AFECTACIÓ DE FIBROBLASTS PER ELECTROGALVANISMES HABITUALS EN EL MEDI ORAL. ESTUDI “IN VITRO”

Joan Badal Vidal

MÀSTER EN TERÀPIA NEURAL I ODONTOLOGIA NEUROFOCAL. BARCELONA 2013

Joan Badal Vidal

Agraïments: A la meva família, per les moltes “estones” que els he pres per fer aquest treball, i per la seva paciència. A la Cristina Gutiérrez, Bioquímica del laboratori de cultius cel·lulars de l’ Institut de Neurociències de la UAB, per la seva gran ajuda, la seva dedicació i implicació en les tasques de laboratori. Al Dr. Ishar Dalmau, que m’ha obert la via de contacte amb l’ institut de Neurociències de la UAB. A l’ Institut de Neurociències de la UAB, per la seva col·laboració en permetre realitzar aquest treball i oferir –me les seves instal·lacions. AL Dr. Manuel J. Lis Arias, Professor titular d’ Enginyeria Química de la UPC. Per l’assessorament en el camp dels metalls, i el seu interès pel treball. Al Laboratori de pròtesi dental JM Pelegrí, per la col·laboració al proporcionar mostres de diferents metalls per a l’ estudi. A la Dra. Rosana Lorenzo , per la col·laboració al proporcionar mostres de metalls per a l’ estudi. Als Professors del Màster en Teràpia Neural, per l’assessorament prestat, i a tots aquells que, d’una manera o altra, han fet possible aquest estudi, a tots: Moltes Gràcies!

1

Joan Badal Vidal

Índex 1.- RESUM-RESUMEN-ABSTRACT ....................................................................................................................... 3 2.- INTRODUCCIÓ. ............................................................................................................................................... 6 3.- HISTÒRIA DELS METALLS EN ODONTOLOGIA. ............................................................................................... 9 4.- METALLS UTILITZATS EN ODONTOLOGIA. .................................................................................................... 11 5.- OBJECTIUS. .................................................................................................................................................. 16 6.- MATERIALS I MÈTODE. ................................................................................................................................ 17 7.- FASE EXPERIMENTAL. .................................................................................................................................. 22 8.- RESULTATS. .................................................................................................................................................. 23 9.-DISCUSIÓ. ..................................................................................................................................................... 35 10.- CONCLUSIONS. .......................................................................................................................................... 37 11.- BIBLIOGRAFIA. ........................................................................................................................................... 38

2

Joan Badal Vidal

1.- RESUM-RESUMEN-ABSTRACT A - Resum:

La utilització de dos, o més metalls en boca, produeix galvanismes, capaços de produir corrosió de metalls, camps elèctrics i alliberació d’ ions, que podrien produir alteracions a la Matriu Extra Cel·lular (MEC) i traduir-se en patologia. El present treball pretén valorar la repercussió dels galvanismes entre metalls d’us habitual en odontologia, sobre teixits biològics. Per aquest motiu s’ ha elaborat un model experimental a partir d’ uns cultius de fibroblasts de teixit pulmonar humà, amb inclusió de metalls. Previ a l’ experiment s’ha fet mesuraments de galvanismes en un medi de sèrum fisiològic. La fase experimental s’ ha perllongat durant 72h. Davant l’evidència de canvis importants en els fibroblasts, es va creure oportú fer un assaig amb MTT per valorar i quantificar el dany cel·lular a partir del seu metabolisme, els valors del mateix, s’han mesurat per espectrofotometria. La mida de la mostra tot i ser n=1, amb els inconvenients que això comporta, resulta suficientment aclaridora per observar el dany cel·lular sobre els fibroblasts. Els resultats suggereixen que cal evitar els bimetal·lismes en boca, i s’ en conclou que els parells que contenen Au son els mes perjudicials. Seria convenient realitzar altres estudis per aprofundir i ampliar els coneixements d’aquests fenòmens electrogalvànics. Els bimetalismes es poden considerar fenòmens irritatius o camps interferents del Sistema Nerviós Vegetatiu (SNV) per la seva afectació sobre els fibroblasts i per extensió de la Matriu Extracel·lular. Paraules clau: odontología neurofocal; terapia neural; metalls; galvanismes; fibroblasts; matriu extracelular; sistema nerviós vegetatiu.

3

Joan Badal Vidal B - Resumen:

La utilización de dos o más metales en boca, produce galvanismos, capaces provocar corrosión de metales campos eléctricos, y liberación de iones, que podrían producir alteraciones en la matriz extracelular (MEC), y traducirse en patología. El presente trabajo pretende valorar la repercusión de galvanismos entre metales de uso habitual en odontología, sobre tejidos biológicos. Por este motivo se ha elaborado un modelo experimental a partir de unos cultivos de fibroblastos de tejido pulmonar humano con inclusiones de metales. Previo a la fase experimental se realizaron mediciones de galvanismos en un medio de suero fisiológico. La fase experimental se prolongó durante 72h. Ante la evidencia de importantes cambios en los fibroblastos, se creyó oportuno realizar un estudio con MTT para poder valorar y cuantificar el daño celular a partir de su metabolismo, los valores del mismo se midieron por espectrofotometría. El tamaño de la muestra, aun siendo n=1, resulta suficiente para observar el daño celular sobre los fibroblastos. Los resultados sugieren la conveniencia de evitar bimetalismos en boca, y concluyen que los pares que contienen Au, son los más perjudiciales. Sería conveniente realizar más estudios para profundizar en el conocimiento de estos fenómenos electrogalvánicos. Los bimetalismos pueden considerarse fenómenos irritativos o campos interferentes del SNV por la afectación que producen sobre los fibroblastos, y por extensión de la Matriz Extracelular. Palabras clave: Terápia neural; Odontología neurofocal; metales; galvanismos; fibroblastos; matriz extracelular; sistema nervioso vegetativo.

4

Joan Badal Vidal C - Abstract:

The using of two or more metals inside the mouth, produces galvanism which can produce metal corrosion, electric fields and ion release which can produce alterations in the extra celular matrix and lead to disease. This study aims to valorate the repercussion of galvanism between the most usual metalls used in odontology. For this reason, we have created an experimental model based in human lung fibroblast's cultures with inclusion of metals. Previous to the experiment, we makes a galvanism mesurement in a saline serum environment. The experimental fase has been during for 72 h. in front of the evidence changes in fibroblasts, we thought necessary to make and MTT assaig to evaluate and quantify de celular damage through it's metabolism. We have mesured the values with spectrofotometry. Although the sample size it's n=1, it results suficient to define a clear evidence of the celular damage of fibroblasts. The results suggest that it's necessary to avoid the bimetalisms inside the mouth. We can conclure that the metal couples who contains Au, are the most damaging. It's convenien to realise another studies to ampliate the knowledge of this electrogalvanics fenomens. The bimetalisms can be considerate like irritative fenomen or interferent fields of the Vegetative Nervous System (VNS) for its fibroblasts afectation and by extension of the extracelular matrix.

