatrofolonas A y B (4 y 5) contra las células AGS, es clara la importancia de la estereoquímica, como puede comprobarse comparando los valores de IC50 de 49 µM y >1000 µM para los isómeros β y α en C-16, respectivamente (Tabla 11). Además, el papel de la estereoquímica en la citotoxicidad

puede ser observado en los

derivados de las jatrofolonas A y B (Tabla 15), donde el efecto de colocar una función éter sobre el grupo OH en C-14 fue investigado comparando el compuesto 4 (jatrofolona A) con los metil y propil éter 15 y 16 así como el compuesto 5 (jatrofolona B) y su éter metílico y propílico 21 y 22, respectivamente. En los derivados de jatrofolona A, un fuerte aumento en la citotoxicidad sobre células AGS fue observado para los derivados 15 y 16, mientras que el efecto sobre fibroblastos fue menos notable mostrando un aumento de la citotoxicidad con el

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largo de la cadena de éter. En los derivados de jatrofolona B (21 y 22), un aumento fuerte en la citotoxicidad fue observado en ambas líneas celulares con valores de IC50 de 56,6 y 48,3 µM sobre fibroblastos y 63,8 y 88,3 µM en células AGS, para los compuestos 21 y 22 respectivamente, en contraste con la baja citotoxicidad del compuesto de partida (5) que presentó valores de IC50 >1000 µM en ambas líneas celulares. La acetilación de la función hidroxilo en C-14 también tiene efectos sobre la citotoxicidad. Este efecto fue claro en las células AGS de ambas jatrofolonas epímeras que presentaban valores de IC50 > 1000 µM, creciendo fuertemente la citotoxicidad a 100 y 148 µM en los acetatos 17 y 23, respectivamente. Tres ésteres fueron preparados para las jatrofolonas A y B, uno de naturaleza vinílica y dos derivados aromáticos para substituidos. Mientras que los compuestos 18 y 24 presentaron citotoxicidad contra células AGS y fibroblastos, los ésteres aromáticos de jatrofolonas A y B (19, 25 y 20, 26) no fueron citotóxicos en ninguna de las dos líneas celulares con valores de IC50 >1000 µM. Como había una clara diferencia en la citotoxicidad de las jatrofolonas A y B, diferenciándose éstas solamente en la estereoquímica del grupo metilo en C-16, se investigó el efecto de un grupo alquílico adicional en C-2. Fue comparada la citotoxicidad de los derivados metílicos y propílicos en C-2 con un éter metílico o propílico en C-14. Los compuestos 27 y 28, con un grupo metilo adicional en C-2 se diferencian en la longitud de la cadena del éter en la función 14-OH. Mientras que el derivado 27 fue desprovisto de citotoxicidad en ambas líneas celulares, el éter propílico 28 demostró ser citotóxico con valores de IC50 de 55,1 y 74,8 µM sobre fibroblastos y células AGS, respectivamente. Una cadena alquílica más larga en C-2 (propilo) aumenta la citotoxicidad como puede ser visto al comparar los valores de IC50 de los productos 29 y 30 con el derivado 27 y los compuestos de partida 4 y 5.

De los 30 compuestos evaluados sobre fibroblastos y células AGS, solamente siete no fueron citotóxicos contra ninguna de las dos líneas celulares. El compuesto más citotóxico de todos los presentados en esta Tesis fue el diterpeno jatrofona (3), el cual no presentó selectividad contra ninguna de las dos líneas celulares empleadas, con valores de IC50 de 2,8 µM en fibroblastos y 2,5 µM para células AGS. Taylor et al. (1983) explican que la alta toxicidad de la jatrofona puede ser debida a que los productos naturales que contienen funciones carbonilo

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α, β-insaturados son susceptibles para conjugar alcanotioles. La adición de alcanotioles se emplea a menudo como indicador significativo de la citotoxicidad potencial. En cada caso la adición conjugada de alcanotioles a estos compuestos se ha demostrado in vitro. Se asume que estos sistemas sirven como electrófilos reaccionando con grupos tioles endógenos presentes en enzimas importantes, dando por resultado la disfunción de la enzima y por lo tanto la muerte de la célula (Taylor et al., 1983).

