BIOQUIMICA Acta Científica Venezolana, 51: 211–222, 2000

EFECTO DE LOS PROTEOGLICANOS ARTERIALES SOBRE LA OXIDACION IN VITRO DE LDL AISLADA DE PACIENTES HIPERCOLESTEROLEMICOS Luz Barón(1) y Flor López(2) Escuela de Medicina J.M.Vargas. Cátedra de Bioquímica. Universidad Central de Venezuela, Caracas. Venezuela. (2) Centro de Biofísica y Bioquímica. Laboratorio de Trombogénesis. Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas, Caracas. Venezuela. (1)

Recibido: 14/05/99 ; Revisado: 19/07/00 ; Aceptado: 19/09/00 RESUMEN: La interacción de la LDL con proteoglicanos de la matriz extracelular aparentemente contribuye a la acumulación de esta lipoproteína y puede favorecer el proceso aterogénico. La retención de la LDL por los proteoglicanos de la íntima arterial aumenta el tiempo de residencia de la lipoproteina en el tejido, necesario para que eventualmente sea objeto de modificaciones estructurales, hidrolíticas y oxidativas. Si la entrada de la LDL excede la capacidad del tejido para eliminar los productos modificados entonces este proceso podría influir en la aterogénesis. En el presente estudio se exploró si las alteraciones en la LDL, inducidas por proteoglicanos arteriales, modifica la susceptibilidad de la lipoproteina a la oxidación. La LDL aislada de pacientes hipercolesterolemicos se hizo interaccionar con proteoglicanos arteriales y luego se disoció con un tampón de alta fuerza iónica. Esta LDL-PG fue luego sometida al proceso de oxidación catalizada por cobre. Este tratamiento aumento la susceptibilidad a la oxidación de la LDL de los pacientes hipercolesterolemicos casi 8 veces por encima del valor obtenido para los controles. Además las LDL de los pacientes hipercolesterolémicos mostraron tener una mayor afinidad por proteoglicanos arteriales que las LDL de los controles. Palabras clave: Proteoglicano arterial, LDL, oxidación, hipercolesterolemia.

EFFECT OF ARTERIAL PROTEOGLYCANS ON IN VITRO OXIDATION OF LDL ISOLATED FROM HYPERCHOLESTEROLEMIC PATIENTS ABSTRACT: The interaction of LDL with extracellular matrix proteoglycan apparently contribute to the acumulation of apo B-lipoproteins in atherogenesis. Retention of LDL by intima proteoglycans appears to increase the residence time needed for their structural, hydrolytic and oxidative modification. If the rate of LDL entry exceeds the tissue capacity to eliminate the modified products, this process may contribute to atherogenesis. In this study we explored whether alterations of LDL induced by human arterial CSPG alter the lipoprotein susceptibility to copper-catalyzed oxidation. Human LDL was complexed with human arterial CSPG and dissociated by raising the ionic strength. The CSPG-treated LDL was subjected to oxidation by micromolar amounts of copper. This treatment increased LDL susceptibility to oxidation 8 times, as indicated by formation rates of thiobarbituric acid-reacting substances (TBARS). Furthermore, the hypercholesterolemic patients show LDL with significantly higher affinity for arterial proteoglycans than LDL from controls. Key Words: Arterial proteoglycan, oxidation. LDL, hypercholesterolemia.

INTRODUCCION Los altos niveles de LDL circulante en plasma aumentan la probabilidad de acumulación de esta lipoproteina en la matriz extracelular de las arterias, que puede terminar en un proceso proliferativo de la íntima y media, que invade la luz de las arterias musculares y en combinación con procesos trombóticos compromete la función de estos vasos, siendo con frecuencia sus primeras manifestaciones clínicas la cardiopatía isquémica42 , no obstante, los mecanismos moleculares y celulares a través de los cuales se da el proceso no están todavía muy claros. En 1949, ya el fisiopatólogo danés Mogen Faber22 había encontrado que el colesterol transportado en el plasma por las lipoproteínas se localizaba en la íntima arterial unido a glicosaminoglicanos (GAG) del tipo condroitin sulfato (CS) y que esta acumulación podía, de alguna manera, contribuir al desarrollo de la lesión. Actualmente se sabe que todos los GAG que están presentes en la íntima y media arterial son glicoproteínas, conocidas genéricamente como proteoglicanos (PG).

Hollander27 , en 1976, también sugirió que los GAG eran fundamentales para la acumulación en la íntima arterial de las lipoproteínas (LP) que contenían apo B. Por otro lado, estudios inmunohistoquímicos lograron confirmar la localización de la LDL con GAG extracelulares en lesiones ateroescleróticas aisladas de arterias humanas26 y de animales25 . Ahora bien, la localización de la LDL con PG de la íntima arterial no explica porque este fenómeno seria aterogénico, no obstante, la evaluación de las interacciones entre las LDL y los PG arteriales han permitido sugerir que los PG al retener a la LP en la matriz extracelular aumentan el tiempo de residencia de ésta en la íntima, lo que eventualmente favorecería que ocurran modificaciones estructurales13 , hidrolíticas5;29; y oxidativas38 de la LP que, junto con la acumulación de colesterol y sus ésteres, haría que ellas se convirtieran en agentes altamente citotóxicos iniciadores de la respuesta del tejido, que resultaría en una lesión proliferativa de la íntima y media arterial. También Williams y Tabas48 , en 1995, discutieron los conceptos generales de cómo la acumulación de las

212 LP con apo B en la íntima podían contribuir a la aterogénesis y propusieron la llamada “Hipótesis de la respuesta a la retención” en las etapas iniciales del proceso ateroesclerótico. La matriz extracelular de la íntima está constituida básicamente por colágeno, elastina y proteoglicanos. En términos de volumen, más no de peso, los principales componentes de la íntima de las grandes arterias son los PG, los cuales forman una red tridimensional que ocupa aproximadamente el 60% del espacio entre las células endoteliales y la lámina elástica interna, por lo tanto, las oportunidades para que las LP entren en contacto con los GAG de los PG son muy altas. Los PG son un grupo de macromoléculas complejas y diversas que están presentes en todos los tejidos y son sintetizados por todas las células. Estas macromoléculas se encuentran principalmente en cuatro sitios : 1) matriz extracelular, 2) asociadas con membrana y lámina basal, 3) formando parte o asociadas con la membrana plasmática y 4) en estructuras intracelulares tales como gránulos secretores y vesículas sinápticas.46 . Los PG monoméricos están constituídos por cadenas de GAG covalentemente unidos a un núcleo de proteína. Los GAG, a su vez, están formados por unidades repetitivas de disacáridos, integrados por un monosacárido ácido (ácido D-glucurónico o ácido L-idurónico) y un monosácarido básico (D-glucosamina o D-galactosamina). Las unidades básicas son N- acetiladas ó N-sulfatadas en uno de los grupos amino y O-sulfatados en uno de los grupos hidroxilo. La mayoría de los PG existen en forma de agregados que se forman por la asociación, no covalente, de PG monoméricos con el ácido hialurónico, a través de una “proteína de unión” Usualmente un tipo de GAG predomina sobre un núcleo proteico dando origen a cuatro familias principales de proteoglicanos: PG de condroitín sulfato (PGCS), PG de dermatán sulfato (PGDS), PG de heparán sulfato (PGHS) y PG de keratán sulfato (PGKS).La alta densidad de carga negativa presente en las unidades disacáridas de los GAG, los convierte en las macromoléculas más aniónicas de los seres vivos y esto les da una alta capacidad de unión con calcio y les permite interactuar con muchas proteínas que tengan aminoácidos cargados positivamente como lisina y arginina. En los vasos sanguíneos se han identificado 3 familias principales de PG que son : PGCS, PGDS y PGHS. Datos histoquímicos e inmunocitoquímicos indican que estas familias están distribuidas de manera diferencial en la pared arterial. Por ejemplo, un enorme PGCS llamado versicán, está presente en la matriz extracelular y son considerados los PG más abundantes de la íntima arterial. Luego existen dos PG pequeños, llamados decorín y biglycán, que son básicamente PGDS los cuales están unidos a las fibras de colágeno y un PGHS, llamado perlecán, que está presente en la membrana basal, asociado con fibras de elastina. y también con membrana plasmática46 . La íntima normal y las regiones con predisposición al desarrollo de la lesión, son inicialmente ricas en PGCS, es decir, en versicán y el contenido de este PG aumenta a

