Efecto de la producci ón in vitro de embriones en la alteraci ón de la proporci ón de sexos.

Dpto. de Reproduccion Animal y Conserva ción de Recursos Zoogen éticos INIA - Madrid

Preselecci ón del sexo • Porqué es importante? – Económicamente • Producir animales con m éritos genéticos • Progreso gen ético

– Enfermedades ligadas al sexo – Flexibilidad de mercado y manejo

Métodos de presel eccionar el sexo

Manipulación in vivo Separación in vitro de Espermatozoides X e Y

Técnicas de gradientes

Diagnóstico preimplantacional in vitro

Marcadores de superficie

Citometría de flujo Albúmina Percoll Sephadex Swim-up

Antígeno HY Electroforesís

Primera aplicación comercial de la selección preimplantacional de embriones: sexaje de los embriones

Sexaje de e mbriones • Biopsia embrionaria – Aspiración – División mecánica

• Técnicas de diagnóstico – Citológicos – Diferencias metabólicas – FISH – PCR (con o sin electroforesis)

División mecánica

Macho

Hembra

FISH

Sexaje de embriones: análisis por FISH de n úcleos en interfase Cromosoma X

Hembra normal

Cromosoma Y

Cromosoma 16

Macho normal

Resultados de sexaje por FISH

Male Female

Sexaje de e mbriones mediante PCR

Sexaje de e mbriones mediante PCR ( Bry, Sal) M

300 bp 210 bp

1

2

3

4

M

Mecanismos de variaci ón pre-concepcional de la proporción de sexo: Selección de esperma • •

Diferencias en los niveles hormonales de las donantes durante el ciclo pueden seleccionar los espermatozoides X ó Y (James, 1996) El envejecimiento de los ovocitos podría ser responsable de la selección de espermas X ó Y (Dominko et First, 1996)

Procesado del esperma • •

La longevidad diferencial de los espermas X e Y (Aranha and Martin, 1992) Comportamiento diferencial (motilidad/reacción acrosómica) de los espermas X e Y (Gutiérrez-Adán et al., 1999)

Efecto de Sistemas in vitro para el sexo de los embriones produc idos: • Medios de cultivo in vitro

(Gutiérrez-Adán et al., 2001)

– Presencia de glucosa – Momento de la primera división celular

• Momento de i nseminación (Gutiérrez-Adán et al., 1999)

Introducci ón Existe evidencia en distintas especies que indica que los embriones producidos in vitro que alcanzan antes el estadio de blastocisto, aparecen mas machos que hembras, los ejemplos incluyen: Ratón

Embriones in vitro (Blastocistos)

Rápidos = 78.0 % ♂

Trasferidos in vitro (Fetos)

Rápidos = 76.2 % ♂

Embriones in vitro (Blastocistos)

Dia 7 = 60 % ♂

Embriones in vitro (Blastocistos)

Día 6 = ↑ % ♂

Cerdo

Embriones in vivo

Cassar et al, 1994

(fetos-Dia 10)

Rápidos = 73.0 % ♂

Humano

Embriones in vitro Nacimientos

>4 cel al transferir ♂:♀=6:1

Valdivia et al. 1993

Bovino Avery et al., 1992

Ovino Bernardi & Delouis 1996

Pergament et al., 1994

Medios = 57.5 % ♂

Lentos = 42.5 % ♂ Lentos = 25.7 % ♂

Día 8 = 40 % ♂

Día 10 = 33 % ♂ Día 8 = ↓ % ♂

Medios = 45.5 % ♂

Lentos = 17.6 % ♂

Velocidad de d esarrollo e mbrionario in vitro Los blastocistos que se desarrollan rápidos en el cultivo son generalmente considerados "mas viables" y mejores supervivientes a la congelación y a la transferencia, que los que se desarrollan mas despacio (Nedambale et al. 2004).

Medio KSOM

KSOM-SOF

Supervivencia 48 h post congelación (%)

Machos (%)

Hembras (%)

Día: 6

58a

72.7

27.3

Día: 6.5 - 7

34b

84.6

15.4

Día: 7.5 - 8

35b

50

50

Día: 6

46ab

91.6

8.4

Día: 6.5 - 7

72c

67.6

32.4

Día: 7.5 - 8

36b

23.7

76.9

Período de Cultivo

Efecto de la duraci ón de la maduraci ón (16 h: línea azul vs 24 h: línea roja) sobre la tasa acumulativa de divisi ón en cada momento (P