4.5 Efecto gastroprotector y citotoxicidad.

El mejor compuesto gastroprotector de origen natural de esta Tesis fue el diterpeno jatrofolona B (5), seguido del diterpeno jatrofona (3). Resultó interesante observar que la jatrofona fue altamente citotóxica, mientras que la jatrofolona B no demostró citotoxicidad en ninguna de las dos líneas celulares utilizadas con valores de IC50 >1000 µM. De los derivados obtenidos por semisíntesis en la serie de sesquiterpenos, el mejor efecto gastroprotector con la más baja citotoxicidad fue encontrado para el compuesto 14. En la serie de los diterpenos pertenecientes a las jatrofolonas A y B, la mejor actividad gastroprotectora fue para los compuestos 15, 20 (evaluados a dosis de 100 mg/kg), 29 y 30 (evaluados a 25 mg/kg). Sin embargo, los compuestos 15, 29 y 30 fueron altamente citotoxicos y el compuesto 20 presentó valores de IC50 >1000 µM en ambas líneas celulares. En base a nuestros conocimientos, los diterpenos de Jatropha presentados en esta Tesis son los mejores diterpenos gastroprotectores aislados de Euphorbiaceae hasta el momento.

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5. Conclusiones.

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Los resultados obtenidos en el marco de esta investigación proporcionan un soporte científico para el uso de “yaguá rová” como droga cruda gastroprotectora en la medicina tradicional paraguaya. Por otra parte, es necesario incluir estudios de toxicidad y mutagenicidad de los extractos crudos para definir su posible conveniencia de empleo según la tradición popular.

•

Jatropha isabelli presenta entre sus componentes una serie de terpenoides con efecto gastroprotector relevante, que pueden ser modificados mediante semisíntesis. Este estudio ha permitido determinar que ciertas partes de la molécula (grupos funcionales y estereoquímica) son importantes para el efecto gstroprotector y al mismo tiempo demostrar que estos centros presentan potencial para ser modificados sintéticamente, buscando análogos con mejor efecto biológico, menor toxicidad y mejor biodisponibilidad.

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Los terpenoides presentes en los rizomas, el triterpeno ácido acetil aleuritólico (1), el sesquiterpeno ácido ciperenoico (2), los diterpenos jatrofona (3), jatrofolona A (4) y jatrofolona B (5), principalmete jatrofolona B y jatrofona, inhiben marcadamente las lesiones gástricas inducidas por HCl/EtOH en ratones.

•

Partiendo de los productos naturales 2, 4 y 5 se obtuvieron derivados semisintéticos varios de los cuales presentaron potente efecto gastroprotector (14, 15, 20, 29 y 30). La biotransformación de la jatrofona permitió obtener un compuesto más polar y menos citotóxico. Las jatrofolonas A y B, que difieren solamente en la estereoquímica del grupo metilo en C-16, demuestran que la estereoquímica juega un rol importante tanto sobre la citotoxicidad como en el efecto gastroprotector.

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Con los resultados obtenidos en esta Tesis pudieron establecerse algunas relaciones de tipo estructura-actividad para ambos grupos de compuestos (sesquiterpenos del tipo cipereno y diterpenos del esqueleto jatrofolano).

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El trabajo realizado permitió aislar y determinar la estructura de 8 productos naturales, de los cuales dos se describen por primera vez. Además se obtuvieron por reacciones de semisíntesis 23 derivados, varios de los cuales se informan por primera vez en esta Tesis.

6. Proyecciones.

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El mejor compuesto gastroprotector descrito en esta Tesis, dentro del grupo de los sesquiterpenos, fue el derivado 14, obtenido como mezcla de dos isómeros. En este trabajo han quedado algunas interrogantes que deben ser esclarecidas a futuro. Se debe emprender una síntesis selectiva utilizando reactivos quirales durante la hidrogenación para obtener los isómeros puros. La evaluación biológica de los isómeros puros aclarará si la actividad observada es debida solamente al isómero 14a o al 14b, o al efecto sinérgico de la mezcla.