Barón y López

medida que avanza el desarrollo de la lesión. Una característica que se observa en los inicios de la ateroesclerosis y en la etapa avanzada, es la acumulación de PG en las lesiones de la íntima que puede predisponer a la pared arterial a la acumulación de lípidos, a la calcificación y a la trombosis en virtud de la habilidad que tienen estos PG de interactuar con componentes moleculares implicados en estos procesos46 . No obstante, todavía no está claro por qué los PG se acumulan y que efectos específicos tienen estas moléculas sobre eventos asociados con la patogénesis de esta enfermedad. Lo que sí se ha observado es que hay una situación especial en los sitios donde hay lesiones que se ha llamado la focalización de la lesión, donde no sólo hay una mayor tendencia al desarrollo de la lesión, sino que hay características propias del sitio que tienen que ver específicamente con la composición de los PG que se sintetizan y se secretan en esas zonas, que por lo general son PGCS43 . Ahora bien, no hay ningún modelo experimental que permita obtener el desarrollo de un proceso aterogénico si no hay, previamente, una modificación de la LDL o una anormalidad en el metabolismo de esta LP. La acumulación de las LP con apo B, inicia el proceso y sin este paso inicial es poco probable que se desarrolle un proceso aterogénico. Trabajos pioneros9;32; indican que las LP con apo B interactúan con PG a través de la asociación de los grupos sulfato de los GAG, cargados negativamente, y las cargas positivas de la lisina y la arginina de la apo B. Hoy en día se ha podido establecer que la interacción de la LDL con PG arteriales, induce alteraciones estructurales en la LP que permanecen después de la disociación del complejo. A baja fuerza iónica, y a concentraciones de calcio y pH fisiológico, la LDL forma agregados con versicán arterial que pueden ser disociados en los componentes solubles al elevar la concentración de NaCl. 28 . Aunque la LDL solubilizada no muestra signos de agregación, no obstante, varias modificaciones estructurales son introducidas por efecto de la interacción, entre ellas, una disminución en la organización del núcleo y de la monocapa de la LP y un aparente aumento en la exposición de péptidos conteniendo arginina y lisina y un aumento en la susceptibilidad a la oxidación15;36; . La LDL oxidada ha sido aislada del compartimiento extracelular de lesiones humanas, por lo tanto, la modificación oxidativa de la LDL mediada por radicales libres debe tener lugar en la intima extracelular8 . Los resultados obtenidos de pacientes con enfermedad coronaria aguda y sujetos con isquemia coronaria crónica, demuestran que los pacientes que sufrieron un infarto del miocardio antes de los 50 años, presentaban una LDL con alta afinidad por PGCS14;34; Esta alta afinidad de la LDL por PGCS, parece estar asociada con subclases de LDL enriquecidas en partículas con alto PI y bajo contenido de triglicéridos (TG). El fraccionamiento de la LDL por su afinidad a versicán o por centrifugación en gradiente, confirmó que las partículas con mayor afinidad eran más pobres en lípidos polares en la superficie y eran más pequeñas, densas y básicas que aquellas que presentaban baja afinidad28 .

213

Proteoglicanos arteriales

col2;3;

encontraron que LDL peRecientemente Anber y queña y densa aislada de pacientes con hipertrigliceridemia moderada y baja HDL, definida como el “fenotipo lipoproteico aterogénico” , presentaba alta afinidad por PGCS aislados de arteria humana. Los autores sugirieron que esta propiedad podría explicar en parte, el aumento de riesgo de enfermedad coronaria asociada con este fenotipo. No esta claro aún como se determinan muchas de las propiedades estructurales que modulan la afinidad de la LDL por PGCS, pero sí se ha observado que la dieta y ciertas drogas pueden modificar estas propiedades. Cuando a los sujetos se les cambia de una dieta rica en aceite de oliva a una dieta rica en aceite poliinsaturado, se incrementa el tamaño de la LDL y disminuye la afinidad, in vitro, por versicán arterial19 . Ciertas drogas que disminuyen los niveles de LP con apo B, por ejemplo simvastatina, y gemfibrozil, también disminuyen la afinidad por el PG arterial, por lo que se sugiere que parte de la acción antiaterogénica de estas drogas puede estar asociada con un disminución de la actividad de atrapamiento de la LDL por los PG de la íntima47 . La evidencia presentada a lo largo de esta revisión sugiere, que la LDL al llegar a la íntima arterial entra en contacto con componentes de la matriz extracelular, específicamente PG, que interactúan con la LP y pueden retenerla favoreciendo así cambios en la LDL, entre los cuales estarían los procesos oxidativos que las harían potencialmente más aterogénicas. Con base en estas consideraciones, se podría pensar que pacientes con hipercolesterolemia, debido a sus elevadas concentraciones de LDL en plasma, podrían tener una mayor entrada de esta LP a la matriz extracelular, que aumentaría la posibilidad de interacción con los proteoglicanos presentes allí y esto a su vez potenciaría los procesos oxidativos que producirían cambios en la LP, haciendo que estos pacientes presenten una mayor predisposición a sufrir un proceso aterogénico. En el presente trabajo se establecieron los siguientes objetivos : 1. Aislar y caracterizar la LDL de los pacientes y de los controles. 2. Determinar su afinidad por PG extraídos de aorta humana. 3. Evaluar la susceptibilidad de la LDL a la oxidación antes y después de ser tratadas con PG arteriales. MATERIALES Y METODOS Sujetos. Se utilizaron donantes de uno u otro sexo cuyas edades oscilaron entre 35 y 60 años. Los 15 controles fueron seleccionados entre sujetos que tenían un perfil lipídico normal, un rango de edades semejante a la de los pacientes y se consideraban clínicamente sanos Los 40 pacientes hipercolesterolémicos se seleccionaron utilizando los