Keywords: neurofocal odontology; neural therapy; metal; galvanism; fibroblasts; extra celular matrix; vegetative nervous system.

5

Joan Badal Vidal

2.- INTRODUCCIÓ. La Teràpia Neural estudia els fenòmens irritatius que es produeixen sobre el Sistema Nerviós Vegetatiu SNV, l’odontologia neurofocal és la manera d’entendre i exercir l’odontologia, des d’una vessant integral de l’esser humà7, aplicant la teràpia neural com a pràctica habitual en els seus tractaments . La Teràpia Neural ens proporciona un enfoc diferent de com tractar distintes patologies, considerant el cos humà com un "tot" indestriable, es tracta d'una visió holística i integral. Tot el cos està interconnectat entre sí a través del Sistema Nerviós Vegetatiu ,(SNV) integrat aquest , en la Matriu Extracel·lular (MEC)5. De fet hi trobem fibres del Vegetatiu per tot l'organisme. La MEC és la base de l'anomenat Teixit connectiu, que fins fa poc se li atribuïen propietats bàsiques de sosteniment i estructura i poca cosa més, sense cap funció rellevant. Estudis com els del histoquímic Dr. Alfred Pischinger posen de relleu la vital importància d'aquest teixit, en quant a equilibri estructural o biotensegritat de les cèl·lules i transmissió de la informació intercel·lular entre d' altres . Pischinger afirma que les alteracions a aquest nivell poden provocar diferents patologies que s'expressen localment o a distància transmeses per fibres del SNV.

Dr. Alfred Pischinger La MEC està sotmesa a múltiples agressions al llarg de la vida , agressions que provoquen un efecte d'irritació neural que en teràpia neural s'anomenen camps interferents del SNV. Actuant

6

Joan Badal Vidal sobre aquests camps interferents o irritatius del SNV estem actuant a l'hora sobre tot l'organisme i per tant, sobre les manifestacions patològiques que l'afecten. En Teràpia Neural es tracten aquestes alteracions injectant Procaïna en dilucions molt baixes del 0.5%, aquesta tècnica ja la varen descriure els germans Drs. Ferdinand i Walter Huneke1 l’any 1925. La procaïna de fet és un fàrmac del grup dels Anestèsics locals però no és aquesta la propietat que busquem en Teràpia Neural si no el potencial elèctric que té la seva molècula que, en contacte amb fibres del vegetatiu alterades , les desbloqueja, tornant a transferir la informació neuronal, i revertint la simptomatologia en molts casos. Així doncs, la Teràpia Neural es realitza bàsicament a nivell de la MEC, i aquesta, està formada principalment pels fibroblasts.

La cavitat oral, com no podia ser d’ altra manera, és també una zona on hi podem trobar multitud de camps interferents, capaços de produir patologia, in situ o bé a distància. El Dr. Ernest Adler , ho va definir i estudiar amplament2. Considerat el pare de l’ odontologia neurofocal, ja advertia dels perills dels metalls en boca, i la conveniència d’ evitar-los.

Dr. Ernest Adler.

7

Joan Badal Vidal En odontologia a l'hora de restaurar dents afectades per càries o rehabilitar edentulismes amb pròtesis dentals ,molt sovint s'utilitzen diferents metalls com: Hg, Ag, Au, Pd, Pt, Zn, Cu, Cr, Ni, Co, Ti, Cd, ... en general en forma d'aliatges, i això en moltes ocasions provoca un tipus d'interferència molt habitual en la cavitat oral, que és el poli metal·lisme, produït per la presència concomitant de dos o més metalls de diferent composició en boca, fruit d'aquesta concurrència son: - Fenòmens elèctrics, deguts a efectes galvànics, alliberació d'electrons d'un dels metalls (actuant d’ ànode) cap a l'altre metall (càtode) connectats entre sí, per la saliva que fa d’ electròlit o medi conductor. -Fenòmens químics, de toxicitat, degut a l'alliberament d' ións metàl·lics fruit de la corrosió, que en arribar a l'intestí son atacats per bacteris i fongs produint-se metilacions que permeten l'absorció dels mateixos a l’interior de l'organisme essent susceptibles de produir en ocasions patologia.

8

Joan Badal Vidal

3.- HISTÒRIA DELS METALLS EN ODONTOLOGIA. Al llarg de la història s'ha utilitzat diferents materials per restaurar peces dentals perdudes o malmeses per càries o traumatismes. Uns dels més utilitzats son, sens dubte, els metalls. Inicialment va ser l'or, gràcies a les seves propietats de mal·leabilitat i resistència a la corrosió. S'han trobat restes dentals humanes amb obturacions fetes amb or cohesiu, impactat en cavitats dentals, i rudimentàries pròtesis dentals, que daten ja dels temps dels etruscs,(s. X aC. Aprox) fetes amb dents naturals de vaca lligades amb una banda d'or a les dents del pacient9.

Pròtesis dentals etrusques. . Al 1855, Robert Arthur, Baltimore USA, perfecciona l’ or cohesiu per a fer obturacions. Més tard es van fer fundes dentals que ajustaven sobre dents tallades, fetes amb planxa d'or doblegada, troquelada o estampada sobre motlles i soldades. Amb el temps l'or fí va anar essent aliat amb d'altres metalls per tal d'abaratir el seu cost i endurir-lo una mica mes per fer ponts, afegint-li Ag, Cu, i d'altres. Aquestes pròtesis troquelades s'utilitzaren durant molts anys fins que es va passar a les tècniques de colat que oferien un millor ajustament al monyó tallat i evitaven així filtració bacteriana. Per a fer colats d'estructures llargues calia un metall més dur que l'or, i es van afegir altres metalls que conferien major duresa com el Platí ,o el Pal·ladi, però tot plegat tenia un cost econòmic relativament important, i amb el temps varen començar a utilitzar-se aliatges de metalls anomenats “no nobles” que alhora de tenir una duresa molt elevada tenien un preu baixíssim, com el Ni Cr, i el Co Cr. Aquests aliatges han anat substituint progressivament i fins els nostres dies als metalls “nobles”(d’alt contingut en or) I als anomenats “Semi-nobles” que solien ser aliatges de Ag, Pd, amb una mica d’Au.