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Los estudios de biotransformación permitieron obtener un derivado hidroxilado y reordenado de la jatrofona. El empleo de otros aislados microbianos podría permitir la obtención de otros derivados con bioactividad diferente al compuesto de partida. Para ello, se debería intentar la biotransformación de jatrofona con otros hongos capaces de hidroxilar y además optimizar las condiciones de cultivo para obtener un mejor rendimiento. Si se obtuvieran compuestos biotransformados en cantidad suficiente, podría planearse la preparación de nuevos derivados de jatrofona mediante reacciones de semisíntesis.

80

•

A partir de las jatrofolonas A y B pueden obtenerse nuevos derivados semisintéticos sobre las posiciones estudiadas (C-14 y C-2), reduciendo el grupo cetona o bien haciendo modificaciones químicas sobre el doble enlace vinílico (hidrogenación, halogenación, epoxidación, entre otras). La evaluación de los derivados obtenidos sobre el efecto gastroprotector y citotoxicidad permitirán obtener una mayor información sobre la relación estructura-actividad de este grupo de compuestos.

•

Otros estudios se deben emprender para elucidar el mecanismo de acción de la jatrofona y de los derivados naturales y semisintéticos del ácido ciperenoico y jatrofolona.

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8. Anexos.

8.1 Descripción de los compuestos mayoritarios presentes en Jatropha isabelli (compuestos 1-7).

Compuesto 1: ácido acetil aleuritólico: cristales incoloros, p.f.: 304-305 °C. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 498,3696 (2) (calc. para C32H50O4: 498,3709), 423 (11), 249 (11), 248 (37), 235 (25), 234 (100), 205 (13), 204 (14), 203 (28), 191 (27), 190 (35), 189 (73), 187 (15), 175 (12), 173 (10), 161 (11), 149 (12), 147 (12), 135 (25), 133 (22), 123 (10), 121 (18), 119 (17), 109 (14), 107 (18), 105 (16), 95 (17), 93 (16), 81 (17), 69 (32), 55 (17). FT-IR (KBr, cm-1): 3400-2700, 2936, 1729, 1689, 1241. [α] 20 D : +20,9 (c = 5,5; CHCl3).

Compuesto 2: ácido ciperenoico: cristales incoloros, p.f.: 162-164 °C. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 234,1620 (calc. para C15H22O2 : 234,1620). FT-IR (KBr, cm-1): 2955, 1676, 1649, 1434, 1287, 950. [α] 20 D : -16,0 (c = 0,5; CHCl3).

Compuesto 3: jatrofona: cristales incoloros, p.f.: 154-155 °C. HRMS (ESI) m/z 313,1797 [M + H]+ (calc. para C20H24O3H+: 313,1804). HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 312,1723 (53) (calc. para C20H24O3: 312,1725), 297 (11), 284 (29), 269 (21), 242 (48), 227 (22), 213 (25), 199 (17), 189 (100), 188 (31), 175 (43), 173 (61), 160 (62), 147 (37), 145 (31), 125 (25), 91 (33), 83 (36), 81 (89), 77 (25), 69 (25), 53 (91). FT-IR (KBr, cm-1): 2960, 1693, 1660, 1612, 1402. [α] 20 D : +295 (c = 1,5; CHCl3)

Compuesto 4: jatrofolona A: cristales incoloros, p.f.: 218-220 °C. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 296,1781 (100) (calc. para C20H24O2: 296,1776), 295 (10), 281 (38), 268 (11), 267 (16), 254 (11), 253 (48), 241 (12), 240 (45), 239 (29), 227 (16), 226 (10), 225 (27), 211 (11), 197 (15), 171 (17), 165 (11), 141 (10), 69 (4). FT-IR (KBr, cm-1): 3247, 2984, 1683, 1575, 881. [α] 20 D : +134,6 (c = 0,26; CHCl3).

98

Compuesto 5: jatrofolona B: cristales incoloros, p.f.: 229-231 °C. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 296,1727 (100) (calc. para C20H24O2: 296,1776), 295 (12), 281 (45), 268 (13), 267 (18), 254 (15), 253 (54), 241 (14), 240 (51), 239 (33), 227 (19), 226 (11), 225 (32), 211 (13), 197 (15), 171 (20), 165 (12), 141 (12), 69 (13). FT-IR (KBr, cm-1): 3247, 2984, 1683, 1575, 882. [α] 20 D : +76,2 (c = 0,21; CHCl3).