datos suministrados por el Programa Nacional de Educación sobre el Colesterol realizado en Estados Unidos23 , el cual informó de una guía sobre los rangos de valores establecidos para la detección, evaluación y tratamiento de la enfermedad. Algunos pacientes presentaban además hipertrigliceridemia moderada (30%), hipertensión (30%), fumadores (25%) y algunos ya habían presentado una enfermedad cardíaca (30%).No se observaron diferencias en cuanto al peso entre los controles y los pacientes. Análisis de las muestras. La sangre obtenida de los donantes se extrajo después de un ayuno de 14 horas y se colectó en tubos que contenían una solución anticoagulante compuesta por ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0.1% (p/v), Thimerosal 0.1% (p/v) y fluoruro de fenil metil sulfonilo (FFMS) 0.2 mM. El plasma se separó centrifugando a 3.000 r.p.m. durante 30 minutos, a temperatura ambiente, El sobrenadante (plasma), fue colectado y guardado a 4Æ C hasta el momento de su uso. Se determinaron las concentraciones de colesterol total, colesterol de la LDL, colesterol de la HDL y triglicéridos mediante el uso de los Kit de Wiener Lab 45 . La concentración de proteínas se determinó por el método de Bradford 12 y la determinación de ácidos urónicos presentes en los PG se realizaron por los métodos de Bitter y Muir11 . Preparación de las lipoproteínas de baja densidad. Las lipoproteinas de baja densidad (LDL) se aislaron del plasma de los donantes por ultracentrifugación en gradiente de densidad siguiendo el método de Redgrave y col. 40 y los 2 ml de LDL obtenidos se guardaron a 4Æ C , en presencia de KBr, por no más de una semana. En el momento de ser utilizadas las LDL se pasaron a través de columnas de exclusión molecular PD - 10 para eliminar el KBr y se equilibraron con tampón hepes de baja fuerza iónica constituido por 5 mM Hepes, 20 mM NaCl, 4 mM CaCl2 y 2 mM MgCl2 p.H 7.2, llamado tampón A. Preparación de los proteoglicanos El proteoglicano rico en condroitin sulfato (PGCS), hoy en día conocido como versicán, fue aislado de segmentos de íntima-media de aorta humana obtenidas en la Medicatura Forense del Instituto de Medicina Legal, durante la autopsia de individuos fallecidos por causas accidentales. El procedimiento de purificación y caracterización de los proteoglicanos utilizados ha sido ampliamente descrito por Camejo y col15 . Interacción de la LDL con PG arteriales. Para evaluar la reactividad de las LDL por el PG arterial, se utilizó el método establecido en 1992 por Camejo y col17 el cual denominó test de afinidad, para ello se coloca en tubos cónicos de polialómero con tapa 1 ml de PG, que tiene 10 xxx*g / ml de hexuronato y 100 xxxml de LDL que contiene 40 xxx*g de proteína /100 xxx*l. Los tubos se agitan fuertemente en vortex y se incuban durante 1 hora a 4Æ C,

214 luego se centrifuga a 10.000 r.p.m., por 10 minutos. El sobrenadante es descartado y el sedimento, conteniendo el complejo LDL-PG, se lava agregando 1 ml de tampón A y centrifugando nuevamente por 5 minutos. El sobrenadante es descartado y el sedimento es resuspendido en 100 *l de tampón de alta fuerza iónica, denominado tampón B, constituido por 5 mM Hepes, 150 mM NaCl, 4 mM CaCl2 y 2 mM MgCl2 p.H 7.2. A este sedimento resuspendido se le determina el contenido de colesterol, por el método de Wiener Lab.45 y de esta forma, se obtiene la cantidad de LDL que fue precipitada por el PG. Cada muestra fue corrida por duplicado y un tubo con tampón A fue usado como blanco de la reacción. Los resultados se expresaron en *g de colesterol insolubilizado y también en porcentaje (%). Oxidación de la LDL nativa. El método del ácido tiobarbitúrico (TBA) es uno de los más usados para determinar la peroxidación lipídica, en el cual se forma un cromógeno de color rosado que es medido a una longitud de onda de 532 nm. La susceptibilidad de la LDL a la modificación oxidativa fue evaluada por incubación de la LDL con cobre y el grado de oxidación fue analizado en función de la tasa de aparición de sustancias reactivas con el ácido tiobarbitúrico (TBARS) producidas en cada período de incubación. La oxidación de la LDL se realiza en placas de microanálisis siguiendo el método de Camejo y col18 , donde 100 xxxml de LDL con una concentración de proteínas de 20 xxxmg / 100 xxxml ( 0.2 mg / ml) se incuban con 10 xxxml de CuSO4 55 xxxmM en tampón A. Las placas se colocan en baño oscilante a 37 Æ C y la oxidación se detiene a distintos períodos de tiempo de 30, 60, 120 y 240 minutos agregando 10 ml de hidroxitolueno butilado (BHT) 1mM. La evaluación colorimétrica del TBARS formado se realiza en la misma placa usando un lector óptico. Una curva estándar con diferentes concentraciones de 1,1,3,3, de tetrametoxipropano fue incluida en cada placa y los resultados fueron expresados como nanomoles de TBARS / mg de proteina de LDL. Las determinaciones para cada LDL en cada tiempo se realizaron por triplicado y se calculó un promedio. Oxidación de la LDL previamente tratada con el PG arterial. Para evaluar el efecto de los PG sobre la oxidación de la LDL se utilizó el procedimiento seguido en el test de afinidad, es decir, primero se hizo interactuar a la LDL con el PG y luego este complejo LDL-PG solubilizado en tampón B fue sometido al proceso de oxidación. Para ello el complejo LDL-PG se ajustó a una concentración de proteínas de 0.2 mg / ml y se colocaron 100 xxx*l de este LDLPG ( 20 xxx*g prot/100 xxx*l), en cada pozo de la placa de microanálisis y se sometió al proceso de oxidación, siguiendo el mismo esquema utilizado para la oxidación de la LDL nativa.