9

Joan Badal Vidal Des de les darreries d’aquest segle passat, aprox. uns vint-i -cinc anys ,s’ha estès en gran manera l’ us del Titani per a fer pròtesis dentals ,tot i que ja s’utilitzava des de feia alguns anys abans, des de l’inici dels implants dentals13. El Ti sembla que presenta una gran biocompatibilitat amb els teixits vius, i tractat de manera convenient disposa d’una acceptable rigidesa per a fer estructures dentals llargues, i segons com, es converteix en un metall extremadament flexible, molt útil per exemple en dispositius ortodòntics. De fet, el canvi de rigidesa és degut a la seva configuració cristal·logràfica Alfa hexagonal , o Beta cúbica ,que es produeix en passar d’una temperatura crítica de 882ºC.

10

Joan Badal Vidal

4.- METALLS UTILITZATS EN ODONTOLOGIA. Actualment els metalls que s’utilitzen en odontologia son: 

Obturacions: Amalgames de Ag ,Hg, Cu, Sn.



Pròtesi fixa: Aliatges Nobles d’alt contingut en Au amb petits percentatges de Pt, Ag, o Pd.



Aliatges Semi-nobles d’alt contingut en Pd amb petits percentatges de Au ,Ag.



Aliatges No Nobles de Ni Cr, i de Cr Co.



Titani: Comercialment pur o lligat a Ni.



Pròtesi removible: o

Esquelètics de Cr Co- Mo.

o

Esquelètics de Ti.



Ortodòncia: Brackets i arcs de Ni Cr, o Ni Ti.



Perns intraradiculars: Ti o de Au.



Fundes prefabricades per a dents temporals endodonciades: Ni Cr (referència Ion Crown 3M ).

Els metalls en boca poden produir diferents reaccions perjudicials per a la salut17, des de reaccions de toxicitat directe, reccions immunològiques, o reaccions derivades de efectes galvànics i de corrosió. En aquestes qüestions influeix molt l’ electronegativitat de cada un dels metalls que interactuen , això vol dir segons L. Pauling : la capacitat d’ un àtom en una molècula per atraure cap a sí mateix els electrons que l’ envolten. A la taula periòdica d’ elements trobem valors més elevats d’ electronegativitat a la part superior dreta i més baixos a la inferior esquerra. La següent gràfica mostra els valors d’ electronegativitat dels metalls més usualment utilitzats en odontologia. Val a dir que l’ electronegativitat pot variar en funció del nivell d’ oxidació que hi hagi en el metall per la qual cosa hi haurà oscil·lacions.

Taula electronegativitats: Au

Pt

Pd

Hg

Ag

Cu

Co

Mo

Ni

Cr

Ti

2.4

2.2

2.2

1.9

1.9

1.9

1.9

1.8

1.8

1.6

1.5

11

Joan Badal Vidal -TOXICITAT DIRECTE: Estudis del Dr. John Wataha6-12 demostren la capacitat citotòxica de segons quins metalls en contacte directe amb fibroblasts. Cal recordar també el cas d’intoxicació massiva que hi va haver en 1953, a Minamata , població costanera del Japó, on varen morir 52 persones i centenars d’afectats, intoxicats per metil mercuri procedent d’uns vessaments de residus industrials al mar, que en esser metabolitzats pels peixos, van entrar a la cadena alimentària, afectant també a la població. -EFECTES INMUNOLÒGICS: Alguns metalls poden produir alteracions en els limfòcits ( T4 T8 )responsables del sistema immunitari, afectant també enzims, antígens de superfície, anticossos, i receptors, provocant reaccions inflamatòries d’hipersensibilitat de tipus IV, això sembla estar relacionat amb patologies com Esclerosi múltiple, Lupus eritematós, patologia inflamatòria intestinal, etc... -GALVANISME: Luigi Galvani (1737-1798) Metge ,Fisiòleg i Físic italià va descobrir que al tocar amb el bisturí unes potes de granota que penjaven d’un ganxo de bronze, es produïa una descàrrega elèctrica que provocava un espasme sobtat de la musculatura d’aquelles potes d’un animal mort, això el va portar a aprofundir sobre aquell fenomen tant interessant. Els estudis de Galvani van suposar l’inici de la neurofisiologia.

L.Galvani

A. Volta

12

Joan Badal Vidal Alessandro Volta (1745 - 1827) Físic també italià, i col·lega de Galvani, va descriure el pas de electricitat provinent d’un metall cap un altre metall de diferent naturalesa, immersos tots dos en un mateix medi conductor. Volta va crear així l’anomenada pila electroquímica. Quan conflueixen dos o més metalls diferents entre sí en un medi electrolític, s’estableix un flux d’electrons que van del pol negatiu anomenat ànode, cap al pol positiu anomenat càtode. Es crea així un camp electromagnètic de baixa intensitat, però que pot assolir diferències de potencial considerables en funció de la naturalesa de cada metall. A l’hora amb la migració d’electrons que estan lligant àtoms metàl·lics entre sí, es produeix l’alliberació d’aquests àtoms en forma d’ ions cap el medi . A la cavitat oral trobem massa sovint fenòmens de galvanisme3. Obturacions d’amalgama de Ag ,i Hg, que conviuen amb pròtesis fetes de Ni Cr, i/o alguna funda antiga feta en Au, Cu, Ag, i la presencia d’un esquelètic de Cr Co, és una combinació força habitual, amb comportaments elèctrics molt diferents entre sí. Tot això està permanentment connectat entre sí per la saliva que actua d’electròlit. -CORROSIÓ: S’entén per corrosió el procés de descomposició total o parcial d’un metall per acció química o electroquímica. En general es produeix pel simple contacte d’un metall amb un medi aquós, com ho és la saliva en el medi oral. El metall, que té a la seva superfície un núvol d’electrons, és atacat per l’O2 procedent de la saliva, i cedeix electrons oxidant-se, a l’hora que es van alliberant ions metàl·lics. A mida que progressa la corrosió, àtoms d’O2 es van introduint a l’interior del metall accelerant així el procés de degradació. Un altre via de corrosió que sovint s’ hi afegeix és la que es produeix per efectes galvànics14 com ja s’ ha exposat anteriorment, la presència de dos o més metalls en proximitat i en contacte amb un electròlit com ho és la saliva. Finalment cal tenir en compte que la presència de bacteris sobre la superfície del metall ( fet inevitable en el medi oral), suposa la formació d’una capa o Biofilm adherit que a través dels seus enzims i demés proteïnes alteren el pH del medi, i aprofitant l’ H dissolt a l’ aigua, produeixen una diferència de potencial que comporta una corrosió electroquímica. Un metall es va dissolent en un medi líquid corrosiu fins la total consumició del mateix, o la saturació de l’ electròlit , cosa que en el medi oral no es produeix degut a que constantment deglutim saliva i aquesta es va renovant la qual cosa perpetua el fenomen. Conseqüència de tot això en resulta: l’alliberació d’ions15 i el corrent elèctric.