Compuesto 6: 9β, 13β-dihidroxiisabelliona: cristales incoloros, p.f.: 122-124 °C. HRMS (ESI): m/z (int. rel. %): 369,1678 (M+ + Na) (calc. para C20H26O5 Na: 369,1678). HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 346.1779 (27) (calc. para C20H26O5: 346.1780), 328 (7), 300 (31), 285 (34), 257 (20), 233 (22), 204 (15), 191 (20), 176 (16), 175 (18), 164 (81), 163 (100), 149 (32), 147 (25), 137 (30), 136 (28), 121 (18), 119 (17), 95 (17), 93 (17), 91 (23), 85 (46), 83 (76), 69 (24), 55 (15). FT-IR (KBr, cm-1): 3415, 2962, 1764, 1659, 1453. [α] 20 D : -64,7 (c = 0,17; CHCl3). Compuesto 6a: 13β-hidroxi-9β-acetoxiisabelliona: aceite amarillo. HRMS (ESI) m/z (rel. int.%): 411,1784 (M+ + Na) (calc. para C22H28O6Na : 411,1783). FT-IR (KBr, cm-1): 3441, 2963, 1767, 1750, 1651. 1458. [α] 20 D :-38,5 (c = 0,13; CHCl3).

Compuesto 7: 1,4-epoxi-p-mentan-2-ol: cristales incoloros, p.f.: 156-158 °C. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 170,165 (calc. para C10H18O2: 170,165) (4), 152 (8), 145 (61), 137 (11), 127 (100), 117 (41), 109 (60), 99 (26), 81 (40), 71 (41), 58 (41). FT-IR (KBr, cm-1): 3330, 2965, 1209, 1042. [α] 20 D : +24,5 (c = 0,59; CHCl3).

99

8.2 Descripción

de

los

sesquiterpenos

derivados

del

ácido

ciperenoico

(compuestos 8-14).

Compuesto 8: ciperenol: cristales incoloros, p.f.: 92-92 °C. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 220,1765 (100) (calc. para C15H24O: 220,1827), 205 (17), 202 (26), 191 (19), 189 (20), 187 (39), 177 (9), 159 (46), 145 (27), 131 (22), 117 (14), 105 (21), 91 (24), 79 (12), 55 (12). FT-IR (KBr, cm-1): 3383, 1710, 1692, 1259, 1055. [α] 20 D : -13,8 (c = 0,29; CHCl3).

Compuesto 9: acetato de ciperenilo: aceite. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 262,1933 (27) (calc. para C17H26O2: 262,1933), 220 (20), 219 (47), 218 (24), 205 (16), 204 (95), 203 (33), 189 (23), 187 (16), 159 (100), 147 (34), 145 (30), 133 (16), 131 (19), 105 (23), 91 (21). FT-IR (KBr, cm-1): 2924, 1744, 1226, 1023. [α] 20 D : -9,1 (c = 0,22; CHCl3).

Compuesto 10: metil éster del ácido ciperenoico: aceite. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 248,1776 (100) (calc. para C16H24O2: 248,1776), 233 (8), 217 (17), 216 (32), 205 (28), 192 (30), 191 (11), 189 (13), 177 (13), 145 (22), 133 (16), 117 (15), 91 (14). FT-IR (KBr, cm-1): 2950, 1710, 1665, 1259, 1055. [α] 20 D : -10,0 (c = 0,5; CHCl3).

Compuesto 11: N-etil-ciperenamida: cristales incoloros, p.f.: 124-126 °C. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 261,2093 (100) (calc. para C17H27NO: 261,2093), 246 (17), 218 (47), 189 (11), 147(6), 133 (5), 119 (6), 117 (5), 105 (7), 91 (9). FT-IR (KBr, cm-1): 3283, 2932,1671, 1621, 1532, 1285, 1145. [α] 20 D : -5,0 (c = 0,2; CHCl3).