Barón y López

Análisis estadístico. Los resultados obtenidos fueron presentados como la media aritmética de los valores individuales obtenidos para los 40 pacientes y los 15 controles * la desviación estándar. Algunas diferencias entre grupos fueron expresadas como porcentaje. Para comparar los resultados obtenidos entre los grupos control y los pacientes se aplicó la prueba t de Student. El criterio de significación estadística fue del 1% (p < 0.01). Para el análisis de las correlaciones se utilizó el mismo criterio de significación con un coeficiente de regresión mayor o igual a  0.5 (r >  0.5). RESULTADOS Las características de los sujetos en estudio se presentan en la tabla NÆ I, donde se observa que los controles tienen un perfil lipídico normal y los pacientes son hipercolesterolémicos, con un promedio de colesterol de 280 mg /100 ml, un alto nivel en la concentración de colesterol de la LDL, con un promedio de 178 mg /100 ml, un bajo nivel de colesterol de la HDL ubicado en un promedio de 30 mg /100 ml, lo cual ya representa un factor de riesgo importante y una concentración promedio de triglicéridos de 185 mg /100 ml. Todos los resultados fueron correlacionados entre sí y sólo se encontró una correlación significativa (r=0.9) entre el colesterol total y el colesterol presente en la LDL, lo cual indicaba que los altos niveles de colesterol total en los pacientes se encontraban reflejados en los altos niveles de colesterol transportados por la LDL. También se analizaron los índices que se obtienen de las relaciones colesterol total / colesterol HDL, considerado de alto riesgo cuando es > 7 y la relación colesterol LDL / colesterol HDL, de alto riesgo con valores > 5. La evaluación indica que los controles muestran índices en rangos normales, mientras que, los pacientes presentan índices de colesterol total / HDL colesterol. de 8.55  1.12 y de LDL colesterol. / HDL colesterol. de 6.90  1.10, es decir, que estos pacientes pueden ser considerados como pacientes de alto riesgo, con predisposición a sufrir aterogénesis y presentar una enfermedad arterial coronaria1 . La reactividad de las distintas LDL por el PG arterial extraído de aorta humana aparece cuantificado en la tabla NÆ II, donde se demuestra que existen diferencias significativas entre los controles y los pacientes con respecto al colesterol precipitado por el PG (p < 0.001). El PG arterial precipitó el 17 % del colesterol de las LDL de los controles y fue capaz de precipitar el 38 % del colesterol de las LDL de los pacientes, es decir, las LDL extraídas del plasma de los pacientes hipercolesterolémicos mostraron mayor afinidad por el PG arterial que las LDL extraídas de los controles. La susceptibilidad a la oxidación catalizada por cobre de las LDL nativas, es decir, sin ser tratadas con el proteoglicano arterial se presenta en la tabla NÆ III donde se observa, que a mayor tiempo de incubación de la LDL con el cobre, mayor es el grado de oxidación de éstas, hasta

215

Proteoglicanos arteriales Tabla I. Niveles lipidicos en plasma de controles y pacientes Controles (N = 15)

Pacientes (N = 40)

 21.0 138.0  59.0 106.0  29.0 40.0  8.0 4.1  1.1 2.5  1.2

Significado Estadístico

 47.0 p < 0.0001 TRIGLICERIDOS (mg / dl) 185.0  83.0 p < 0.02 LDL COLESTEROL (mg / dl) 178.0  49.0 p < 0.0001 HDL COLESTEROL (mg / dl) 30.0  6.0 p < 0.0001 COL Total / HDL colest. 8.5  1.1 p < 0.0001 LDL Colest. / HDL Colest. 6.9  1.1 p < 0.003 Los valores representan la media  la desviación estándar.

COLESTEROL (mg / dl)

166.0

Pacientes (N = 40)

 47.0 185.0  80.0 178.0  49.0 30.0  6.0 8.5  1.1 6.9  1.1

280.0

280.0

Tabla IV. Oxidación de la LDL previamente tratada con el proteoglicano arterial a diferentes periodos de tiempo. Tabla II. Colesterol de la LDL precipitado por un proteoglicano arterial Controles (N = 15) 6.8 COLESTEROL PRECIPITADO (g) * COLESTEROL PRECIPITADO (%) **

 1.2 17

Pacientes (N = 40)

Significado Estadístico

 1.25

p < 0.001

38

p < 0.001

15.2

* Representa la cantidad absoluta de colesterol de la LDL precipitada durante la incubación con el proteoglicano arterial (PG).La media la desviación estándar. * Representa la cantidad de colesterol de la LDL precipitada por el PG, expresada como porcentaje del colesterol total de LDL agregado al medio de incubación.



Tabla III. Oxidación de la LDL nativa de controles y pacientes a diferentes períodos de tiempo.

Tiempo (Minutos)

30

 DE 42

X Controles (N=15)* Pacientes (N=40)*

8

3

60

 DE 10  4

X

14

5

120

 DE 14  4

X

40

5

240

 DE 14  4

X

60

6

Significado p < 0.0001 p < 0.0001 p < 0.0001 p < 0.0001 estadistico * (nmoles Tbars/mg prot.). Los valores de sustancias reactivas con el ácido tiobarbitúrico (TBARS) representan el promedio de determinaciones realizadas por triplicado a controles y pacientes.

Tiempo (Minutos)

30

60

120

240

  

  

  

  

X DE X DE X DE X DE Controles 8 4 14 5 18 4 19 3 (N=15)* 27 5 148 14 165 15 Pacientes 14 4 (N=40)* Significado p < 0.0001 p < 0.0001 p < 0.0001 p < 0.0001 estadistico * (nmoles Tbars/mg prot.). * Los valores de sustancias reactivas con el ácido tiobarbitúrico (TBARS) representan el promedio de determinaciones realizadas por triplicado a controles y pacientes.Expresado como la media la desviación estándar.



que la formación de TBARS se estabiliza y es la misma aunque el tiempo de incubación sea mayor. En la figura NÆ 1 se observa que en los controles a los 60 minutos se forman 10 nanomoles de TBARS y el proceso de oxidación se estabiliza a partir de los 120 minutos donde se forman 14 nanomoles de TBARS / mg de proteína, al igual que a los 240 minutos. En los pacientes la formación de TBARS es mayor que en los controles, en todos los períodos de tiempo, a los 120 minutos la diferencia se hace más significativa y a los 240 minutos se alcanza la máxima oxidación de la LDL con la formación de 60 nanomoles de TBARS / mg de proteína, ya que, después de este tiempo el valor es el mismo. El análisis de estos resultados indica que la oxidación de la LDL nativa de los pacientes a los 120 minutos, es casi 3 veces la de los controles y a los 240 minutos la oxidación es más de cuatro veces la observada en los controles. Estos valores fueron los encontrados en una investigación previa realizada por nuestro laboratorio7 . En ese momento se consideró importante evaluar como se modificaría la susceptibilidad a la oxidación de las LDL aisladas de controles y pacientes si previamente esta LDL era tratada con el PG arterial (LDL-PG) y los resultados se presentan en la tabla NÆ IV, donde se aprecia nuevamente que a medida que el tiempo de incubación de la LDL con el cobre es mayor el proceso de oxidación también es mayor,

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Barón y López

Figura 1. Nivel de oxidación de la LDL nativa de controles y pacientes a diferentes períodos de tiempo, donde se observa que la oxidación de los pacientes a los 120 minutos es casi 3 veces la de los controles y a los 240 minutos es 4 veces mayor que la de los controles.