1.-Alliberació d’ ions Una vegada a la saliva, els ions son empassats tub digestiu avall. Aquests ions de metall lliure, en arribar al budell son atacats per bacteris i fongs, produint-se metilacions, canvis estructurals per unió a partícules orgàniques que els fan permeables a la membrana intestinal, entrant així a l’interior de l’organisme i emmagatzemant-se. L’efecte d’aquests ions metàl·lics , és potencialment 13

Joan Badal Vidal susceptible de produir reaccions de toxicitat. Aquest fenomen es veu perillosament incrementat quan degut a tractaments antibiòtics, la flora bacteriana intestinal és greument agredida , produint-se proliferació de càndida àlbicans, (candidiasi) multiplicant de manera exponencial les metilacions, i per tant l’absorció d’ ions metàl·lics . Normalment els estudis que es fan per mesurar toxicitat de metalls en boca, es fan sobre pacients sans, és a dir, en absència de malaltia, i per tant no es pot valorar en ells aquesta variable.

2.-Corrent elèctric El pas d’electrons que s’estableix entre el metall que actua d’ànode cap el que actua de càtode, transcorre a través de la saliva, interactuant amb les diferents estructures que l’envolten, el nostre organisme té una conductivitat elèctrica molt alta8 i cal recordar que una gran part del nostre organisme és aigua (excel·lent conductora elèctrica)i per tant d’aquí es transmet per tot l’organisme. La cavitat oral, zona d’ origen d’aquests fenòmens, està revestida per la geniva, formada per diferents tipus de cèl·lules i que, com la resta de teixits orgànics, aquestes estan unides entre elles per la matriu extracel·lular MEC. Estructura encarregada de donar suport estructural, i a partir dels treballs del Dr. Pischinger sabem que permet, entre d’altres coses més, intercanvi d’informació intercel·lular. Es tracta d’una immensa xarxa interconnectada de cap a peus i rica en fibres nervioses del Sistema Nerviós Vegetatiu SNV. L’estructura bàsica de la MEC està formada per un entramat de proteïnes ,fibres de proteoglicans i glucoproteïnes , sintetitzats pels fibroblasts, cèl·lules majoritàries de la MEC amb gran capacitat de diferenciació, segons el teixit del qual formin part. Quan aquests fibroblasts es troben en males condicions o són agredits per fenòmens irritatius, es produeixen alteracions importants a la MEC4, que poden traduir-se en reaccions patològiques que es manifestin a nivell local o a distància, tot i que de fet, l’afectació es produeix a nivell integral, en tot l’organisme, en una visió holística. En la pràctica diària, trobem galvanismes a la boca dels nostres pacients portadors de dos o més metalls, en ocasions la diferència de potencial arriba a nivells molt elevats, en funció de la naturalesa de cadascun dels metalls presents . Personalment he trobat entre amalgames convencionals unes diferències d’aprox 30-40 mV, i aquesta, augmenta molt quan és entre amalgames i Au ò NiCr. En alguna ocasió s’han trobat galvanismes exageradament elevats en unes amalgames antigues i molt toves (provablement poc condensades o brunyides).

14

Joan Badal Vidal

La capacitat de cedir o atraure electrons d’un àtom o d’una molècula és el que el defineix com electropositiu o electronegatiu ,és a dir, quant més diferents siguin (un de molt electronegatiu amb un altre de molt electropositiu)més galvanisme es produirà. Totes les cèl·lules tenen en la seva membrana un gradient elèctric o potencial transmembrana18 que ve donat per l’equilibri elèctric entre ions de Na i K .L’impuls nerviós en les neurones es transmet per canvis elèctrics de la seva membrana, despolaritzacions i repolaritzacions, que s’originen a partir de l’ anomenat potencial d’acció i es transmet progressivament a través de tota la neurona. Aquest potencial d’acció és de -70mV.aprox.i les diferències de potencial galvàniques superen, en la majoria dels casos amplament, aquesta quantitat.

15

Joan Badal Vidal

5.- OBJECTIUS. Les cèl·lules tenen un potencial elèctric propi16 i entre elles s’estableix una comunicació basada en estímuls elèctrics que es propaguen a través de la seva membrana. La presència concomitant de dos o més metalls de diferent naturalesa a la cavitat oral produeix corrents elèctrics galvànics amb afectació local i generalitzada a tot l’organisme8, doncs cal recordar que som en un 80% aprox. Aigua, i aquesta és un excel·lent conductor de l’electricitat. Aquests camps elèctrics galvànics en incidir amb d’altres camps elèctrics cel·lulars, suposadament produirien alteracions o interferències que es podrien traduir en alteracions morfològiques i/o funcionals de les cèl·lules, que impliquessin alteracions fisiològiques a nivell tissular o orgànic, és a dir: un procés patològic; ”in situ” o bé a distància; local o generalitzat. La matriu extracel·lular és el lloc on podrien tenir inici multitud de malalties, segons Pischinger, que l’anomena “sistema bàsic” la defineix com una estructura tridimensional que actua de filtre biofísic de protecció, de manera que quan s’altera la seva estructura poden aparèixer processos patològics. Com ja s’ha dit, la MEC està formada bàsicament per fibroblasts. Aquest treball es proposa estudiar i valorar “in vitro”, l’afectació potencial de fenòmens galvànics produïts per bimetal·lismes o polimetal·lismes presents a la cavitat oral, i d’ús molt freqüent en odontologia, sobre un cultiu de fibroblasts.El grau de toxicitat que aquests galvanismes produeixin en els fibroblasts11, en determinarà el grau de patogenicitat d’aquests metalls, és a dir la capacitat de produir malaltia, i per tant des de la Teràpia Neural es confirmarien com a camps interferents de la matriu extracel·lular.

16

Joan Badal Vidal

6.- MATERIALS I MÈTODE. El model experimental s’ha basat en un assaig in vitro, introduint parelles de metalls d’us molt habitual en odontologia en uns pouets de material plàstic, on prèviament s’ha sembrat uns cultius de fibroblasts. Els diferents metalls son retalls de sobrants de fundació pel que fa a Ti, CrCo, i CrNi, l’ Au son unes pastilles originals, de la casa Ordenta , i les mostres d’ amalgama, s’ han elaborat a partir d’una càpsula, amalgamada amb un vibrador adequat i amb un aplicador d’ amalgames s’ ha fet uns cilindres.

Placa de 6 pouets amb els metalls i suports corresponents.