Compuesto 12: N-butil-ciperenamida: resina marrón. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 289,2406 (75) (calc. para C19H31NO: 289,2406), 274 (23), 256 (27), 254 (27), 246 (38), 232 (25), 223 (27), 217 (47), 216 (38), 213 (26), 189 (29), 133 (31), 127 (56), 91 (44), 81 (30), 72 (43), 69 (28), 64 (65), 57 (100), 55 (78). FT-IR (KBr, cm-1): 3324, 2956, 1668, 1623, 1526, 1248. [α] 20 D : -10,3 (c = 0,29; CHCl3).

100

Compuesto 13: N-(4-metoxifenil) ciperenamida: resina marrón. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 339,2198 (100) (calc. para C22H29NO2: 339,2198), 324.18 (6), 218 (16), 217 (94), 189 (9), 133 (7), 123 (9), 122 (5), 119 (5), 105 (7), 91 (8), 69 (4). FT-IR (KBr, cm-1): 3310, 2925, 1665, 1630, 1512, 1246, 1036, 828. [α] 20 D : -10,0 (c = 0,1; CHCl3).

Compuesto 14: ácido 15-patchoulanoico: cristales incoloros, p.f.: 90-93 °C. Analisis elemental calculado: C: 76,23; H: 10,24; encontrado: C: 76,00; H: 10,15 (C15H24O2). FT-IR (KBr, cm-1): 2956, 1697, 1420, 1281, 950. [α] 20 D : -53,6 (c = 0,28; CHCl3). Obtenido como una mezcla 2:1 de 14a y 14b.

8.3 Descripción

de

los

diterpenos

derivados

de

jatrofolonas

A

y

B

(compuestos 15-30).

Compuesto 15: metil éter de jatrofolona A: cristales incoloros, p.f.: 75-77 °C. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 310,1926 (100) (calc. para C21H26O2: 310,1933), 309 (15), 295 (49), 282 (10), 281 (19), 268 (17), 267 (62), 255 (11), 254 (52), 253 (21), 241 (20), 239 (19), 185 (15). FT-IR (KBr, cm-1): 2926, 1712, 1278, 1117, 887. [α] 20 D : +100 (c = 0,18; CHCl3).

Compuesto 16: propil éter de jatrofolona A: aceite amarillo. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 338,2262 (100) (calc. para C23H30O2: 338,2246), 337 (14), 323 (20), 310 (13), 309 (17), 296 (18), 295 (57), 283 (15), 282 (35), 281 (33), 269 (16), 267 (16), 253 (21), 239 (21), 211 (17), 165 (15). FT-IR (KBr, cm-1): 2926, 1712, 1277, 1100, 888. [α] 20 D : + 46,7 (c = 0,15; CHCl3).

101

Compuesto 17: acetato de jatrofolona A: cristales incoloros, p.f.: 102-104 °C. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 338,1871 (100) (calc. para C22H26O3: 338,1882), 323 (12), 309 (10), 297 (18), 296 (74), 295 (36), 283 (14), 282 (42), 281 (57), 269 (16), 268 (27), 267 (24), 254 (15), 253 (45), 241 (15), 240 (50), 239 (25), 227 (22), 226 (13), 225 (25), 211 (13), 197 (14), 171 (14), 165 (15). FT-IR (KBr, cm-1): 2926, 1765, 1712, 1193, 886. [α] 20 D : +58,8 (c = 0,17; CHCl3). Compuesto 18: 2-propenil éster de jatrofolona A: aceite amarillo. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 350,1893 (100) (calc. para C23H26O3: 350,1882), 335 (15), 321 (14), 312 (9), 307 (30), 297 (13), 296 (37), 295 (31), 294 (30), 293 (17), 281 (29), 269 (10), 268 (25), 267 (22), 253 (31), 240 (27), 239 (23), 227 (16), 225 (14), 211 (15), 165 (15), 163 (9), 91 (9), 69 (50). FT-IR (KBr, cm-1): 2926, 1745, 1712, 1236, 888. [α] 20 D : +36,4 (c = 0,11; CHCl3).