hasta que la formación de TBARS se estabiliza. Pero en este caso se observa que el tratamiento previo de la LDL con el PG, hace que la predisposición a la oxidación sea mayor, tanto en los controles como en los pacientes En la figura NÆ 2 se compara el grado de oxidación de las LDL-PG de controles y pacientes, a los distintos períodos de tiempo. Al analizar las LDL-PG de los controles se observa que a partir de los 120 minutos el proceso de oxidación se estabiliza y la formación de TBARS se ubica en 19 nmoles de TBARS / mg de proteína, mientras que, en el caso de las LDL-PG de los pacientes la formación de TBARS es mayor que en los controles, en todos los períodos de tiempo, a los 120 minutos la diferencia se hace mucho más significativa y a los 240 minutos se estabiliza en 165 nmoles TBARS / mg de proteína, ya que después de este tiempo el valor no cambia. Estos resultados indican que la susceptibilidad a la oxidación de las LDL-PG de los pacientes fue más de 8 veces la observada en las LDL-PG de los controles, es decir, que la LDL de los pacientes ya tenía predisposición a la oxidación en su forma nativa, pero cuando estas LDL entraron en contacto con los PG arteriales antes de ser sometidas a la oxidación, esta susceptibilidad aumentó considerablemente. En la figura NÆ 3 se presenta de manera comparativa y resumida la oxidación de la LDL nativa y LDL tratada con PG (LDL-PG) de controles y pacientes, a tres diferentes períodos de tiempo (60, 120 y 240 minutos). Si se comparan entre sí la oxidación de las LDL de los controles en

su forma nativa y tratada con el PG (LDL-PG), se observa que las LDL-PG de los controles muestran un nivel de oxidación mayor (19 nmoles de TBARS/mg de proteína) que las LDL nativas (14 nmoles de TBARS/mg de proteína) aunque la diferencia es muy pequeña, poco significativa. En cambio cuando se compara entre sí la oxidación de las LDL de los pacientes en su forma nativa y tratada con el PG ( LDL-PG), se observa que la LDL-PG de los pacientes muestra un grado de oxidación mucho mayor (165 nmoles de TBARS/mg de proteína), que cuando se encuentra en forma nativa (60 nmoles de TBARS / mg de proteína). Esto demuestra que en los pacientes la interacción previa de la LDL con PG arteriales, aumenta dramáticamente la susceptibilidad de la LDL a la oxidación. DISCUSION La determinación de los niveles de lipoproteínas circulantes en plasma es importante ya que existe una relación directa entre altos niveles de colesterol y la enfermedad arterial coronaria. No obstante, esta evaluación puede, sólo en parte, predecir el progreso clínico de una enfermedad cardíaca o de la ateroesclerosis. En este sentido, Krauss y col33 estudiaron la estructura de la LDL con el objeto de obtener una visión más completa de los factores que podían contribuir a la enfermedad y sus resultados permitieron plantear que, además de los altos niveles de la LDL en plasma, los factores estructurales y las interac-

Proteoglicanos arteriales

217

Figura 2. Nivel de oxidación de las LDL de controles y pacientes previamente tratadas con proteoglicanos arteriales, a diferentes períodos de tiempo, donde se aprecia que la oxidación de los pacientes a los 240 minutos es 8 veces la de los controles.

Figura 3. Comparación entre la oxidación de la LDL nativa y la LDL tratada con proteoglicanos arteriales (LDL-PG) de controles y pacientes a tres diferentes períodos de tiempo (60,120 y 240 minutos).

218 ciones de esta LP con componentes de la pared arterial, pueden desempeñar un papel aún más fundamental en el desarrollo de la enfermedad. Avila y col4 , en 1978, encontraron que un PG rico en condroitín sulfato, aislado de íntima-media de aorta humana, era capaz de formar, in vitro, cantidades diferentes de complejo insoluble con LDL proveniente del suero de distintos sujetos. Cuando analizaron estas LDL encontraron que, aquellas que mostraban gran afinidad por el PG tenían una relación colesterol/proteína elevada y un alto punto isoeléctrico Así que, la reactividad diferencial que presentaban las LDL por los PG se atribuyó a diferencias en la composición lipídica y en el punto isoeléctrico de éstas LP. El PG aislado de aorta humana y usado en este estudio, permitió evaluar si las LP aisladas de controles y pacientes presentaban una afinidad diferencial por el PG. Nuestros resultados demostraron que la LDL extraída de pacientes hipercolesterolémicos presentaba mayor afinidad por estos PG que la LDL de los controles y se ubicó en valores de 15.20 xxxmg de colesterol insolubilizado  1.25. Igualmente se estableció que la relación colesterol total / proteína era de 4.46  1.9, mucho mayor que la que presentaba el grupo control que se ubicó en 2.29 1.2, lo cual estaba de acuerdo con los resultados encontrados previamente por Avila y col4 y que se relacionaban con una mayor afinidad de la LDL por el PG. Por otro lado, estudios realizados por Linden y col34 demostraron que la LDL aislada del plasma de individuos que habían sufrido un infarto del miocardio tenían una mayor afinidad por PG arteriales que los controles y encontró valores de 21.7 xxxmg de colesterol insolubilizado  5, lo cual significa que la reactividad de los pacientes infartados del estudio de Linden fue aproximadamente 1.5 veces mayor que la de nuestros pacientes. Estos valores más bajos, encontrados en nuestros pacientes, pueden deberse al hecho de que nuestra evaluación se hizo con LDL mientras que Linden utilizó suero y esto probablemente incrementa los valores ya que pueden quedar atrapadas en el complejo otras LP como VLDL. No obstante, se considera muy significativo que la reactividad presentada por la LDL aislada de los pacientes hipercolesterolémicos fuera mayor que la observada en los controles y se podría sugerir que la LDL de estos pacientes ya comienza a mostrar una mayor afinidad por PG arteriales, sin llegar a igualar la que presentan los pacientes que ya han sufrido un infarto. También se puede sugerir que niveles elevados de LDL con alta reactividad incrementaría la probabilidad de formación de complejos con PG de la íntima arterial que podría contribuir al inicio y desarrollo de la lesión ateroesclerótica. Estos resultados indican que hay diferencias en la afinidad de la LDL por PG arteriales, pero no discrimina si la alta reactividad fue causada por la abundancia de una subclase especial de partículas de LDL. Esto es importante señalarlo ya que se ha demostrado que dentro de una misma LDL existen subclases con diferente reactividad por el PG arterial, lo cual también fue puesto en evidencia