Els respectius metalls s’han subjectat a través d’unes estructures de suport fetes del mateix material plàstic que els recipients (pouets) per tal de no alterar l’assaig amb diferents materials que poguessin induir a biaixos en els resultats obtinguts. Per la mateixa raó, els diferents elements del suport son fixats amb encaixos a pressió per evitar cap adhesiu químic. Les mostres cilíndriques de metall que no podien ser fixades del tot i quedaven inestables s’han fixat amb un film de material inert (Parafilm “M”, Laboratory film, Pechiney plastic packaging, Chicago, IL 60631 )per donar més fricció i ajust a la peça.

17

Joan Badal Vidal

Detall dels suports amb els metalls.

El pouet nº 1, s’ha reservat com a control, i no s’hi introdueix cap metall, no obstant per tal de simular les mateixes condicions de ventilació que la resta de pouets de cultiu, s’ha introduït una estructura plàstica com les altres, però sense mostres metàl·liques. Previ a l’assaig en cultiu, s’han fet determinacions puntuals de milivoltatges amb un multímetre entre els diferents metalls en igual ordre que l’assaig pròpiament dit, però immersos en una solució salina fisiològica de Na Cl al 9%. A la vista que les diferències de potencial són considerables, sobretot en els parells que inclouen l’or entre algun dels metalls, degut a que és l’or, el metall més electronegatiu de tots ( 2.4 ) i que els mesuraments varien en el temps fent oscil·lacions importants, s’ha cregut oportú tot seguit, fer mesuraments més específics, prenent la condició nº 2 ( Amalgama – Au ) com a model, i en immersió en sèrum fisiològic durant 72 h, fent mesuraments periòdics de milivoltatge: a les 0,0 , 24 , 48 , i 72 h que dura l’observació. El mateix s’ha fet després, però en una solució més àcida amb sèrum fisiològic i àcid acètic per disminuir-ne el seu pH. Els valors de totes aquestes observacions es registren en unes gràfiques que es mostren al capítol de resultats.

18

Joan Badal Vidal

Nº1

CONTROL

Nº2

AMALGAMA – Au

Nº3

AMALGAMA – AMALGAMA

Nº4

AMALGAMA – Ni Cr

Nº5

Co Cr – Ti

Nº6

AMALGAMA – Au – Co Cr – Ni Cr

Descripció detallada de les mostres de cada pouet:

La referència de les mostres de metall utilitzades a l’assaig son les següents: Amalgama: KERR Dental Alloys –Tytin-2 Au: “OROMIT 804”, Oros dentales SA Ni Cr: ”WIRON 99” Bego Dental, Bremen Co Cr: “WIRONIUM PLUS” Bego Dental, Bremen Ti: “ZENOTEC Ti” Wieland Dental + Technik Germany Les cèl·lules utilitzades en el present assaig són fibroblasts de teixit pulmonar humà no tumoral anomenades MRC-5, de l’empresa ATCC (American Tipe Culture Collection) i amb referència: (ATCC CCL171), distribuït per LGC Standarts S.L.U. Barcelona.

El medi de manteniment utilitzat, està composat per: 

500ml alfa-MEM (life technologies: 22561).



50ml Fetal Bovine Serum (FBS)(Sigma: F7524).



5ml penicilin/streptomicin (life technologies: 15140-148).

Les plaques de cultiu són: placa multiwell de 6 pouets (Reactiva TPP Ref: 92006).

19

Joan Badal Vidal

La manipulació de tot el procés es fa seguint el protocol utilitzat al Laboratori de cultius cel·lulars de l’ Institut de Neurociències de la UAB, i que tot seguit es transcriu: Tot el material cal que sigui estèril, puntes de pipeta, tubs i altre material de plàstic han d’esser autoclavats a 121ºC i 1,5 Atmosferes de pressió durant 30 minuts. En cas de solucions, cal passarles per un filtre de 0.22 micres. Quan es manipulen cultius, es fa en una cabina de seguretat biològica, o de flux laminar, que es desinfecta amb etanol al 70% abans i després del seu ús. Durant el temps que es treballa a la cabina de flux laminar, es fa amb guants estèrils. Prèviament cal desinfectar-se be les mans i s’ha d’evitar situar objectes entre el filtre de la cabina i la zona de treball. Una vegada tot finalitzat, s’ autoclavaran els residus generats abans de ser eliminats. Descongelació: Les cèl·lules utilitzades, estan conservades en nitrogen líquid fins al moment del seu ús, aleshores es retira el vial del nitrogen dipositant-lo posteriorment en un bany a 37ºC fins que es descongeli. Després, s’introdueix dins d’una cabina de seguretat biològica i en condicions de treball estèril, s’obren i es transfereix el seu contingut en un recipient de cultiu cel·lular o flask de 75cm2. Se li afegeixen 11ml de medi de manteniment i s’introdueix en un incubador a 37ºC, 5% de CO2 i en atmosfera humida. Passades 24h, i una vegada examinats al microscopi de contrast de fases, per tal de verificar el seu estat i l’adherència al plàstic se li canvia el medi per retirar les restes de DMSO que conté el vial inicial, doncs aquestes poden ser tòxiques. Tripsinització: Una vegada les cèl·lules arriben a un 70% de confluència,(ocupació de la superfície del recipient ) cal diluir-les, es renta dues vegades el flask confluent amb PBS 1X estèril per retirar el debri cel·lular i permeabilitzar la membrana cel·lular a la tripsina. S’afegeixen 3ml d’una solució de tripsina EDTA (sigma ref: T3924) i s’incuben 3 minuts. Passat aquest temps, es retira el flask i s’afegeixen 9ml de medi de manteniment, per inhibir l’efecte de la tripsina. Les cèl·lules han d’estar desenganxades, es transfereix el contingut del flask a un tub i es centrifuga 3 minuts a 1000 rpm. S’aspira el sobrenedant i es dilueix el pellet amb medi de manteniment a la dilució desitjada i finalment es sembra la quantitat necessària de fibroblasts en cada un dels sis pouets i s’incuba a 37ºC, 5% de CO2 i atmosfera humida. Una vegada sembrats els cultius amb les mostres inserides, es fan controls diaris de l’evolució amb observació visual directe i amb microscopi a les 24h i 48h,respectivament, i a les 72h es procedeix a l’ observació amb microscopi de contrast de fases,(NIKON eclipse TE-2000),i es registra fotogràficament, moment en que conclou la fase experimental d’observació i contacte pròpiament dita. Segons l’evolució de l’assaig, es farà a la fi d’aquest període, una prova addicional amb MTT, que consisteix en una anàlisi bioquímica per valorar la viabilitat cel·lular a través de la seva activitat metabòlica. 20

Joan Badal Vidal L’ MTT o Bromur de 3-[4,5-Dimetiltiazol-2-il]-2,5, difenitetrazolio, és una sal de tetrazoli insoluble en medi aquós. Els enzims mitocondrials redueixen la sal de tetrazoli a formazan, compost de color púrpura. Si es dissol la sal precipitada amb DMSO i es realitza la lectura a 620 i 560 nm s’ obté una relació d’ absorvàncies que es correlaciona amb la viabilitat del cultiu. S’afegeix a cada pouet de fibroblasts a la fi de l’experiment i es deixa un temps determinat perque sigui metabolitzat pels enzims mitocondrials dels fibroblasts, passat el qual, precipiten uns cristalls que son el resultant del Tetrazoli de l’MTT que s’ha reduït a Formazan que te un color lilós, després aquests, es dissolen amb DMSO, i es mesura el seu color amb un espectrofotòmetre que en funció del color ens indicarà la viabilitat del cultiu, és a dir a més intensitat de color, més activitat mitocondrial de les cèl·lules, i per tant indica que hi ha més cèl·lules vives. Finalment, si no hi ha resultats que així ens ho facin replantejar, aquesta fase es dona per conclosa.