Compuesto 19: p-nitrofenil éster de jatrofolona A: aceite amarillo. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 445,1881 (71) (calc. para C27H27NO5: 445,1889), 430 (23), 416 (11), 402 (23), 390 (11), 389 (39), 388 (14), 295 (20), 239 (8), 151 (8), 150 (100), 120 (29), 104 (24), 69 (4). FT-IR (KBr, cm-1): 2926, 1742, 1712, 1530, 1255, 846. [α] 20 D : +13,3 (c = 0,15; CHCl3).

Compuesto 20: p-clorofenil éster de jatrofolona A: aceite amarillo. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 434,1658 (32) (calc. para C27H27ClO3: 434,1649), 378 (11), 295 (6), 141 (28), 139 (100), 111 (16). FT-IR (KBr, cm-1): 2925, 1740, 1712, 1254, 886, 754. [α] 20 D : +23,1 (c = 0,13; CHCl3). Compuesto 21: metil éter de jatrofolona B: cristales incoloros, p.f.: 93-95 °C. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 310,1917 (100) (calc. para C21H26O2: 310,1933), 309 (7), 295 (32), 282 (12), 281 (12), 268 (10), 267 (42), 255 (9), 254 (35), 253 (16), 241 (9), 239 (15), 185 (9). FT-IR (KBr, cm-1): 2926, 1711, 1278, 1118, 887. [α] 20 D : +69,2 (c = 0,13; CHCl3).

102

Compuesto 22: propil éter de jatrofolona B: aceite amarillo. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 338,2249 (100) (calc. para C23H30O2: 338,2246), 337 (7), 323 (18), 310 (9), 309 (12), 296 (13), 295 (48), 283 (7), 282 (31), 281 (28), 269 (8), 267 (7), 253 (14), 239 (11), 211 (7), 165 (7). FT-IR (KBr, cm-1): 2926, 1712, 1277, 1099, 888. [α] 20 D : +35 (c = 0,2; CHCl3).

Compuesto 23: acetato de jatrofolona B: cristales incoloros, p.f.: 131-133 °C. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 338,1893 (100) (calc. para C22H26O3: 338,1882), 323 (8), 309 (8), 297 (13), 296 (66), 295 (38), 283 (8), 282 (34), 281 (54), 269 (9), 268 (21), 267 (18), 254 (11), 253 (38), 241 (12), 240 (46), 239 (24), 227 (15), 226 (8), 225 (18), 211 (10), 197 (11), 171 (15), 165 (15). FT-IR (KBr, cm-1): 2924, 1765, 1712, 1191, 886. [α] 20 D : +61,5 (c = 0,13; CHCl3).

Compuesto 24: 2-propenil éster de jatrofolona B: aceite amarillo. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 350,1893 (100) (calc. para C23H26O3: 350,1882), 335 (16), 321 (13), 312 (11), 307 (28), 297 (16), 296 (53), 295 (38), 294 (36), 293 (20), 281 (32), 269 (10), 268 (20), 267 (14), 253 (26), 240 (26), 239 (23), 227 (13), 225 (14), 211 (14), 165 (16), 163 (37), 91 (12), 69 (19). FT-IR (KBr, cm-1): 2925, 1744, 1712, 1236, 888. [α] 20 D : +16,7 (c = 0,12; CHCl3).

Compuesto 25: p-nitrofenil éster de jatrofolona B: aceite amarillo. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 445,1894 (71) (calc. para C27H27NO5: 445,1889), 430 (16), 416 (11), 402 (27), 390 (11), 389 (36), 388 (16), 295 (22), 239 (12), 151 (11), 150 (100), 120 (33), 104 (30), 69 (17). FT-IR (KBr, cm-1): 2924, 1743, 1712, 1529, 1255, 846. [α] 20 D : +20 (c = 0,11; CHCl3).

Compuesto 26: p-clorofenil éster de jatrofolona B: aceite amarillo. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 434,1664 (24) (calc. para C27H27ClO3: 434,1649), 378 (10), 295 (5), 141 (31), 139 (100), 111 (12). FT-IR (KBr, cm-1): 2924, 1740, 1712, 1254, 886, 754. [α] 20 D : +50 (c = 0,1; CHCl3).