Barón y López

col4

por Avila y quienes demostraron que subfracciones de LDL con alta afinidad por el PG eran más densas y más electropositivas que aquellas con baja afinidad. Un estudio más detallado sobre la correlación entre composición y estructura de las subclases de LDL y su afinidad por el PG fue realizado por Hurt-Camejo y col30 donde claramente se demostró que la fracción con mayor afinidad por el PG tenía una menor cantidad de lípidos totales con un alto porcentaje de ésteres de colesterol. No obstante, la propiedad más interesante observada fue que el área ocupada por los lípidos polares, fosfolípidos y colesterol estaba inversamente relacionada con la afinidad por el PG. Así, las partículas con mayor afinidad deben tener 20 a 30% más área accesible para el otro componente de superficie que es la apo B100. Debido a que el volumen y por consiguiente el área del núcleo no polar no es muy diferente entre las subclases, el área disponible para la apo B100 aparece como la principal diferencia. Recientemente McNamara y col37 analizaron subfracciones de LDL obtenidas por ultracentrifugación diferencial y concluyeron que la LDL con menor tamaño y mayor densidad, tiene menos núcleo no polar cubierto por la monocapa de fosfolípidos y colesterol y propusieron que en esta LDL más pequeña y densa, con mayor afinidad por el PG, la apo B100 posiblemente se vuelve un mejor ligando para los GAG porque dos o mas segmentos positivos coalescen en la superficie de la partícula y quedan más expuestos los residuos de arginina y lisina que se unirían con mayor afinidad al PG arterial. Se sugiere que una LDL grande en la cual la apo B100 está más extendida, estos sitios cargados positivamente estarían más separados mientras que en la LDL pequeña y densa, la apo B100 tendría la región conteniendo los segmentos de unión más juntos y expuestos 31 . La secuencia de la apo B100 que une a los GAG, se ubica entre los aminoácidos 3359-3367, la cual esta contenida en el segmento ubicado entre 3359-3369 que Baren y col 6 recientemente identificaron como la región de unión del receptor de la LDL. Estos autores también propusieron que cambios en la composición lipídica de la LDL puede exponer más los segmentos de unión 3359-3369, por lo tanto, cambios en el empaquetamiento de la superficie de la partícula puede alterar la exposición de las regiones de unión de los GAG y del receptor. En nuestro estudio es posible que la mayor afinidad presentada por las LDL de los pacientes se deba a algunas de estas consideraciones, bien que la LDL de los pacientes sea mas pequeña y densa lo cual facilite que ella presente una mayor afinidad por el PG o que esta LDL esté enriquecida en una cierta subclase de partículas, que también presenten estas características y que haga que la LDL como un todo presente una mayor afinidad. También es posible suponer que esta mayor afinidad se deba a cambios en la composición lipídica de las LDL producto de la hipercolesterolemia o que sea consecuencia de una VLDL grande enriquecida en triglicéridos, que al ser procesada por la lipasa lipoproteica da origen a una LDL pequeña y densa con más afinidad por el PG.

Proteoglicanos arteriales

Paralelamente, otros autores han establecido que puede ocurrir modificación oxidativa de la LDL en la pared arterial lo que contribuiría al desarrollo de la lesión ateroesclerótica. Algunas evidencias que apoyan esta hipótesis fueron presentadas por Haberland y col24 y Palinski y col39 , quienes, utilizando técnicas inmunológicas demostraron la presencia en lesiones ateroescleróticas de LDL modificada oxidativamente. La oxidación de la LDL es un proceso de peroxidación lipídica en la cual los ácidos grasos insaturados de la LDL, son transformados en hidroperóxidos lipídicos y luego convertidos en ciertos aldehídos, capaces de neutralizar cargas positivas presentes en la apoproteina B, por lo cual la apo B deja de ser reconocida por el receptor de la LDL y comienza a ser reconocida por el “receptor recolector” presente en los macrófagos, que se cargan con colesterol y finalmente se transforman en células espumosas, las cuales son consideradas como la fase inicial del proceso aterogénico. Si la incubación de macrófagos se hace con niveles fisiológicos de LDL normal, no se produce en ellos ni acumulación de lípidos ni su transformación en células espumosas, por lo que se considera que es indispensable la modificación de la LDL para que pueda ser tomada por los macrófagos, como podría ser la modificación oxidativa de la LP La evaluación de la susceptibilidad a la oxidación de las LDL aisladas de los pacientes hipercolesterolémicos demostraron que en todos los períodos de tiempo de oxidación ( 30, 60, 120 y 240 minutos), a los cuales fueron sometidas estas LDL, la oxidación siempre fue mayor en los pacientes que en los controles, ubicándose en valores de 3 y 4 veces por encima de los encontrados para los controles. Actualmente, no se conoce con precisión la razón de la marcada diferencia en el grado de oxidación entre muestras de LDL sometidas a las mismas condiciones oxidativas, no obstante, se piensa que la diferencia se debe a variaciones en la composición de la LDL como contenido de antioxidantes, donde se considera que la vitamina E y A constituyen la primera defensa contra la oxidación y dependiendo de su concentración en la LDL esta tendrá mayor o menor predisposición a la oxidación21 , variabilidad en la composición de ácidos grasos donde hay resultados contradictorios pero donde se aprecia que dietas ricas en ácidos grasos monoinsaturados hacen que las lipoproteinas que lo contengan sean resistentes a la oxidación 44 y a factores estructurales donde se ha establecido que subespecies de LDL pequeñas y densas muestran mayor susceptibilidad a la oxidación16 . En este sentido, ya en 1993, Chait y col20 habían encontrado que sujetos hipercolesterolémicos donde predomina la LDL pequeña y densa, muestran una mayor susceptibilidad a la modificación oxidativa y un riesgo mayor a sufrir una enfermedad coronaria. También los estudios realizados por Regnstrom y col41 demostraron que la oxidación de la LDL de sujetos hipercolesterolémicos producía una disminución de la afinidad de la LDL por su receptor y un incremento de su incorporación en los macrófagos a tra-

219 vés del receptor “recolector” . Ahora bien, una vez demostrado que la susceptibilidad a la oxidación de la LDL de pacientes hipercolesterolémicos es mayor que la que presentan los controles, el siguiente paso fue verificar cómo sería el comportamiento si estas mismas LDL eran tratadas previamente con PG arteriales (LDL-PG) y luego sometidas al proceso oxidativo. Nuestros resultados demostraron que las LDL-PG de pacientes y controles fueron siempre oxidadas en mayor proporción que las LDL nativas siendo la oxidación de las LDL-PG de los pacientes más de 8 veces la de los controles. Camejo y col17 han informado que la interacción de la LDL con los PG induce un incremento en la exposición de regiones de la apo B-100 ricas en lisina y arginina, por lo que el PG puede potenciar la modificación de estos residuos durante la oxidación de la LDL, ya que la oxidación produce ciertos aldehídos capaces de neutralizar las cargas positivas presentes. Esto ha sido confirmado por estos mismos investigadores los cuales han encontrado que la LDL, previamente tratada con el PG y luego sometida al proceso de oxidación, presenta, a pH fisiológico, una carga neta más negativa que la LDL nativa. Aunque no se conoce con exactitud cuál es el cambio estructural que podría ser responsable del incremento en la susceptibilidad a la oxidación de estas LDL tratadas con el PG, Mateu y col36 utilizando difracción de rayos X, y Bihari Varga10 , mediante scanning diferencial calorimétrico, demostraron que la interacción de la LDL con los PG provoca una pérdida en la organización del corazón lipídico de la LP formado por triglicéridos y ésteres de colesterol y un incremento en la susceptibilidad a la proteólisis de la apo B. Estos autores sugirieron que el tratamiento de la LDL con PG permite obtener una estructura de la LP más abierta la cual parece tener más sitios de unión para el cobre. En trabajos posteriores Camejo y col15 sugirieron que los PG crean una serie de cambios estructurales en la LDL que producen un aumento aparente en la afinidad de la LDL por el cobre, el cual tendría acceso a regiones internas de la apo B100 donde este metal podría catalizar la formación de radicales peróxido en los ácidos grasos poliinsaturados modificando así a la LDL. Si los PG inducen modificaciones en la LDL que aumentan la afinidad de ésta por el cobre favoreciendo su oxidación, entonces se podría pensar que los PG también contribuyen a la modificación oxidativa de la LDL en la matriz extracelular, lo cual aumentaría la captación de esta LDL modificada por los macrófagos, produciendo su transformación en células espumosas. Todas las evidencias sugieren que la LDL que se ubica en un rango de densidad entre 1.019 a 1.063 g / ml es una población heterogénea de partículas y que el versicán arterial tiene máxima afinidad por partículas de LDL densas, básicas (mayor PI), con el más alto contenido relativo de apo B-100 y el más bajo contenido de fosfolípidos (FL) y colesterol libre (CL) en su monocapa superficial. Se sugiere entonces que, debido al área superficial mas pequeña de la partícula, cubierta por regiones de apo B100 mas