Manipulació del cultiu a la cabina de flux laminar.

21

Joan Badal Vidal

7.- FASE EXPERIMENTAL. Dia 1: Es procedeix a netejar i assecar convenientment tots els elements plàstics, i prèvia esterilització per immersió en etanol, i rentat posterior amb PBS estèril (tampó de pH neutre) s’omple cada pouet amb 2ml de medi de cultiu i fibroblasts dipositant-s’hi sobre les corresponents estructures amb les mostres de metalls. A continuació es guarda la placa a l’ incubadora a 37ºC, 5% de CO2 i atmosfera humida. Dia 2: (24h) Observació directe i amb microscopi òptic. No s’aprecia diferències entre les cèl·lules, estan enganxades al fons i l’aspecte és bo. Dia 3: (48h) Observació directe i amb microscopi òptic. L’aspecte en general continua siguent bo, enganxades i creixent. Tot i això cal destacar que en alguna condició comença a haver-hi canvis, concretament la condició num 3, al voltant del metall de l’esquerra (Amalgama) presenta menys creixement de fibroblasts que en el control, i fins i tot n’hi ha algun de mort. Dia 4: (72h) Observació directe i amb microscopi òptic. S’aprecien diferències importants entre les diferents condicions, hi ha zones de creixement correcte i altres de escàs o nul creixement. Es porta la placa al microscopi de contrast de fases i fem registres fotogràfics a 10x, 20x, i 30x. Després com que s’evidencien els canvis fem l’assaig de l’ MTT: Retirem les mostres de metalls de les diferents condicions i s’afegeix a cada una 286 µl d’ MTT pur i ho deixem incubar durant 35 minuts, passat aquest temps es retira la placa de la incubadora i posem 1200 µl de DMSO per pouet, i en retirem tres mostres de300microlitres de cada una de les sis condicions, a fi d’obtenir un resultat més representatiu del conjunt de cada pouet, per tal de minimitzar possibles biaixos en els resultats colorimètrics, donat que en aquest estudi la nostra mostra es de n=1, i el color obtingut a simple vista no resulta molt intens. Finalment es llegeix l’ absorbància amb un espectrofotòmetre. A major intensitat de color púrpura, major quantitat de mitocondris viables i conseqüentment major viabilitat cel·lular. Els valors es registren i s’avaluaran al capítol de resultats, donant per finalitzada la fase experimental.

22

Joan Badal Vidal

8.- RESULTATS. Fase pre-experimental:

CONDICIÓ

METALLS

LECTURA Mv

1

Control

---

2

Amal / Au

402

3

Amal / Amal

87

4

Amal / NiCr

21

5

CrCo / Ti

34

6A

NiCr / Au

380

6B

Amal / Au

384

6C

CrCo / Au

510

6D

CrCo / Amal

114

6E

NiCr / Amal

63

6F

NiCr / CrCo

48

Valors lectures inicials.(puntuals)

23

Joan Badal Vidal Medicions de les diferentes condicions amb tester:

24

Joan Badal Vidal

00 H

312 mV

24 H

358 mV

48 H

365 mV

72 H

362 mV

Lectures de la condició nº 2, fetes en Sèrum fisiològic a PH 6.

00 H

341 mV

24 H

319 mV

48 H

314 mV

72 H

295 mV

Lectures de la condició nº 2, fetes en Sèrum fisiològic més Àcid Acètic a PH 3.5.

25

Joan Badal Vidal Fase experimental: Fotografies amb microscopi de contrast de fase.

Fig. 1

Fig. 2

Fig. 3

Fig. 4

Fig.5

Fig. 6

26

Joan Badal Vidal

Fig. 7

Fig. 8

Fig. 9

Fig. 10

Fig. 11

Fig. 12

27

Joan Badal Vidal

Fig. 13

Fig. 14

Fig. 15

Fig. 16

Fig. 17

Fig. 18

28

Joan Badal Vidal

Fig. 19

Fig. 20

Fig. 21

Fig. 22

Fig. 23

Fig. 24

29

Joan Badal Vidal

Fig. 25

Fig. 26

Fig. 27

Fig. 28

Fig. 29

30

Joan Badal Vidal Descripció de les microfotografies: Fig 1 Fig 2 Fig 3 Fig 4 Fig 5 Fig 6 Fig 7 Fig 8 Fig 9 Fig 10 Fig 11 Fig 12 Fig 13 Fig 14 Fig 15 Fig 16 Fig 17 Fig 18 Fig 19 Fig 20 Fig 21 Fig 22 Fig 23 Fig 24 Fig 25 Fig 26 Fig 27 Fig 28 Fig 29

Control Control Control Condició nº 2 Condició nº 2 Condició nº 2 Condició nº 2 Condició nº 3 Condició nº 3 Condició nº 3 Condició nº 3 Condició nº 3 Condició nº 3 Condició nº 3 Condició nº 3 Condició nº 4 Condició nº 4 Condició nº 4 Condició nº 4 Condició nº 4 Condició nº 5 Condició nº 5 Condició nº 6 Condició nº 6 Condició nº 6 Condició nº 6 Condició nº 6 Condició nº 6 Condició nº 6

100X 200X 300X 100X 100X 200X 300X 100X 100X 100X 200X 200X 200X 300X 300X 100X 100X 100X 200X 300X 100X 200X 100X 100X 100X 100X 100X 200X 300X

Detall : Vacuola Detall : Vacuola a major augment Presència de Debry i cèl·lules mortes Proximitat a Amalgama Dta Proximitat a Amalgama Esq Zona central Proximitat a zona Dta Proximitat a zona Esq Zona central Proximitat zona Dta Zona central Proximitat Amalgama Proximitat a Ni Cr Zona central Zona central Zona central (cèl·lula morta)

Proximitat Amalgama Proximitat Au Zona central Proximitat Co Cr Proximitat Ni Cr Zona central Proximitat Au (presència de cèl·lules mortes)

Comentari de les microfotografies: Figs 1,2,3, Condició nº 1, a 100X, 200X, i 300X respectivament. S’observa creixement correcte, i uniforme a tota la superfície, que està ben pavimentada formant una monocapa. Figs 4 a 7 Condició nº 2, S’observa molt poca proliferació de fibroblasts, i alteracions morfològiques importants com la presència de vacuoles (fig 4 i 6) que indiquen dany cel·lular, i Debry o restes cel·lulars (Fig 7). S’aprecien cèl·lules mortes. Figs 8 a 15, Condició nº 3, Imatges a diferents augments. S’aprecia proliferació irregular, així doncs, veiem que en les proximitats a les amalgames el creixement és escàs mentre que en zones més allunyades ( zona central) el creixement es més correcte.