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Compuesto 27: metil éter de 2-metil jatrofolona: cristales incoloros, p.f.: 164-166 °C. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 324,2086 (100) (calc. para C22H28O2: 324,2089), 309 (40), 296 (11), 295 (15), 282 (13), 281 (50), 269 (12), 268 (35), 267 (30), 255 (13), 253 (18), 225 (11), 165 (10), 155 (10), 69 (18). FT-IR (KBr, cm-1): 2923, 1710, 1277, 1099, 886. [α] 20 D : +47,4 (c = 0,19; CHCl3). Compuesto 28: propil éter de 2-metil jatrofolona: aceite amarillo. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 352,2399 (100) (calc. para C22H28O2: 352,2402), 337 (16), 323 (12), 310 (13), 309 (47), 297 (8), 296 (9), 295 (28), 267 (9). FT-IR (KBr, cm-1): 2925, 1712, 1276, 1104, 887. [α] 20 D : +61,5 (c = 0,13; CHCl3).

Compuesto 29: metil éter de 2-propil jatrofolona: aceite amarillo. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 352,2398 (100) (calc. para C22H28O2: 352,2402), 337 (23), 323 (12), 310 (30), 309 (47), 297 (10), 296 (29), 295 (28), 267 (16), 254 (11), 253 (20), 239 (13), 69 (14). FT-IR (KBr, cm-1): 2926, 1711, 1278, 1105, 888. [α] 20 D : +28,6 (c = 0,14; CHCl3).

Compuesto 30: propil éter de 2-propil jatrofolona: aceite amarillo. HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 380,2711 (100) (calc. para C26H36O2: 380,2715), 365 (15), 338 (25), 337 (49), 324 (28), 323 (20), 295 (10), 281 (13), 253 (8), 211 (8), 69 (13). FT-IR (KBr, cm-1): 2926, 1712, 1277, 1105, 887. [α] 20 D : +66,7 (c = 0,3; CHCl3).

8.4 Descripción del derivado biotransformado de la jatrofona (compuesto 31).

Compuesto 31: 9β–hidroxiisabelliona: cristales incoloros, p.f.: 95-97 °C. HRMS (ESI) m/z 353,1736 [M + Na]+ (calc. para C20H26O4Na+: 353,1729). HRMS (EI) 70 eV, m/z (rel. int.%): 330,1836 (2) (calc. para C20H26O4: 330,1831), 313 (12), 312 (49), 297 (22), 269 (18), 203 (12), 189 (11), 164 (18), 163 (100), 149 (11), 137 (11), 135 (17), 131 (12), 107 (14), 91 (29), 79 (12), 77 (13), 69 (11), 55 (15), 53 (11). FT-IR (KBr, cm-1): 3477, 2927, 1756, 1659, 1462. [α] 20 D : -76,5 (c = 0,17; CHCl3).

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8.5 Publicaciones.

Pertino, M., Rodríguez, J.A., Theoduloz, C., Razmilic, I., Schmeda-Hirschmann. G., 2006. Gastroprotective activity of cyperenoic acid derivatives. Journal of Pharmacy and Pharmacology (en prensa).

Pertino,

M.,

Schmeda-Hirschmann.

G.,

Rodríguez,

J.A.,

Theoduloz,

C.,

2006.

Biotransformation of jatrophone by Aspergillus niger ATCC 16404. Zeitschrift fur Naturforschung B (en prensa).

Pertino, M., Schmeda-Hirschmann. G., Rodríguez, J.A., Theoduloz, C., Gastroprotective effect and cytotoxicity of diterpenes from the Paraguayan crude drug “yagua rova” (Jatropha isabelli). Journal of Ethnopharmacology (enviado el 29.09.2006).

Pertino, M., Schmeda-Hirschmann. G., Rodríguez, J.A., Theoduloz, C., Gastroprotective effect and cytotoxicity of semisynthetic jatropholone derivatives. Journal of Pharmacy and Pharmacology (enviado el 07.12.2006).

8.6 Presentaciones a congresos.

6 al 8 de Noviembre de 2005 Actividad gastroprotectora del diterpeno jatrofona y el sesquiterpeno ácido ciperenoico. XV Simposio Nacional de Química Orgánica, SAIQO, Mar del Plata, Argentina.

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