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positivas, estas partículas se vuelven mas accesibles para la asociación con el PG, el cual posiblemente selecciona estas partículas más pequeñas entre toda la población heterogénea de partículas y ellas pueden ser entonces más susceptibles a las alteraciones estructurales inducidas por los PG. Estas LP con alta afinidad por PG aumentan su tiempo de residencia en la matriz extracelular de la íntima con la formación de complejos permanentes o transitorios y esto proporciona la oportunidad para modificaciones estructurales, hidrolíticas y oxidativas de la LP que finalmente pueden terminar con procesos inflamatorios y degenerativos característicos de la aterogénesis. Las alteraciones en los perfiles lipídicos pueden ser controlados con drogas y regímenes alimentarios que lleven a reducir la cantidad de LDL circulante en plasma, reduciendo igualmente la que llega a la íntima. Otra posible acción antiaterogénica sería la disminución de la susceptibilidad de la LDL a la oxidación. Existen evidencias indirectas que relacionan el aumento de la resistencia a la oxidación con una disminución de las manifestaciones clínicas de la aterogénesis. Estas evidencias han sido aportadas por un estudio prospectivo, de más de 10 años de seguimiento, realizado en Norteamérica, en más de 80.000 mujeres donde se observó que en el grupo con la ingesta más alta de betacarotenos y vitamina E había una disminución del 40% en la incidencia de enfermedades coronarias respecto al grupo con menor ingesta de estos antioxidantes naturales.35 . Desde un punto de vista clínico y epidemiológico se podría pensar que un mejor desarrollo y aplicación de las técnicas usadas en este estudio, podrían ser utilizadas para evaluar distintos tipos de pacientes y que además se pudieran analizar los efectos de las dietas, drogas y antioxidantes con el objeto de identificar mecanismos que pudieran servir como indicativos de la predisposición

de la población a sufrir enfermedades arteriales coronarias y por lo tanto poder establecer medidas de prevención para disminuir la aparición de la enfermedad en la población sana. CONCLUSIONES 1.- En el presente trabajo se demostró que las LDL aisladas de pacientes hipercolesterolémicos mostraron una mayor afinidad por PG arteriales aislados de íntima - media de aorta humana y una mayor susceptibilidad a la oxidación que las LDL de los controles, por lo que las LDL deben ser consideradas como una familia de partículas heterogéneas con características muy propias en cuanto a su composición lipídica, tamaño y densidad, que podrían ser las responsables de la afinidad diferencial que muestran cuando se unen con PG arteriales. 2.- Las LDL de los pacientes hipercolesterolémicos que, antes de ser sometidas a la oxidación, se hicieron interaccionar con los PG arteriales mostraron mayor susceptibilidad a la oxidación que las LDL nativas, es decir, no tratadas con el PG. Este resultado se considera de gran importancia ya que está demostrado que la LDL al llegar a la íntima arterial entra en contacto con estos componentes de la matriz extracelular los cuales son capaces de retenerla en la pared arterial, favoreciendo la oxidación de la misma. AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen al Dr. Rafael Apitz, Jefe del Laboratorio de Trombogénesis del Centro de Biofísica y Bioquímica del I.V.I.C. por toda la colaboración prestada.

REFERENCIAS 1. Abbot, R., Wilson, P., Kannel, W. and Castelli, W. High density lipoprotein cholesterol, total cholesterol screening and myocardial infarction. The Framingham study. Arteriosclerosis 8:207-211, 1988. 2. Anber, V., Griffin, B., M. Connell, M., Packard, C. and Sheperd, J. Influence of plasma lipid and LDL-subfraction profile on the interaction between low density lipoprotein with human arterial wall proteoglycans. Atherosclerosis 124:261-271, 1996. 3. Anber, V., Packard, C. and Sheperd, J. Preferential binding of small dense LDL to Human arterial proteoglycan. Atherosclerosis 109:217. Abstract, 1994. 4. Avila, E., López, F. and Camejo, G. Properties of low density lipoprotein related to its interaction with arterial wall components. Artery 4:36 -60, 1978. 5. Aviram, M. and Maor, I. Phospolipase A2 modified LDL is taken up at enhanced rate by macrophages. Biochem. Biophys. Res. Commun. 185:465 -472, 1992.

6. Baren, J., Lee, Y., Zhu, W., Arnold, K., Taylor, S. and Innerarity, T. Identification of the low density lipoprotein receptor-binding site in apolipoprotein B100 and the modulation of its binding activity by the carboxyl terminus in familial defective apo B100. J. Clin. Invest. 101:1084-1093, 1998. 7. Barón, L. y López, F. Predisposición a la oxidación in vitro de la LDL aislada de pacientes con hipercolesterolemia. Interacción con proteoglicanos arteriales. Acta Cient. Venez. 50:134-143, 1999. 8. Berliner, J. and Heinecke, J. The role of oxidized lipoproteins in atherogenesis. Free Radic. Biol. Med. 20:707-727, 1996. 9. Bihari-Vargas, M. and Vegh, M. Quantitative studies on the complexes formed between aortic mucopolysacharides and serum lipoproteins. Biochim. Biophys. Acta 1444:202-210, 1967. 10. Bihari-Vargas, M., Camejo, G. and Lopez, F. Structure of