31

Joan Badal Vidal Figs 16 a 20 Condició nº 4, Proliferació escassa i irregular, la morfologia és acceptable. La fig 20 s’aprecia en detall una cèl·lula morta. Figs 21 i 22 Condició nº 5, imatges a 100X i 200X, presenta aspecte força correcte i uniforme. El més semblant de tots al cas Control. Figs 23 a 29 Condició nº 6, Trobem una distribució molt irregular i caòtica en funció de la proximitat a segons quins metalls. Cal destacar que en la proximitat al Au, el cultiu es veu molt més perjudicat, presentant molt poca proliferació i cèl·lules mortes.(Figs 24 i 29)

32

Joan Badal Vidal Assaig de viabilitat de l’ MTT, Resultats:

Fotografia de la placa de pouets abans i després de ser retirades les mostres de metalls (observi’s la distribució dels cristalls, al voltant de les mostres).

La mateixa placa una vegada diluïts els cristalls per a ser llegits per l’espectrofotòmetre.

Lectura 1 Lectura 2 Lectura 3 mitjana % lectura 1 % lectura 2 % lectura 3

control

cond 2

0,043 0,041 0,042 0,042 100

0,024 0,024 0,024 0,024 57,14 57,14 57,14

cond3 0,025 0,032 0,01 0,0285 59,52 76,19

cond4 0,042 0,043 0,045 0,04333 100 102,4 107,14

cond5 0,027 0,036 0,034 0,032333 64,28 85,71 80,95

cond6 0,022 0,027 0,025 0,024666 52,38 64,28 59,52

Taula 1: Registre de les diferents lectures de l’espectrofotòmetre, els resultats s’han traduït a percentatges per poder-los comparar millor, prenent el valor del cas control com a valor 100%.

33

Joan Badal Vidal

mitjana %

control 0,042 100

cond 2 0,024 57,14

cond3 0,0285 67,855

cond4 0,04333 103,18

cond5 0,032333 76,98

cond6 0,024666 58,72

Taula 2 : Mostra els valors mitjans de cada condició, i el seu equivalent en percentatges.

Gràfic 1: Il·lustra la distribució dels diferents valors.

34

Joan Badal Vidal

9.-DISCUSIÓ. En la literatura consultada per a realitzar aquest treball, hi ha estudis per a totes les opinions, tant a favor com en contra10 de l’ us dels metalls en boca. No obstant els partidaris dels metalls en general admeten que no ofereixen resultats estètics, i en el cas de polimetalismes hi ha risc de galvanismes però per una qüestió de corrosió del metall i per tant de pèrdua de les seves propietats físiques, i no tant pel perill que podria comportar per a la salut. Fins i tot alguns insisteixen en afirmar que l’ us de les amalgames és del tot segur, i que es tracta d’ un excel·lent material d’ obturació. Hi ha molts autors que neguen la possible toxicitat dels metalls en boca, fins i tot dirigents d’ organitzacions col·legials10. En aquest treball queda clar que els fibroblasts resulten molt afectats al estar en condicions d’electrogalvanisme, formant vacuoles , i fins i tot n’ hi ha que moren directament, i si s’alteren els fibroblasts, conseqüentment s’ altera la matriu extracel·lular, i amb ella el SNV. A la vista de l’ estudi realitzat es confirma l’ existència de fenòmens electrogalvànics entre metalls utilitzats habitualment en odontologia. Aquests corrents elèctrics tot i ser de molt baixa intensitat poden assolir diferències de potencial molt elevades, en comparació amb els 90 mV que solen haver a les membranes cel·lulars. Tot i que els corrents elèctrics elevats puguin ser perjudicials per a les cèl·lules el fet que uns metalls produeixin més o menys diferència de potencial no és el que determina finalment la patogenicitat del metall, amb baixos voltatges també es produeix corrosió i l’ alliberació d’ ions, si es tracta d’ un metall molt tòxic poden induir efectes patològics de toxicitat directe per contacte. Els resultats obtinguts ens obliguen a fer unes consideracions. Cal tenir en compte que l’estudi s’ha realitzat amb un tamany de mostra n=1, per raons pressupostàries, i això fa que els seus resultats no siguin extrapolables com si s’ hagués fet amb una mostra de gran tamany. Així doncs tenim per exemple que en l’ assaig de l’ MTT, hi ha el resultat de la condició 4, Amalgama / NiCr , amb un valor 103.18% superior al Cas Control (100%) A la vista d’ aquest resultat semblaria lògic suposar que es tracta d’ un resultat erroni, doncs d’altra manera suposaria que hi ha un metabolisme encara millor que el del control tot i estar sota la influència d’ un corrent elèctric i que en la imatge de microscopi es veia un creixement proliferatiu escàs i irregular, si bé també és cert que la diferència de potencial, pre experiment, d’aquella condició nº 4 es de 21mV, un resultat bastant més baix del que seria d’ esperar comparat amb d’ altres observacions clíniques realitzades al marge del present estudi. Una possible explicació a aquest fet, encara que improbable, seria una mutació d’aquests fibroblasts, que els fes tenir un metabolisme excessivament accelerat, com el que es produiria en cèl·lules neoplàsiques. Pel que fa a les lectures de l’MTT, val a dir que per tal d’ obtenir un resultat més representatiu de cada condició, es van fer tres extraccions de cada mostra per evitar biaixos en el resultat.

35

Joan Badal Vidal Resulta també interessant veure com els fibroblasts creixen de manera desigual al voltant de segons quin metall, i així tenim que en la condició nº5, CrCo / Ti, el creixement cel·lular és molt semblant al cas control mentre que en les condicions que inclouen Au, el resultat és caòtic, amb dany cel·lular demostrat per la formació de vacuoles al fibroblast i la presència de cèl·lules mortes, i confirmat amb l’ assaig de MTT que li dona a aquestes condicions ( 2 i 6 ) els valors més baixos. Això contrasta amb altres estudis com el del Dr Wataha6-12 de citotoxicitat per contacte directe en el que afirma que aliatges d’ alt contingut en Au son els més ben tolerats. Es clar que aquell estudi no es va fer en situació d’ electrogalvanisme per bimetal·lismes, i que va ser patrocinat per una empresa de metalls preciosos, però d’aquí es dedueix, que un metall determinat, es comporta a nivell de toxicitat cel·lular, de diferent manera quan es troba en presència d’ un altre metall.