Proteoglicanos arteriales low density lipoprotein in complexes formed with arterial matrix components. J. Biol. Macromol. 5:59-65, 1983. 11. Bitter, T. and Muir, H. A modified uronic acid carbazole reaction. Anal. Biochem. 4:330-334, 1962. 12. Bradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal. Biochem. 72:248-255, 1976. 13. Camejo, G., Rosengren, B. and Lopez, F. Modification of copper-catalyzed oxidation of low density lipoprotein by proteoglycans and glycosaminoglycans. J. Lip. Res. 32:19831991, 1991. 14. Camejo, G., Acquatella, H. and Lalaguna, F. The interaction of low density lipoproteins with arterial proteoglycans: an additional risk factor?. Atherosclerosis 36:55-65, 1980. 15. Camejo, G., Hurt, E., Wiklund, O., Rosengren, B., Lopez, F. and Bondjers, G. Modifications of low density lipoprotein induce by arterial proteoglycans and chondroitin-6-sulfate. Biochim. Biophys. Acta 1096:253-261, 1991. 16. Camejo, G., Hurt-Camejo, E., Wiklund, O. and Bondjers, G. Association of apo B lipoproteins with arterial proteoglycans: Pathological significance and molecular basis. Atherosclerosis 139:205-222, 1998. 17. Camejo, G., Rosengren, B., Lopez, F. and Bondjers, G. Effect of arterial proteoglycans and glycosaminoglycans on low density lipoprotein oxidation and its uptake by human macrophages and arterial smooth muscle cells. Arteriosclerosis and Thrombosis. 125:569-583, 1992. 18. Camejo, G., Wallin, B., Rosengren, B. and Shertzer, H. Lipoprotein oxidation and measurement of thiobarbituric acid reacting substances formation in a single microtiter plate: Its use for evaluation of antioxidants. Anal. Biochem. 208:1015, 1993. 19. Carmena, R., Ascaso, J., Camejo, G., Varela, G. and Hurt-Camejo, E., Ordovas, J., Martinez-Valls, J., Bergstrom, M. and Wallin, B. Effect of olive and sunflower oils on low density lipoprotein level composition, size, oxidation and interaction with arterial proteoglycans. Atherosclerosis 125:243-256, 1996. 20. Chait, A., Brazg, R., Tribble, D. and Krauss, R. Susceptibility of small, dense, low-density lipoproteins to oxidative modification in subjects with the atherogenic lipoprotein phenotype, pattern B. Am. J. Med. 94:350-356, 1993. 21. Cominacini, L., Garbin, U. and Cenci, B. Predisposition to LDL oxidation during copper-catalyzed oxidative modification and its relation to -tocopherol content in humans. Clin. Chim. Acta 204:57-68, 1991. 22. Faber, M. The human aorta: sulfate containing polyuronides and the deposition of cholesterol. Arch Pathol. 48:342- 350, 1949. 23. Gotto, A. The U. S. National Cholesterol Education Program Updates its Adult Treatment Guidelines. Newsletter International Atherosclerosis Society.1993.

221 24. Haberland, M., Fong, D. and Cheng, L. Malondialdehyde altered protein occurs in atheroma of watanabe heritable hyperlipidemic rabbits. Science 241:215, 1988. 25. Hoff, H. and Bond, G. Apolipoprotein B localization in coronary atherosclerotic plaques from cynomolgus monkeys. Artery 12:104-116, 1983. 26. Hoff, H. and Gaubatz, J. Isolation, purification and characterization of a lipoprotein containing apo B from the human aorta. Atherosclerosis 42:39-62, 1982. 27. Hollander, W. Unified concept on the role of acidic mucopolysaccharides and connective tissue proteins in the accumulation of lipids, lipoproteins and calcium in the atherosclerotic plaque. Exp. Mol. Pathol. 25:106-120, 1976. 28. Hurt, E., Bondjers, G. and Camejo, G. Interaction of LDL with human arterial proteoglycans stimulates its uptake by human monocyte-derived macrophages. J. Lip. Res. 31:443-454, 1990. 29. Hurt-Camejo, E., Andersen, S., Sandal, R., Rosengren, B., Sartipy, P., Stadberg, E. and Johansen, B. Localization of non pancreatic secretory phospholypase A2 in normal and atherosclerotic arteries: activity of the isolated enzyme on low density lipoproteins. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17:300-309, 1997. 30. Hurt-Camejo, E., Camejo, G., Rosengren, B., Lopez, F., Wiklund, O. and Bondjers, G. Differential uptake of proteoglycan-selected subfractions of low density lipoprotein by human macrophages. J. Lipid Res. 31:1387-1398, 1990. 31. Hurt-Camejo, E., Olsson, U., Wiklund, O., Bondjers, G. and Camejo, G. Cellular consequences of the association of apo B lipoproteins with proteoglycans: potential contribution to atherogenesis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17:10111017, 1997. 32. Iverius, P. The interaction between human plasma lipoprotein and connective tissue glycosaminoglycan. J. Biol. Chem. 247:2607-2613, 1972. 33. Krauss, R. Relationship of intermediate and low density lipoprotein subspecies to risk of coronary artery disease. Am. Heart J. 113:578, 1987. 34. Linden, T., Bondjers, G., Camejo, G., Bergstrand, R., Wilhelmsen, L. and Wiklund, O. Affinity of LDL to a human arterial proteoglycans among male survivors of myocardial infarction. Eur. J. Clin. Invest. 19:38-44, 1989. 35. Mason, J., Srampfer, M. and Willet, W. A prospective study of antioxidant vitamins and incidence of coronary heart disease in women Circulation 84 IV. Abstract 2168, 1991. 36. Mateu, L., Avila, E., León, V. and Liscano, N. The structural stability of low density lipoprotein:a kinetic x-ray scattering study of its interaction with arterial wall proteoglycans. Biochim. Biophys. Acta. 795:525-534, 1984. 37. M. Namara, J., Small, D., Li, Z. and Schaefer, E. Differences in LDL subspecies involve alterations in lipid composition and conformational changes in apolipoprotein B. J. Lipid Res. 37:1924-1935, 1996.

222

Barón y López

38. Navab, M., Berliner, J., Watson, A., Hama, S., Territo, M., Lusis, A., Shih, D., Van Lenten, B., Frank, J., Demer, L., Edwards, P. and Fogelman, A. The Ying and Yang of oxidation in the development of the fatty streak. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16:831-842, 1996.

43. Stary, H., Blakenhorn, D., Chandler, A., Glagov, S., Insull, W., Richardson, M., Rosenfeld, M., Schaffer, S., Schwartz, X. and Wagner, W. A definition of the intima of human arteries and its atherosclerosis-prone regions. Circulation 85:391-405, 1991.

39. Palinsky, W., Rosenfeld, M. and Yla Herttuala. Low density lipoprotein undergoes modification in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. 86:1372, 1989.

44. Trevisan, M., Krogh, V. and Freudenheim, J. Comsumption of olive oil, butter and vegetable oils and coronary heart disease risk factors. J. Am. Med. Assoc. 263:688-692, 1990.

40. Redgrave, T., Roberts, D. and West, C. Separation of plasma lipoproteins by density gradient ultracentrifugation. Anal. Biochem. 65:42-49, 1975.

45. Wiener Lab. Vademécum. Rosario. Argentina.1991.

41. Regnstrom, J., Walldius, G. and Carlson, L. Effect of probucol treatment on the susceptibility of low density lipoprotein isolated from hypercholesterolemic patients to become oxidatively modified in vitro. Atherosclerosis 82:43-51, 1990. 42. Shepherd, J., Cobbe, S., Ford, I., Isles, C., Lorimer, R., MacFarlane, P., M. Killop, J. and Packard, C. Prevention of coronary heart disease with pravastatin in men with hypercholesterolemia. New Engl. J. Med. 333:1301-1307, 1995.

46. Wight, T. Cell biology of arterial proteoglycans. Arteriosclerosis 9:1-20, 1989. 47. Wiklund, O., Bondjer, G., Wright, Y. and Camejo, G. Insoluble complex formation between LDL and arterial proteoglycans in relation to serum lipid levels and effect of lipid lowering drugs. Atherosclerosis 119:57-68, 1996. 48. Williams, K. and Tabas, I. The response to retention hypothesis of early therogenesis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 15:551-561, 1995.