36

Joan Badal Vidal

10.- CONCLUSIONS. Avui per avui només hi ha dos llocs on un odontòleg pot dipositar el Hg d’una manera legal: a la boca dels pacients o en un recipient per a materials biològicament perillosos. Alguna cosa no funciona bé... Aquesta frase la va escriure un odontòleg ja fa temps i jo la subscric. La lògica ja fa pensar que això de posar metalls en boca no és una de les millors idees, no obstant sorprèn llegir declaracions i informes “científics” on es lloen les excepcionals virtuts dels metalls en boca, tot afirmant categòricament la seva seguretat i innocuïtat. Voltaire, al segle XVIII, ja va dir que el científic sempre dubte, mentre que el neci postula i afirma categòricament. En la meva opinió, cal ser sempre cautes i prudents en tota acció que fem sobre una persona, i a la vista d’ aquest i molts d’ altres estudis, s’ ha d’ evitar en la mesura del possible la utilització de metalls en boca i quan sigui imprescindible, evitar els bimetal·lismes. Crec que seria convenient realitzar més estudis en aquesta direcció per tal d’ obtenir resultats més contrastats. Si be la mostra utilitzada en el present treball (n=1) resulta molt escassa, per tal de poder generalitzar cap conclusió, és prou per aportar una mica més de llum a aquest problema dels galvanismes per bimetalismes que, malauradament i a diari, estem provocant molts odontòlegs en introduir dos o més metalls a la boca dels nostres soferts pacients. Els galvanismes produeixen corrents elèctrics de molt baixa intensitat, però poden arribar a ser d’ alta diferència de potencial, com en cas de combinar Au / CrCo (510mV),o Amalgama / Au (402 mV), nivells molt alts on s’ evidencien greus alteracions i danys en un cultiu cel·lular, arribant fins i tot a produir mort cel·lular. Les diferències de potencial mes elevades s’ han trobat en els parells formats per metalls més diferents des del punt de vista d’ electronegativitat. Això indicaria la conveniència de realitzar nous estudis per valorar el parell Au (2.4) / Ti (1.5), els més distants a la taula d’ electronegativitat. Per tot això crec que es podria afirmar que els bimetal·lismes creen corrents electrogalvàniques, i que aquestes, son molt perjudicials per als fibroblasts produint en ells greus alteracions i fins i tot la seva mort. Això és encara més dramàtic en combinacions que inclouen l’ Au que resulta el més perjudicial en bimetal·lismes, atès que és el més electronegatiu de tots ells. Podria concloure que, en un ambient on s’ hi produeix una alteració tant greu com l’ observada a l’ assaig en els fibroblasts, que en son els formadors de la matriu extracel·lular, aquesta també en resulta afectada, i per extensió, això es pot considerar un camp interferent del sistema nerviós vegetatiu. Finalment, i al fil del que ja s’ ha dit, davant un pacient amb una patologia que no sigui clarament atribuïble a una interferència concreta, cal valorar la presència de metalls en boca i en cas de bi o polimetalismes, retirar-los per tal de normalitzar la MEC i conseqüentment ajudar a restaurar l’ equilibri de la persona.

37

Joan Badal Vidal

11.- BIBLIOGRAFIA. 1. Dosch, Peter, “Libro de la enseñanza de la Terapia Neural según Huneke”,(4ª edició) 1975 2. Ernest Adler, “Enfermedades generales causades por campos de irritación del Sistema Nervioso Vegetativo” 3ª Edició. 1983 3. Wilman, Jane Mary, “La amalgama y su influencia sobre el cuerpo humano” València 2004 4. T. Alvaro et al, “La Matriz extracel·lular: de la mecànica molecular al microambiente tumoral” (part II), Revista espanyola de patologia. Ed Elsevier – Doyma. Vol 43, 2010 5. T.Alvaro et al,”La matriz extracel·lular: morfologia, función y biotensegridad.” (part I), Revista espanyola de patologia. Ed Elsevier – Doyma. Vol 42, 2009 6. Wataha, John C, “Pruebas de citotoxicidad para evaluar el rendimiento biológico de aleaciones moldeadas dentales.” Revista Informe Dental, Gener 1998 nº 15 Ed Grupo Espin. 7. Arcilla César “Un diente enfermo amenaza a todo el organismo” Barcelona, desembre 1993 8. Fundació Terra,”Perspectiva ambiental” nº 18 : Electromagnetisme, Barcelna. Abril 2000 9. Ceperuelo, Dolors, “Els etruscs i les primeres pròtesis dentals.” Revista COEC, nº 162, Barcelona 2012. 10. Villa Vigil, Alfonso. Seguridad de las amalgames. Gaceta Dental, 22 Octubre 2009.

11. V. Grill, M A Sandrucci, M Basa [et al]. The influence of dental metal alloys on cell proliferation and fibronectin arrangement in human fibroblast cultures. Archs oral biology. Vol.42 nº 9. 1997 Great Britain. Elsevier science Ltd. 12. John C. Wataha; Norris L. O’Dell; Baldev B. Singh [et al]. Relating Nickel induced tissue inflammation to nickel release in vivo. 2001. 13. J. S. Hayes; I. M. Khan; C. W. Archer; R. G. Richards. The role of surface microtopography in the modulation of osteoblast differentiation. European cells and materials. Vol.20. 2010. 14. Lamia Mutlu-Sagesen; Gulfem Ergun; Erden Karabulut. Ion release from metal-ceramic alloys in three different media. Dental materials journal. 2011. 15. Sachiko Hiromoto. Corrosion of metallic biomaterials in cell culture environment. Electrochemical society interface. 2008.

38

Joan Badal Vidal 16. Grup Sabater Tobella, Espanya [Internet] Barcelona. Ultima actualització: 26/06/2006 [consultat el maig de 2013]. Disponible en: http://www.sabatertobella.com/index.php?id=87&L=0. 17. Asociacion espanyola de afectados por mercurio de amalgames dentales y otras situacions. Espanya [Internet]. [Consultat el maig de 2013]. Disponible en: http://mercuriados.org/es/pag107 18. Conferència del màster en Teràpia Neural. Hospital Sant Joan de Déu, Barcelona, Catalunya. Almudena Martín, Barcelona 2013.

39